CN112500459A - Aerolysin突变纳米孔及其在分子生物检测方面的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种Aerolysin突变纳米孔孔以及Aerolysin突变纳米孔在分子生物检测方面的应用，Aerolysin突变纳米孔由Aerolysin突变单体组成，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，且所述突变Aerolysin单体包含以下任意一个或其任意组合中相应位置氨基酸的取代：K238Q/C/E/G/N/R/F/Y、R288D、D222R、N226Q/S228K/G270D、T232L/N226Q/S228K、T274L/N226Q/S228K、T230G/T232K/K238Q、S236C、S272K/N226W/G270F/E258H、N262S/S264Q/Q268T、S264Q、G270Q、S272Q、T274C、S278C、S276Y/C、S276C/S278C、T274L/N226Q/G270K,T274Q/N226Q/G270K、T210A，R104D，R397D、N226Q/S228K、N226Q/G270K、S228K/T232K/K238Q中。由上述突变单体组装成的纳米孔具有增强检测和表征分析物的能力，如DNA序列的长度和碱基种类。特定来说，使寡聚核苷酸穿过纳米孔的速度降低了两个数量级以上。可以选择性地使混合物中的特定的分子穿过纳米孔。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，具体涉及Aerolysin突变纳米孔以及Aerolysin突变纳米孔在分子生物检测方面的应用。
技术背景
纳米孔道检测技术是通过监控由待测物分子与孔道内部的相互作用产生的特征性电流阻断信号，从而实现单分子水平上的分析。可通过在绝缘膜上放置纳米尺寸的孔道和监测在分析物分子存在下通过孔的电压驱动的离子转运来实现。通过分析物的独特电流标志来揭露分析物的特性，例如，阻断电流的大小和持续时间。
现有的常规核酸测序技术缓慢且昂贵，这主要是因为现有测序技术主要依赖于核苷酸扩增技术来产生大体积的核酸，且需要大量的用于信号检测的专业荧光化学试剂。而纳米孔测序技术不需要荧光标记物并且不需要进行核酸扩增，能直接并快速“读”出DNA，同时足够廉价，使进行大量重复实验成为可能。
气单胞菌溶素（Aerolysin）来源于嗜水气单胞菌，能够在水溶液中能够自组装形成七聚体孔道，并插入宿主细胞的细胞膜形成一个直径约1 nm的孔道，造成渗透压的不平衡，进而引起细胞的破裂。与常用的生物纳米孔道相比，气单胞菌溶素没有前庭结构，孔径仅为1-1.4 nm，能在较宽的pH范围内保持稳定，因此很多科学研究者利用它的这种特性，作为一种生物纳米孔道对核酸、多肽、寡聚糖和蛋白质等分子进行检测分析，此外还可应用于实时监测酶降解和单分子化学反应等动力学过程。但是野生型的Aerolysin纳米孔道检测灵敏度和应用范围有限，因此需要对气单胞菌溶素生物纳米孔道进行修饰，例如氨基酸的定点突变，从而加强待测物与孔道内氨基酸的相互作用。期望增强纳米孔道的灵敏性，降低待测物分子的穿孔速度和检测限。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一种Aerolysin突变纳米孔以及该Aerolysin纳米孔在核酸检测方面的应用，用以解决现有技术核酸检测耗时耗力，成本过高的缺陷。
为解决上述技术问题，本发明提供一种Aerolysin突变纳米孔，组成该纳米孔的突变单体其氨基酸序列如SEQ ID NO:1中所示，且所述突变Aerolysin单体包含对应于SEQ IDNO:1所示序列中的K238Q/C/E/G/N/R/F/Y、 R288D、D222R、N226Q/S228K/G270D、T232L/N226Q/S228K、T274L/N226Q/S228K、T230G/T232K/K238Q、S236C、S272K/N226W/G270F/E258H、N262S/S264Q/Q268T、S264Q、G270Q、S272Q、T274C、S278C 、S276Y/C、S276C/S278C、T274L/N226Q/G270K, T274Q/N226Q/G270K、T210A，R104D，R397D、N226Q/S228K、N226Q/G270K、S228K/T232K/K238Q中任意一个或其任意组合中相应位置氨基酸取代。
其中所述Aerolysin突变单体还包含以下取代中的一个或多个：R220A/C/K/Q、Q212N/E、N226S、、N226Q/K238Q、、K238N/R/Y、R282Q、T232K/K238N、D209R、D209K、D209H、D209Q、D209G、D209C、D209E、D209F、Q212R、Q212K、Q212H、Q212D、Q212E、Q212G、Q212C、Q212F、T284R、T284K、T284H、T284D、T284E、T284Q、T284N、T284G、T284C、T284S、T284Y、T284F、P286R、P286K、P286H、P286D、P286V、P286C、P286G、P286Q、P286F、R288E、R288F、R288C、R288Q、R288S、D216E、D216R、D216K、D216H、D216F、D216C、D216G、D216Q、D216S、T218R、T218K、T218H、T218F、T218C、T218G、T218Q、T218E、T218D、T218Y、R220K、R220H、R220A、R220E、R220Q、D222K、D222R、D222H、D222E、D222A、D222Q、A224K、A224R、A224H、A224D、A224E、A224F、A224Q、A224T、A224Y、N226Q、N226R、N226H、N226E、N226C、N226A、N226Y、N226T、S228T、S228Y、S228R、S228H、S228F、S228A、S228C、S228Q、S228E、T230R、T230K、T230H、T230F、T230C、T230G、T230Q、T230E、T230D、T230Y、T232K、T232R、T232E、T232F、T232A、T232C、T232Q、T232Y、T232S、G234R、G234K、G234D、G234E、G234H、G234F、G234C、G234Q、G234S、G234Y、G234T、S236T、S236Y、S236R、S236H、S236F、S236A、S236C、S236Q、S236E、K238Q、K238C、K238E、K238G、K238N、K238R、K238F、K238Y、T240R、T240K、T240H、T240F、T240C、T240G、T240Q、T240E、T240D、T240Y、S256T、S256Y、S256R、S256H、S256F、S256A、S256C、S256Q、S256E、E258D、E258H、E258K、E258R、E258F、E258C、E258G、E258Q、E258S、E258Y、E258T、A260H、A260K、A260R、A260C、A260D、A260E、A260F、A260Q、A260T、A260Y、N262Q、N262R、N262H、N262E、N262C、N262A、N262Y、N262T、S264T、S264Y、S264R、S264H、S264F、S264A、S264C、S264Q、S264E、A266H、A266K、A266R、A266C、A266D、A266E、A266F、A266Q、A266T、A266Y、Q268R、Q268K、Q268H、Q268D、Q268E、Q268G、Q268C、Q268F、Q268S、Q268Y、Q268T、G270R、G270K、G270D、G270E、G270H、G270F、G270C、G270Q、G270S、G270Y、G270T、G270W、S272T、S272Y、S272R、S272H、S272F、S272A、S272C、S272Q、S272E、T274R、T274K、T274H、T274F、T274C、T274G、T274Q、T274E、T274D、T274Y、S276T、S276Y、S276R、S276H、S276F、S276A、S276C、S276Q、S276E、S278T、S278Y、S278R、S278H、S278F、S278A、S278C、S278Q、S278E、S280T、S280Y、S280R、S280H、S280F、S280A、S280C、S280Q、S280E、R282D、R282H、R282K、R282E、R282F、R282C、R282G、R282Q、R282S、R282Y、R282T、K242Q、K242C、K242E、K242G、K242N、K242R、K242F、K242Y、K242T、K244Q、K244C、K244E、K244G、K244N、K244R、K244F、K244Y、K244T、F245H、F245R、F245K、F245D、F245E、F245A、F245C、F245G、F245Q、F245S、F245Y、F245T、K246H、K246R、K246T、K246D、K246E、K246F、K246A、K246C、K246Q、K246S、K246Y、E252D、E252H、E252K、E252R、E252F、E252C、E252G、E252Q、E252S、E252Y、E252T、E254D、E254H、E254K、E254R、E254F、E254C、E254G、E254Q、E254S、E254Y、E254T、F308H、F308R、F308K、F308D、F308E、F308A、F308C、F308G、F308Q、F308S、F308Y、F308T、R397H、R397K、R397F、R397D、R397E、R397A、R397C、R397G、R397Q、R397S、R397Y、R397T。
其中所述变异体包含K238Q/N226Q、K238Q/T232K。上述Aerolysin突变单体在同源或异源寡聚孔方面的应用，其中同源或异源寡聚孔衍生自Aerolysin，且所述同源或异源寡聚孔包含至少一个前述Aerolysin突变单体。
上述Aerolysin突变单体在纳米孔道检测技术方面的应用。且用于分析的靶分析物为金属离子、无机盐、聚合物、氨基酸、肽、多肽、蛋白质、核苷酸、寡核苷酸、聚核苷酸、染料、漂白剂、药物、诊断剂、娱乐性药物、爆炸性或环境污染物中的一种或多种。
上述Aerolysin突变单体在纳米孔道检测技术方面的应用中，当所述靶分析物是靶聚核苷酸时，其具体步骤如下：
（a）使所述聚核苷酸与所述孔接触，使得所述聚核苷酸相对于所述孔移动；（b）在所述聚核苷酸相对于所述孔移动时，进行一或多个测量，其中所述测量指示所述聚核苷酸的一或多个特征，且从而表征所述靶聚核苷酸。
本发明的有益效果如下：
本发明的Aerolysin突变孔以及使用Aerolysin对待测物进行检测和表征可以更好地适用于横跨广泛应用范围的快速且廉价的核酸(例如DNA或RNA)测序。同时提供了完整的表征靶聚核苷酸体系及其衍生产物，具有好的转化前景。
附图说明
图1为本发明示出来自大肠杆菌(E .coli)的Aerolysin示意图；
图2为本发明示出Aerolysin的尺寸示意图；
图3为本发明示出野生型和D209R突变型Proaerolysin凝胶电泳结果；
图4为本发明示出多种突变型Aerolysin纳米孔道电流-电压关系曲线图；
图5为本发明示出寡聚核苷酸在K238突变型Aerolysin纳米孔道内的穿孔时间随电压变化曲线图；
图6为本发明示出寡聚核苷酸在突变型Aerolysin纳米孔道内的穿孔时间随电压变化曲线图；
图7为本发明示出寡聚核苷酸在K238突变型Aerolysin纳米孔道内的阻断程度随电压变化曲线图；
图8为本发明示出寡聚核苷酸在突变型Aerolysin纳米孔道内的阻断程度随电压变化曲线图；
图9为本发明示出DNA分子和甲基化修饰的DNA分子穿过Aerolysin纳米孔道过程中受到的力；
图10为本发明示出DNA分子和甲基化修饰的DNA分子在Aerolysin纳米孔道R220附近受到的范德华力和静电力；
图 11为 N226Q/S228K Aerolysin纳米孔道检测正电性多肽分子GSNKGAIIGLM的原始电流轨迹；
图 12 N226Q/G270K Aerolysin纳米孔道检测多肽分子DDFFIFFDD的原始电流轨迹；、
图 13 G270Q Aerolysin纳米孔道检测多肽分子MLGIIAGKNSG的原始电流轨迹。
序列表的描述：SEQ ID NO:1显示野生型Proaerolysin的氨基酸序列。SEQ ID NO:2显示进行密码子优化后的野生型Proaerolysin的聚核苷酸序列。
具体实施方式
下面结合说明书附图1至附图8对本发明做进一步说明。
本发明人已经证实，Aerolysin和其新颖突变可用于检测和表征分析物，如核苷酸和多肽等。本发明涉及突变Aerolysin单体。本发明人已经证实，由突变单体组装成的纳米孔具有增强检测和表征分析物的能力，如DNA序列的长度和碱基种类。如实施例3所示，本发明人已制备出降低待测物穿孔速度的突变孔，特定来说，使寡聚核苷酸穿过纳米孔的速度降低了两个数量级以上，例如K238Q。本发明人已制备出增强待测物选择性的突变孔，特定来说，可以选择性地使混合物中的特定的分子穿过纳米孔，例如R220A/E/Q。本发明人已制备出灵敏性更强的突变孔。
提及包含SEQ ID NO:1中所示序列的变异体的突变Aerolysin单体，涵盖包含如在如下文所公开的其它SEQ ID NO中陈述的序列变异体的突变Aerolysin单体。可对包含除SEQ ID NO:1中所示以外的序列变异体的Aerolysin单体，进行等效于本文所公开的参考包含SEQ ID NO:1中所示序列的变异体的突变Aerolysin单体的那些取代、缺失和/或添加的氨基酸取代、缺失和/或添加。
上述Aerolysin突变单体在纳米孔道检测技术方面的应用中，当所述靶分析物是靶聚核苷酸时，其具体步骤如下：
（a）使所述聚核苷与所述孔接触，使得所述聚核苷酸相对于所述孔移动；和
（b）在所述聚核苷酸相对于所述孔移动时，测量穿过所述孔的电流，其中所述电流指示所述聚核苷酸的一或多个特征，且从而表征所述靶聚核苷酸。
其中所述一或多个特征是选自（i）所述聚核苷酸的得长度、（ii）所述聚核苷酸的一致性、（iii）所述聚核苷酸的序列、（iv）所述聚核苷酸的二级结构和（v）所述聚核苷酸是否经修饰。
其中所述方法是用于表征靶聚核苷酸，且所述方法包含：
a)使所述聚核苷酸与前述任一项所述的孔和核酸外切酶接触，使得所述核酸外切酶消化来自所述靶聚核苷酸一端的个别核苷酸，且所述个别核苷酸相对于所述孔移动；
b)在所述个别核苷酸相对于所述孔移动时，进行一或多个测量，其中所述测量指示所述个别核苷酸的一或多个特征，且从而表征所述靶聚核苷酸。
其中所述孔在膜中。
其中膜是两亲层或包含固态层。
在使所述靶分析物与所述孔接触之前，将其与所述膜偶联。
所述靶分析物连接于微粒，所述微粒向所述膜递送所述分析物。
一种形成用于表征靶聚核苷酸的传感器的方法，其包含在前述任一项所述的孔与聚核苷酸结合蛋白之间形成复合体，且从而形成用于表征所述靶聚核苷酸的传感器。
所述复合体通过以下来形成：(a)在所述靶聚核苷酸存在下，使所述孔与所述聚核苷酸结合蛋白接触，和(b)在所述孔两端施加电势。
所述电势是电压电势或化学势。
所述复合体通过将所述孔与所述蛋白质共价连接来形成。
一种用于表征靶聚核苷酸的传感器，其包含前述任一项所述的孔与聚核苷酸结合蛋白之间的复合体。
一种表征靶聚核苷酸的方法，其包含：
a)使所述聚核苷酸与任一项所述的孔、聚合酶和标记核苷酸接触，使得磷酸标记物种通过所述聚合酶依序添加到所述靶聚核苷酸中，其中所述磷酸物种含有对各核苷酸具有特异性的标记；
b)使用所述孔检测所述磷酸标记物种，且从而表征所述聚核苷酸。
一种生产所述的突变单体或所述的构筑体的方法，其包含在合适宿主细胞中表达所述的聚核苷酸，且从而生产所述的突变单体或所述的构筑体。
在（a）中，变异体可包含任何数量的取代和取代的组合，如1、2、3、4、5、6或7个取代。在（a）中，变异体优选的包含可以改变对待测物选择性和捕获率的突变单体，变异体优选的包含以下中的一个或多个：D209R/K/H/Q/G/C/E/F、Q212R/K/H/D/E/G/C/F、D216E/R/K/H/F/C/G/Q/S、T218/K/H/F/C/G/Q/E/D/Y、R220K/H/A/E/Q、R282D/H/K/E/F/C/G/Q/S/Y/T、T284R/K/H/D/E/Q/N/G/C/S/Y/F、P286R/K/H/D/V/C/G/Q/F、R288E/F/C/Q/S、F308H/R/K/D/E/A/C/G/Q/S/Y/T和R397H/K/F/D/E/A/C/G/Q/S/Y/T
在本发明的一些实施例中，SEQ ID NO:1的变异体包含K238C/E/G/N/Q/R，优选的选K238Q。在 (b) 中，变异体可包含任何数量的位置和位置的组合处的修饰，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25和26个位置。在（b）中，变异体优先的包含以下中的一或多个： D222K/R/H/E/A/Q/K/R/H/D/E/F/Q/T/Y、N226Q/R/H/E/C/A/Y/T、S228T/Y/R/H/F/A/C/Q/E、T230R/K/H/F/C/G/Q/E/D/Y、T232K/R/E/F/A/C/Q/Y/S、G234R/K/D/E/H/F/C/Q/S/Y/T、S236T/Y/R/H/F/A/C/Q/E、K238Q/C/E/G/N/R/F/Y、T240R/K/H/F/C/G/Q/E/D/Y、S256T/Y/R/H/F/A/C/Q/E、E258D/H/K/R/F/C/G/Q/S/Y/T、A260H/K/R/C/D/E/F/Q/T/Y、N262Q/R/H/E/C/A/Y/T、S264T/Y/R/H/F/A/C/Q/E、A266H/K/R/C/D/E/F/Q/T/Y、Q268R/K/H/D/E/G/C/F/S/Y/T、G270R/K/D/E/H/F/C/Q/S/Y/T/W、S272T/Y/R/H/F/A/C/Q/E、T274R/K/H/F/C/G/Q/E/D/Y、S276T/Y/R/H/F/A/C/Q/E、S278T/Y/R/H/F/A/C/Q/E、S280T/Y/R/H/F/A/C/Q/E和。
在（b）中，变异体优选的包含对靶聚核苷酸阻断程度增强的突变单体，特定来说，在（b）中，变异体优选的包含在以下位置处的一个或多个突变：T232、N226、G270和S264。变异体优先的包含以下中的一或多个：T232K/R/E/F/A/C/Q/Y/S、N226Q/R/H/E/C/A/Y/T、G270R/K/D/E/H/F/C/Q/S/Y/T/W和S264 T/Y/R/H/F/A/C/Q/E。这些可以针对位点T232、N226、G270和S264所示的任何组合存在。
在（b）中，变异体优选地包含允许由突变单体构筑的孔优选地降低寡聚核苷酸穿过纳米孔道的速度。特定来说，在（b）中，变异体优选的包含在以下位置处的一或多个突变：K238和G270。变异体可包含任何数量的位置和位置的组合处的修饰，优选地包含以下中的一或多个：K238Q/C/E/G/N/R/F/Y和G270R/K/D/E/H/F/C/Q/S/Y/T/W。
在（b）中，变异体优选地包含提供穿孔速度更慢和阻断程度更强的一或多个修饰。特定来说，在(b)中，变异体优选地包含在以下位置处的一或多个突变：（i）K238Q/C/E/G/N/R/F/Y、（ii）T232K/R/E/F/A/C/Q/Y/S、（iii）N226Q/R/H/E/C/A/Y/T、（iv）G270 R/K/D/E/H/F/C/Q/S/Y/T/W和（v）S264 T/Y/R/H/F/A/C/Q/E。变异体可包含：：{i}；{ii}；{iii}；{iv}；{v}；{i ,ii}；{i ,iii}；{i ,iv}；{i ,v}；{ii ,iii}；{ii ,iv}；{ii ,v}；{iii ,iv}；{iii,v}；{iv ,v}；{i ,ii ,iii}；{i ,ii ,iv}；{i ,ii ,v}；{i ,iii ,iv}；{i ,iii ,v}；{i ,iv ,v}；{ii ,iii ,iv}；{ii ,iii ,v}；{ii ,iv ,v}；{iii ,iv ,v}；{i ,ii ,iii ,iv}；{i ,ii ,iii ,v}；{i ,ii ,iv ,v}；{i ,iii ,iv ,v}；{ii ,iii ,iv ,v}或{i ,ii ,iii,iv ,v}
在本申请中，在于特定位置处的不同氨基酸通过/符号分隔，/符号意指“或”。举例来说，K238Q/C意指K238Q或K238C。本申请中分隔不同位置处突变的/符号，/符号意指“和”。举例来说，K238Q/N226Q意指K238Q和N226Q。
在SEQ ID NO:1中不同位置处的突变可以任何可能的方法来进行组合。特定来说，本发明的单体可包含：增强阻断程度的一或多个突变、改变选择性的一或多个突变、增强捕获率的一或多个突变、和/或减缓穿孔速度的一或多个突变。
在本发明的突变单体中，SEQ ID NO:1的变异体优选地包含以下中的一或多个：在以下位置处的一或多个突变(即在以下位置中的一或多个处的突变)：（i）D209R/K/H/Q/G/C/E/F，Q212R/K/H/D/E/G/C/F，T284R/K/H/D/E/Q/N/G/C/S/Y/F，P286R/K/H/D/V/C/G/Q/F，R288H/F/K/D/E/A/C/G/Q/S/Y/T，D216E/R/K/H/F/C/G/Q/S，T218/K/H/F/C/G/Q/E/D/Y，R220H/F/K/D/E/A/C/G/Q/S/Y/T，D222K/R/H/E/A/Q/K/R/H/D/E/F/Q/T/Y，S280T/Y/R/H/F/A/C/Q/E/K/E/G，R282D/H/K/E/F/C/G/Q/S/Y/T；（ii）F308H/R/K/D/E/A/C/G/Q/S/Y/T；（iii）R397H/K/F/D/E/A/C/G/Q/S/Y/T；（iv）K238Q/C/E/G/N/R/K/F/Y/H/A/T/P/S/W/I；（v）S256K/D/T/Y/R/H/F/A/C/Q/E；（vi）T232K/R/E/D/F/A/C/Q/Y/S/H；（vii）N226K/R/E/D/F/A/C/Q/Y/S/H/T；（viii）S228T/Y/R/K/H/F/A/C/Q/E/D；（ix）E258D/H/K/R/F/C/G/Q/S/Y/T；（x）Q268R/K/H/D/E/G/C/F/S/Y/T；（xi）G270R/K/D/E/H/F/C/Q/S/Y/T/W；（xii）A224T/Y/R/K/H/F/G/C/Q/E/D；（xiii）T230R/K/H/F/C/G/Q/E/D/Y；（xiv）G234R/K/D/E/H/F/C/Q/S/Y/T；（xv）S236R/K/D/E/H/F/C/Q/G/Y/T；（xvi）T240 R/K/H/F/C/G/Q/E/D/Y/S/P；（xvii）A260H/K/R/C/D/E/F/Q/T/Y；（xviii）N262Q/R/K/H/E/D/C/A/Y/T；（xix）S264T/Y/R/K/H/F/A/C/Q/E/D；（xx）A266H/K/R/C/D/E/F/Q/T/Y；（xxi）K290H/F/K/D/E/A/C/G/Q/S/Y/T（xxii）S272T/Y/R/K/H/F/A/C/Q/E/D；（xxiii）T274R/K/H/F/C/G/Q/E/D/Y；（xxiv）S276T/Y/R/K/H/F/A/C/Q/E/D；（xxv）S278T/Y/R/K/H/F/A/C/Q/E/D。变异体可包含(i)到(xxv)的任何组合。
用于引入或取代天然存在的氨基酸的方法在所属领域中是众所周知的。举例来说，可通过在编码突变单体的聚核苷酸中的相关位置处用赖氨酸的密码子(AAA)置换苏氨酸的密码子(ACG)，而用赖氨酸(K)将苏氨酸(T)取代。接着，可如下文所论述来检测聚核苷酸。
用于引入或取代非天然存在的氨基酸的方法在所属领域中也是众所周知的。举例来说，可通过在用于表达突变单体的IVTT系统中包括合成氨基酰基-tRNA来引入非天然存在的氨基酸。替代地，可通过在特定氨基酸营养缺陷型大肠杆菌中在那些特定氨基酸的合成(即非天然存在的)类似物存在下表达突变单体，来引入所述非天然存在的氨基酸。如果突变单体是使用部分肽合成来生产，那么其还可通过裸接合来生产突变体。
除上文所论述的特定突变以外，变异体可包括其它突变。在SEQ ID NO:1的氨基酸序列的整个长度内，基于氨基酸同源性，变异体将优选地与所述序列至少50％同源。更优选的，跨膜区域的氨基酸序列至少50%同源。
孔形成突变单体通常保持形成与野生型Proaerolysin单体相同的3D结构的能力，如与具有SEQ ID NO:1的序列的Proaerolysin单体相同的3D结构。可在野生型Proaerolysin序列中进行任何数量的除本文所描述突变以外的突变，其限制条件为，Proaerolysin突变单体保持通过本发明的突变赋予其的改进的特性。
可对SEQ ID NO:1的氨基酸序列进行除上文所论述的那些以外的氨基酸取代，例如至多1、2、3、4、5、10、20或30个取代。保守取代用具有类似化学结构、类似化学特性或类似侧链体积的其它氨基酸来置换氨基酸。所引入的氨基酸可具有与其置换的氨基酸类似的极性、亲水性、疏水性、碱性、酸性、电中性或电荷。替代地，保守取代可引入代替预先存在的芳族或脂族氨基酸的另一芳族或脂族氨基酸。保守氨基酸改变在所属领域中是众所周知的，且可根据如在下文表1中限定的20中主要氨基酸的特性来选择。当氨基酸具有类似极性时，还可参考表2中的氨基酸侧链的亲水性值来决定这个选择。
表1-氨基酸的化学特性
| Ala | 脂族、疏水性、中性 | Met | 疏水性、中性 |
| Cys | 极性、疏水性、中性 | Asn | 极性、亲水性、中性 |
| Asp | 极性、亲水性、电负性 | Pro | 疏水性、中性 |
| Glu | 极性、亲水性、电负性 | Gln | 极性、亲水性、中性 |
| Phe | 芳族、疏水性、中性 | Arg | 极性、亲水性、电正性 |
| Gly | 脂族、中性 | Ser | 极性、亲水性、中性 |
| His | 芳族、极性、亲水性、电正性 | Thr | 极性、亲水性、中性 |
| Ile | 脂族、疏水性、中性 | Val | 脂族、疏水性、中性 |
| Lys | 极性、亲水性、电正性 | Trp | 芳族、疏水性、中性 |
| Leu | 脂族、疏水性、中性 | Tyr | 芳族、极性、疏水性 |
表2-氨基酸亲水性值
| 氨基酸 | 亲水性值 |
| Ile | 4.5 |
| Val | 4.2 |
| Leu | 3.8 |
| Phe | 2.8 |
| Cys | 2.5 |
| Met | 1.9 |
| Ala | 1.8 |
| Gly | -0.4 |
| Thr | -0.7 |
| Ser | -0.8 |
| Trp | -0.9 |
| Tyr | -1.3 |
| Pro | -1.6 |
| His | -3.2 |
| Glu | -3.5 |
| Gln | -3.5 |
| Asp | -3.5 |
| Asn | -3.5 |
| Lys | -3.9 |
| Arg | -4.5 |
变异体可包括SEQ ID NO:1的片段。此类片段保持孔形成活性。片段的长度可为至少50、至少100或至少150个氨基酸。此类片段可用于产生孔。片段优选地包含SEQ ID NO:1的跨膜域，即D206-S289。
替代地或另外，可向上文所描述的多肽中添加一或多个氨基酸。可在SEQ ID NO:1或其变异体或片段的氨基酸序列的氨基端或羧基端处提供延长物。延长物的长度可以非常短，例如1到10个氨基酸。同时，延长物也可以较长，例如50到100个氨基酸。可将载体蛋白与本发明的氨基酸序列融合。其它融合蛋白在下文更详细地论述。
衍生自Proaerolysin的单体可以添加特定修饰基团修饰以辅助其纯化或表征，例如通过添加组氨酸标签来辅助亲和层析纯化，其它合适的标签在下文更详细地论述。单体可用显露标记来进行标记。显露标记可以是使单体被检测到的任何合适标记。
衍生自Proaerolysin的单体含有一或多个特异性修饰以便于核苷酸鉴别。衍生自Proaerolysin的单体还可含有其它非特异性修饰，只要其不干扰孔形成即可。本领域中已知多种非特异性侧链修饰，例如，通过与醛反应，随后用NaBH4、用甲基乙酰亚氨酸脒化或用乙酸酐酰化来对氨基酸还原烷化。
此外，突变单体可以进行化学修饰。突变单体可以任何方式和在任何位点处进行化学修饰。用于进行此类修饰的合适方法在所属领域中是众所周知的。突变单体可通过连接任何分子来进行化学修饰。举例来说，突变单体可通过连接染料或荧光团来进行化学修饰。
突变单体包含有助于纳米孔与靶聚核苷酸之间的相互作用的分子衔接子。衔接子的存在改进孔和核苷酸或聚核苷酸序列的宿主-客体化学，且从而改进突变纳米孔的测序能力。宿主-客体化学的原理在所属领域中是众所周知的。衔接子对于孔的物理或化学特性具有效果，其改进其与核苷酸或聚核苷酸序列的相互作用。衔接子可改变孔的折叠桶或通道的电荷，或特异性与核苷酸相互作用或结合，从而促进其与孔相互作用。
单体可连接于聚核苷酸结合蛋白。这形成可在本发明的测序方法中使用的模块测序系统。下文论述聚核苷酸结合蛋白。
聚核苷酸结合蛋白优选地共价连接于突变单体。可使用本领域中已知的任何方法，将蛋白质共价连接于单体。可对单体和蛋白质进行化学融合或基因融合。如果从单一聚核苷酸序列表达完全构筑体，那么单体和蛋白质是基因融合的。
可例如通过添加组氨酸残基(his标签)、天冬氨酸残基(asp标签)、抗生蛋白链菌素标签、flag标签、SUMO标签、GST标签或MBP标签等，来对本文所描述的任一种蛋白质(如本发明的突变单体和孔进行修饰)以辅助其纯化或表征。另外，也可以通过化学反应将标签连接到蛋白质上。
本文所描述的任一个蛋白质，如本发明的突变单体和孔，可用显露标记来标记。显露标记可以是使蛋白质被检测到的任何合适标记。合适标记包括(但不限于)荧光分子；放射性同位素，例如125I、35S；酶；抗体；抗原；聚核苷酸；和配体，如生物素。
还可使用D-氨基酸来生产蛋白质。举例来说，蛋白质可包含L-氨基酸与D-氨基酸的混合物。
构筑体
本发明还提供一种构筑体，其包含两个或更多个共价连接的Aerolysin单体，其中所述单体中的至少一个是本发明的突变单体。本发明的构筑体保持其形成孔的能力，用于表征(如测序)聚核苷酸。构筑体可包含至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个单体。构筑体优选地包含七个单体。两个或更多个单体可相同或不同。
构筑体中的本发明的突变单体的长度优选地大致相同，或相同。构筑体中的本发明的突变的折叠桶的长度优选地大致相同，或相同。长度可以氨基酸数量和/或长度单位的形式测量。
本发明还提供聚核苷酸序列，其编码本发明的突变单体。突变单体可以是上文所论述的那些突变单体中的任一个。基于核苷酸一致性，聚核苷酸序列优选地包含在整个序列上与SEQ ID NO:1的序列至少50％、60％、70％、80％、90％或95％同源的序列。在300个或更多个，例如375、450、525或600或更多个连续核苷酸的延伸段上，可存在至少80％，例如至少85％、90％或95％核苷酸一致性(“硬同源性”)。可如上文所描述来计算同源性。基于基因密码的简并，聚核苷酸序列可包含不同于SEQ ID NO:2的序列。
可以使用所属领域的标准方法来推导Proaerolysin的DNA序列，并进行碱基优化以有助于蛋白质表达，通过全合成技术合成DNA序列。也可以从生产Proaerolysin的生物体中提取编码野生型Proaerolysin的DNA序列。将野生型Proaerolysin DNA序列连接到表达载体上，得到野生型Proaerolysin重组质粒。表达载体可用于在相容的宿主细胞中扩增。因此，可通过将DNA序列引入到可扩增的表达载体中，将所述载体引入到相容的宿主细胞中，和在产生载体扩增的条件下使宿主细胞生长，来制备DNA序列。可从宿主细胞回收表达载体，用于在合适宿主细胞中进行表达，该技术在本领域中已知，且在下文更详细地描述。
以野生型Proaerolysin重组质粒为模板，可以利用PCR定点突变技术以得到突变型Proaerolysin重组质粒。可接着将表达载体引入到合适宿主细胞中，宿主细胞在合适的表达的条件下生长，并表达Proaerolysin蛋白质。将Proaerolysin蛋白质从细胞中提取出来，经过纯化和活化后可以在适合的条件下自组装到膜上。
载体可例如为质粒、病毒或噬菌体载体，其具备复制起点、任选地启动子和终止子的调控子。载体可含有一或多个可选标记基因，例如氨苄抗性基因。可选择启动子和其它表达调控信号，以与被设计成表达载体的宿主细胞相容。通常使用T7、trc、lac、ara或λL启动子。
宿主细胞通常能够高水平表达目的蛋白质。宿主细胞需要与用于转化细胞的表达载体相容。宿主细胞通常是细菌并优选用大肠杆菌。优先选择 BL21(DE3)plysS。
纳米孔
本发明还提供各种纳米孔。本发明的孔对于表征(如测序)聚核苷酸序列是理想的，这是因为其对核酸有较高的灵敏性，基于孔中的停留时间和流过孔的电流，可以鉴别不同长度和类型的核酸。本发明的纳米孔甚至可以区分甲基化和未甲基化的核酸。
本发明的孔可在一系列不同的条件下对多种核酸之间进行鉴别。本发明可通过改变所施加的电势、离子浓度和类型、缓冲液、温度和添加剂的存在(如脲、甜菜碱和DTT)来优化表征结果。
本发明的纳米孔可呈个别或单一孔存在。同时，本发明的孔可以同源孔群体或两种或更多种纳米孔的异源群体存在，例如阵列孔。
同源寡聚孔包含相同的本发明的突变单体。同源寡聚孔可包含本发明的突变中的任一个。本发明的同源寡聚孔对于表征聚核苷酸是非常理想的。本发明的同源寡聚孔可具有上文所论述的任一个优势。
同源寡聚孔可含有任何数量的突变单体。孔通常可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等多个突变单体。孔优选地包含7相同突变单体。一或多个，如2、3、4、5、6、7、8、9或10个突变单体优选地如上文所论述进行化学修饰。
组成异源寡聚孔的单体可包含任何类型的突变单体。孔通常可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等多个突变单体。孔优选地包含7相同突变单体。一或多个，如2、3、4、5、6、7、8、9或10个突变单体优选地如上文所论述进行化学修饰。
本发明提供一种测定靶分析物是否存在和表证其特征的方法。靶分析物与本发明的纳米孔相互作用，使得靶分析物相对于(如穿过)孔移动，从而测定分析物是否存在或其一或多个特征。靶分析物还可被称为模板分析物。
靶分析物可以是金属离子、无机盐、聚合物、氨基酸、肽、多肽、蛋白质、DNA、RNA、染料、漂白剂、药物、诊断剂、爆炸性或环境污染物。DNA、RNA、氨基酸、肽、或蛋白质可为天然存在的或非天然存在的，可通过所属领域中任何可用的方法来修饰靶分析物。
可在分析物存在下进行对照实验，以测定分析物的特征电流。本发明可用于测定样本中是否存在特定分析物。本发明还可基于分析物对于穿过孔的电流具有不同效果，而用于区分具有类似结构的分析物。本发明还可用于测量样本中的特定分析物的浓度。使用除Aerolysin以外的纳米孔来进行分析物表征在本领域中已知。
方法可涉及测量聚核苷酸的一个、两个、三个、四个或五个或更多个特征。一或多个特征优选地是选自：(i)聚核苷酸的长度；(ii)聚核苷酸的一致性；(iii)聚核苷酸的序列；(iv)聚核苷酸的二级结构；和(v)聚核苷酸是否被修饰。可根据本发明来测量(i)到(v)的任何组合，如：{i}、{ii}、{iii}、{iv}、{v}、{i，ii}、{i，iii}、{i，iv}、{i，v}、{ii，iii}、{ii，iv}、{ii，v}、{iii，iv}、{iii，v}、{iv，v}、{i，ii，iii}、{i，ii，iv}、{i，ii，v}、{i，iii，iv}、{i，iii，v}、{i，iv，v}、{ii，iii，iv}、{ii，iii，v}、{ii，iv，v}、{iii，iv，v}、{i，ii，iii，iv}、{i，ii，iii，v}、{i，ii，iv，v}、{i，iii，iv，v}、{ii，iii，iv，v}或{i，ii，iii，iv，v}。
对于(i)，可以通过测定聚核苷酸与纳米孔之间的相互作用产生的特征性电流阻断和聚核苷酸与纳米孔之间的相互作用的持续时间，来测量聚核苷酸的长度。
对于(ii)，可以采用多种方式来测量聚核苷酸的一致性。可直接测量整个聚核苷酸的序列进行鉴定。可以通过其它若干方式来测量聚核苷酸的一致性。举例来说，可测量聚核苷酸中部分的特定序列的存在。同时，还可以利用特定电子和/或光学信号的测量可鉴定特定来源的聚核苷酸。
对于(iii)，可根据不同核苷酸与纳米孔相互作用而产生的特征性阻断电流来区分不同的核苷酸，进而通过算法来检测聚核苷酸中核苷酸的排列顺序。
对于(iv)，可以多种方式来测量二级结构。举例来说，如果方法涉及电化学测量，那么可使用阻断时间的变化或阻断电流的变化来测量二级结构。
对于(v)，可测量是否存在任何修饰。举例说明可基于在孔与各核苷酸相互作用期间流过纳米孔的电流，将甲基胞嘧啶与胞嘧啶区别开。
具体实验方法可参照专利CN201510047662.9中的设备和步骤来进行。
可进行各种不同类型的测量。这包括(但不限于)电测量和光学测量。可能电测量例如电流测量和阻抗测量。
由于本发明涉及测量在聚核苷酸与孔道相互作用时的电流。因此，在方法中使用的设备还可包含能够施加电势和测量膜和孔两端的电信号的电路。可使用贴片钳或电压钳来进行方法。方法优选地涉及使用电压钳。
用于测量通过跨膜蛋白孔的离子电流的合适条件是所属领域中已知的，且公开于实例中。通常通过在膜和孔两端施加的电压来驱动。所用电压通常是+5V到-5V，如+4V到-4V、+3V到-3V、+2V到-2V或+1V到-1V。所用电压通常是-400mV到+400mV。所用电压优选地在具有下限和上限的范围内，下限选自：-400mV、-300mV、-200mV、-150mV、-100mV、-50mV、-20mV和0mV，上限独立地选自：+10mV、+20mV、+50mV、+100mV、+150mV、+200mV、+300mV和+400mV。所用电压更优选地在60mV到200mV的范围内，并且最优选在80mV到160mV的范围内。
在公开实例中，缓冲溶液中通常含有盐离子，如金属盐，例如碱金属盐、卤盐，例如氯化物盐。含有离子液体或有机盐，例如四甲基氯化铵、三甲基苯基氯化铵、苯基三甲基氯化铵，或1-乙基-3-甲基氯化咪唑。通常使用氯化钾(KCl) 、氯化钠(NaCl)、氯化铯(CsCl)，或亚铁氰化钾和铁氰化钾的混合物。优选KCl、NaCl，以及亚铁氰化钾和铁氰化钾的混合物。盐离子可以是跨膜不对称的。举例来说，膜的两侧的盐离子类型和/或浓度可不同。
盐浓度可以是饱和的，也可以是3M或更低，且通常0.1到3 M。盐浓度优选地是1M。高盐浓度提供高信噪比且允许在正常电流波动的背景下鉴定指示核苷酸存在的电流。
在本发明的方法中可使用任何缓冲液。通常，缓冲液是氯化物盐缓冲液。优选Tris-KCl缓冲液。通常采用的pH为 3到10，优选8。
可在以下温度下来进行方法：0 ℃到75 ℃，通常在室温下进行方法。特定的实例在支持酶功能活性的温度下进行。
实施例1
本实例以D209R突变孔道为例，描述Proaerolysin质粒突变的方法
材料和方法
对GenBank内的Proaerolysin参考序列（编号P09167）进行密码子优化， 并由上海派森诺有限公司全基因合成野生型Proaerolysin序列。设计上游引物序列为5’-TATCGGAATTAATTCGGATCCGGATCCGGCAGAACC-3’；下游引物序列为5’-TCGAGTGCGGCCGCAAGCTTAAGCTTTTGATTTGC-3’ ，引物合成于苏州泓讯生物科技有限公司。采用Pfu DNA聚合酶对Proaerolysin序列进行PCR扩增，反应条件为94 °C，预变性3分钟；94 °C变性30秒, 60 °C退火30秒，72 °C延伸1.5分钟，35个循环；72 °C延伸10分钟。采用限制性内切酶BamH I和Hind III 对空载体pET-22b (+)进行双酶切后，用凝胶回收试剂盒回收酶切后的载体。采用一步克隆试剂盒连接Proaerolysin序列和酶切后的载体得到pET-22b-Proaerolysin重组表达载体，最后将表达载体转化到DH5α大肠杆菌感受态细胞中，由上海桑尼生物科技有限公司测序（测序结果为SEQ ID：2），采用质粒小提试剂盒进行提取质粒备用。
采用KOD-Plus PCR聚合酶通过点突变反向PCR技术构建突变型Proaerolysin表达载体D209R。设计上游引物序列为5’-CGTACCCCGCAATCTGGTTACGACG-3’，下游引物序列为5’-GCTATCGTTAACTGCCCAACCTAC-3’，引物合成于苏州泓讯生物科技有限公司。在50 μL的PCR体系中含有5 μL 10× KOD Plus聚合酶缓冲液，1 μL KOD Plus聚合酶(1 u/μL)，5 μL dNTPs（0.2 mM），2 μL MgSO4（1.0 mM），上游引物（10 μM）和下游引物（10 μM）各1.5 μL，0.5 μLProaerolysin质粒（200 ng/μL）和33.5 μL灭菌水。反应条件为94℃预变性3分钟，进行以下循环，包括94℃变性15秒，68℃延伸8分钟，30个循环后72℃延伸10分钟。PCR产物用DPnl酶消化，以去除其中的模板质粒。在20 μL的消化体系中，2 μL的DPnl酶缓冲液，1 μL的DPnl酶，17 μL PCR产物，37 ℃孵育2小时。消化产物用于T4 DNA连接酶环化为质粒。在20 μL的环化体系中，2 μL的T4 DNA连接酶缓冲液，1 μL T4 PNK（10 u/mL），1 μL T4 DNA连接酶（400 u/mL），2 μL消化产物，以及14 μL灭菌水，16 ℃孵育3小时。将环化产物转化入DH5α大肠杆菌感受态细胞后由上海桑尼生物科技有限公司测序（测序结果为SEQ ID：2），采用质粒小提试剂盒进行提取质粒备用。以上为D209R突变型Proaerolysin表达载体构建方法，其他突变型Proaerolysin表达载体构建方法步骤相同，其所用引物如下所示：D209R-Fw:CGTACCCCGCAATCTGGTTACGACG；D209R-Rv:GCTATCGTTAACTGCCCAACCTAC；T210A-Fw:GCCCCGCAATCTGGTTACGACG；
T210A-Rv: ATCGCTATCGTTAACTGCCCAACC；
Q212N-Fw:AACTCTGGTTACGACGTTACCCTGCG
Q212N-Rv: CGGGGTATCGCTATCGTTAACTG
Q212E-Fw:GAATCTGGTTACGACGTTACCCTGCG
Q212E-Rv: CGGGGTATCGCTATCGTTAACTG
G270Q-Fw:CAGGGTAGTACCACCACCAGTCTGAG
G270Q-Rv: GTTTTGAGATGCCCAGCTCTG
K238N-Fw: AACGTCACCACCAAAAACAAATTC
K238N-Rv: CTCGCTCAGACCGTAGGTATTGG
K238R-Fw: CGAGTCACCACCAAAAACAAATTC
K238R-Rv: CTCGCTCAGACCGTAGGTATTGG
K238Y-Fw: TACGTCACCACCAAAAACAAATTC
K238Y-Rv: CTCGCTCAGACCGTAGGTATTGG
S264Q-Fw:CAATGGGCATCTCAAAACGGTGGTAG
S264Q-Rv: CTGATTTGCCGCGATTTCAATACTC
N226Q-Fw:CAATGGAGCAAAACCAATACCTACGG
N226Q-Rv: GGTTGCGGTATCGTAACGCAGGG
N226S-Fw:AGCTGGAGCAAAACCAATACCTACGG
N226S-Rv: GGTTGCGGTATCGTAACGCAGGG
R220A-Fw: GCTTACGATACCGCAACCAACTGGAGC
R220A-Rv: CAGGGTAACGTCGTAACCAGATTGC
R220C-Fw: TGCTACGATACCGCAACCAACTGGAGC
R220C-Rv: CAGGGTAACGTCGTAACCAGATTGC
R220K-Fw: AAGTACGATACCGCAACCAACTGGAGC
R220K-Rv: CAGGGTAACGTCGTAACCAGATTGC
R220Q-Fw: CAGTACGATACCGCAACCAACTGGAGC
R220Q-Rv: CAGGGTAACGTCGTAACCAGATTGC
R282Q-Fw:CAGCCGACCGTTCCGGCACGTAG
R282Q-Rv: CACGCTCTGACTCAGACTGGTGGTG
S272Q-Fw: AGTACCACCACCAGTCTGAGTCAG
S272Q-Rv: ACCACCGTTTTGAGATGCCCAGC
S276Y-Fw: TATGAGTCAGAGCGTGCGTCCGACCG
S276Y-Rv: CTGGTGGTGGTACTACCACCG
S276C-Fw: TGTGAGTCAGAGCGTGCGTCCGACCG
S276C-Rv: CTGGTGGTGGTACTACCACCG
N226Q/S228K-Fw:CAATGGAAGAAAACCAATACCTACGG
N226Q/S228K-Rv: GGTTGCGGTATCGTAACGCAGGG
N226Q/G270K（两次突变）:
N226Q-Fw: CAATGGAGCAAAACCAATACCTACGG
N226Q-Rv: GGTTGCGGTATCGTAACGCAGGG
G270K-Fw:AAAGGTAGTACCACCACCAGTCTGAG
G270K-Rv: GTTTTGAGATGCCCAGCTCTG
N226QK238Q（两次突变）:
N226Q-Fw: CAATGGAGCAAAACCAATACCTACGG
N226Q-Rv: GGTTGCGGTATCGTAACGCAGGG
K238Q-Fw: CAAGTCACCACCAAAAACAAATTC
K238Q-Rv: CTCGCTCAGACCGTAGGTATTGG
S276C/S278C-Fw: GTACCACCACCTGTCTGTGTCAGAGCGTGCGTCCGACCGTTC
S276C/S278C-Rv: TACCACCGTTTTGAGATGCCCAGCTC
N262S/S264Q/Q268T-Fw:AGTCAGCAATGGGCATCTACAAACGGTGGTAGTACCACCACC
N262S/S264Q/Q268T-Rv: TGCCGCGATTTCAATACTCAGTTCG
T274C-Fw: TGTACCAGTCTGAGTCAGAGCGTGCG
T274C-Rv: GGTACTACCACCGTTTTGAGATGCC
S236C-Fw: CCTACGGTCTGTGCGAGAAAGTCACCACCAAAAAC
S236C-Rv: TATTGGTTTTGCTCCAGTTGGTTGCGGTATC
S278C-Fw: TGTCAGAGCGTGCGTCCGACCGTTC
S278C-Rv: CAGACTGGTGGTGGTACTACC
T240C-Fw: CTGAGCGAGAAAGTCTGCACCAAAAACAAATTCAAATGG
T240C-Rv: ACCGTAGGTATTGGTTTTGCTCC
S228K/T232K/K238Q（两次突变）:
T232K/K238Q-Fw: AAATACGGTCTGAGCGAGCAAGTCACCACCAAAAACAAATTC
T232K/K238Q-Rv: ATTGGTTTTGCTCCAGTTGG
S228K-Fw: AAAAAAACCAATACCTACGGTC
S228K-Rv:CCAGTTGGTTGCGGTATCGTAACG
T230G/T232K/K238Q-Fw: GGCAATAAATACGGTCTGAGCGAGCAAGTCACCACCAAAAACAAATTC
T230G/T232K/K238Q-Rv: TTTGCTCCAGTTGGTTGCGGTATC
T232K/K238N-Fw: AAATACGGTCTGAGCGAGAACGTCACCACCAAAAACAAATTC
T232K/K238N-Rv: ATTGGTTTTGCTCCAGTTGG
N226Q/S228K/G270D（两次突变）:
N226Q/S228K-Fw: CAATGGAAGAAAACCAATACCTACGG
N226Q/S228K-Rv: GGTTGCGGTATCGTAACGCAGGG
G270D-Fw:GACGGTAGTACCACCACCAGTCTGAG
G270D-Rv: GTTTTGAGATGCCCAGCTCTG
N226Q/S228K/T274L（两次突变）:
N226Q/S228K-Fw: CAATGGAAGAAAACCAATACCTACGG
N226Q/S228K-Rv: GGTTGCGGTATCGTAACGCAGGG
T274L-Fw: CTGACCAGTCTGAGTCAGAGCGTGCG
T274L-Rv: GGTACTACCACCGTTTTGAGATGCC
N226Q/G270K/T274Q（两次突变）:
N226Q-Fw: CAATGGAGCAAAACCAATACCTACGG
N226Q-Rv: GGTTGCGGTATCGTAACGCAGGG
G270K/T274Q-Fw:AAAGGTAGTACCCAGACCAGTCTGAGTCAGAGCGTG
G270K/T274Q-Rv:GTTTTGAGATGCCCAGCTCTG
N226Q/G270K/T274L（两次突变）:
N226Q-Fw: CAATGGAGCAAAACCAATACCTACGG
N226Q-Rv: GGTTGCGGTATCGTAACGCAGGG
G270K/T274L-Fw:AAAGGTAGTACCCTGACCAGTCTGAGTCAGAGCGTG
G270K/T274L-Rv: GTTTTGAGATGCCCAGCTCTG
R104D-Fw:GATCTGGTTCACGATTCTGCAAACTTC
R104D-Rv:CCACTGAACGTCAACTTCGTCGCCG
R397D-Fw:GATGCTGGTATTACCGGCGATTTTTC
R397D-Rv: AACCGGACGCAGAACGCGTGCC
D222R-Fw: CGTACCGCAACCAACTGGAGCAAAACC
D222R-Rv: GTAACGCAGGGTAACGTCGAACC
N226W/G270F/S272K/E258H（三次突变）:
N226W-Fw:TGGTGGAGCAAAACCAATACCTACGG
N226W-Rv: GGTTGCGGTATCGTAACGCAGGG
G270K/S272K-Fw:AAAGGTAAAACCACCACCAGTCTGAGTCAGAGCGTG
G270K/S272K-Rv: GTTTTGAGATGCCCAGCTCTG
E258H-Fw: CACATCGCGGCAAATCAGAGCTGGGC
E258H-Rv:AATACTCAGTTCGGTTTCGCCG
实施例2表达和纯化Proaerolysin的方法。
材料和方法
将提取的质粒转化入 BL21(DE3) plysS感受态细胞并涂布于氨苄抗性的LB平板上，挑取单菌落接种于10 mL的LB培养基中(含100 mg/ml氨苄)，37 ℃振荡培养过夜。将菌液接种于1 L新鲜的LB培养基中(含100 mg/ml氨苄)，37 ℃振荡培养至菌液OD600值达到0.6-0.8后，加入1 mL IPTG（0.5 M），16 ℃诱导培养4个小时。诱导后菌液5000 rpm离心20分钟，用60 mL裂解缓冲液（20 mM磷酸钠，0.5 M氯化钠，pH为7.4）重悬菌体，用超声波细胞粉碎机破碎菌液（5s/次，10s/间隔，共200次）后，转速为10000 rpm离心30分钟。使上清样品以5 s/滴的速度通过处理后的Ni-NTA柱，然后依次用分别用含50 mM、100mM咪唑的洗脱液（20 mM磷酸钠，0.5 M氯化钠，pH为7.4）梯度洗脱杂蛋白，最后用含有300 mM咪唑的洗脱液（20 mM磷酸钠，0.5 M氯化钠，pH为7.4）洗脱Ni-NTA柱获得目的蛋白Proaerolysin。通过12%的SDS-PSGE凝胶电泳对目的蛋白相对分子质量和纯度进行表征（电泳结果如图3。Aerolysin单体分子量为52 kDa左右，D209R与野生型Aerolysin的分子量相匹配）。
实施例3若干种Aerolysin突变纳米孔的电化学表征。
在室温下用胰蛋白酶酶切Proaerolysin蛋白6小时，得到有活性的Aerolysin蛋白。实验所用的缩醛树脂检测池由分别称为cis端和trans端的两个检测池组成，两个检测池中分别含有1mL的缓冲溶液（1.0 M KCl，10 mM Tris，1.0 mM EDTA，pH 8.0），磷脂双分子层趴附在检测池中间50 µm的小孔上，在cis端检测池中加入一定量的突变Aerolysin单体蛋白溶液，Aerolysin突变单体自组装成七聚体并插入到磷脂双分子层上形成纳米孔道，所有的纳米孔电化学分析实验温度均控制在20 ± 2 ℃。将模板待测物Poly(dA)4（5’-AAAA-3’）加入到cis端检测池中，检测不同电压下的电流信号。使用膜片钳放大器(Axopatch200B) 放大和采集Aerolysin突变纳米孔道内的电流信号，并通过模数转换器(Digidata1440A)转换成数字信号。采样率为 100 kHz，滤波频率为5 kHz; 通过Clampex 10.4软件(Molecular Devices, Forest City, CA)获取电流信号并使用MOSAIC和Origin软件对所得数据进行统计分析。
采用上述方法表征了多种突变纳米孔，纳米孔的电流-电压关系如图4所示，突变纳米孔道有较明显的整流现象。
纳米孔在100 mV下的开孔电流和60 mV下的I+/I-如表3所示，显示了不同纳米孔道的整流程度（由于Aerolysin纳米孔为阴离子选择性，因此某些突变孔道在较大的负电压下会关闭，R220C和T210A因此取的为最大开孔负电压下的I+/I-）。
| 突变孔 | 100mv开孔电流 | I<sup>+</sup>/I<sup>-</sup>（60 mV） |
| WT | 48 | -0.989 |
| D209R | 47 | -0.975 |
| G270Q | 46 | -0.958 |
| K238C | 52 | -1.569 |
| K238E | 56 | -1.306 |
| K238F | 53 | -1.284 |
| K238G | 56 | -1.559 |
| K238N | 54 | -1.661 |
| K238Q | 53 | -1.392 |
| K238R | 57 | -1.014 |
| K238Y | 53 | -1.524 |
| S264Q | 49 | -1.002 |
| N226Q | 47 | -0.962 |
| T232K | 44 | -0.901 |
| S272Q | 40 | -0.958 |
| R220A | 40 | -0.793 |
| R220C | 37 | -0.838（30mv） |
| R220E | 39 | -0.7659 |
| R220K | 47 | -1.025 |
| R220Q | 42 | -0.788 |
| R282Q | 33 | -0.628 |
| S272Q | 47 | -0.984 |
| S276Y | 54 | -1.256 |
| T210A | 45 | -0.972（50mv） |
| T232KK238Q | 43 | -1.197 |
| N226QS228K | 45 | -1.008 |
| N226QG270K | 48 | -0.9932 |
| N226QK238Q | 52 | -1.323 |
Poly(dA)4在多种突变孔道中不同电压下的阻断时间分别如图5和图6所示，寡聚核苷酸在大多数突变孔道中的阻断时间比在野生型纳米孔道中长，观察到靶核苷酸穿过孔道的速度相比野生型明显降低。Poly(dA)4在多种突变孔道中不同电压下的阻断程度如图7和8所示，寡聚核苷酸在突变孔道中的阻断程度范围在0.15到0.7之间。且阻断程度大部分低于野生型纳米孔，说明在纳米孔道内一个或多个特定位点设计氨基酸突变，可以调控待测物在纳米孔道中的阻断程度和阻断时间。
当表征靶聚核苷酸时，本发明的突变型纳米孔的分辨能力增强，如附图8所示，包括N226R和S264Q的阻断程度明显增大。
实施例4野生型Aerolysin纳米孔及多种突变类型对DNA/多肽穿孔过程的影响
利用分子动力学模拟，研究野生型Aerolysin纳米孔及多种突变类型对DNA/多肽穿孔过程的影响，以及穿孔过程中的关键位点及相互作用。使用NAMD 2.13 程序，利用CHARMM 36力场和TIP3P水模型来进行模拟。Aerolysin的结构取自蛋白质数据库编号5JZT。为了构建突变型Aerolysin纳米孔道原型，使用VMD 1.9.3构建突变型孔道的初始结构。
对于DNA的行为模拟，接着将DNA放置到孔口或孔中，预设三个系统：
i. 将 ssDNA放置到孔道中，恰好在第一个收缩区上（大致位于残基220环中心位置）；
ii． 沿孔轴放置单链DNA（ssDNA），其中3’端朝向β-折叠桶侧。在这种系统中，ssDNA预先插入到孔的整个长度中；
iii. 在孔口放置单链DNA（ssDNA），其中3’端朝向孔道入口处；
接着，将体系溶剂化，并添加实验所用的离子类型及离子强度，并逐步解除原子限制将能量平衡至最低稳定。
使用295K的Langevin piston 的恒压器和Langevin dynamics的恒温器，在NPT体系中模拟各系统。在整个模拟过程中，对孔的骨架原子施加限制。
为了牵引DNA通过纳米孔道，在系统i及系统iii中，对DNA磷酸骨架的磷原子施加拉。通过将DNA磷原子利用弹簧连接到假想原子，对假想原子施加恒定速度，使得DNA以恒定速度平行于孔轴穿过纳米孔道。值得注意的是，弹簧并不具有任何形状及体积，设置弹簧常数为7.0 kcal mol-1 Å-2。
为了研究DNA在孔道内的相互作用及诱导的离子流阻断，在系统ii中，对DNA磷酸骨架施加限制，并对体系施加一定电压120 mV，使得阴阳离子定向迁移过孔。
结果
ssDNA 穿过R220氨基酸残疾环
如图9所示，施加拉力对于时间的图展示，对于ssDNA穿过野生型Aerolysin纳米孔，其穿过R220位氨基酸残基环时，存在很大的阻碍。
ssDNA 穿过野生型Aerolysin纳米孔道
如图9所示，施加拉力对于时间的图展示，当ssDNA进入Aerolysin纳米孔道时，施加的拉力突然升高，而在R220氨基酸残基环和K238氨基酸残基环附近所需的拉力最大。
ssDNA与孔道的相互作用
如图9和10所示，仅有甲基化差异的两种ssDNA在孔道内R220氨基酸残基环附近时，具有和野生型Aerolysin纳米孔差异较大的相互作用，包括范德华力、静电力以及氢键。
实施例5 一种利用突变型Aerolysin纳米孔道检测正电性多肽分子的方法，具体步骤如下：
（1）本方法设计了N226Q/S228K孔道，利用定点突变技术表达并纯化了相应的突变型Proerolysin蛋白用于孔道构建，具体步骤如参考专利CN202010131704.8。
（2）将0.63 mg/mL的Proerolysin蛋白与胰蛋白酶100：6混合并在室温下孵育6小时，得到具有成孔活性的N226Q/S228K Aerolysin单体蛋白。
（3）将实验温度控制在20±2℃。在两个检测池中分别加入1 mL（1.0 M KCl, 10mM Tris, 1.0 mM EDTA, pH=8）缓冲溶液，用提拉法制备磷脂双分子层，具体步骤参考专利CN201510047662.9。
（4）在稳定的磷脂双分子层形成后，施加200 mV电压，在cis检测池中加入1µL的N226Q/S228K Aerolysin单体蛋白质。N226Q/S228K Aerolysin单体自组装形成七聚体并插入磷脂膜中形成稳定的纳米孔道，同时，离子流发生跃升，在100 mV电压下获得稳定的开孔电流，约为47 pA。
（5）在cis检测池中加入80 µL浓度为500 μM的正电性多肽GSNKGAIIGLM，施加140mV的外加电压。采集到的原始电流轨迹如图11所示。
实施例6 一种利用突变型Aerolysin纳米孔道检测含有疏水氨基酸多肽分子的方法。具体步骤如下：
（1）本方法设计了N226Q/G270K孔道，利用定点突变技术表达并纯化了相应的突变型Proerolysin蛋白用于孔道构建，具体步骤如参考专利CN202010131704.8。
（2）将0.60 mg/mL的Proerolysin蛋白与胰蛋白酶100：6混合并在室温下孵育6小时，得到具有成孔活性的N226Q/G270K Aerolysin单体蛋白。
（3）将实验温度控制在20±2℃。在两个检测池中分别加入1 mL（1.0 M KCl, 10mM Tris, 1.0 mM EDTA, pH=8）缓冲溶液，用提拉法制备磷脂双分子层，具体步骤参考专利CN201510047662.9。
（4）在稳定的磷脂双分子层形成后，施加200 mV电压，在cis检测池中加入1µL的N226Q/S228K Aerolysin单体蛋白质。当N226Q/GS228K Aerolysin单体在溶液中自组装形成七聚体并插入磷脂膜中形成稳定的纳米孔道时，离子流会发生跃升，在100 mV电压下获得稳定的开孔电流，约为48 pA。
（5）在cis检测池中加入10 µL浓度为500 μM的DDFFIFFDD多肽，施加60 mV的外加电压。采集到的原始电流轨迹如图所示。图12为检测多肽分子DDFFIFFDD的原始电流轨迹。
实施例7一种利用突变型Aerolysin纳米孔道检测线性多肽分子的方法。具体步骤如下：
（1）本方法设计了G270Q孔道，利用定点突变技术表达并纯化了相应的突变型Proerolysin蛋白用于孔道构建，具体步骤如参考专利CN202010131704.8。
（2）将0.60 mg/mL的Proerolysin蛋白与胰蛋白酶100：6混合并在室温下孵育6小时，得到具有成孔活性的G270Q Aerolysin单体蛋白。
（3）将实验温度控制在20±2℃。在两个检测池中分别加入1 mL（1.0 M KCl, 10mM Tris, 1.0 mM EDTA, pH=8）缓冲溶液，用提拉法制备磷脂双分子层，具体步骤参考专利CN201510047662.9。
（4）在稳定的磷脂双分子层形成后，施加200 mV电压，在cis检测池中加入1µL的G270Q Aerolysin单体蛋白质。当G270Q Aerolysin单体在溶液中自组装形成七聚体并插入磷脂膜中形成稳定的纳米孔道时，离子流会发生跃升，在100 mV电压下获得稳定的开孔电流，约为48 pA。
（5）在cis检测池中加入40 µL浓度为500 μM的多肽MLGIIAGKNSG，施加160 mV的外加电压。采集到的原始电流轨迹如图所示。图13为检测正电性多肽分子MLGIIAGKNSG的原始电流轨迹。
通过上述实施例显示：Aerolysin单体K238Q构筑的孔，相对于野生型纳米孔，靶聚核苷酸穿过孔道的速度显著减慢。当本发明的Aerolysin单体包含K238E、K238C、K238N、K238R或K238G时，也观察到靶核苷酸穿过孔道的速度明显降低。因此，可由一或多个突变Aerolysin单体来构筑孔，所述突变Aerolysin单体包含SEQ ID NO: 1的K238处的修饰，使得所述修饰增强氨基酸与靶聚核苷酸的相互作用。举例来说，此类修饰可包括含有任何可增强与待测物相互作用的氨基酸，包括（但不限于）Q、E和G。
本发明的包含T232K的Aerolysin纳米孔在表征把核苷酸时，比野生型纳米孔产生阻断程度更大的阻断电流信号，这可归因于修饰后氨基酸侧链体积的增大，因此，位置232可被侧链较大的氨基酸所取代。除了T232K外，本发明在232处的修饰还包含任何侧链增长的额外修饰，所述修饰可改进突变孔对待测物的表征能力。
当表征靶聚核苷酸时，本发明的一些实施实例显示突变型纳米孔的分辨能力增，包括T232K、N226Q/R、S264Q、K238G/Q、G270K和G230K。
本发明一些实施实例显示，T210A、Q212R和D209R突变型Aerolysin单体较难形成纳米孔道，推测这些位点的氨基酸参与孔道的组装过程，因此突变后会阻碍孔道的形成。
本发明一些实施实例显示，靶聚核苷酸难以进入R282G/Q和R220A/E/Q突变型纳米孔道中，而靶聚核苷酸可以顺利进入R220K纳米孔道，因此，这一结果可以归因于位于孔口处的220和R282位点的正电荷的减少。另外，本发明在R220和R282位点处的修饰还包括可降低正电荷的所有氨基酸，所述修饰可以阻碍电负性的待测物进入纳米孔道，增强了孔道的选择性。
本发明一些实例显示，在表征靶聚核苷酸时，K238Q/G/E、N226Q/K238Q和T232K/K238Q突变型纳米孔为纳米孔道引入了一个能垒，可以利用电压来控制不同长度的靶聚核苷酸选择性的进入孔道，这显著的增强了纳米孔道的选择性。
本发明一些实施实例显示，在表征靶聚核苷酸时，N226Q/K238Q和T232K/K238Q突变型纳米孔道可以显著延长电流阻断信号的第二个台阶的阻断时间，对于野生型纳米孔道，第二个台阶的电流轨迹为尖刺形状，而N226Q/K238Q和T232K/K238Q可以通过两个台阶的特征性电流信号来协同表征待测物，显著增强了Aerolysin纳米孔道的分辨能力。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的仅为本发明的优选例，并不用来限制本发明，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
序列表
<110> 南京大学
<120> Aerolysin突变纳米孔及其在分子生物检测方面的应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 470
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Ala Glu Pro Val Tyr Pro Asp Gln Leu Arg Leu Phe Ser Leu Gly Gln
1 5 10 15
Gly Val Cys Gly Asp Lys Tyr Arg Pro Val Asn Arg Glu Glu Ala Gln
20 25 30
Ser Val Lys Ser Asn Ile Val Gly Met Met Gly Gln Trp Gln Ile Ser
35 40 45
Gly Leu Ala Asn Gly Trp Val Ile Met Gly Pro Gly Tyr Asn Gly Glu
50 55 60
Ile Lys Pro Gly Thr Ala Ser Asn Thr Trp Cys Tyr Pro Thr Asn Pro
65 70 75 80
Val Thr Gly Glu Ile Pro Thr Leu Ser Ala Leu Asp Ile Pro Asp Gly
85 90 95
Asp Glu Val Asp Val Gln Trp Arg Leu Val His Asp Ser Ala Asn Phe
100 105 110
Ile Lys Pro Thr Ser Tyr Leu Ala His Tyr Leu Gly Tyr Ala Trp Val
115 120 125
Gly Gly Asn His Ser Gln Tyr Val Gly Glu Asp Met Asp Val Thr Arg
130 135 140
Asp Gly Asp Gly Trp Val Ile Arg Gly Asn Asn Asp Gly Gly Cys Asp
145 150 155 160
Gly Tyr Arg Cys Gly Asp Lys Thr Ala Ile Lys Val Ser Asn Phe Ala
165 170 175
Tyr Asn Leu Asp Pro Asp Ser Phe Lys His Gly Asp Val Thr Gln Ser
180 185 190
Asp Arg Gln Leu Val Lys Thr Val Val Gly Trp Ala Val Asn Asp Ser
195 200 205
Asp Thr Pro Gln Ser Gly Tyr Asp Val Thr Leu Arg Tyr Asp Thr Ala
210 215 220
Thr Asn Trp Ser Lys Thr Asn Thr Tyr Gly Leu Ser Glu Lys Val Thr
225 230 235 240
Thr Lys Asn Lys Phe Lys Trp Pro Leu Val Gly Glu Thr Glu Leu Ser
245 250 255
Ile Glu Ile Ala Ala Asn Gln Ser Trp Ala Ser Gln Asn Gly Gly Ser
260 265 270
Thr Thr Thr Ser Leu Ser Gln Ser Val Arg Pro Thr Val Pro Ala Arg
275 280 285
Ser Lys Ile Pro Val Lys Ile Glu Leu Tyr Lys Ala Asp Ile Ser Tyr
290 295 300
Pro Tyr Glu Phe Lys Ala Asp Val Ser Tyr Asp Leu Thr Leu Ser Gly
305 310 315 320
Phe Leu Arg Trp Gly Gly Asn Ala Trp Tyr Thr His Pro Asp Asn Arg
325 330 335
Pro Asn Trp Asn His Thr Phe Val Ile Gly Pro Tyr Lys Asp Lys Ala
340 345 350
Ser Ser Ile Arg Tyr Gln Trp Asp Lys Arg Tyr Ile Pro Gly Glu Val
355 360 365
Lys Trp Trp Asp Trp Asn Trp Thr Ile Gln Gln Asn Gly Leu Ser Thr
370 375 380
Met Gln Asn Asn Leu Ala Arg Val Leu Arg Pro Val Arg Ala Gly Ile
385 390 395 400
Thr Gly Asp Phe Ser Ala Glu Ser Gln Phe Ala Gly Asn Ile Glu Ile
405 410 415
Gly Ala Pro Val Pro Leu Ala Ala Asp Ser Lys Val Arg Arg Ala Arg
420 425 430
Ser Val Asp Gly Ala Gly Gln Gly Leu Arg Leu Glu Ile Pro Leu Asp
435 440 445
Ala Gln Glu Leu Ser Gly Leu Gly Phe Asn Asn Val Ser Leu Ser Val
450 455 460
Thr Pro Ala Ala Asn Gln
465 470
<210> 2
<211> 1423
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggatccggca gaaccggttt atccggatca actgcgtctg tttagtctgg gtcaaggcgt 60
ttgcggcgat aaatatcgcc cggttaaccg cgaagaggca cagagcgtta aaagcaacat 120
tgtcggcatg atgggtcagt ggcaaatttc tgggctggca aacggttggg taattatggg 180
tccgggttac aacggcgaaa ttaaaccggg taccgcttct aacacctggt gttatccgac 240
caatccggtt accggcgaaa ttccgaccct gtctgcactg gatattccgg acggcgacga 300
agttgacgtt cagtggcgtc tggttcacga ttctgcaaac ttcatcaaac cgaccagcta 360
cctggcacat tatctgggtt acgcttgggt tggcggtaac catagccagt acgtcggcga 420
agatatggac gttacccgcg acggcgacgg ttgggttatt cgtggtaata acgacggggg 480
ttgcgacggt tatcgctgcg gggataaaac cgcgattaaa gtcagcaact tcgcgtacaa 540
cctggacccg gatagcttta aacacggcga cgttacccag agcgatcgtc agctggttaa 600
aaccgttgta ggttgggcag ttaacgatag cgataccccg caatctggtt acgacgttac 660
cctgcgttac gataccgcaa ccaactggag caaaaccaat acctacggtc tgagcgagaa 720
agtcaccacc aaaaacaaat tcaaatggcc gctggtcggc gaaaccgaac tgagtattga 780
aatcgcggca aatcagagct gggcatctca aaacggtggt agtaccacca ccagtctgag 840
tcagagcgtg cgtccgaccg ttccggcacg tagtaaaatc ccggtcaaaa tcgagctgta 900
caaagcggat atcagctacc cgtacgagtt caaagcggat gttagctacg atctgaccct 960
gtctggtttt ctgcgttggg gcggtaacgc ttggtatacc catccggata accgtccgaa 1020
ttggaaccat accttcgtca tcggcccgta caaagataaa gcgagctcta tccgctatca 1080
gtgggataaa cgctacattc cgggcgaagt caaatggtgg gattggaact ggaccattca 1140
gcagaacggt ctgagcacca tgcagaataa tctggcacgc gttctgcgtc cggttcgcgc 1200
tggtattacc ggcgattttt cagcggaaag ccagtttgcg ggtaatattg aaattggcgc 1260
accggttccg ctggcagcag attctaaagt tcgtcgtgca cgttctgttg acggcgctgg 1320
tcaaggtctg cgtctggaaa ttccgctgga cgctcaagaa ctgtcaggcc tgggctttaa 1380
caacgttagt ctgtctgtta ccccggcagc aaatcaaaag ctt 1423
Claims (6)
1.一种Aerolysin突变纳米孔，其特征在于，所述Aerolysin突变纳米孔由Aerolysin突变单体组成，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，且所述突变Aerolysin单体包含以下任意一个或其任意组合中相应位置氨基酸的取代：K238Q/C/E/G/N/R/F/Y、 R288D、D222R、N226Q/S228K/G270D、T232L/N226Q/S228K、T274L/N226Q/S228K、T230G/T232K/K238Q、S236C、S272K/N226W/G270F/E258H、N262S/S264Q/Q268T、S264Q、G270Q、S272Q、T274C、S278C、S276Y/C、S276C/S278C、T274L/N226Q/G270K, T274Q/N226Q/G270K、T210A，R104D，R397D、N226Q/S228K、N226Q/G270K、S228K/T232K/K238Q中。
2.根据权利要求1所述一种Aerolysin突变纳米孔，其特征在于所述Aerolysin突变单体还包含以下氨基酸取代中的一个或多个：R220A/C/K/Q、Q212N/E、N226S、N226Q/K238Q、、K238N/R/Y、R282Q、T232K/K238N。
3.根据权利要求1所述一种Aerolysin突变纳米孔，其特征在于所述Aerolysin突变单体还包含以下氨基酸取代中的一个或多个3.根据权力1和2权利要求中所述的突变单体，其中所述变异体包含以下取代中的一或多个：D209R、D209K、D209H、D209Q、D209G、D209C、D209E、D209F、Q212R、Q212K、Q212H、Q212D、Q212E、Q212G、Q212C、Q212F、T284R、T284K、T284H、T284D、T284E、T284Q、T284N、T284G、T284C、T284S、T284Y、T284F、P286R、P286K、P286H、P286D、P286V、P286C、P286G、P286Q、P286F、R288E、R288F、R288C、R288Q、R288S、D216E、D216R、D216K、D216H、D216F、D216C、D216G、D216Q、D216S、T218R、T218K、T218H、T218F、T218C、T218G、T218Q、T218E、T218D、T218Y、R220K、R220H、R220A、R220E、R220Q、D222K、D222R、D222H、D222E、D222A、D222Q、A224K、A224R、A224H、A224D、A224E、A224F、A224Q、A224T、A224Y、N226Q、N226R、N226H、N226E、N226C、N226A、N226Y、N226T、S228T、S228Y、S228R、S228H、S228F、S228A、S228C、S228Q、S228E、T230R、T230K、T230H、T230F、T230C、T230G、T230Q、T230E、T230D、T230Y、T232K、T232R、T232E、T232F、T232A、T232C、T232Q、T232Y、T232S、G234R、G234K、G234D、G234E、G234H、G234F、G234C、G234Q、G234S、G234Y、G234T、S236T、S236Y、S236R、S236H、S236F、S236A、S236C、S236Q、S236E、K238Q、K238C、K238E、K238G、K238N、K238R、K238F、K238Y、T240R、T240K、T240H、T240F、T240C、T240G、T240Q、T240E、T240D、T240Y、S256T、S256Y、S256R、S256H、S256F、S256A、S256C、S256Q、S256E、E258D、E258H、E258K、E258R、E258F、E258C、E258G、E258Q、E258S、E258Y、E258T、A260H、A260K、A260R、A260C、A260D、A260E、A260F、A260Q、A260T、A260Y、N262Q、N262R、N262H、N262E、N262C、N262A、N262Y、N262T、S264T、S264Y、S264R、S264H、S264F、S264A、S264C、S264Q、S264E、A266H、A266K、A266R、A266C、A266D、A266E、A266F、A266Q、A266T、A266Y、Q268R、Q268K、Q268H、Q268D、Q268E、Q268G、Q268C、Q268F、Q268S、Q268Y、Q268T、G270R、G270K、G270D、G270E、G270H、G270F、G270C、G270Q、G270S、G270Y、G270T、S272T、S272Y、S272R、S272H、S272F、S272A、S272C、S272Q、S272E、T274R、T274K、T274H、T274F、T274C、T274G、T274Q、T274E、T274D、T274Y、S276T、S276Y、S276R、S276H、S276F、S276A、S276C、S276Q、S276E、S278T、S278Y、S278R、S278H、S278F、S278A、S278C、S278Q、S278E、S280T、S280Y、S280R、S280H、S280F、S280A、S280C、S280Q、S280E、R282D、R282H、R282K、R282E、R282F、R282C、R282G、R282Q、R282S、R282Y、R282T、K242Q、K242C、K242E、K242G、K242N、K242R、K242F、K242Y、K242T、K244Q、K244C、K244E、K244G、K244N、K244R、K244F、K244Y、K244T、F245H、F245R、F245K、F245D、F245E、F245A、F245C、F245G、F245Q、F245S、F245Y、F245T、K246H、K246R、K246T、K246D、K246E、K246F、K246A、K246C、K246Q、K246S、K246Y、E252D、E252H、E252K、E252R、E252F、E252C、E252G、E252Q、E252S、E252Y、E252T、E254D、E254H、E254K、E254R、E254F、E254C、E254G、E254Q、E254S、E254Y、E254T、F308H、F308R、F308K、F308D、F308E、F308A、F308C、F308G、F308Q、F308S、F308Y、F308T、R397H、R397K、R397F、R397D、R397E、R397A、R397C、R397G、R397Q、R397S、R397Y、R397T。
4.权利要求1所述一种Aerolysin突变纳米孔在同源或异源寡聚孔方面的应用，其中同源或异源寡聚孔衍生自Aerolysin，且所述同源或异源寡聚孔包含至少一个前述Aerolysin突变单体。
5.权利要求1所述Aerolysin突变纳米孔在纳米孔道检测技术方面的应用，且用于检测的靶分析物为金属离子、无机盐、聚合物、氨基酸、肽、多肽、蛋白质、核苷酸、寡核苷酸、聚核苷酸、染料、漂白剂、药物、诊断剂、娱乐性药物、爆炸性或环境污染物中的一种或多种。
6.根据权利要求4所述Aerolysin突变纳米孔在纳米孔道检测技术方面的应用中，当所述靶分析物是靶聚核苷酸时，其具体步骤如下：
（a）使所述聚核苷酸与所述孔接触，使得所述聚核苷酸相对于所述孔移动；（b）在所述聚核苷酸相对于所述孔移动时，进行一或多个测量，其中所述测量指示所述聚核苷酸的一或多个特征，且从而表征所述靶聚核苷酸。
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-
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