CN112481302B

CN112481302B - Masp2基因人源化的非人动物的构建方法及应用

Info

Publication number: CN112481302B
Application number: CN202110157088.8A
Authority: CN
Inventors: 张译夫; 张赞; 王琳琳
Original assignee: Baccetus Beijing Pharmaceutical Technology Co ltd
Current assignee: Baccetus Beijing Pharmaceutical Technology Co ltd
Priority date: 2021-02-05
Filing date: 2021-02-05
Publication date: 2021-05-14
Anticipated expiration: 2041-02-05
Also published as: CN112481302A

Abstract

本发明提供了一种MASP2基因人源化的非人动物的构建方法，利用同源重组的方式将编码人MASP2蛋白的核苷酸序列导入非人动物基因组中，该动物体内能正常表达人源化MASP2蛋白，可以作为人MASP2信号机理研究、肿瘤及免疫相关疾病药物筛选的动物模型，对免疫靶点的新药研发具有重要的应用价值。本发明还提供了一种嵌合MASP2基因、一种MASP2基因的靶向载体及sgRNA，以及上述构建方法获得的非人动物及其在生物医药领域的应用。

Description

MASP2基因人源化的非人动物的构建方法及应用

技术领域

本发明属于动物基因工程和基因遗传修饰领域，具体地说，涉及一种MASP2基因改造非人动物模型的构建方法及其在生物医药领域的应用。

背景技术

补体系统由存在于人或脊椎动物血清、组织液以及细胞表面的一组被启动后具有酶活性的30多种蛋白质成分构成的复杂的网络结构，可通过经典途径、凝集素途径和替代途径这三条溶血途径启动，参与机体微生物防御反应以及免疫调节反应，是体内具有重要生物学作用的效应系统和效应放大系统。

甘露糖结合凝集素相关的丝氨酸蛋白酶2（Mannan binding lectin-associatedserine protease 2，MASP2）是补体凝集素溶血途径的重要一员，在启动补体凝集素溶血途径中发挥着至关重要的作用。其主要在肝脏中表达，在血浆中以酶原形式存在，在补体启动的凝集素途径中，MASP2与MBL（Mannan-Binding lectins）或纤维凝胶蛋白（ficolin）分子结合形成大分子复合物后发生构象变化，激活并裂解C4和C2，促进生成C3转化酶，进一步启动下游信号通路。MASP2的许多基因突变影响其血清含量变化，从而可能引发多种疾病。研究发现，在儿童恶性肿瘤患者应用化学治疗过程中，该蛋白缺乏是化疗并发感染的危险因素，它将增大导致发热与发生中性粒细胞减少症的危险；MASP2功能缺陷能够加速肺囊性纤维化；其表达与食管鳞状细胞癌、癌前病变组织和淋巴结转移等疾病进展以及肿瘤侵袭性密切相关；其蛋白表达水平是预测结直肠癌复发和存活时间的独立标志；该基因突变导致HCV感染性肝细胞癌发生的危险性增高。此外，MASP2还与自身免疫性疾并具有很大的关系，例如银屑病、遗传性血管性水肿等。

实验动物疾病模型对于研究人类疾病发生的病因、发病机制、开发防治技术和开发药物是不可缺少的研究工具。但由于动物与人类的生理结构和代谢系统本身的差异，传统的动物模型并不能很好的反映人体的真实状况，在动物体内建立更接近人类的生理特征的疾病模型是生物医药行业的迫切需求。

随着基因工程技术的不断发展和成熟，用人类基因替代或置换动物的同源性基因已经实现，通过这种方式开发人源化实验动物模型是动物模型未来的发展方向。其中基因人源化动物模型，即利用基因编辑技术，用人源正常或突变基因替换动物基因组的同源基因，可建立更接近人类生理或疾病特征的正常或突变基因动物模型。基因人源化动物不但本身具有重要应用价值，如通过基因人源化可改进和提升细胞或组织移植人源化动物模型，更重要的是，由于人类基因片段的插入，动物体内可表达或部分表达人源蛋白，可作为仅能识别人蛋白序列的药物的靶点，为在动物水平进行抗人抗体及其它药物的筛选提供了可能。然而，由于动物与人类在生理学及病理学方面存在差异，加上基因的复杂性，如何能构建出“有效”的人源化动物模型用于新药研发仍是最大的挑战。

鉴于MASP2在肿瘤及自身免疫性疾病等治疗领域的巨大应用价值，为进一步探索其相关生物学特性，提高临床前期药效试验的有效性，提高研发成功率，使临床前期的试验更有效并使研发失败最小化，本领域急需开发MASP2相关信号通路的非人动物模型。此外，本方法得到的非人动物还可与其它基因人源化非人动物交配得到多基因人源化动物模型，用于筛选和评估针对该信号通路的人用药及联合用药的药效研究。本发明在学术和临床研究中具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明的第一方面，提供了一种MASP2基因人源化的非人动物的构建方法，所述的非人动物的基因组中包括人MASP2基因的全部或部分。优选的，包括人MASP2基因的1号至11号外显子中的任一个或两个以上的组合。进一步优选的，包括人MASP2基因的1号外显子的部分、2号至10号外显子的全部和11号外显子的部分，优选还包含1-2号内含子和/或10-11号内含子，其中，1号外显子的部分至少包含1号外显子中编码第2个氨基酸的核苷酸序列，11号外显子的部分至少包含11号外显子中编码人MASP2蛋白氨基酸的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的非人动物的基因组中包括编码人MASP2蛋白的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的非人动物的基因组中包括编码SEQ IDNO：2第2至686位的核苷酸序列。优选还包含终止密码子。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的非人动物的基因组中包括SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。

优选的，所述的构建方法包括用包含人MASP2基因的1号至11号外显子的全部或部分插入或替换至非人动物MASP2基因座。进一步优选包括用包含人MASP2基因的1号至11号外显子中的一个或两个以上的组合插入或替换至非人动物MASP2基因座。更进一步优选包括用包含人MASP2基因的1号外显子的部分、2号至10号外显子的全部和11号外显子的部分插入或替换至非人动物MASP2基因座。

优选的，所述的构建方法包括用包含编码人MASP2蛋白的核苷酸序列插入或替换至非人动物MASP2基因座。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括用包含编码SEQ ID NO：2第2至686位的核苷酸序列插入至非人动物MASP2基因座。其中，所述的插入序列还包含终止密码子。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括用包含SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列插入至非人动物MASP2基因座。

优选的，所述插入的序列还包含非人动物MASP2。

优选的，所述的插入的序列还包含辅助序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的辅助序列为STOP序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述插入的序列为嵌合MASP2基因的核苷酸序列，所述的嵌合MASP2基因从5’-3’依次包含人MASP2、非人动物MASP2以及STOP序列，其中，人MASP2的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，非人动物MASP2的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，STOP序列如SEQ ID NO：7所示。

优选的，所述的非人动物为小鼠或大鼠。

优选的，所述的非人动物表达人或人源化MASP2蛋白。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化MASP2蛋白包含SEQ ID NO：2第2-686位所示的氨基酸序列，或者，包含与SEQ ID NO：2第2-686位具有60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%同一性的氨基酸序列，或者，包含与SEQ ID NO：2第2-686位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸，或者，包含具有SEQ ID NO：2第2-686位所示的包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。

优选的，所述非人动物内源MASP2蛋白的表达降低或缺失。

优选的，所述的替换为相应位置的替换。所述的相应位置即为人和鼠相比，发挥相同功能的氨基酸或者核苷酸序列。

优选的，所述的插入至非人动物MASP2基因座为插入非人动物MASP2基因内源调控元件之后。进一步优选为非人动物MASP2基因的1号至11号外显子区域上的任一个核苷酸前后或任一段核苷酸序列之间。更进一步优选的，所述的插入至非人动物MASP2基因座为插入非人动物1号外显子上。

优选的，所述的插入之前还包含破坏非人动物MASP2基因编码框的步骤或者所述插入步骤即可导致非人动物MASP2蛋白不表达。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的插入至非人动物MASP2基因座为插入非人动物MASP2的编码第1个氨基酸的核苷酸序列与第2个氨基酸的核苷酸序列之间，或者插入非人动物MASP2基因1号外显子的第45bp与第46bp之间。

优选的，所述的人MASP2基因、编码人MASP2蛋白的核苷酸序列或者嵌合MASP2基因通过非人动物内源MASP2调控元件调控。其中，调控元件优选为MASP2启动子。

本发明使用基因编辑技术进行MASP2基因人源化的非人动物的构建，所述基因编辑技术包括利用胚胎干细胞的基因打靶技术、CRISPR/Cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术。

在本发明的一个具体实施方式中，使用靶向载体进行非人动物的构建。

其中，所述的靶向载体包含人MASP2基因的1号至11号外显子的全部或部分。优选包含1号至11号外显子中的任一个或两个以上的组合。进一步优选包含人MASP2基因的1号外显子的部分、2号至10号外显子的全部和11号外显子的部分，优选还包含1-2号内含子和/或10-11号内含子。

所述的靶向载体包含编码人MASP2蛋白的核苷酸序列。优选可以为基因组DNA、cDNA或CDS序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体包含编码SEQ ID NO：2第2至686位的核苷酸序列或包含SEQ ID NO：5所示核苷酸序列。

所述的靶向载体还包含5’臂和/或3’臂。

其中，所述的5’臂为与待改变的转换区5’端同源的DNA片段。优选的，其选自与NCBI登录号为NC_000070.7至少具有90%同源性的核苷酸。进一步优选的，其长度为1000-2000bp。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的5’臂的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

所述的3’臂为与待改变的转换区3’端同源的DNA片段。优选的，其选自与NCBI登录号为NC_000070.7至少具有90%同源性的核苷酸。进一步优选的，其长度为1000-2000bp。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的3’臂的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

优选的，所述的待改变的转换区位于非人动物MASP2基因的1号至11号外显子上。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将上述靶向载体导入非人动物细胞中，培养该细胞（优选为胚胎干细胞），然后将培养后的细胞移植至雌性非人动物输卵管内，允许其发育，鉴定筛选获得MASP2基因人源化的非人动物。

在本发明的另一个具体实施方式中，使用sgRNA进行非人动物的构建。

所述的sgRNA靶向非人动物MASP2基因的1号外显子。

所述的sgRNA在MASP2基因上的靶位点序列如SEQ ID NO：8-13任一项所示。

在本发明的一个具体实施方式中，使用靶向载体和sgRNA进行非人动物的构建。

本发明的第二方面，提供了一种上述构建方法获得的MASP2基因人源化的非人动物。

本发明的第三方面，提供了一种MASP2基因缺失的非人动物的构建方法，所述的非人动物缺失MASP2基因的全部或部分。优选缺失MASP2基因的1号至11号外显子。进一步优选缺失1号外显子的部分、2号至10号外显子的全部和11号外显子的部分。

本发明的第四方面，提供了一种上述构建方法获得的MASP2基因缺失的非人动物。

本发明的第五方面，提供了一种MASP2基因缺失的细胞、组织或器官，所述的细胞、组织或器官采用上述MASP2基因缺失的非人动物的构建方法获得，或者，上述的细胞、组织或器官来源于上述构建的MASP2基因缺失的非人动物。

本发明的第六方面，提供了一种MASP2基因的靶向载体，所述的靶向载体包含人MASP2基因的1号至11号外显子的全部或部分。优选包含1号至11号外显子中的任一个或两个以上的组合。进一步优选包含人MASP2基因的1号外显子的部分、2号至10号外显子的全部和11号外显子的部分，优选还包含1-2号内含子和/或10-11号内含子。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体包含上述的嵌合MASP2基因。

所述的靶向载体还包含5’臂和/或3’臂。

优选的，所述的靶向载体还包含可选择的基因标记。

优选的，所述标记基因为负筛选标记的编码基因。进一步优选的，所述负筛选标记的编码基因为白喉毒素A亚基的编码基因（DTA）。

优选的，所述靶向载体还包括阳性克隆筛选的抗性基因。进一步优选的，所述阳性克隆筛选的抗性基因为新霉素磷酸转移酶编码序列Neo。

优选的，所述靶向载体还包括特异性重组系统。进一步优选的，所述特异性重组系统为Frt重组位点(也可选择常规的LoxP重组系统)。所述的特异性重组系统为2个，分别装在抗性基因的两侧。

本发明的第七方面，提供了一种sgRNA，所述的sgRNA靶向非人动物MASP2基因的1号外显子。

优选的，所述的sgRNA在MASP2基因上的靶位点序列如SEQ ID NO：8-13任一项所示。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的sgRNA在MASP2基因上的靶位点序列如SEQ ID NO：12所示。

本发明的第八方面，提供了一种编码上述sgRNA的DNA分子。优选的，所述的

DNA分子双链分别为上述sgRNA的上下游序列，或者加入酶切位点后的正反向寡核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的DNA分子双链分别为SEQ ID NO:14和SEQID NO:16，SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:17。

本发明的第九方面，提供了一种sgRNA载体，所述的sgRNA载体包含上述的sgRNA。

本发明的第十方面，提供了一种包含上述靶向载体、上述的sgRNA、上述的DNA分子或上述的sgRNA载体的细胞。

本发明的第十一方面，提供了一种上述的靶向载体、上述的sgRNA、上述的DNA分子、上述的sgRNA载体或上述的细胞在MASP2基因编辑中的应用。优选，所述的应该包括在敲除、插入或替换MASP2基因中的应用。

本发明的第十二方面，提供了一种多基因修饰的非人动物的构建方法，包括如下步骤：

I）提供上述的MASP2基因人源化的非人动物或MASP2基因缺失的非人动物，或者采用上述的构建方法获得的MASP2基因人源化的非人动物；

II）将步骤I）提供的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外受精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物。

优选的，所述的其他基因修饰的非人动物包括但不限于基因PD-1、PD-L1、IL4、IL4R、IL6、IL6R或IL17修饰的非人动物。

优选的，所述的多基因修饰的非人动物为双基因修饰非人动物、三基因修饰非人动物、四基因修饰非人动物、五基因修饰非人动物、六基因修饰非人动物、七基因修饰非人动物、八基因修饰非人动物或九基因修饰非人动物。

优选的，所述的多基因修饰的非人动物的基因组中修饰的多个基因中的每一个基因均可以是纯合或杂合的。

本发明的第十三方面，提供了一种上述的构建方法获得的多基因修饰的非人动物。

本发明的第十四方面，提供了一种动物的疾病模型，所述的动物的疾病模型来源于上述的非人动物或者上述方法获得的非人动物。

本发明的第十五方面，提供了一种上述构建方法获得的MASP2基因人源化的非人动物、上述的构建方法获得的MASP2基因缺失的非人动物或上述的非人动物在制备动物的疾病模型中的应用。优选的，所述的疾病模型可以为肿瘤、炎症、免疫相关疾病、细菌或病毒感染。

本发明的第十六方面，提供了一种上述构建方法获得的MASP2基因人源化的非人动物、上述的构建方法获得的MASP2基因缺失的非人动物、上述的非人动物或上述动物的疾病模型在制备治疗肿瘤、炎症、免疫相关疾病、细菌或病毒感染的药物中的应用。

本发明的第十七方面，提供了一种上述构建方法获得的MASP2基因人源化的非人动物、上述的构建方法获得的MASP2基因缺失的非人动物、上述的非人动物或上述动物的疾病模型在制备治疗MASP依赖性补体介导的与缺血-再灌注损伤相关的疾病的药物中的应用。

本发明的第十八方面，提供了一种细胞或细胞系或原代细胞培养物，所述细胞或细胞系或原代细胞培养物来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代或者上述的疾病模型。

本发明的第十九方面，提供了一种组织或器官或其培养物，所述组织或器官或其培养物来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代或者上述的疾病模型。

本发明的第二十方面，提供了一种荷瘤后的瘤组织，所述的瘤组织来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代，或者上述的疾病模型。

本发明的第二十一方面，提供了一种嵌合MASP2基因，所述的嵌合MASP2基因从5’-3’依次包含人MASP2、非人动物MASP2以及STOP序列，其中，人MASP2的核苷酸序列如SEQ IDNO：5所示，非人动物MASP2的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，STOP序列如SEQ ID NO：7所示。

优选的，所述的非人动物为小鼠或大鼠。

本发明的第二十二方面，提供了一种上述嵌合MASP2基因编码的人源化MASP2蛋白。

本发明的第二十三方面，提供了一种包含上述嵌合MASP2基因的构建体。

本发明的第二十四方面，提供了一种包含上述构建体的细胞。

本发明的第二十五方面，提供了一种包含上述细胞的组织。

本发明的第二十六方面，提供了一种上述MASP2基因人源化的细胞，所述的细胞包含人MASP2基因的全部或部分。

优选的，包括人MASP2基因的1号至11号外显子中的任一个或两个以上的组合。进一步优选的，包括人MASP2基因的1号外显子的部分、2号至10号外显子的全部和11号外显子的部分，优选还包含1-2号内含子和/或10-11号内含子，其中，1号外显子的部分至少包含1号外显子中编码第2个氨基酸的核苷酸序列，11号外显子的部分至少包含11号外显子中编码人MASP2蛋白氨基酸的核苷酸序列。

优选的，包括编码人MASP2蛋白的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的细胞包含上述嵌合MASP2基因。

优选的，所述的细胞表达人或人源化MASP2蛋白。

优选的，所述的细胞中内源MASP2蛋白表达降低或缺失。

本发明的第二十七方面，提供了一种上述的构建方法获得的MASP2基因人源化的非人动物、上述的嵌合MASP2基因的应用，所述的应用为非疾病诊断、非疾病治疗目的，所述的应用包括：

A）涉及人类细胞的与MASP2相关的免疫过程的产品开发中的应用；

B）作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的与MASP2相关的模型系统中的应用；

C）涉及生产和利用动物实验疾病模型用于与MASP2相关的病原学研究和/或用于开发诊断策略和/或用于开发治疗策略中的应用；

D）在体内研究人MASP2信号通路调节剂的筛选、药效检测、评估疗效、验证或评价中的应用；或者，

E）研究MASP2基因功能，研究针对人MASP2靶位点的药物、药效，研究与MASP相关的免疫相关疾病药物以及抗肿瘤药物方面的应用。

本发明所述的“肿瘤”包括但不限于淋巴瘤、B细胞肿瘤、T细胞肿瘤、骨髓/单核细胞肿瘤、非小细胞肺癌、白血病、卵巢癌、鼻咽癌、乳腺癌、子宫内膜癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、膀胱癌、肺癌、支气管癌、骨癌、前列腺癌、胰腺癌、肝和胆管癌、食管癌、肾癌、甲状腺癌、头颈部癌、睾丸癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤、骨髓增生异常综合征、以及肉瘤。其中，所述的白血病选自急性淋巴细胞性（成淋巴细胞性）白血病、急性骨髓性白血病、髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、以及慢性骨髓性白血病；所述淋巴瘤选自霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，包括B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；所述肉瘤选自骨肉瘤、尤文肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、软组织肉瘤、血管肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、及软骨肉瘤。在本发明的一个具体实施方式中，所述的肿瘤选自食管鳞状细胞癌、癌前病变组织和淋巴结转移、直肠癌。

本发明所述的“免疫相关疾病”包括但不限于过敏、哮喘、心肌炎、肾炎、肝炎、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、硬皮病、甲状腺功能亢进、原发性血小板减少性紫癜、自身免疫性溶血性贫血、溃疡性结肠炎、自身免疫性肝病、糖尿病、疼痛或神经障碍等。在本发明的一个具体实施方式中，所述的免疫相关疾病选自银屑病、遗传性血管性水肿

本发明所述的“炎症”包括急性炎症，也包括慢性炎症。具体的，包括但不限于变质性炎症、渗出性炎症（浆液性炎、纤维素性炎、化脓性炎、出血性炎、坏死性炎、卡他性炎）、增生性炎症、特异性炎症（结核、梅毒、麻疯、淋巴肉芽肿等）。

本发明所述的“人源化MASP2蛋白”，包含来源于人MASP2蛋白的部分和非人MASP2蛋白的部分。

本发明所述的“嵌合MASP2基因”包含来源于人MASP2基因的部分和非人MASP2基因的部分。

本发明所述的“包含”或“包括”为开放式写法，当在本申请中用于描述蛋白质或核酸的序列时，所述蛋白质或核酸可以是由所述序列组成，或者在所述蛋白质或核酸的一端或两端可以具有额外的氨基酸或核苷酸，但仍然具有本发明所述的活性。

本发明所述的“xx号至xx号外显子”或者“xx号外显子至xx号外显子”包含外显子及其期间的内含子。例如“1号至11号外显子”包含1号外显子、1-2号内含子、2号外显子、2-3号内含子、3号外显子、3-4号内含子、4号外显子、4-5号内含子、5号外显子、5-6号内含子、6号外显子、6-7号内含子、7号外显子、7-8号内含子、8号外显子、8-9号内含子、9号外显子、9-10号内含子、10号外显子、10-11号内含子、11号外显子的核苷酸序列。

本发明所述的“x-xx号内含子”表示x号外显子至xx号外显子之间的内含子。例如“2-3号内含子”表示2号外显子至3号外显子之间的内含子。

本发明所述的“基因座”广义上讲代表基因在染色体上所占的位置，狭义上讲代表某一基因上的一段DNA片段，即可以是一个基因也可以是一个基因的一部分。例如所述的“MASP2基因座”表示MASP2基因上的任选一段的DNA片段。

本发明所述的“核苷酸序列”包含天然的或经过修饰的核糖核苷酸序列、脱氧核糖核苷酸序列。优选为DNA、cDNA、pre-mRNA、mRNA、rRNA、hnRNA、miRNAs、scRNA、snRNA、siRNA、sgRNA、tRNA。

本发明所述“治疗（treating）”（或“治疗（treat）”或“治疗（treatment）”）表示减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性，但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除。术语“治疗（treating）”等是指在疾病已开始发展后改善疾病或病理状态的体征、症状等等的治疗干预。

本发明所述“同源性”，是指在使用氨基酸序列或核苷酸序列的方面，本领域技术人员在保证与已知序列相似结构或功能的前提下，可以根据实际工作需要对序列进行调整，使使用序列与现有技术获得的序列相比，具有（包括但不限于）1%，2%，3%，4%，5%，6%，7%，8%，9%，10%，11%，12%，13%，14%，15%，16%，17%，18%，19%，20%，21%，22%，23%，24%，25%，26%，27%，28%，29%，30%，31%，32%，33%，34%，35%，36%，37%，38%，39%，40%，41%，42%，43%，44%，45%，46%，47%，48%，49%，50%，51%，52%，53%，54%，55%，56%，57%，58%，59%，60%，70%，80%，81%，82%，83%，84%，85%，86%，87%，88%，89%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%，99.1%，99.2%，99.3%，99.4%，99.5%，99.6%，99.7%，99.8%，99.9%的同一性。

本领域的技术人员能够确定并比较序列元件或同一性程度，以区分另外的小鼠和人序列。

在一个方面，所述非人动物是哺乳动物，优选啮齿类动物、猪、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人哺乳动物。在一个方面，所述非人动物是小型哺乳动物，例如跳鼠科。在一个实施方式中，所述基因人源化的非人动物是啮齿动物。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自鼠家族。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物来自丽仓鼠科（例如小鼠样仓鼠）、仓鼠科（例如仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠）、鼠总科（真小鼠和大鼠、沙鼠、刺毛鼠、冠毛大鼠)、马岛鼠科（登山小鼠、岩小鼠、有尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠）、刺睡鼠科（例如多刺睡鼠）和鼹形鼠科（例如摩尔大鼠、竹大鼠和鼢鼠）家族。在一个特定实施方式中，所述基因修饰的啮齿动物选自真小鼠或大鼠（鼠总科）、沙鼠、刺毛鼠和冠毛大鼠。在一个实施方式中，所述基因修饰的小鼠来自鼠科家族成员。在一个实施方式中，所述动物是啮齿动物。在一个特定实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠和大鼠。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠。

在一个特定实施方式中，所述非人动物是啮齿动物，其为选自BALB/c、A、A/He、A/J、A/WySN、AKR、AKR/A、AKR/J、AKR/N、TA1、TA2、RF、SWR、C3H、C57BR、SJL、C57L、DBA/2、KM、NIH、ICR、CFW、FACA、C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、 C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr和C57BL/Ola的C57BL、C58、CBA/Br、CBA/Ca、CBA/J、CBA/st、CBA/H品系的小鼠。

除非特别说明，本发明的实践将采取细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的传统技术。这些技术在以下文献中进行了详细的解释。例如：Molecular Cloning A Laboratory Manual，2ndEd.，ed. By Sambrook，FritschandManiatis(Cold Spring Harbor Laboratory Press：1989)；DNA Cloning，Volumes I and II (D.N.Glovered.，1985)；Oligonucleotide Synthesis (M.J.Gaited.，1984)；Mullisetal. U.S. Pat.No.4，683，195；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames& S.J.Higginseds.1984)；Transcription And Translation (B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Culture Of Animal Cells (R.I.Freshney，AlanR.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press，1986)；B.Perbal，A PracticalGuide To Molecular Cloning(1984)；the series，Methods In ENZYMOLOGY (J.Abelsonand M.Simon，eds.-in-chief，Academic Press，Inc.，New York)，specifically，Vols.154 and 155 (Wuetal.eds.) and Vol.185，″Gene Expression Technology″(D.Goeddel，ed.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J.H.Miller andM.P.Caloseds.，1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods InCell And Molecular Biology (Mayer and Walker，eds.，Academic Press，London，1987)；Handbook Of Experimental Immunology，Volumes V (D.M.Weir andC.C.Blackwell，eds.，1986)；and Manipulating the Mouse Embryo，(Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。

以上只是概括了本发明的一些方面，不是也不应该认为是在任何方面限制本发明。

本说明书提到的所有专利和出版物都是通过参考文献作为整体而引入本发明的。本领域的技术人员应认识到，对本发明可作某些改变并不偏离本发明的构思或范围。

下面的实施例进一步详细说明本发明，不能认为是限制本发明或本发明所说明的具体方法的范围。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：

图1：小鼠MASP2基因和人MASP2基因座对比示意图（非按比例）；

图2：小鼠MASP2基因人源化改造示意图（非按比例）；

图3：MASP2基因打靶策略及靶向载体设计示意图（非按比例）；

图4：Cas9/sgRNA活性检测结果，其中Con为空白对照，PC为阳性对照；

图5：F0代小鼠基因型鉴定结果，其中WT为野生型对照，H₂O为水对照；

图6：F1代小鼠基因型鉴定结果，其中M为Marker，WT为野生型对照，PC为阳性对照，H₂O为水对照；

图7：Southern blot检测结果，其中WT为野生型对照；

图8：ELISA检测结果，其中WT为野生型C57BL/6小鼠，MASP2(+/-)为MASP2基因人源化杂合子小鼠，mMASP2为鼠MASP2（图8A），hMASP2为人MASP2（图8B）。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

在下述每一实施例中，设备和材料是从以下所指出的几家公司获得：

BbsI、BglII、EcoRV酶购自NEB，货号分别为R0539L、R0144M、R0195M；

C57BL/6小鼠购自中国食品药品检定研究院国家啮齿类实验动物种子中心；

Ambion体外转录试剂盒购自Ambion，货号AM1354；

Cas9mRNA来源SIGMA，货号CAS9MRNA-1EA；

UCA试剂盒来源百奥赛图公司，货号BCG-DX-001；

Mouse MASP2 ELISA Kit购自MyBioSource，货号MBS9428247；

Human MASP2 ELISA Kit购自MyBioSource，货号MBS2883949。

实施例1 MASP2基因人源化小鼠

小鼠MASP2基因（NCBI Gene ID：17175，Primary source：MGI：1330832，UniProt：Q91WP0，位于4号染色体NC_000070.7的第148679079至148699939位，基于转录本NM_001003893.2及其编码蛋白NP_001003893.1（SEQ ID NO：1））和人MASP2基因（NCBI GeneID：10747，Primary source：HGNC:6902，UniProt ID：O00187，位于1号染色体NC_000001.11的第11026523至11047239位，基于转录本NM_006610.4及其编码蛋白NP_006601.2（SEQ IDNO：2））对比示意图如图1所示。

为了达到本发明的目的，可在小鼠内源MASP2基因座引入编码人MASP2蛋白的核苷酸序列，使得该小鼠表达人或人源化MASP2蛋白。具体来说，用基因编辑技术，在小鼠MASP2基因调节元件的控制下，插入包含人MASP2编码基因和小鼠3’UTR及下游部分序列的核苷酸序列，并在小鼠序列后插入STOP序列，得到人源化MASP2基因座示意图如图2所示，实现对小鼠MASP2基因的人源化改造。

引入CRISPR/Cas系统进行基因编辑，设计如图3所示的打靶策略，图3中显示了靶向载体上含有小鼠MASP2基因上游和下游的同源臂序列，以及包含人MASP2序列的A片段。其中，上游同源臂序列（5’同源臂，SEQ ID NO：3）与NCBI登录号为NC_000070.7的第148685564至148687045位核苷酸序列相同，下游同源臂序列（3’同源臂，SEQ ID NO：4）与NCBI登录号为NC_000070.7的第148687046至148688504位核苷酸序列具有99.9%的同源性，区别在于第148687192位上C替换为G；A片段上人MASP2、鼠MASP2以及STOP序列按照5’-3’顺序依次排列，其中，人MASP2的核苷酸序列（SEQ ID NO：5）与NCBI登录号为NM_006610.4的第36至2093位核苷酸序列相同，鼠MASP2的序列如SEQ ID NO：6所示，STOP序列如SEQ ID NO：7所示。

鉴于人MASP2和鼠MASP2具有多种亚型或转录本，本文所述的方法可应用于其它亚型或转录本。

靶向载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接、直接合成等。构建好的靶向载体通过酶切进行初步验证后，再送测序公司进行测序验证。将测序验证正确的靶向载体用于后续实验。

靶序列决定了sgRNA的靶向特异性和诱导Cas9切割目的基因的效率。因此，高效特异的靶序列选择和设计是构建sgRNA表达载体的前提。设计并合成识别靶位点的sgRNA序列，各sgRNA在MASP2基因上的靶位点序列如下：

sgRNA1靶位点（SEQ ID NO：8）：5’-TAGGTGGCACACCATGAGGTGGG-3’

sgRNA2靶位点（SEQ ID NO：9）：5’-CTAGGTGGCACACCATGAGGTGG-3’

sgRNA3靶位点（SEQ ID NO：10）：5’-AGTTTGGTGGCCACACTTCTGGG-3’

sgRNA4靶位点（SEQ ID NO：11）：5’-GAGTTTGGTGGCCACACTTCTGG-3’

sgRNA5靶位点（SEQ ID NO：12）：5’-GACACCAGGCGCCCGAATACAGG-3’

sgRNA6靶位点（SEQ ID NO：13）：5’-GATGGTCAGCATACTTCTCTGGG-3’

利用UCA试剂盒检测多个sgRNA的活性，从结果可见sgRNA具有不同活性，检测结果见图4。从中选择sgRNA5进行后续实验。在其5’端及互补链上分别加上酶切位点得到正向寡核苷酸和反向寡核苷酸序列（见表1），退火后将退火产物连接至pT7-sgRNA质粒（质粒先用BbsI线性化），获得表达载体pT7-MASP2-5。

表1 sgRNA5序列列表

pT7-sgRNA载体由质粒合成公司合成含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA（SEQ ID NO：18）并依次通过酶切（EcoRI及BamHI）连接至骨架载体（来源Takara，货号3299）上，经专业测序公司测序验证，结果表明获得了目的质粒。

取小鼠的原核期受精卵，例如C57BL/6小鼠，利用显微注射仪将pT7-MASP2-5质粒的体外转录产物（使用Ambion体外转录试剂盒，按照说明书方法进行转录）、靶向载体与Cas9 mRNA预混好后注射至小鼠受精卵细胞质或细胞核中。按照《小鼠胚胎操作实验手册（第三版）》（安德拉斯・纳吉，化学工业出版社，2006）中的方法进行受精卵的显微注射，注射后的受精卵转移至培养液中短暂培养，然后移植至受体母鼠的输卵管中发育，将获得的小鼠（F0代）通过杂交和自交，扩大种群数量，建立稳定的MASP2基因突变小鼠品系。

可通过常规检测方法（如PCR分析）鉴定F0代小鼠体细胞的基因型，部分F0代小鼠的鉴定结果见图5。结合5’端引物检测结果和3’端引物检测结果，经测序进一步验证图5中编号为F0-01到F0-05的5只小鼠均为阳性小鼠。PCR分析包括下述引物：

5’端引物：

L-GT-F（SEQ ID NO：19）：5’-CTCCTCACCAGAAGGGAGAAGTCCA-3’

L-GT-R（SEQ ID NO：20）：5’-TGTTGAGAGTCAGCAGTAGCCTCAT-3’

3’端引物：

R-GT-F（SEQ ID NO：21）：5’-TGCCATCGATCCATCTACCACCAGA-3’

R-GT-R（SEQ ID NO：22）：5’-AGAGACACACAGCCACAGTGGAAAC-3’

其中，引物L-GT-F位置位于5’同源臂左侧，R-GT-R位于3’同源臂右侧，L-GT-R和R-GT-F均位于A片段上。

将F0鉴定为阳性的MASP2基因人源化小鼠与野生型小鼠交配得到F1代小鼠。可使用同样的PCR方法对F1代小鼠进行基因型鉴定，示例性检测结果见图6，显示编号为F1-01到F1-02的2只小鼠为阳性小鼠。

PCR检测引物序列包括：

WT-F（SEQ ID NO：23）：5’-CTCTCAGAGCCACCGAACCGAACC-3’，

WT-R（SEQ ID NO：24）：5’-ATACTTCTCTGGGAAGCCAGGGGAC-3’；

Mut-F（SEQ ID NO：25）：5’-TCCACACAGGCATAGAGTGTCTGCT-3’

对这2只F1代PCR鉴定为阳性的小鼠进行Southern blot检测，确认是否存在随机插入。剪取鼠尾提取基因组DNA，选用EcoRV酶或BglII酶消化基因组，转膜，杂交。5’探针和3’探针分别位于A片段序列上及3’同源臂外侧，具体探针及目的片段的长度见表2。Southern blot检测结果见图7，综合3’探针和5’探针的结果表明，2只小鼠均无随机插入，证实这2只小鼠为阳性杂合小鼠且不存在随机插入。这表明使用本方法能构建出可稳定传代，且无随机插入的MASP2基因人源化的基因工程小鼠。

表2具体探针及目的片段的长度

探针合成引物如下：

5’ Probe-F（SEQ ID NO：26）：5’-AACTGATGAATGGGAGCAGTGGTGG-3’

5’ Probe-R（SEQ ID NO：27）：5’-GCAGACACTCTATGCCTGTGTGGAG-3’

3’ Probe-F（SEQ ID NO：28）：5’-TTCCACTGTGGCTGTGTGTCTCTTG-3’

3’ Probe-R（SEQ ID NO：29）：5’-CTCGGTACTGCCCTCCTTTTGGAAG-3’

将F1代鉴定为阳性的杂合小鼠相互交配，获得F2代MASP2基因人源化纯合子小鼠。

可通过常规检测方法确认阳性小鼠体内人MASP2蛋白的表达情况，例如使用ELISA方法等。具体来说，分别选取8周龄野生型C57BL/6雌性小鼠和本实施例制备的MASP2基因人源化杂合子小鼠各4只，脱颈安乐死后取血清，稀释4倍后分别按照Mouse MASP2 ELISA Kit和Human MASP2 ELISA Kit说明书操作进行检测，检测结果如图8所示。从图中可以看出，在野生型C57BL/6小鼠体内仅能检测出鼠MASP2蛋白的表达（图8A），检测不到人MASP2蛋白的表达（图8B）；在MASP2基因人源化杂合子小鼠体内既能检测到鼠MASP2蛋白的表达（图8A），也能检测到人MASP2蛋白的表达（图8B）。

实施例2 双重人源化或多重双人源化小鼠的制备

利用本方法或制得的MASP2基因人源化小鼠还可以制备双人源化或多人源化小鼠模型。如，前述实施例1中，囊胚显微注射使用的胚胎干细胞可选择来源于含有PD-1、PD-L1、IL4、IL4R、IL6、IL6R、IL17等其它基因修饰的小鼠，或者，也可在人源化MASP2小鼠的基础上，利用分离小鼠ES胚胎干细胞和基因重组打靶技术，获得MASP2与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的小鼠模型。也可将本方法得到的MASP2小鼠纯合子或杂合子与其它基因修饰的纯合或杂合小鼠交配，对其后代进行筛选，根据孟德尔遗传规律，可有一定机率得到人源化MASP2与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的杂合小鼠，再将杂合子相互交配可以得到双基因或多基因修饰的纯合子，利用这些双基因或多基因修饰的小鼠可以进行靶向人MASP2和其它基因调节剂的体内药效验证等。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

序列表

<110> 百奥赛图（北京）医药科技股份有限公司

<120> MASP2基因人源化的非人动物的构建方法及应用

<130> 1

<160> 29

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 685

<212> PRT

<213> 小鼠(Mouse)

<400> 1

Met Arg Leu Leu Ile Phe Leu Gly Leu Leu Trp Ser Leu Val Ala Thr

1 5 10 15

Leu Leu Gly Ser Lys Trp Pro Glu Pro Val Phe Gly Arg Leu Val Ser

20 25 30

Pro Gly Phe Pro Glu Lys Tyr Ala Asp His Gln Asp Arg Ser Trp Thr

35 40 45

Leu Thr Ala Pro Pro Gly Tyr Arg Leu Arg Leu Tyr Phe Thr His Phe

50 55 60

Asp Leu Glu Leu Ser Tyr Arg Cys Glu Tyr Asp Phe Val Lys Leu Ser

65 70 75 80

Ser Gly Thr Lys Val Leu Ala Thr Leu Cys Gly Gln Glu Ser Thr Asp

85 90 95

Thr Glu Gln Ala Pro Gly Asn Asp Thr Phe Tyr Ser Leu Gly Pro Ser

100 105 110

Leu Lys Val Thr Phe His Ser Asp Tyr Ser Asn Glu Lys Pro Phe Thr

115 120 125

Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Ala Ala Glu Asp Val Asp Glu Cys Arg Val

130 135 140

Ser Leu Gly Asp Ser Val Pro Cys Asp His Tyr Cys His Asn Tyr Leu

145 150 155 160

Gly Gly Tyr Tyr Cys Ser Cys Arg Ala Gly Tyr Val Leu His Gln Asn

165 170 175

Lys His Thr Cys Ser Ala Leu Cys Ser Gly Gln Val Phe Thr Gly Arg

180 185 190

Ser Gly Tyr Leu Ser Ser Pro Glu Tyr Pro Gln Pro Tyr Pro Lys Leu

195 200 205

Ser Ser Cys Thr Tyr Ser Ile Arg Leu Glu Asp Gly Phe Ser Val Ile

210 215 220

Leu Asp Phe Val Glu Ser Phe Asp Val Glu Thr His Pro Glu Ala Gln

225 230 235 240

Cys Pro Tyr Asp Ser Leu Lys Ile Gln Thr Asp Lys Gly Glu His Gly

245 250 255

Pro Phe Cys Gly Lys Thr Leu Pro Pro Arg Ile Glu Thr Asp Ser His

260 265 270

Lys Val Thr Ile Thr Phe Ala Thr Asp Glu Ser Gly Asn His Thr Gly

275 280 285

Trp Lys Ile His Tyr Thr Ser Thr Ala Arg Pro Cys Pro Asp Pro Thr

290 295 300

Ala Pro Pro Asn Gly Ser Ile Ser Pro Val Gln Ala Ile Tyr Val Leu

305 310 315 320

Lys Asp Arg Phe Ser Val Phe Cys Lys Thr Gly Phe Glu Leu Leu Gln

325 330 335

Gly Ser Val Pro Leu Lys Ser Phe Thr Ala Val Cys Gln Lys Asp Gly

340 345 350

Ser Trp Asp Arg Pro Met Pro Glu Cys Ser Ile Ile Asp Cys Gly Pro

355 360 365

Pro Asp Asp Leu Pro Asn Gly His Val Asp Tyr Ile Thr Gly Pro Glu

370 375 380

Val Thr Thr Tyr Lys Ala Val Ile Gln Tyr Ser Cys Glu Glu Thr Phe

385 390 395 400

Tyr Thr Met Ser Ser Asn Gly Lys Tyr Val Cys Glu Ala Asp Gly Phe

405 410 415

Trp Thr Ser Ser Lys Gly Glu Lys Leu Pro Pro Val Cys Glu Pro Val

420 425 430

Cys Gly Leu Ser Thr His Thr Ile Gly Gly Arg Ile Val Gly Gly Gln

435 440 445

Pro Ala Lys Pro Gly Asp Phe Pro Trp Gln Val Leu Leu Leu Gly Gln

450 455 460

Thr Thr Ala Ala Ala Gly Ala Leu Ile His Asp Asn Trp Val Leu Thr

465 470 475 480

Ala Ala His Ala Val Tyr Glu Lys Arg Met Ala Ala Ser Ser Leu Asn

485 490 495

Ile Arg Met Gly Ile Leu Lys Arg Leu Ser Pro His Tyr Thr Gln Ala

500 505 510

Trp Pro Glu Glu Ile Phe Ile His Glu Gly Tyr Thr His Gly Ala Gly

515 520 525

Phe Asp Asn Asp Ile Ala Leu Ile Lys Leu Lys Asn Lys Val Thr Ile

530 535 540

Asn Gly Ser Ile Met Pro Val Cys Leu Pro Arg Lys Glu Ala Ala Ser

545 550 555 560

Leu Met Arg Thr Asp Phe Thr Gly Thr Val Ala Gly Trp Gly Leu Thr

565 570 575

Gln Lys Gly Leu Leu Ala Arg Asn Leu Met Phe Val Asp Ile Pro Ile

580 585 590

Ala Asp His Gln Lys Cys Thr Ala Val Tyr Glu Lys Leu Tyr Pro Gly

595 600 605

Val Arg Val Ser Ala Asn Met Leu Cys Ala Gly Leu Glu Thr Gly Gly

610 615 620

Lys Asp Ser Cys Arg Gly Asp Ser Gly Gly Ala Leu Val Phe Leu Asp

625 630 635 640

Asn Glu Thr Gln Arg Trp Phe Val Gly Gly Ile Val Ser Trp Gly Ser

645 650 655

Ile Asn Cys Gly Ala Ala Asp Gln Tyr Gly Val Tyr Thr Lys Val Ile

660 665 670

Asn Tyr Ile Pro Trp Ile Glu Asn Ile Ile Ser Asn Phe

675 680 685

<210> 2

<211> 686

<212> PRT

<213> 人(human)

<400> 2

Met Arg Leu Leu Thr Leu Leu Gly Leu Leu Cys Gly Ser Val Ala Thr

1 5 10 15

Pro Leu Gly Pro Lys Trp Pro Glu Pro Val Phe Gly Arg Leu Ala Ser

20 25 30

Pro Gly Phe Pro Gly Glu Tyr Ala Asn Asp Gln Glu Arg Arg Trp Thr

35 40 45

Leu Thr Ala Pro Pro Gly Tyr Arg Leu Arg Leu Tyr Phe Thr His Phe

50 55 60

Asp Leu Glu Leu Ser His Leu Cys Glu Tyr Asp Phe Val Lys Leu Ser

65 70 75 80

Ser Gly Ala Lys Val Leu Ala Thr Leu Cys Gly Gln Glu Ser Thr Asp

85 90 95

Thr Glu Arg Ala Pro Gly Lys Asp Thr Phe Tyr Ser Leu Gly Ser Ser

100 105 110

Leu Asp Ile Thr Phe Arg Ser Asp Tyr Ser Asn Glu Lys Pro Phe Thr

115 120 125

Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Ala Ala Glu Asp Ile Asp Glu Cys Gln Val

130 135 140

Ala Pro Gly Glu Ala Pro Thr Cys Asp His His Cys His Asn His Leu

145 150 155 160

Gly Gly Phe Tyr Cys Ser Cys Arg Ala Gly Tyr Val Leu His Arg Asn

165 170 175

Lys Arg Thr Cys Ser Ala Leu Cys Ser Gly Gln Val Phe Thr Gln Arg

180 185 190

Ser Gly Glu Leu Ser Ser Pro Glu Tyr Pro Arg Pro Tyr Pro Lys Leu

195 200 205

Ser Ser Cys Thr Tyr Ser Ile Ser Leu Glu Glu Gly Phe Ser Val Ile

210 215 220

Leu Asp Phe Val Glu Ser Phe Asp Val Glu Thr His Pro Glu Thr Leu

225 230 235 240

Cys Pro Tyr Asp Phe Leu Lys Ile Gln Thr Asp Arg Glu Glu His Gly

245 250 255

Pro Phe Cys Gly Lys Thr Leu Pro His Arg Ile Glu Thr Lys Ser Asn

260 265 270

Thr Val Thr Ile Thr Phe Val Thr Asp Glu Ser Gly Asp His Thr Gly

275 280 285

Trp Lys Ile His Tyr Thr Ser Thr Ala Gln Pro Cys Pro Tyr Pro Met

290 295 300

Ala Pro Pro Asn Gly His Val Ser Pro Val Gln Ala Lys Tyr Ile Leu

305 310 315 320

Lys Asp Ser Phe Ser Ile Phe Cys Glu Thr Gly Tyr Glu Leu Leu Gln

325 330 335

Gly His Leu Pro Leu Lys Ser Phe Thr Ala Val Cys Gln Lys Asp Gly

340 345 350

Ser Trp Asp Arg Pro Met Pro Ala Cys Ser Ile Val Asp Cys Gly Pro

355 360 365

Pro Asp Asp Leu Pro Ser Gly Arg Val Glu Tyr Ile Thr Gly Pro Gly

370 375 380

Val Thr Thr Tyr Lys Ala Val Ile Gln Tyr Ser Cys Glu Glu Thr Phe

385 390 395 400

Tyr Thr Met Lys Val Asn Asp Gly Lys Tyr Val Cys Glu Ala Asp Gly

405 410 415

Phe Trp Thr Ser Ser Lys Gly Glu Lys Ser Leu Pro Val Cys Glu Pro

420 425 430

Val Cys Gly Leu Ser Ala Arg Thr Thr Gly Gly Arg Ile Tyr Gly Gly

435 440 445

Gln Lys Ala Lys Pro Gly Asp Phe Pro Trp Gln Val Leu Ile Leu Gly

450 455 460

Gly Thr Thr Ala Ala Gly Ala Leu Leu Tyr Asp Asn Trp Val Leu Thr

465 470 475 480

Ala Ala His Ala Val Tyr Glu Gln Lys His Asp Ala Ser Ala Leu Asp

485 490 495

Ile Arg Met Gly Thr Leu Lys Arg Leu Ser Pro His Tyr Thr Gln Ala

500 505 510

Trp Ser Glu Ala Val Phe Ile His Glu Gly Tyr Thr His Asp Ala Gly

515 520 525

Phe Asp Asn Asp Ile Ala Leu Ile Lys Leu Asn Asn Lys Val Val Ile

530 535 540

Asn Ser Asn Ile Thr Pro Ile Cys Leu Pro Arg Lys Glu Ala Glu Ser

545 550 555 560

Phe Met Arg Thr Asp Asp Ile Gly Thr Ala Ser Gly Trp Gly Leu Thr

565 570 575

Gln Arg Gly Phe Leu Ala Arg Asn Leu Met Tyr Val Asp Ile Pro Ile

580 585 590

Val Asp His Gln Lys Cys Thr Ala Ala Tyr Glu Lys Pro Pro Tyr Pro

595 600 605

Arg Gly Ser Val Thr Ala Asn Met Leu Cys Ala Gly Leu Glu Ser Gly

610 615 620

Gly Lys Asp Ser Cys Arg Gly Asp Ser Gly Gly Ala Leu Val Phe Leu

625 630 635 640

Asp Ser Glu Thr Glu Arg Trp Phe Val Gly Gly Ile Val Ser Trp Gly

645 650 655

Ser Met Asn Cys Gly Glu Ala Gly Gln Tyr Gly Val Tyr Thr Lys Val

660 665 670

Ile Asn Tyr Ile Pro Trp Ile Glu Asn Ile Ile Ser Asp Phe

675 680 685

<210> 3

<211> 1482

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgccaaggca ttagaaccat ccaggtatcc tctgctgggg gaaggcctca gcctagcgcc 60

tgcccaagga ggaacttgtc tgccaggaat ccattccaca cagttctgat ggttcccgtt 120

cacctgacag ctgagacagt ggtggtggga ccacattttg agcagtattg cttatgtaca 180

caaacctctt gatctccagt taaatccaaa cccgggtcag gactctgaag agctcactag 240

acctctgctc ttcccaatgt ggccacattg aataaatcct ttttctctgc ttttcactat 300

taagttgtct gtataattgg cctattgaag actggtagcc gagactaact gttttgagtt 360

ctgaccctaa caattttggt ataatgaaaa aacaaaaaac aaaaaaaaca gcccaaaatg 420

tttatttttt gatttgagac aggtttttgt gtagccctgg ctgccctgga attcatctgt 480

agaccaggct ggtctggaac tcagaaatct gcctgcctct gcctcacaag tgctgggatc 540

aaaagtgtgc accgcccacc cccacccctg ccccgagatt tctttggcga gctgactcag 600

ctgttagcac tagctgctct ccctgggttc tcaagttcaa ttcccagtac ttggtcccca 660

gctgcctata actccaactt caggagagcc agcgctctct tctgggctct aaaagcattg 720

aacatacatg gctcagcact cagacagaca gacagacaga cacctaaaca actgctgtcc 780

ttgcgggcct ccacagtcca gtccaagttc aagccaagcc tccccatttc tcaattttta 840

cttatgtaat tgctgggata aaggttccct ccctgcaggg ctccagagcc acaggcagga 900

gaactagaca agtctgaggc tagtctggtc tccaccgttc aaagccagtc agggctaaat 960

ggaaagaccc tgttttcaaa tgagtcatgt tatctccaaa tgagcaccgg tgccaggaac 1020

cccagcttct aattctgctt tgggcttaga agtcacctgc aagacattcc tcctgcctgc 1080

atccaccatt catggtccca agtgtagcca aagtttatct tatgcctgtt ccgtatcctt 1140

ttgttcatga gtttcctcaa attattcttt tttcgcctct ccctgagttg ggggtggggg 1200

tgggatctta ggctgtccac gtcgtcactg agactctcgc ccaccagacc ttcctggtcc 1260

cactaggaag gaagtgcaga tggtgggtga gagtagaatt tttttttact accaggctgg 1320

ctctcagagc caccgaaccg aaccttcctg cctggaaggg aggcaggcag gagccatggg 1380

tagattccca gaatccttgg tttgtggagg tggggcctgg tgctggacaa acagatcaaa 1440

ggtgataggc gctggacctg cagagctagg tggcacacca tg 1482

<210> 4

<211> 1459

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aggtgggtgg gcgacccata gcttctgggg aagctgaatg agttaggcct ggaccctcat 60

gtcactcccc tgcccacagg ctactcatct tcctgggtct gctgtggagt ttggtggcca 120

cacttctggg ttcaaagtgg cctgaagctg tattcgggcg cctggtgtcc cctggcttcc 180

cagagaagta tgctgaccat caagatcgat cctggacact gactgcaccc cctggctacc 240

gcctgcgcct ctacttcacc cactttgacc tggaactctc ttaccgctgc gagtatgact 300

ttgtcaaggt atctgacggg gtgctcggct ggggccttct tatgaggtac agcaaaggct 360

gggcctggtt ctaacctccc tcccttgacc cctgactcca cagttgagct cagggaccaa 420

ggtgctggcc acactgtgtg ggcaggagag tacagacact gagcaggcac ctggcaatga 480

caccttctac tcactgggtc ccagcctaaa ggtcaccttc cactccgact actccaatga 540

gaagccgttc acagggtttg aggccttcta tgcagcggag ggtgagcagt ggtgggctca 600

ggcagcccag atgcagctgg gtggctgcct tgtcttagcc ccgtccccat ctttgggtgt 660

cttgcttccc acctctcctt tgggctctgg attcaggtca aaccaacagg aaaggcgggt 720

gggttctgct gtcacgtgcc acgtgaatgc aggaacgcag agcagccatc gggttacaaa 780

gggcttgcac aggctgaagc cttccacttg actgtattct ttggtccctg aaggagagag 840

actgtgtgac ctcaggcaag tggctcaacc tctctgctca gaaagcttct acccggttgc 900

cactggattg atgatggctc ttccctcctc tgcccgggtg acttaacctg ccactggttt 960

agcaacggtg ctacttgcaa ctctgggccc aggcccaggc gaagcaacag gcctcctatc 1020

aagtgggtca gggccaccaa agcctgagct ctctgttcca tctctttccc tcctgtctgc 1080

ctggcctctc tcctttagat gtggatgaat gcagagtgtc tctgggagac tcagtccctt 1140

gtgaccatta ttgccacaac tacttgggcg gctactattg ctcctgcaga gcgggctacg 1200

ttctccacca gaacaagcac acgtgctcag gtgagggggt aggggcatcc catctacacc 1260

aggttattcc agctaccaaa gcaggagttg ttctgcccag ggagctgggc tcttctgctt 1320

cctccaacac tattagcatg tctaactcct cccactttcc ctccctccaa tggtgtactt 1380

tgatcccgcc cctactcttg gaacccctag ttccatcagc caattgtctc tgccttctgg 1440

gtgcttccta ggtgggctt 1459

<210> 5

<211> 2058

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aggctgctga ccctcctggg ccttctgtgt ggctcggtgg ccaccccctt gggcccgaag 60

tggcctgaac ctgtgttcgg gcgcctggca tcccccggct ttccagggga gtatgccaat 120

gaccaggagc ggcgctggac cctgactgca ccccccggct accgcctgcg cctctacttc 180

acccacttcg acctggagct ctcccacctc tgcgagtacg acttcgtcaa gctgagctcg 240

ggggccaagg tgctggccac gctgtgcggg caggagagca cagacacgga gcgggcccct 300

ggcaaggaca ctttctactc gctgggctcc agcctggaca ttaccttccg ctccgactac 360

tccaacgaga agccgttcac ggggttcgag gccttctatg cagccgagga cattgacgag 420

tgccaggtgg ccccgggaga ggcgcccacc tgcgaccacc actgccacaa ccacctgggc 480

ggtttctact gctcctgccg cgcaggctac gtcctgcacc gtaacaagcg cacctgctca 540

gccctgtgct ccggccaggt cttcacccag aggtctgggg agctcagcag ccctgaatac 600

ccacggccgt atcccaaact ctccagttgc acttacagca tcagcctgga ggaggggttc 660

agtgtcattc tggactttgt ggagtccttc gatgtggaga cacaccctga aaccctgtgt 720

ccctacgact ttctcaagat tcaaacagac agagaagaac atggcccatt ctgtgggaag 780

acattgcccc acaggattga aacaaaaagc aacacggtga ccatcacctt tgtcacagat 840

gaatcaggag accacacagg ctggaagatc cactacacga gcacagcgca gccttgccct 900

tatccgatgg cgccacctaa tggccacgtt tcacctgtgc aagccaaata catcctgaaa 960

gacagcttct ccatcttttg cgagactggc tatgagcttc tgcaaggtca cttgcccctg 1020

aaatccttta ctgcagtttg tcagaaagat ggatcttggg accggccaat gcccgcgtgc 1080

agcattgttg actgtggccc tcctgatgat ctacccagtg gccgagtgga gtacatcaca 1140

ggtcctggag tgaccaccta caaagctgtg attcagtaca gctgtgaaga gaccttctac 1200

acaatgaaag tgaatgatgg taaatatgtg tgtgaggctg atggattctg gacgagctcc 1260

aaaggagaaa aatcactccc agtctgtgag cctgtttgtg gactatcagc ccgcacaaca 1320

ggagggcgta tatatggagg gcaaaaggca aaacctggtg attttccttg gcaagtcctg 1380

atattaggtg gaaccacagc agcaggtgca cttttatatg acaactgggt cctaacagct 1440

gctcatgccg tctatgagca aaaacatgat gcatccgccc tggacattcg aatgggcacc 1500

ctgaaaagac tatcacctca ttatacacaa gcctggtctg aagctgtttt tatacatgaa 1560

ggttatactc atgatgctgg ctttgacaat gacatagcac tgattaaatt gaataacaaa 1620

gttgtaatca atagcaacat cacgcctatt tgtctgccaa gaaaagaagc tgaatccttt 1680

atgaggacag atgacattgg aactgcatct ggatggggat taacccaaag gggttttctt 1740

gctagaaatc taatgtatgt cgacataccg attgttgacc atcaaaaatg tactgctgca 1800

tatgaaaagc caccctatcc aaggggaagt gtaactgcta acatgctttg tgctggctta 1860

gaaagtgggg gcaaggacag ctgcagaggt gacagcggag gggcactggt gtttctagat 1920

agtgaaacag agaggtggtt tgtgggagga atagtgtcct ggggttccat gaattgtggg 1980

gaagcaggtc agtatggagt ctacacaaaa gttattaact atattccctg gatcgagaac 2040

ataattagtg atttttaa 2058

<210> 6

<211> 1261

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tttgcatcgt ccaatcattg ttcctcatat cgccaagtac ctgggaagct tagtaacaaa 60

cctaagaatg acagcctacc ccaaaatcag agcaggtgag attgttacag gtccaaacac 120

ttgccaatat cagctttgat ttgtgtttaa cagtgcttgg ccaaccccca acacagaaaa 180

aacaagttgt atttgattcc ctacaatcta cttattttat actggctgtt tccatttctg 240

gccaacaaag ggcttgttgt gtctagtgtg tagatttggt cttaatgagc tcagaaagtg 300

ctcttacttt ctgagtaact tctgagtggt tccagaatac cttttggaag gtaagcggaa 360

agcaggtgtg tgaccttcac attagatcag ctattaaatt aacaccaagt ccattccaga 420

atattgggat ataggcatgt tctaccagat tcaccaaatt gtcagataaa aagaacacga 480

aacagcattt taccctttac aagggcaatt tagcaaatca ttccaaaaac cttaacaggt 540

gtttcactat acccagccca cttttcttag gtgagcgttg ggctcaggga agtcaaccgt 600

aactgtacaa ggtacagtca tttgcttatg tatcaaaaac agtaagttat cctgaaataa 660

actgctcttc tgctaagatg ctgaccttaa aggtcatgtt tgattttaac tggctcttcc 720

aacaaggcaa gacagggtgc ctcaagatgg ggaaatagct ggcctacaac tcatttacac 780

caattctggg attaaaagca tgggccacca cacccacctg gagactcaaa ttttaaagga 840

tgaaaatgct atattgcatc ttcccacata agtcacctta acttttctag cattgtcatg 900

atatagaatt tttttttctt ccagtaagac tccagacact aaactgttgg tggcaagaaa 960

accttttatt caactgtggt tcaaagagtt gttcttcatt atttctaagg aatgaacgcg 1020

ttttgatgac cagactttca aaaccaaatc tttgccaagt agtttatttc taaaacctca 1080

tttacggcaa gtaactaact acagctatgt catccataaa catgttaaaa ggctgatcaa 1140

cactgaaaga cttctatgac cagtaagtct ttaacaagtg taaaaaaggg atcaaaacca 1200

tgccattgac aagtaactta ccccaggact cctggccgtc tttggaggtc cccgaaaacc 1260

a 1261

<210> 7

<211> 1361

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggtaccatta agggttccgg atcctcgggg acaccaaata tggcgatctc ggccttttcg 60

tttcttggag ctgggacatg tttgccatcg atccatctac caccagaacg gccgttagat 120

ctgctgccac cgttgtttcc accgaagaaa ccaccgttgc cgtaaccacc acgacggttg 180

ttgctaaaga agctgccacc gccacggcca ccgttgtagc cgccgttgtt gttattgtag 240

ttgctcatgt tatttctggc acttcttggt tttcctctta agtgaggagg aacataacca 300

ttctcgttgt tgtcgttgat gcttaaattt tgcacttgtt cgctcagttc agccataata 360

tgaaatgctt ttcttgttgt tcttacggaa taccacttgc cacctatcac cacaactaac 420

tttttcccgt tcctccatct cttttatatt ttttttctcg agggatcttt gtgaaggaac 480

cttacttctg tggtgtgaca taattggaca aactacctac agagatttaa agctctaagg 540

taaatataaa atttttaagt gtataatgtg ttaaactact gattctaatt gtttgtgtat 600

tttagattcc aacctatgga actgatgaat gggagcagtg gtggaatgcc tttaatgagg 660

aaaacctgtt ttgctcagaa gaaatgccat ctagtgatga tgaggctact gctgactctc 720

aacattctac tcctccaaaa aagaagagaa aggtagaaga ccccaaggac tttccttcag 780

aattgctaag ttttttgagt catgctgtgt ttagtaatag aactcttgct tgctttgcta 840

tttacaccac aaaggaaaaa gctgcactgc tatacaagaa aattatggaa aaatattctg 900

taacctttat aagtaggcat aacagttata atcataacat actgtttttt cttactccac 960

acaggcatag agtgtctgct attaataact atgctcaaaa attgtgtacc tttagctttt 1020

taatttgtaa aggggttaat aaggaatatt tgatgtatag tgccttgact agagatcata 1080

atcagccata ccacatttgt agaggtttta cttgctttaa aaaacctccc acacctcccc 1140

ctgaacctga aacataaaat gaatgcaatt gttgttgtta acttgtttat tgcagcttat 1200

aatggttaca aataaagcaa tagcatcaca aatttcacaa ataaagcatt tttttcactg 1260

cattctagtt gtggtttgtc caaactcatc aatgtatctt atcatgtctg gatctgacat 1320

ggtaagtaag cttgggctgc aggtcgaggg acctagatat c 1361

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

taggtggcac accatgaggt ggg 23

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ctaggtggca caccatgagg tgg 23

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

agtttggtgg ccacacttct ggg 23

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gagtttggtg gccacacttc tgg 23

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gacaccaggc gcccgaatac agg 23

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gatggtcagc atacttctct ggg 23

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gacaccaggc gcccgaatac 20

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

taggacacca ggcgcccgaa tac 23

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gtattcgggc gcctggtgtc 20

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

aaacgtattc gggcgcctgg tgtc 24

<210> 18

<211> 132

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gaattctaat acgactcact atagggggtc ttcgagaaga cctgttttag agctagaaat 60

agcaagttaa aataaggcta gtccgttatc aacttgaaaa agtggcaccg agtcggtgct 120

tttaaaggat cc 132

<210> 19

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ctcctcacca gaagggagaa gtcca 25

<210> 20

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

tgttgagagt cagcagtagc ctcat 25

<210> 21

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

tgccatcgat ccatctacca ccaga 25

<210> 22

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

agagacacac agccacagtg gaaac 25

<210> 23

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

ctctcagagc caccgaaccg aacc 24

<210> 24

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

atacttctct gggaagccag gggac 25

<210> 25

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

tccacacagg catagagtgt ctgct 25

<210> 26

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

aactgatgaa tgggagcagt ggtgg 25

<210> 27

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

gcagacactc tatgcctgtg tggag 25

<210> 28

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

ttccactgtg gctgtgtgtc tcttg 25

<210> 29

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

ctcggtactg ccctcctttt ggaag 25

Claims

1.一种MASP2基因人源化的非人动物的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括用嵌合MASP2基因的核苷酸序列插入至非人动物MASP2基因1号外显子的第45bp与第46bp之间，所述的嵌合MASP2基因的核苷酸序列通过非人动物内源MASP2调控元件调控，所述的嵌合MASP2基因从5’-3’依次包含人MASP2、非人动物MASP2以及STOP序列，其中，人MASP2的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，非人动物MASP2的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，STOP序列如SEQ ID NO：7所示，所述非人动物内源MASP2蛋白表达降低或缺失，所述的非人动物为小鼠。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，使用靶向载体和sgRNA进行非人动物的构建，其中，

所述的靶向载体包含嵌合MASP2基因的核苷酸序列，所述的靶向载体还包含5’臂和3’臂，所述的5’臂的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述的3’臂的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；

3.一种MASP2基因的靶向载体，其特征在于，所述的靶向载体包含嵌合MASP2基因的核苷酸序列，所述的嵌合MASP2基因从5’-3’依次包含人MASP2、非人动物MASP2以及STOP序列，其中，人MASP2的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，非人动物MASP2的核苷酸序列如SEQ IDNO：6所示，STOP序列如SEQ ID NO：7所示，所述的靶向载体还包含5’臂和3’臂，所述的5’臂的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述的3’臂的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

4.一种sgRNA，其特征在于，所述的sgRNA在MASP2基因上的靶位点序列如SEQ ID NO：8-13任一项所示。

5.一种嵌合MASP2基因，其特征在于，所述的嵌合MASP2基因从5’-3’依次包含人MASP2、非人动物MASP2以及STOP序列，其中，人MASP2的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，非人动物MASP2的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，STOP序列如SEQ ID NO：7所示，所述的非人动物为小鼠。

6.根据权利要求1-2任一所述的构建方法获得的MASP2基因人源化的非人动物、权利要求5所述的嵌合MASP2基因的应用，其特征在于，所述的应用为非疾病诊断、非疾病治疗目的，所述的应用包括：