CN112481155A - 一株可改善口腔健康的乳酸乳球菌及其应用 - Google Patents

一株可改善口腔健康的乳酸乳球菌及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112481155A
CN112481155A CN202011333119.2A CN202011333119A CN112481155A CN 112481155 A CN112481155 A CN 112481155A CN 202011333119 A CN202011333119 A CN 202011333119A CN 112481155 A CN112481155 A CN 112481155A
Authority
CN
China
Prior art keywords
lactococcus lactis
oral
strain
lactis
oral health
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202011333119.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112481155B (zh
Inventor
陈作国
朱珺
李宝磊
孙盛
林国栋
刘冠辰
陈苏
李言郡
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
HANGZHOU WAHAHA TECHNOLOGY CO LTD
Original Assignee
HANGZHOU WAHAHA TECHNOLOGY CO LTD
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by HANGZHOU WAHAHA TECHNOLOGY CO LTD filed Critical HANGZHOU WAHAHA TECHNOLOGY CO LTD
Priority to CN202011333119.2A priority Critical patent/CN112481155B/zh
Publication of CN112481155A publication Critical patent/CN112481155A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112481155B publication Critical patent/CN112481155B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
    • A23C9/00—Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations
    • A23C9/12—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes
    • A23C9/123—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes using only microorganisms of the genus lactobacteriaceae; Yoghurt
    • A23C9/1236—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes using only microorganisms of the genus lactobacteriaceae; Yoghurt using Leuconostoc, Pediococcus or Streptococcus sp. other than Streptococcus Thermophilus; Artificial sour buttermilk in general
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2400/00—Lactic or propionic acid bacteria
    • A23V2400/21—Streptococcus, lactococcus
    • A23V2400/231—Lactis
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)

Abstract

本发明涉及微生物领域，公开了一株可改善口腔健康的乳酸乳球菌及其应用，所述乳酸乳球菌命名为2311，已于2018年5月25日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.15812；微生物分类命名为乳酸乳球菌乳酸亚种Lactococcus lactis subsp.lactis。本发明菌株在口腔健康相关应用方面具有特殊特性，具体表现为对口腔有害菌具有良好的拮抗特性，具有良好的聚集能力，以及具有不产生挥发性硫化物以及低酸化的特征，因此适于应用于各类口腔改善的食品、药品、膳食补充剂、口腔护理制品等。

Description

一株可改善口腔健康的乳酸乳球菌及其应用
技术领域
本发明涉及微生物领域，尤其涉及一株可改善口腔健康的乳酸乳球菌及其应用。
背景技术
口腔是一个复杂而完整的微生态系统，定植于口腔的微生物主要包括细菌、真菌、支原体等，这些微生物共同构成了微生态系统。研究表明，许多口腔相关疾病的起因是口腔细菌微生态发生改变，同时口腔相关疾病也会进而影响口腔微生态改变，影响人体健康。
正常生理状态下，口腔微生物之间、微生物与宿主之间存在着动态平衡，共同参与和影响口腔的代谢、免疫及营养等。但在各种外界因素影响下，口腔微生态的平衡会被打破，平时没有危害的条件致病菌开始产生致病影响，从而导致口腔相关疾病的发生，如龋齿、牙龈炎、牙周炎、口臭等，而如上的口腔疾病又会反过来加剧菌群的失衡，使致病菌大量繁殖，形成恶性循环。如牙周病，其主要发病原因是牙菌斑微生物在牙颈部和牙龈沟内堆积，控制牙菌斑对牙周病的防治至关重要。
在我国，口腔问题十分普遍。根据全国第三次口腔健康流行病学的调查结果显示，我国5岁、12岁、35-44岁、65-74岁年龄组的患龋率分别为66.0％、28.9％、88.1％和98.4％。其中，5岁儿童中96.7％的龋齿未得到治疗。牙周病的情况也不乐观，调查显示12岁、35-44岁、65-74岁人群牙龈出血的检出率分别达到57.7％、77.3％和68.0％，牙石检出率分别达到 59.0％、97.3％和88.7％，35岁以上成年人牙齿脱落的主要原因为牙周病。口腔疾病严重影响着人们日常的生活质量。
现阶段对口腔健康的护理最常用的是采用机械方式或抑菌剂类产品对口腔中的微生物进行彻底的清除，但同时也会带来口腔菌群破坏或失衡等问题。尤其在口腔微生物重建过程中，有害菌会再次出现或呈现优势生长，导致口腔健康无法得到有效的解决。采用益生菌类制剂不仅可以有效抑制有害菌的生长，同时还能帮助维持正常的口腔的微生态平衡，保障口腔健康。唾液链球菌K12(Streptococcus salivarius K12)能产生两种羊毛硫样细菌素，唾液素A、唾液素B，对普雷沃菌属、脆弱拟杆菌等病原菌的生长有抑制作用，对口臭等口腔健康问题有改善作用。
益生菌在口腔健康维护、口腔疾病的预防和治疗等方面具有一定的功能潜力。但由于益生菌发挥益生功效具有菌株特异性，应对其做充分筛选及功能评价。此外，现有技术中的益生菌在应用于口腔护理的同时也会带来一些副作用，因此我们在筛选菌株时也应充分考虑在口腔中可能的不利效应。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一株可改善口腔健康的乳酸乳球菌及其应用，本发明的乳酸乳球菌新菌株对由于口腔微生态系统紊乱而引起的诸如龋齿、牙周病、口臭等口腔疾患与不适症状具有预防或改善作用，适于应用于各类口腔改善的食品、药品、膳食补充剂、口腔护理制品等。本发明菌株在口腔健康相关应用方面具有特殊特性，具体表现为对口腔有害菌具有良好的拮抗特性，具有良好的聚集能力，以及具有不产生挥发性硫化物以及低酸化的特征。
本发明的具体技术方案为：
第一方面，本发明提供了一株可改善口腔健康的乳酸乳球菌，所述乳酸乳球菌命名为2311，已于2018年5月25日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址：中国北京，保藏编号为 CGMCC No.15812；微生物分类命名为乳酸乳球菌乳酸亚种Lactococcus lactis subsp.lactis。
具体地，本发明菌株分离自新疆青贮样品，经MRS接种培养、分离纯化后分离获得，经鉴定其属于乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)。该菌株的生物学性质如下：
形态学特征：在MRS培养基上形成明显的圆形、乳白色菌落，边缘整齐，隆起，不透明，表面光滑湿润。革兰氏染色典型阳性，显微镜观察下细胞形状为球状，无鞭毛，不产芽孢，不运动。
培养特征：最适生长温度为30-37℃，需氧或兼性厌氧，生长于MRS培养基中。培养基成分：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，乙酸钠5g，K2HPO4 2g，MgSO4·7H2O0.2g，MnSO4·4H2O 0.2g。
本发明提供的乳酸乳球菌新菌株，该菌株对由于口腔微生态系统紊乱而引起的诸如龋齿、牙周病、口臭等口腔疾患与不适症状具有预防或改善作用，适于应用于各类口腔改善的食品、药品、膳食补充剂、口腔护理制品等。本发明菌株在口腔健康相关应用方面具有特殊特性，具体表现为对口腔有害菌具有良好的拮抗特性，具有良好的聚集能力，以及具有不产生挥发性硫化物以及低酸化的特征(详见下文)。
本发明的乳酸乳球菌相较于其他同类菌株，更加适用于口腔护理，原因在于其具备以下特性：
(1)乳酸乳球菌2311相对于其他同类菌株对口腔中的有害菌表现出更为显著的抑制活性，主要表现为对其生长的抑制。所述有害菌与龋齿、口臭、牙龈炎、牙周炎等口腔疾病或不适症状相关。所述有害菌涉及变异链球菌、具核梭杆菌、牙龈卟啉单胞菌，但不只限于以上有害菌。同时，乳酸乳球菌2311发挥其抑菌活性与菌株的生长温度有关，在低于37℃温度下，更有益于该菌株分泌抑菌物质。
(2)一方面，乳酸乳球菌2311与口腔有害菌具有非常好的共聚集效果，可通过干扰有害菌生物膜的形成有效降低牙菌斑的形成，减少龋病的发生。牙菌斑形成是有害菌彼此之间聚集的结果。有害菌为变异链球菌，但不止限于以上有害菌。另一方面。乳酸乳球菌2311 拥有良好的自聚集能力，其具备在口腔环境中快速繁殖和生存的优势。
形成聚集物的能力和与致病菌良好的聚集能力对具有口腔健康应用的益生菌株而言非常重要，良好的自聚集能力有利于菌株在口腔的生存，与致病菌的聚集特性更能通过干扰病原体生物膜的形成来抑制和减少牙菌斑。无论是自聚集能力还是和致病菌变异链球菌的共聚集能力，本发明菌株均优于其他同类菌株。
(3)乳酸乳球菌2311还表现出较低的酸化特征。众所周知，普通的乳酸菌利用糖等碳源物质发酵会产生大量的有机酸，可能存在增加龋齿的风险，是乳酸菌应用于口腔健康防护中可能产生的副作用之一。但本发明的乳酸乳球菌2311表现出较低的产酸特性，使得其相比其他乳酸菌更适合应用于口腔健康相关产品的开发。
(4)相较于其他同类菌株，本发明乳酸乳球菌2311具有不产生或极少产生臭味化合物的特点。所述臭味化合物主要指硫化氢、甲硫醇、二甲基二硫醚、二甲基三硫醚等挥发性硫化物。因此更加适用于口腔护理产品。
(5)相较于其他同类菌株，本发明乳酸乳球菌2311还同时具有良好的发酵性能。在鲜牛奶、脱脂乳、全脂乳等基料中均可发酵。发酵后酸奶中乳酸乳球菌活菌数可达 5.0E+08cfu/mL，降低了菌株的使用成本的同时，发酵过程中产生的菌体代谢产物具有额外的益生作用。
第二方面，本发明提供了一株可改善口腔健康的乳酸乳球菌的突变体，所述突变体为上述乳酸乳球菌进行诱变、驯化、基因重组或者经自然突变而获得的突变体。
第三方面，本发明提供了一种含有上述乳酸乳球菌或含有突变体的菌体培养物。
作为优选，所述菌体培养物为菌液或菌剂。
第四方面，本发明提供了上述乳酸乳球菌或突变体或菌体培养物在制备预防口腔疾病或改善口腔健康的食品、药品、膳食补充剂或口腔护理制品中的应用。
上述产品中含有所述乳酸乳球菌和/或所述突变体和/或所述菌体培养物，以及含有生理上可接受的赋形剂和/或稀释剂。作为优选，所述食品为一种冻干酸奶块产品。冻干酸奶块产品在口腔中能快速崩解，更利于本发明中所述菌株在口腔中释放、定植与发挥益生功效。同时，本发明菌株自身具有发酵性能，可以发酵形成酸奶，不需要额外添加其他发酵剂菌株，也保证了本发明菌株在产品中达到足够的有效含量。冻干酸奶块中乳酸乳球菌活菌数可达 2.0E+09cfu/mL。
与现有技术对比，本发明的有益效果是：
(1)本发明菌株在口腔健康相关应用方面具有特殊特性，具体表现为对口腔有害菌具有良好的拮抗特性，具有良好的聚集能力，以及具有不产生挥发性硫化物以及低酸化的特征等。
(2)本发明的乳酸乳球菌对由于口腔微生态系统紊乱而引起的诸如龋齿、牙周病、口臭等口腔疾患与不适症状具有预防或改善作用，适于应用于各类口腔改善的食品、药品、膳食补充剂、口腔护理制品等。
(3)本发明的乳酸乳球菌同时具有良好的发酵性能，经发酵制备的含有丰富活菌的冻干酸奶块产品，更利于本发明中所述菌株在口腔中释放、定植与发挥益生功效。
附图说明
图1为本发明乳酸乳球菌的外观特性。其中，菌株菌落特征如图1A所示，革兰氏染色显微镜观察特征如图1B所示；
图2为本发明乳酸乳球菌对变异链球菌的抑菌效果图。其中，图2A为乳酸乳球菌新菌株2311 抑菌图，图2B为对照菌唾液链球菌K12抑菌图，图2C为阴性对照，图2D、E、F、G、H、1 分别为乳酸乳球菌790、1328、1552、1882、1848、3090抑菌图。
图3为本发明乳酸乳球菌在乳基里发酵的酸度变化曲线。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
总实施例
一株可改善口腔健康的乳酸乳球菌，根据菌种细胞形态、生理生化特征、16S rRNA基因序列等数据综合分析，该菌株鉴定结果为乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactobacillus lactissubsp.lactis)，命名为2311，已于2018年5月25日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.15812。以下所示为乳酸乳球菌2311菌株的微生物学特性：
a.培养温度为30-37℃；
b.培养基优选为MRS培养基；
c.革兰氏阳性，球形，无芽孢，无鞭毛，接触酶阴性，氧化酶阴性(图1B)；
d.菌落的形态特征为：在MRS固体培养基37℃培养48h后，菌落呈乳白色，乳白色菌落、不透明、圆形、表面光滑，中央凸起(图1A)。
碳水化合物产酸情况(API50CH)如表1所示。
表1.乳酸乳球菌2311的结果
甘油 - 肌醇 - 菊糖 -
赤藓醇 - 甘露醇 - 松二糖 -
D-阿拉伯糖 - 山梨醇 - 棉籽糖 -
L-阿拉伯糖 - α-甲基-D-甘露糖甙 - 淀粉 +
D-核糖 + α-甲基-D-葡萄糖甙 - 糖原 -
D-木糖 - N-乙酰-葡糖胺 + 木糖醇 -
L-木糖 - 苦杏仁甙 - 龙胆二糖 -
阿东醇 - 熊果甙 - D-松二糖 -
β-甲基-D-木糖甙 - 七叶灵 + D-来苏糖 -
D-半乳糖 + 水杨苷 + D-塔格糖 -
D-葡萄糖 + 纤维二糖 + D-岩藻糖 -
D-果糖 + 麦芽糖 + L-岩藻糖 -
D-甘露糖 + 乳糖 - D-阿拉伯糖醇 -
L-山梨糖 - 蜜二糖 - L-阿拉伯糖醇 -
L-鼠李糖 - 蔗糖 + 葡萄糖酸盐 -
卫茅醇 - 海藻糖 + 2-酮基-葡萄糖酸盐 -
一株可改善口腔健康的乳酸乳球菌的突变体，所述突变体为上述乳酸乳球菌进行诱变、驯化、基因重组或者经自然突变而获得的突变体。
一种含有上述乳酸乳球菌或含有突变体的菌体培养物。作为优选，所述菌体培养物为菌液或菌剂。
一种上述乳酸乳球菌或突变体或菌体培养物在制备预防口腔疾病或改善口腔健康的食品、药品、膳食补充剂或口腔护理制品中的应用。上述产品含有生理上可接受的赋形剂和/ 或稀释剂。作为优选，所述食品为冻干酸奶块产品。
实施例1：乳酸乳球菌对口腔有害菌的抑制效果
对变异链球菌的抑制效果
变异链球菌(Streptococcus mutans，ATCC 25175)采用BHI培养基，于37℃条件下，培养后用于抑菌实验。采用双层平板打孔扩散法进行本发明菌株抑菌特性的测定。将已灭菌的1.5％琼脂倾倒在无菌培养皿中，待凝固后，将已分装灭菌的固体培养基(含1.1％琼脂)降至一定温度后，与指示菌混合并立即倾注于已摆放牛津杯的琼脂层上。指示菌需根据生长情况调整至合理浓度。待上层凝固后，取出牛津杯，并在孔中分别加入100μL受试菌上清液与对照试剂。其中上清液制备方法如下：取菌株发酵液以4000g离心10min后，取上清，经pH调整后，采用0.22μm滤膜进行过滤，获得的无菌上清液用于抑菌实验。随后，将平板经扩散后放入37℃培养过夜后，观察指示菌的生长状况及抑菌圈的大小。以唾液链球菌K12和其他乳酸乳球菌作为比对菌株。
抑菌实验结果如图2所示。乳酸乳球菌2311组可观察到明显抑菌圈，抑菌圈直径为17.94±0.42mm，对照菌唾液链球菌K12和其他乳酸乳球菌未观察到抑菌圈。表明乳酸乳球菌2311分泌产生的菌代谢物对变异链球菌具有抑制作用，且效果优于对照商业菌株唾液链球菌K12。
②对具核梭杆菌、牙龈卟啉单胞菌的抑制效果以具核梭杆菌(Fusobacteriumnucleatum，ATCC 10953)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis，ATCC 33277)两株口腔有害菌为指示菌进一步评价乳酸乳球菌2311的抑菌效果。
将具核梭杆菌与牙龈卟啉单胞菌分别以2％的接种量接种到10mL的TSB培养基和含氯化血红素维生素溶液的BHI培养基中，与37℃条件下厌氧培养，培养至对数末期后用于实验。将乳酸乳球菌2311、唾液链球菌K12和其他乳酸乳球菌在37℃条件下，采用MRS培养基进行培养。取菌株发酵液以4000g离心10min后，取上清，经pH调整后，采用0.22μm 滤膜进行过滤，获得的无菌上清液用于抑菌实验。以2％的接种量将已活化好的具核梭杆菌和牙龈卟啉单胞菌接入培养基，加入菌培养上清液，在37℃条件下厌氧条件下培养，于24h后测定两株有害菌的菌液浊度值(OD600)。
表2.乳酸乳球菌2311、唾液链球菌K12及其他乳酸乳球菌对其他口腔有害菌的抑菌结果
Figure BDA0002794711330000061
平均值±标准差，标注不同字母a，b，c表示具有显著性差异(p＜0.05)
结果如表2所示，乳酸乳球菌2311分泌代谢物对具核梭杆菌与牙龈卟啉单胞菌也具有显著的抑制其生长的作用，其中对牙龈卟啉单胞菌的抑制作用更为明显，抑制率接近100％。与对照菌唾液链球菌K12和其他乳酸乳球菌相比，乳酸乳球菌2311具有更强的抑制具核梭杆菌和牙龈卟啉单胞菌生长的功能。
实施例2：乳酸乳球菌新菌株的聚集能力
(1)自聚集能力
乳酸乳球菌2311与对比菌株以2％的接种量接入MRS培养基中，与37℃条件下培养至对数末期，收集菌液。菌液于4200rpm条件下离心10min后，收集菌体菌泥，经PBS清洗1次后(4200rpm离心5min)，重悬至OD600值为0.80±0.05，记录初始OD值为A0。取重悬后的菌悬液2mL于5mL离心管中，37℃下静置存放，分别于4h、16h后测定上清液OD600值，记录为(Ai)。计算各菌株的自聚集能力，计算公式如下：自聚集能力＝(A0-Ai)/A0*100％。结果如表3所示，乳酸乳球菌2311在4h、16h条件下自聚集能力均优于其他乳酸乳球菌对比菌株，与商业菌株唾液链球菌K12相似。
表3.自聚集能力实验结果
Figure BDA0002794711330000071
(2)共聚集能力
乳酸乳球菌2311与对比菌株以2％的接种量接入MRS培养基中，与37℃条件下培养至对数末期，收集菌液。变异链球菌ATCC 25175以2％的接种量接入BHI培养基中，与37℃条件下培养至对数末期，收集菌液。菌液于4200rpm条件下离心10min后，收集菌体菌泥。菌泥经PBS清洗1次后(4200rpm离心5min)，重悬至OD600值为0.800±0.05，记录初始OD 值为Ap、Am。取变异链球菌与实验菌株菌悬液各1mL于5mL离心管中，37℃下静置存放，分别于4h、16h后测定上清液OD600值，记录为(Ap+m)。计算各菌株的共聚集能力，计算公式如下：共聚集能力＝((Ap+Am)/2-A(p+m))/(Ap+Am)/2*100％。结果如表4所示，乳酸乳球菌2311在4h、16h条件下共聚集能力均优于其他乳酸乳球菌对比菌株，与商业菌株唾液链球菌K12相似。
表4.共聚集能力实验结果
Figure BDA0002794711330000081
形成聚集物的能力和与致病菌良好的聚集能力对具有口腔健康应用的益生菌株而言非常重要，良好的自聚集能力有利于菌株在口腔的生存，与致病菌的聚集特性更能通过干扰病原体生物膜的形成来抑制和减少牙菌斑。本专利菌株在具有优秀的自聚集能力同时还具有与致病菌变异链球菌共聚集的能力。
实施例3：乳酸乳球菌的产酸特性
乳酸乳球菌2311、对照菌株唾液链球菌K12及其他乳酸乳球菌以1％的接种量接种到200mL MRS培养基中，过夜培养后，测定菌液酸度。同时通过平板稀释计数法，测定菌液的菌数。酸度计算公式如下：X＝c×V×100/(m×0.1)。
X＝发酵液酸度，以100g样品所消耗的0.1mol/L氢氧化钠毫升数计，单位为毫升每100g (mL/100g)。V＝滴定时所消耗的氢氧化钠标准溶液的体积，单位为毫升。C＝氢氧化钠标准溶液的摩尔浓度，单位为摩尔每升。M＝试样的质量，单位为克。最后以以下公式评价产酸能力：产酸能力＝酸度/108菌数，值越高代表产酸能力越强。结果如表5所示，乳酸乳球菌2311 的产酸能力不仅远弱于商业菌株唾液链球菌K12，还比同类乳酸乳球菌弱很多。
表5.产酸能力实验结果
Figure BDA0002794711330000082
实施例4：乳酸乳球菌产生挥发性硫化物的能力
取乳酸乳球菌2311、对比菌株唾液链球菌K12、其他乳酸乳球菌、牙龈卟啉单胞菌以1％的接种量接种到10mL含1％D-(+)-葡萄糖，0.5mM DL-蛋氨酸的改良GAM液体培养基(蛋白胨5g、大豆蛋白胨3g、示蛋白胨5g、消化血清粉10g、酵母提取物2.5g、半胱氨酸盐酸盐 0.3g、巯基乙酸钠0.3g、L-精氨酸1g、维生素k15mg、血红素10mg，磷酸二氢钾2.5g、氯化钠3.0g、水1L，pH7.3)中，厌氧培养24h后，在培养液中添加0.16mL的6M HCl使pH 降至1以下，使菌体物质代谢停止，取适量菌液于顶空气相瓶中，对具有挥发性的(硫化氢、甲硫醇、二甲基二硫醚)进行气相分析。结果如表6所示，乳酸乳球菌2311、唾液链球菌 K12及其他乳酸乳球菌均不产生硫化氢、甲硫醇、二甲基二硫醚、二甲基三硫醚等挥发性硫化物。
表6.挥发性硫化物实验结果
Figure BDA0002794711330000091
N.D.：not detected(未检测到)
实施例5：不同培养条件对乳酸乳球菌抑菌效果的影响
采用双层平板打孔扩散法进行菌株抑菌效果的测定。具体实施方法同实施例1。其中，本发明菌株发酵上清液的制备方法如下：将已活化的乳酸乳球菌2311以2％的接种量接入MRS 培养基中，分别于30、34、37℃条件下进行培养，于培养进行的2、4、6、8、10、12、14、 16、18、20、22、24h取菌发酵液。取菌株发酵液以4000g离心10min后，取上清，经pH 调整后，采用0.22μm滤膜进行过滤，获得无菌上清液用于抑菌实验。
表7.不同培养温度和培养时间对菌株抑菌效果的影响结果
Figure BDA0002794711330000092
Figure BDA0002794711330000101
“-”代表未观察到抑菌圈。
结果如上表所示，乳酸乳球菌2311培养至6h时，所分泌的代谢物开始具有抑菌效果。其中，在37℃培养条件下，抑菌效果随时间延长呈现先升高后降低的趋势。不同温度对抑菌作用的影响结果显示，乳酸乳球菌2311在30、34℃下的抑菌效果较37℃条件下明显，在相对较低温度的培养条件下有利于本发明菌株抑菌物质的产生与分泌。
实施例6：乳酸乳球菌2311在冻干酸奶块上的应用
准确称取全脂乳粉110g、蔗糖40g，溶入850g 55℃纯水中，低速搅拌溶解，剪切20min。剪切结束后室温下静置水合30min。之后溶解好后，加热均质。均质温度60～70℃，均质压力50/200bar。均质后加热至95℃保温杀菌5分钟，然后冷却至37℃，备用。在上述基料中接入6.0E+06cfu/mL的乳酸乳球菌2311，在37℃条件下发酵20h(图3为乳酸乳球菌2311在乳基中发酵的酸度变化曲线)。发酵终点酸奶PH＝4.5，活菌数达到5.0E+08cfu/mL。所得酸奶凝乳结实，无乳清析出，具有典型的酸香气味。
将上述酸奶置于200目筛网上过夜，过滤分离乳清并进一步浓缩后，进行冷冻干燥。所采用冷冻干燥工艺如下：1)预冻：-45℃4h；2)一次干燥：-20℃，0.3mbar，30h；3)二次干燥：20℃，0.1mbar，8h。最终获得的冻干酸奶块乳酸乳球菌活菌数达到2.0E+09cfu/g。传统生产工艺制成的酸奶块，尤其是较长的晒干环节，很容易失去益生菌活性并破坏其他营养成分。通过冷冻干燥机在低温真空条件下制得冻干酸奶块，能更好地保留益生菌的菌株活性和其他营养成分。同时，冻干酸奶块产品在口腔中能快速崩解，更利于本发明中所述菌株在口腔中释放、定植与发挥益生功效。
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (7)

1.一株可改善口腔健康的乳酸乳球菌，其特征在于：所述乳酸乳球菌命名为2311，已于2018年5月25日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCCNo.15812；微生物分类命名为乳酸乳球菌乳酸亚种Lactococcus lactis subsp. lactis。
2.一株可改善口腔健康的乳酸乳球菌的突变体，其特征在于，所述突变体为对权利要求1所述乳酸乳球菌进行诱变、驯化、基因重组或者经自然突变而获得的突变体。
3.一种含有如权利要求1所述乳酸乳球菌或含有如权利要求2所述突变体的菌体培养物。
4.如权利要求3所述的菌体培养物，其特征在于，所述菌体培养物为菌液或菌剂。
5.如权利要求1所述乳酸乳球菌或权利要求2所述突变体或权利要求3所述菌体培养物在制备预防口腔疾病或改善口腔健康的食品、药品、膳食补充剂或口腔护理制品中的应用。
6.一种可预防口腔疾病或改善口腔健康的组合物，其特征在于，含有权利要求1所述乳酸乳球菌和/或权利要求2所述突变体和/或权利要求3所述菌体培养物，以及含有生理上可接受的赋形剂和/或稀释剂。
7.如权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述组合物为食品、药品、膳食补充剂或口腔护理制品。
CN202011333119.2A 2020-11-24 2020-11-24 一株可改善口腔健康的乳酸乳球菌及其应用 Active CN112481155B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011333119.2A CN112481155B (zh) 2020-11-24 2020-11-24 一株可改善口腔健康的乳酸乳球菌及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011333119.2A CN112481155B (zh) 2020-11-24 2020-11-24 一株可改善口腔健康的乳酸乳球菌及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112481155A true CN112481155A (zh) 2021-03-12
CN112481155B CN112481155B (zh) 2023-05-26

Family

ID=74934127

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011333119.2A Active CN112481155B (zh) 2020-11-24 2020-11-24 一株可改善口腔健康的乳酸乳球菌及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112481155B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114806949A (zh) * 2022-05-06 2022-07-29 河北一然生物科技股份有限公司 乳酸乳球菌s133及其在改善肠道健康和提升免疫中的应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR19990024297A (ko) * 1997-08-07 1999-04-06 오종석 인체 구강내 치태형성을 억제하는 신규한 유산균
JP2010124772A (ja) * 2008-11-28 2010-06-10 Lion Corp 乳酸菌及びこれを含有する口腔用組成物、ならびに口腔内バイオフィルム形成抑制剤、ポルフィロモナス・ジンジバリス及び／又はフゾバクテリウム・ヌクレアタムの生育阻害剤、う蝕予防剤、歯周病予防・治療剤及び口臭改善・予防剤

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR19990024297A (ko) * 1997-08-07 1999-04-06 오종석 인체 구강내 치태형성을 억제하는 신규한 유산균
JP2010124772A (ja) * 2008-11-28 2010-06-10 Lion Corp 乳酸菌及びこれを含有する口腔用組成物、ならびに口腔内バイオフィルム形成抑制剤、ポルフィロモナス・ジンジバリス及び／又はフゾバクテリウム・ヌクレアタムの生育阻害剤、う蝕予防剤、歯周病予防・治療剤及び口臭改善・予防剤

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
徐磊: "学龄前乳牙列儿童唾液微生物群落分析", 《中国博士学位论文电子期刊全文数据库》 *
梁甲武等: "口腔乳杆菌作为口腔益生菌对牙周病影响的研究", 《口腔护理用品工业》 *
胡轶等: "益生菌对口腔健康的影响", 《广东牙病防治》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114806949A (zh) * 2022-05-06 2022-07-29 河北一然生物科技股份有限公司 乳酸乳球菌s133及其在改善肠道健康和提升免疫中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN112481155B (zh) 2023-05-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108048347B (zh) 鼠李糖乳杆菌、鼠李糖乳杆菌制剂及其用途
US5709857A (en) Lactobacillus strains of human origin, their compositons and uses thereof
EP4074817A1 (en) Lactobacillus rhamnosus x253 beneficial to oral health, separation and purification method therefor and use thereof
US20220218769A1 (en) Strain of Lactobacillus crispatus Capable of Preventing and/or Treating Helicobacter pylori Infection
CN110564638A (zh) 一株具有益生特性的罗伊氏乳杆菌及其用途
CN113430135B (zh) 一种有改善抑郁作用的瑞士乳杆菌菌株及其应用
TW202200029A (zh) 可促進排便的組合物及其用途
CN107099482B (zh) 一种戊糖片球菌及其应用
JP6033290B2 (ja) チャノキ葉から分離した新規なラクトバチルス・プランタラム
CN111635875A (zh) 一种长双歧杆菌cz70及其制备活菌型黑莓果浆的方法
CN111471626A (zh) 一株能够抑制幽门螺杆菌的瑞士乳杆菌及其应用
CN111528283A (zh) 一种具有抗疲劳作用和可提高机体疲劳耐受能力的鼠李糖乳杆菌x253的应用
CN112481155A (zh) 一株可改善口腔健康的乳酸乳球菌及其应用
CN112458016B (zh) 两歧双歧杆菌i771、其分离纯化方法及应用
KR100707102B1 (ko) 헬리코박터 파이로리 및 유해미생물의 증식을 억제하는 김치 유산균, 이를 이용한 김치의 제조방법 및 이의 용도
CN114214256A (zh) 一株用于防治泌尿生殖感染的格氏乳杆菌及其应用
CN117264806B (zh) 一株凝结魏茨曼氏菌及其在抑制口腔致病菌中的应用
CN113273697A (zh) 一种抑制变异链球菌的益生菌组合物及其应用
CN116925980A (zh) 一株缓解鼠伤寒沙门氏菌感染的格氏乳杆菌及其应用
EP2785878B1 (en) Reuterin-producing lactobacillus brevis
CN111454862A (zh) 一种具有口腔保健功能的副干酪乳杆菌冻干粉、制备方法及应用
US20220313756A1 (en) Method for alleviating helicobacter pylori-associated disorder using culture of lactic acid bacterial strain
KR100725012B1 (ko) 한국인 성인 장내 분리, 유기산 생성능이 우수하여변비개선능과 정장작용이 탁월한 신규 락토바실러스애시도필러스 에이취와이 7036 및 이를 함유하는 제품
CN104673702A (zh) 一株弯曲乳酸杆菌(Lactobacillus crispatus)及其制药用途
KR20020072807A (ko) 면역 증강 효과를 갖는 신규 락토바실러스 속 미생물

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant