CN112472794A - 双靶点激动剂多肽治疗anit介导的pbc及其相关的肝纤维化 - Google Patents

双靶点激动剂多肽治疗anit介导的pbc及其相关的肝纤维化 Download PDF

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CN112472794A CN202011285180.4A CN202011285180A CN112472794A CN 112472794 A CN112472794 A CN 112472794A CN 202011285180 A CN202011285180 A CN 202011285180A CN 112472794 A CN112472794 A CN 112472794A
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Abstract

本发明涉及一类具有胰高血糖素样肽‑1受体(Glucagon‑like peptide‑1 receptor，GLP‑1R)和胰高血糖素受体(Glucagon receptor，GCGR)双激动效应的多肽化合物及相关类似物多肽的用途。此类化合物能够明显改善α‑萘基异硫氰酸酯(ANIT)介导胆汁淤积所诱发的肝脏功能异常,主要表现为改善肝脏胆红素代谢紊乱，和减缓肝脏损伤进程。试验终点肝脏大体解剖及肝脏组织病理学检测结果表明，此类化合物对ANIT介导的肝脏组织病理学损伤具有明显的修复作用，主要表现为抑制肝脏坏死灶进程、改善汇管区炎症细胞浸润及抑制肝脏胆管增生及其纤维化进程三个方面。提示此双靶点激动剂可用于预防或治疗胆汁性肝硬化及相关肝纤维化疾病。

Description

双靶点激动剂多肽治疗ANIT介导的PBC及其相关的肝纤维化
技术领域
本发明涉及一种双靶点激动剂多肽的应用，特别涉及一种激动剂多肽用于治疗α-萘基异硫氰酸酯介导的原发性胆汁性肝硬化及其相关的肝纤维化中的应用。
背景技术
随着生物技术与多肽合成技术的日臻成熟，越来越多的多肽药物被开发并应用于临床。多肽药物作为新一类药物，在临床应用上和生产制备上体现了自身的优越性，在临床应用上跟单抗药物、重组蛋白药物相似，特异性强，疗效好；在生产制备方式上，多肽药物偏向小分子化药，质量可控，纯度高，结构容易鉴定。多肽药物的主要优势在于特异性好和选择性好，很低的浓度就有很高的药效。目前已广泛应用于肿瘤、肝炎、糖尿病、艾滋病等慢性疾病的预防、诊断和治疗，多肽药物具有广阔的开发前景。
原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis,PBC)，是一种自身免疫性、慢性进行性胆汁淤积性肝脏疾病。PBC的主要病理特征为肝脏门静脉炎性细胞浸润和免疫系统介导的肝小叶胆管损伤[1]。胆管损伤进而引起胆汁淤积以及渐进性的肝脏损伤，病情可进一步发展为肝纤维化、肝硬化，最终导致肝脏衰竭，从而必需依靠肝脏移植来治疗[2]。PBC的患病率因地区差异而不同，流行病学调查资料显示，加拿大的患病率为22.4/10万、日本为2.7/10万、澳大利亚为1.9/10万、英国则为20～25/10万[3]。美国的患病率为40.2/10万[4]，在我国PBC的患病率则高达49.2/10万，其中40岁以上女性的患病率为155.8/10万[5]。
美国食品药品监督管理局(FDA)批准的用于治疗PBC的药物只有熊去氧胆酸(ursodeoxycholic acid,UDCA)和奥贝胆酸(obeticholic acid,OCA)。高达40％的患者对UDCA应答欠佳，对UDCA无应答或应答不完全可影响疾病预后，肝移植或肝脏相关死亡风险亦明显增加[6]。2016年，OCA(商品名： Ocaliva)经美国FDA批准上市，终结了在PBC治疗上面UDCA长达19年孤儿药的历史。OCA作为一种通过激动法尼醇X受体调节胆汁酸代谢的药物，主要用于对UDCA应答不佳的PBC患者。OCA治疗过程中存在较为突出的瘙痒和高密度脂蛋白胆固醇降低等不良反应，目前还不能明确是否会加重心血管疾病的风险[7]。部分患者甚至因为严重瘙痒而被迫停药，考虑到患者用药的依从性，这可能是OCA普及应用的一个阻碍[8]。目前OCA价格昂贵，药物经济学分析认为OCA在费用－疗效比方面并不乐观，尚有待进一步优化提高[9]。 PBC发病机制的假说、学说有多种，报道较多的是自身抗体，遗传易感基因及分子模拟机制。尽管在分子生物学方面的研究，已有了长足的进展，但对 PBC的治疗却不尽人意。迄今为止，尚缺乏能够有效治疗肝纤维化、肝硬化的药物。因此，积极寻找抗肝纤维化的药物迫在眉睫。
发明内容
本发明的目的在于提供一种该类GLP-1R/GCGR双靶点激动剂多肽的新用途，具体提供一种该类GLP-1R/GCGR双靶点激动剂多肽在抑制和改善α- 萘基异硫氰酸酯(ANIT)介导的胆汁性肝硬化及相关肝纤维化病程方面的生物活性及治疗用途。
为达上述目的，本发明提供一种双靶点激动剂多肽在制备用于预防或治疗 ANIT介导的PBC及其相关的肝纤维化药物中的应用，所述双靶点激动剂多肽具有以下氨基酸序列表示的母体肽：
His-Xaa2-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa10-Ser-Lys-Xaa13-Leu-Asp-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Ala-Xaa20-Xaa21-Phe-Xaa23-Xaa24-Trp-Leu-Xaa27-Xaa28-Xa a29-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-COR1
其中，R1＝-NH2；
Xaa2＝Aib或D-Ser；
Xaa10＝Lys或Tyr；
Xaa13＝Lys或Tyr；
Xaa16＝Glu或Lys；
Xaa17＝Lys或Arg；
Xaa18＝Arg或Ala；
Xaa20＝His，Gln或Lys；
Xaa21＝Asp或Glu；
Xaa23＝IIe或Val；
Xaa24＝Glu或Gln；
Xaa27＝Met，Leu或Nle；
Xaa28＝Asn，Asp或Arg；
Xaa29＝Gly或Thr。
所述Xaa10，Xaa16，Xaa17或Xaa20中至少一个为Lys，所述至少一个 Lys或所述氨基酸序列的第12位Lys的侧链与亲脂性的取代基相连接，所述连接方式为所述亲脂性的取代基以其羧基与桥接基团的氨基形成酰胺键，所述桥接基团的羧基与所述母体肽的Lys的N-末端残基形成酰胺键以连接到所述母体肽上，所述桥接基团为Glu，Asp和/或(PEG)m，其中m为2-10的整数；所述亲脂性的取代基为选自CH3(CH2)nCO-或HOOC(CH2)nCO-的酰基，其中n是10-24的整数。
当所述氨基酸序列的第10、12、16、17或20位为Lys时，所述Lys侧链与所述亲脂性取代基及所述桥接基团连接为下述结构之一：
Figure BDA0002782141060000031
Figure BDA0002782141060000041
Figure BDA0002782141060000051
本发明中涉及的化合物基于理论分子内桥可以稳定分子的螺旋结构，从而提高了针对GLP-1R或GCGR的效力和/或选择性。本发明化合物在序列中携带一个或多个分子内桥。这样的桥是由两个氨基酸残基的侧链之间形成，所述两个氨基酸残基通常被线性序列中的三个氨基酸所分隔。例如所述桥可在残基对12与16、16与20、17与21或者20与24侧链之间形成。两个侧链可通过离子相互作用或通过共价键彼此相连接。因此，这些残基对可包含带相反电荷的侧链，从而通过离子相互作用形成盐桥。例如，一个残基可以是Glu或Asp，而另一残基可以是Lys或Arg，Lys与Glu配对以及Lys与Asp配对可以分别发生反应形成内酰胺环。
本发明的所述亲脂性的取代基连接的Lys可被HomoLys、Orn、Dap或Dab 代替。
本发明的所述母体肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:9，SEQID NO:10，SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:14，SEQ ID NO:15，SEQID NO:16，SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18，SEQ ID NO:19，SEQ ID NO:20，SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:22， SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:24，SEQ ID NO:25母体肽的氨基酸序列。
本发明还提供含有本发明的GLP-1R/GCGR双靶点激动剂多肽的药物组合物，以所述GLP-1R/GCGR双靶点激动剂多肽作为活性成分添加药学上可接受的载体和/或辅料制成药物组合物。
本领域技术人员可以理解，本发明的药物组合物适用于各种给药方式，例如口服给药、经皮给药、静脉给药、肌肉内给药、局部给药、经鼻给药等。根据所采用的给药方式，可将本发明的多肽衍生物药物组合物制成各种合适的剂型，其中包含至少一种有效量的本发明的多肽衍生物和至少一种药学上可接受的药用载体。
适当剂型的实例为片剂、胶囊、糖衣片剂、粒剂、口服溶液和糖浆、用于皮肤表面的油膏和药贴、气雾剂、鼻喷剂、以及可用于注射的无菌溶液。
含有本发明多肽衍生物的药物组合物可以制成溶液或者冻干粉以用于胃肠外给药，在使用前可加入适当溶剂或其他可药用的载体将粉末重新配制，液体配方一般是缓冲液、等渗溶液和水溶液。
本发明人经过大量的实验研究，证明该类双靶点激动剂多肽能够显著抑制体外人肝星状细胞LX-2的活化，提示活性多肽具有良好的体外抗肝纤维化效应。同时该类多肽能够明显改善α-萘基异硫氰酸酯(ANIT)介导胆汁淤积所诱发的肝脏功能异常,主要表现为改善肝脏胆红素代谢紊乱和减缓肝脏损伤进程。试验终点肝脏大体解剖及肝脏组织病理学检测结果表明，此类化合物对 ANIT介导的肝脏组织病理学损伤具有明显的修复作用，主要表现为抑制肝脏坏死灶进程、改善汇管区炎症细胞浸润及抑制肝脏胆管增生及其纤维化进程三个方面。提示此双靶点激动剂多肽可用于预防或治疗ANIT介导的胆汁性肝硬化及相关肝纤维化疾病，该类双靶点激动剂多肽对胆汁性肝硬化等疾病具有显著的治疗作用。
本发明的双靶点激动剂多肽对ANIT诱介导引起的肝纤维化病程疾病具有改善和治疗作用。本发明的双靶点激动剂多肽可用于直接或间接治疗由ANIT 介导引起的肝纤维化及相关肝纤维化病程所引起的或者以其为特征的病症。
本发明的双靶点激动剂多肽在药物组合物中的用量可以在较大范围内变动，本领域技术人员可以根据一些客观的因素如疾病的种类、病情严重程度、患者体重、剂型、给药途径等因素很容易地加以确定。
本发明的双靶点激动剂多肽优点在于：
1)具有良好的生物学活性；
2)在药物的药代实验中显示稳定性，稳定性好，易于放大生产，成本低；
3)与小分子化合物相比具有更低毒性，安全窗口更大，用量更小。
4)能用于抑制和改善α-萘基异硫氰酸酯(ANIT)介导的胆汁性肝硬化及相关肝纤维化。
在具体的实施方案中，涉及下述GLP-1R/GCGR双靶点激动剂多肽衍生物，其具有序列：
化合物1(涉及SEQ ID NO:1)：
His-(D-Ser)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Lys(PEG2-P EG2-γGlu-CO(CH2)14CH3)-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn- Thr-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2
H-(d-S)-QGTFTSDYSKYLD-K(PEG2-PEG2-γGlu-CO(CH2)14CH3)-RRAQDFVQWLMNTGGPSSGAPPPS-NH2
化合物2(涉及SEQ ID NO:2)：
His-(D-Ser)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Lys(PE G2-PEG2-γGlu-CO(CH2)16CO2H)-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2
H-(d-S)-QGTFTSDYSKYLDE-K(PEG2-PEG2-γGlu-CO(CH2)16CO2H)-RAQDFVQWLMNTGGPSSGAPPPS-NH2
化合物3(涉及SEQ ID NO:3)：
His-Aib-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Lys(PEG2-PEG2-γGlu-CO(CH2)14CO2H)-S er-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Leu-Asp-Gly-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2
H-Aib-QGTFTSD-K(PEG2-PEG2-γGlu-CO(CH2)14CO2H)-SKYLDERRAQDFVQWLLDGGGPSSGAPPPS-NH2
化合物4(涉及SEQ ID NO:4)：
His-Aib-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Lys(PEG2-PEG2-γGlu-CO(CH2)16CH3)-Ser -Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Leu-Asp-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2
H-Aib-QGTFTSD-K(PEG2-PEG2-γGlu-CO(CH2)16CH3)-SKYLDERRAQDFVQWLLDGGPSSGAPPPS-NH2
化合物5(涉及SEQ ID NO:5)：
His-Aib-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Lys(PEG2-PEG2-γGlu-CO(CH2)16CO2H)-S er-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Leu-Asp-Gly-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2
H-Aib-QGTFTSD-K(PEG2-PEG2-γGlu-CO(CH2)16CO2H)-SKYLDERRAQDFVQWLLDGGGPSSGAPPPS-NH2
化合物6(涉及SEQ ID NO:6)：
His-Aib-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Lys(PEG2-PEG2-γGlu-CO(CH2)14CH3)-Ser -Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Leu-Asp-Gly-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2
H-Aib-QGTFTSD-K(PEG2-PEG2-γGlu-CO(CH2)14CH3)-SKYLDERRAQDFVQWLLDGGGPSSGAPPPS-NH2
化合物7(涉及SEQ ID NO:7)：
His-(D-Ser)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Lys-Lys(PE G2-PEG2-γGlu-CO(CH2)16CO2H)-Ala-Ala-His-Asp-Phe-Val-Glu-Trp-Leu-Leu-Arg-Thr-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2
H-(d-S)-QGTFTSDYSKYLDK-K(PEG2-PEG2-γGlu-CO(CH2)16CO2H)-AAHDFVEWLLRTGGPSSGAPPPS-NH2
化合物8(涉及SEQ ID NO:8)：
His-(D-Ser)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Lys-Ala -Ala-Lys(PEG2-PEG2-γGlu-CO(CH2)16CO2H)-Glu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Leu-Arg- Thr-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2
H-(d-S)-QGTFTSDYSKYLDEKAA-K(PEG2-PEG2-γGlu-CO(CH2)16CO2H)-EFIEWLLRTGGPSSGAPPPS-NH2
化合物9(涉及SEQ ID NO:9)：
His-(D-Ser)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Lys(PE G2-PEG2-γGlu-CO(CH2)16CO2H)-Ala-Ala-His-Asp-Phe-Val-Glu-Trp-Leu-Leu-Asn-Gly-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2
H-(d-S)-QGTFTSDYSKYLDE-K(PEG2-PEG2-γGlu-CO(CH2)16CO2H)-AAHDFVEWLLNGGGPSSGAPPPS-NH2
化合物10(涉及SEQ ID NO:10)：
His-(D-Ser)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Lys-Ala -Ala-Lys(PEG2-PEG2-γGlu-CO(CH2)14CH3)-Glu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Leu-Arg--Gly-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2
H-(d-S)-QGTFTSDYSKYLDEKAA-K(PEG2-PEG2-γGlu-CO(CH2)14CH3)-EFIEWLLRGGGPSSGAPPPS-NH2
化合物11(涉及SEQ ID NO:11)：
His-(D-Ser)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Lys-Ala -Ala-Lys(PEG2-PEG2-γGlu-CO(CH2)16CH3)-Glu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Leu-Arg--Gly-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2
H-(d-S)-QGTFTSDYSKYLDEKAA-K(PEG2-PEG2-γGlu-CO(CH2)16CH3)-EFIEWLLRGGGPSSGAPPPS-NH2
化合物12(涉及SEQ ID NO:12)：
His-(D-Ser)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Lys-Ala -Ala-Lys(PEG2-PEG2-γGlu-CO(CH2)16CO2H)-Glu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Leu-Asn- Gly-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2
H-(d-S)-QGTFTSDYSKYLDEKAA-K(PEG2-PEG2-γGlu-CO(CH2)16CO2H)-EFIEWLLNGGGPSSGAPPPS-NH2
化合物13(涉及SEQ ID NO:13)：
His-(D-Ser)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Lys-Ala -Ala-Lys(PEG2-PEG2-γGlu-CO(CH2)14CO2H)-Glu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Leu-Asn- Gly-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2
H-(d-S)-QGTFTSDYSKYLDEKAA-K(PEG2-PEG2-γGlu-CO(CH2)14CO2H)-EFIEWLLNGGGPSSGAPPPS-NH2
化合物14(涉及SEQ ID NO:14)：
His-(D-Ser)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Lys-Ala -Ala-Lys(PEG2-PEG2-γGlu-CO(CH2)16CH3)-Glu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Leu-Asn-Gl y-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2
H-(d-S)-QGTFTSDYSKYLDEKAA-K(PEG2-PEG2-γGlu-CO(CH2)16CH3)-EFIEWLLNGGGPSSGAPPPS-NH2
化合物15(涉及SEQ ID NO:15)：
His-(D-Ser)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Lys-Ala -Ala-Lys(PEG2-PEG2-γGlu-CO(CH2)14CH3)-Glu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Leu-Asn-Gl y-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2
H-(d-S)-QGTFTSDYSKYLDEKAA-K(PEG2-PEG2-γGlu-CO(CH2)14CH3)-EFIEWLLNGGGPSSGAPPPS-NH2
化合物16(涉及SEQ ID NO:16)：
His-(D-Ser)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Lys-Lys(PE G2-PEG2-γGlu-CO(CH2)14CH3)-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2
H-(d-S)-QGTFTSDYSKYLDK-K(PEG2-PEG2-γGlu-CO(CH2)14CH3)-RAQDFVQWLMNTGGPSSGAPPPS-NH2
化合物17(涉及SEQ ID NO:17)：
His-(D-Ser)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Lys(PEG2-P EG2-γGlu-CO(CH2)16CO2H)-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn -Thr-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2
H-(d-S)-QGTFTSDYSKYLD-K(PEG2-PEG2-γGlu-CO(CH2)16CO2H)-RRAQDFVQWLMNTGGPSSGAPPPS-NH2
化合物18(涉及SEQ ID NO:18)：
His-(D-Ser)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Lys(PEG2-P EG2-CO(CH2)16CO2H)-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2
H-(d-S)-QGTFTSDYSKYLD-K(PEG2-PEG2-CO(CH2)16CO2H)-RRAQDFVQWLMNTGGPSSGAPPPS-NH2
化合物19(涉及SEQ ID NO:19)：
His-(D-Ser)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Lys(PEG2-P EG2-γGlu-CO(CH2)16CH3)-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn- Thr-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2
H-(d-S)-QGTFTSDYSKYLD-K(PEG2-PEG2-γGlu-CO(CH2)16CH3)-RRAQDFVQWLMNTGGPSSGAPPPS-NH2
化合物20(涉及SEQ ID NO:20)：
His-(D-Ser)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Lys(PEG2-P EG2-γGlu-CO(CH2)14CH3)-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Nle -Asn-Thr-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2
H-(d-S)-QGTFTSDYSKYLD-K(PEG2-PEG2-γGlu-CO(CH2)14CH3)-RRAQDFVQ WL-Nle-NTGGPSSGAPPPS-NH2
化合物21(涉及SEQ ID NO:21)：
His-(D-Ser)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Lys(PEG2-P EG2-γGlu-CO(CH2)16CO2H)-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Nle-Asn -Thr-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2
H-(d-S)-QGTFTSDYSKYLD-K(PEG2-PEG2-γGlu-CO(CH2)16CO2H)-RRAQDFV QWL-Nle-NTGGPSSGAPPPS-NH2
化合物22(涉及SEQ ID NO:22)：
His-(D-Ser)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Lys(PEG2-P EG2-γGlu-CO(CH2)16CO2H)-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Leu-Asn -Thr-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2
H-(d-S)-QGTFTSDYSKYLD-K(PEG2-PEG2-γGlu-CO(CH2)16CO2H)-RRAQDFVQWLLNTGGPSSGAPPPS-NH2
化合物23(涉及SEQ ID NO:23)：
His-(D-Ser)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Lys(PEG2-P EG2-γGlu-CO(CH2)14CH3)-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Leu-Asn- Thr-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2
H-(d-S)-QGTFTSDYSKYLD-K(PEG2-PEG2-γGlu-CO(CH2)14CH3)-RRAQDFVQWLLNTGGPSSGAPPPS-NH2
化合物24(涉及SEQ ID NO:24)：
His-(D-Ser)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Lys(PEG2-P EG2-CO(CH2)16CO2H)-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Nle-Asn-Thr-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2
H-(d-S)-QGTFTSDYSKYLD-K(PEG2-PEG2-CO(CH2)16CO2H)-RRAQDFVQWL- Nle-NTGGPSSGAPPPS-NH2
化合物25(涉及SEQ ID NO:25)：
His-(D-Ser)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Lys(PEG2-P EG2-CO(CH2)14CH3)-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Leu-Asn-Thr-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2
H-(d-S)-QGTFTSDYSKYLD-K(PEG2-PEG2-CO(CH2)14CH3)-RRAQDFVQWLLNTGGPSSGAPPPS-NH2
本发明中所用缩写具体含义如下:
Boc为叔丁氧羰基，Fmoc为芴甲氧羰基，t-Bu为叔丁基，ivDDe为1-(4,4- 二甲基-2,6-二氧代亚环己基)-3-甲基-丁基的脱除与亲脂取代基，resin为树脂， TFA为三氟乙酸，EDT为1,2-乙二硫醇，Phenol为苯酚，FBS为胎牛血清，BSA为牛血清白蛋白，HPLC为高效液相，GLP-1R为胰高血糖素样肽1受体， GCGR为胰高血糖素受体，GLP-1为胰高血糖素样肽，mPEG为单甲氧基聚乙烯二醇，OXM为胃泌酸调节素，His为组氨酸，Ser为丝氨酸，D-Ser为D-型丝氨酸，Gln为谷氨酰胺，Gly为甘氨酸，Glu为谷氨酸，Ala为丙氨酸，Thr 为苏氨酸，Lys为赖氨酸，Arg为精氨酸，Tyr为酪氨酸，Asp为天冬氨酸，Trp 为色氨酸，Phe为苯丙氨酸，IIe为异亮氨酸，Leu为亮氨酸，Cys为半胱氨酸， Pro为脯氨酸，Val为缬氨酸，Met为蛋氨酸，Asn为天冬酰胺，HomoLys为高赖氨酸，Orn为鸟氨酸，Dap为二氨基庚二酸，Dab为2,4-二氨基丁酸，Nle 为正亮氨酸，Aib为2-氨基异丁酸，AEEA为[2-[2-(氨基)乙氧基]乙氧基]乙酸。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1：为实施例2中，6组大鼠在试验期间的体重变化图。
图2A：为实施例2中，6组大鼠在试验中期和试验终点时，血样中胆红素含量情况柱状图。
图2B：为实施例2中，6组大鼠在试验中期和试验终点时，血样中碱性磷酸酯酶、谷丙转氨酶和谷草转氨酶含量情况柱状图。
图3A：为实施例2中，6组大鼠在试验终点时，肝脏重量及肝体指数柱状图。
图3B：为实施例2中，6组大鼠在试验终点时，肝脏组织切片图。
图3C：为实施例2中，6组大鼠在试验终点时，肝脏组织经天狼星红染色切片图及肝脏胶原容积分数柱状图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。除非另有说明，否则所用试剂或仪器均可以通过市购获得。
实施例1、双靶点激动剂多肽的合成
材料:
所有的氨基酸购自NovaBiochem公司。如果没有特别说明，其他所有试剂均为分析纯，购自Sigma公司。采用Protein Technologies PRELUDE 6通道多肽合成仪。PhenomenexLuna C18制备柱(46mm x250mm)用来纯化多肽。高效液相色谱仪为Waters公司产品。质谱分析采用Agilent质谱仪进行测定。
以多肽化合物1为例说明本发明多肽化合物的合成方法：
化合物1的结构序列：
His-(D-Ser)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Lys(PE G2-PEG2-γGlu-CO(CH2)14CH3)-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-M et-Asn-Thr-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2
a)主肽链组装：
按照Fmoc/t-Bu策略在CS336X多肽合成仪(美国CS Bio公司)上合成 0.25mmol规模的如下多肽：
Boc-His(Boc)-D-Ser(t-Bu)-Gln(OtBu)-Gly-Thr(t-Bu)-Phe-Thr(t-Bu)-Ser(tBu) -Asp(OtBu)-Tyr(t-Bu)-Ser(t-Bu)-Lys(Boc)-Tyr(t-Bu)-Leu-Asp(OtBu)-Lys(ivDde)- Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Ala-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Phe-Val-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Met- Asn(Trt)-Thr(t-Bu)-Gly-Gly-Pro-Ser(t-Bu)-Ser(t-Bu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(t-B u)-rink amide树脂
(1)第一步：将0.75克Rink amide MBHA-LL树脂(Novabiochem，上样0.34mmol/g)在二氯甲烷(DCM)中溶胀一个小时，用N,N-二甲基甲酰胺 (DMF)充分洗涤树脂3次；
(2)第二步：以Rink amide树脂为载体，以偶联剂由6-氯苯并三氮唑 -1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯(HCTU)、有机碱N,N-二异丙基乙胺(DIEPA) 两者按物质的量比1:1，以N,N-二甲基甲酰胺(DMF)为溶剂，进行程序反应，依次进行缩合反应连接
Fmoc-Ser(t-Bu)-OH，Fmoc-Pro-OH(3x)，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Gly-OH， Fmoc-Ser(t-Bu)-OH(2x)，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Gly-OH(2x)， Fmoc-Thr(t-Bu)-OH，Fmoc-Asn(Trt)-OH，Fmoc-Met-OH，Fmoc-Leu-OH， Fmoc-Trp(Boc)-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Phe-OH， Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Gln(Trt)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH(2x)，Fmoc-Lys(ivDde)-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Leu-OH， Fmoc-Tyr(t-Bu)-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Ser(t-Bu)-OH， Fmoc-Tyr(t-Bu)-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Ser(t-Bu)-OH， Fmoc-Thr(t-Bu)-OH，Fmoc-Phe-OH，Thr(t-Bu)-OH，Fmoc-Gly-OH， Fmoc-Gln(Trt)-OH，Fmoc-D-Ser(t-Bu)-OH，Boc-His(Boc)-OH得到：
Boc-His(Boc)-D-Ser(t-Bu)-Gln(OtBu)-Gly-Thr(t-Bu)-Phe-Thr(t-Bu)-Ser(tBu) -Asp(OtBu)-Tyr(t-Bu)-Ser(t-Bu)-Lys(Boc)-Tyr(t-Bu)-Leu-Asp(OtBu)-Lys(ivDde)- Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Ala-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Phe-Val-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Met- Asn(Trt)-Thr(t-Bu)-Gly-Gly-Pro-Ser(t-Bu)-Ser(t-Bu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(t-B u)-rink amide树脂。此后依次用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，二氯甲烷(DCM)，甲醇(Methanol)，二氯甲烷(DCM)，N,N-二甲基甲酰胺(DMF)充分洗涤树脂各3次。
在反应中，1)第一个氨基酸Fmoc-Ser(t-Bu)-OH的用量与树脂用量的物质的量比为1:1～6:1；2)接下来的每次缩合反应中Fmoc保护氨基酸，6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯(HCTU)，有机碱N,N-二异丙基乙胺 (DIEPA)的用量均过量2～8倍，反应时间为1～5个小时。
b)1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代亚环己基)-3-甲基-丁基(ivDde)的脱除与亲脂取代基的引入：
用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)/二氯甲烷(DCM)＝1:1(体积比)的溶液中将树脂洗涤两次，加入新鲜制备的3.0％的肼水合物N,N-二甲基甲酰胺 (DMF)溶液，将该反应混合物在室温下振荡10～30分钟进行肼处理步骤，然后过滤。将肼处理步骤重复5次得到：
Boc-His(Boc)-D-Ser(t-Bu)-Gln(OtBu)-Gly-Thr(t-Bu)-Phe-Thr(t-Bu)-Ser(tBu) -Asp(OtBu)-Tyr(t-Bu)-Ser(t-Bu)-Lys(Boc)-Tyr(t-Bu)-Leu-Asp(OtBu)-Lys-Arg(Pbf )-Arg(Pbf)-Ala-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Phe-Val-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Met-Asn(Trt) -Thr(t-Bu)-Gly-Gly-Pro-Ser(t-Bu)-Ser(t-Bu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(t-Bu)-rink amide树脂。此后依次用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，二氯甲烷(DCM)，甲醇(Methanol)，二氯甲烷(DCM)，N,N-二甲基甲酰胺(DMF)充分洗涤树脂各3次。
加入FmocNH-PEG2-OH(Quanta BioDesign)，2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)，二异丙基乙基胺(DIEPA)的 N,N-二甲基甲酰胺(DMF)混合偶联液(均过量5倍)，振荡2小时后，过滤。此后依次用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，二氯甲烷(DCM)，甲醇(Methanol)，二氯甲烷(DCM)，N,N-二甲基甲酰胺(DMF)充分洗涤树脂各3次得到：
Boc-His(Boc)-D-Ser(t-Bu)-Gln(OtBu)-Gly-Thr(t-Bu)-Phe-Thr(t-Bu)-Ser(tBu) -Asp(OtBu)-Tyr(t-Bu)-Ser(t-Bu)-Lys(Boc)-Tyr(t-Bu)-Leu-Asp(OtBu)-Lys(Fmoc-P EG2)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Ala-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Phe-Val-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Leu -Met-Asn(Trt)-Thr(t-Bu)-Gly-Gly-Pro-Ser(t-Bu)-Ser(t-Bu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-S er(t-Bu)-rink amide树脂。此后依次用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，二氯甲烷 (DCM)，甲醇(Methanol)，二氯甲烷(DCM)，N,N-二甲基甲酰胺(DMF) 充分洗涤树脂各3次。
20％的哌啶(Piperidine)/N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液脱除Fmoc基团(30分钟，重复脱除两次)，加入Fmoc-PEG2-OH，2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)，二异丙基乙基胺(DIEPA)的 N,N-二甲基甲酰胺(DMF)混合偶联液(均过量5倍)，进行偶联反应得到：
Boc-His(Boc)-D-Ser(t-Bu)-Gln(OtBu)-Gly-Thr(t-Bu)-Phe-Thr(t-Bu)-Ser(tBu) -Asp(OtBu)-Tyr(t-Bu)-Ser(t-Bu)-Lys(Boc)-Tyr(t-Bu)-Leu-Asp(OtBu)-Lys(Fmoc-P EG2-PEG2)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Ala-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Phe-Val-Gln(Trt)-Trp(Bo c)-Leu-Met-Asn(Trt)-Thr(t-Bu)-Gly-Gly-Pro-Ser(t-Bu)-Ser(t-Bu)-Gly-Ala-Pro-Pro -Pro-Ser(t-Bu)-rink amide树脂。此后依次用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，二氯甲烷(DCM)，甲醇(Methanol)，二氯甲烷(DCM)，N,N-二甲基甲酰胺(DMF) 充分洗涤树脂各3次。
20％的哌啶(Piperidine)/N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液脱除Fmoc基团(30分钟，重复脱除两次)，然后按照常规条件依次偶联Fmoc-γGlu-OtBu，加入十六酸(棕榈酸)得到：
Boc-His(Boc)-D-Ser(t-Bu)-Gln(OtBu)-Gly-Thr(t-Bu)-Phe-Thr(t-Bu)-Ser(tBu) -Asp(OtBu)-Tyr(t-Bu)-Ser(t-Bu)-Lys(Boc)-Tyr(t-Bu)-Leu-Asp(OtBu)-Lys(PEG2-P EG2-C16)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Ala-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Phe-Val-Gln(Trt)-Trp(Boc) -Leu-Met-Asn(Trt)-Thr(t-Bu)-Gly-Gly-Pro-Ser(t-Bu)-Ser(t-Bu)-Gly-Ala-Pro-Pro-P ro-Ser(t-Bu)-rink amide树脂。此后依次用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，二氯甲烷(DCM)，甲醇(Methanol)，二氯甲烷(DCM)充分洗涤树脂各3次后，真空抽干。
c)多肽全保护的脱除：
Boc-His(Boc)-D-Ser(t-Bu)-Gln(OtBu)-Gly-Thr(t-Bu)-Phe-Thr(t-Bu)-Ser(tBu) -Asp(OtBu)-Tyr(t-Bu)-Ser(t-Bu)-Lys(Boc)-Tyr(t-Bu)-Leu-Asp(OtBu)-Lys(PEG2-P EG2-C16)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Ala-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Phe-Val-Gln(Trt)-Trp(Boc) -Leu-Met-Asn(Trt)-Thr(t-Bu)-Gly-Gly-Pro-Ser(t-Bu)-Ser(t-Bu)-Gly-Ala-Pro-Pro-P ro-Ser(t-Bu)-rink amide树脂加入切割液TFA/Phenol/thioanisole/EDT/H2O(82.5:5:5:2.5:5，体积比)中，升温，控制裂解液温度25℃，反应2.5小时。过滤，滤饼用少量裂解液洗涤3次，合并滤液。滤液在搅拌下缓慢倒入冰乙醚中。静置2小时以上，待沉淀完全，离心，用冰乙醚洗涤沉淀3次，得到粗品化合物：
His-(D-Ser)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Lys(PE G2-PEG2-γGlu-CO(CH2)14CH3)-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-M et-Asn-Thr-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2
d)多肽化合物的精制纯化：
将所得粗品化合物溶于乙腈(ACN)/H2O＝1:2(体积比)的溶液中，通过5.0mm反相C18填充的46mm x 250mm柱上进行制备型HPLC纯化。用 30％乙腈(含0.05％三氟乙酸)/H2O(含0.05％三氟乙酸)为起始，以梯度 (1.33％/min的速度增加乙腈的比例)，流速为15mL/min将该柱洗脱30分钟，收集含有肽的组分，冷冻抽干，得到HPLC纯度大于95％的纯品。用液质联用分析分离出的产物。
基于以上合成步骤，合成本发明的如下多肽化合物(表1)：
表1、本发明实施例中所合成的多肽化合物结构：
Figure BDA0002782141060000181
Figure BDA0002782141060000191
Figure BDA0002782141060000201
Figure BDA0002782141060000211
实施例2、双靶点激动剂多肽对α-萘基异硫氰酸酯(ANIT)诱介导的胆汁性肝硬化大鼠模型的改善治疗作用
试验设计依据：原发性胆汁淤积性肝硬化(PrimaryBiliaryCirrhosis,PBC)，主要病理特点表现为进行性、破坏性肝内小胆管炎，导致肝脏胆汁通过障碍进而诱发胆汁淤积性肝炎/肝硬化，最终可发展至肝硬化。α-异硫氰酸萘酯(ANIT) 是一种能形成明显胆汁淤积性肝病的肝毒剂，主要表现为肝细胞变性坏死，肝内胆管上皮细胞损伤，肝小叶间胆管周围产生炎症细胞浸润，从而诱发肝脏胆汁通过障碍，出现胆汁淤积病变导致胆管上皮细胞增生及肝脏纤维化/硬化进程。大鼠对ANIT具备显著敏感性，是构建该类疾病模型的敏感动物种属，因此选用ANIT在Wistar大鼠上构建原发性胆汁淤积性肝硬化模型，进行评价此类双靶点激动剂多肽在PBC模型鼠上的作用。
试验设计：
供试品：选用实施例1中双靶点激动剂多肽化合物23，将其命名为No.23，由深圳建元公司提供，纯度为98.0％，-20℃干燥保存。阳性对照品：熊去氧胆酸，由上海阿拉丁生化科技公司提供。α-异硫氰酸萘酯(ANIT)：由上海阿拉丁生化科技公司提供。
试验动物：SPF级Wistar大鼠，60只雄性，体重：180-250g，4-6周龄，来源：北京维通利华实验动物技术有限公司。
组别设计：试验共分6个组，包括正常对照组、PBC模型对照组、阳性药物(熊去氧胆酸，UCDA)治疗组及三个供试品No.23治疗组(20μg/kg、 40μg/kg及80μg/kg)。各组给药方式及给药频率如下表1所示。
表1
Figure BDA0002782141060000221
口服灌胃给予α-萘基异硫氰酸酯(ANIT)，每周一次，连续四周造模，同步进行No.23(20μg/kg、40μg/kg及80μg/kg，腹腔注射给药)药物预防性治疗评价，每两天腹腔给药一次，阳性对照组每天口服灌胃一次。
试验结果分析检测：
每天定期观察，给药前及给药2周和4周后进行体重称量，并分别于药物治疗第2周及试验终点采血进行生化指标检测。
肝脏病理学检测：药物治疗周期结束36小时，实验动物经安可乐死后行大体解剖，取肝脏组织，称重后，10％甲醛固定，石蜡包埋，切成5μm厚的切片，然后在二甲苯中脱蜡，梯度乙醇水合，HE染色，脱水、透明，封固，显微镜下观察并拍摄肝脏组织病理学改变；天狼猩红染色，脱水、透明，封固，显微镜像拍取不同倍数图像，采用Image J对图像进行分析。
统计分析：表格中各组动物实验数据采用均值±标准差(Mean±SD)表示，图片中实验数据以均数±标准误(Mean±SEM.)描述。正态和方差齐的多组间比较先采用单因素方差分析(ANOVA)，进一步组间多重比较采用 Tukey’s HSD检验；不满足正态分布或者方差不齐，采用Kruskal-Wallis H检验(K-W法)进行分析，组间多重比较采用Dunn's法。p<0.05为差异具有统计学意义。所有的统计分析，均使用Stata 15软件完成。
试验结果发现：
No.23在设定剂量(20μg/kg、40μg/kg及80μg/kg,隔天一次)及治疗周期(4周)能够改善ANIT诱导的动物黄疸症状，主要表现为治疗中后期对模型动物尿液及毛发发黄具有明显的改善作用，阳性对照药物熊去氧胆酸对模型动物黄疸反应改善作用较供试品No.23弱，并且组内出现明显的个体差异。
No.23在设定剂量(20μg/kg、40μg/kg及80μg/kg,隔天一次)及治疗周期(4周)内对模型动物体重增长具有显著的抑制作用，但对其相关临床观察指标包括摄食饮水、排尿及活动等没有异常影响。
图1为本实施例中，6组大鼠在试验期间的体重变化图。图1中A为供试品治疗期(D0-D33)内各试验组大鼠的体重变化曲线图；图1中B为试验终点(D29)各试验组大鼠的体重；图1中C为供试品治疗周期内，各试验组大鼠的体重变化情况(治疗终点与分组当天各试验组动物体重差值)，所有数据均采用平均值(Mean)±标准差(SD)进行统计分析，***P<0.001、
****P<0.0001表示不同试验组组与正常对照组的统计分析结果，#P<0.05、
##P<0.01、###P<0.001、####P<0.0001表示不同治疗组动物与模型对照组的统计分析结果。
图2A为本实施例中，6组大鼠在试验中期和试验终点时，血样中胆红素含量情况柱状图。各试验组动物均于试验中期(2W)及终点(4W)经颈静脉采集血样样本，分离血样并进行总胆红素(T-BIL)及直接胆红素(D-BIL) 检测，所有个体数据均采用平均值(Mean)±标准差(SD)进行统计分析， ***P<0.001、****P<0.0001表示不同试验组组与正常对照组的统计分析结果， #P<0.05、##P<0.01、###P<0.001、####P<0.0001表示不同治疗组动物与模型对照组的统计分析结果。
图2B为本实施例中，6组大鼠在试验中期和试验终点时，血样中碱性磷酸酯酶、谷丙转氨酶和谷草转氨酶含量情况柱状图。各试验组动物均于试验中期(2W)及终点(4W)经颈静脉采集血样样本，分离血样并进行碱性磷酸酯酶(ALP)、谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)检测，所有个体数据均采用平均值(Mean)±标准差(SD)进行统计分析，***P<0.001、****P<0.0001 表示不同试验组组与正常对照组的统计分析结果，#P<0.05、##P<0.01、 ###P<0.001、####P<0.0001表示不同治疗组动物与模型对照组的统计分析结果。
从图2A和图2B的结果可以看出，No.23在设定剂量(20μg/kg、40μg/kg 及80μg/kg,隔天一次)及治疗周期(4周)内对PBC模型大鼠肝脏损伤及肝内胆汁淤积进程具有良好的修复作用，血清胆红素代谢紊乱及肝损伤进程明显好转；血清生物化学指标ALP、AST以及ALT的降低，尤其对胆汁淤积性肝硬化最敏感的ALP具有动态修复作用；本发明的双靶点激动剂多肽对胆红素代谢障碍及肝脏功能具有明显的改善作用。
图3A为本实施例中，6组大鼠在试验终点时，肝脏重量及肝体指数柱状图。试验终点结束36小时后，解剖采集各试验组动物肝脏组织，称重计算肝体指数，所有个体数据均采用平均值(Mean)±标准差(SD)进行统计分析， ***P<0.001、****P<0.0001表示不同试验组组与正常对照组的统计分析结果， #P<0.05、##P<0.01、###P<0.001、####P<0.0001表示不同治疗组动物与模型对照组的统计分析结果。
图3B为本实施例中，6组大鼠在试验终点时，肝脏组织切片图。各试验组动物皮肤组织病理学检测结果，分别于40×、100×及200×光学显微镜下对肝脏进行组织病理学诊断及分析，选取各试验3只动物个体进行结果展示。
图3C为本实施例中，6组大鼠在试验终点时，肝脏组织经天狼星红染色切片图及肝脏胶原容积分数柱状图。图3C中A为各试验组动物肝脏组织天狼星红染色检测结果，分别于40×及100×光学显微镜下对肝脏进行组织天狼星红染色结果进行诊断分析，选取各试验3只动物个体进行结果展示；图3C中 B为各试验组动物皮肤胶原容积分数的统计分析结果，基于天狼星染色结果采用ImageJ测定各试验组动物肝脏胶原容积分数，所有数据均采用所有数据均采用平均值(Mean)±标准差(SD)进行统计分析，*P<0.05、***P<0.001、 ****P<0.0001表示不同试验组与阴性对照组的统计分析结果，#P<0.05、###P <0.001、####P<0.0001表示不同供试品治疗组与模型对照组的统计分析结果。
图3A显示了No.23对模型动物肝体指数的影响；图3B显示了No.23对模型动物肝脏组织病理学损伤的修复作用；图3C显示了No.23对模型动物肝脏组织纤维化进程的改善作用。从图3A、图3B以及图3C的结果可以看出， No.23在设定剂量(20μg/kg、40μg/kg及80μg/kg,隔天一次)及治疗周期(4 周)内模型动物肝脏损伤具有良好的修复作用，主要表现为抑制肝脏坏死灶进程、改善汇管区炎症细胞浸润及抑制肝脏胆管增生及其纤维化进程三个方面。
综上所述，本发明的双靶点激动剂多肽对胆红素代谢障碍及肝脏功能具有明显的改善作用，还能抑制肝脏坏死灶进程、改善汇管区炎症细胞浸润及抑制肝脏胆管增生及其纤维化进程；本发明的双靶点激动剂多肽在用于预防或治疗 ANIT介导的PBC及其相关的肝纤维化的过程中具有良好的作用。
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9.Samur,S.,et al.,Long-term clinical impact and cost-effectiveness ofobeticholic acid for the treatment of primary biliary cholangitis.Hepatology,2017.65(3):p.920-928。

Claims (9)

1.双靶点激动剂多肽在制备用于预防或治疗ANIT介导的PBC及其相关的肝纤维化药物中的应用，所述双靶点激动剂多肽具有以下氨基酸序列表示的母体肽：
His-Xaa2-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa10-Ser-Lys-Xaa13-Leu-Asp-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Ala-Xaa20-Xaa21-Phe-Xaa23-Xaa24-Trp-Leu-Xaa27-Xaa28-Xaa29-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-COR1
其中，R1＝-NH2；
Xaa2＝Aib或D-Ser；
Xaa10＝Lys或Tyr；
Xaa13＝Lys或Tyr；
Xaa16＝Glu或Lys；
Xaa17＝Lys或Arg；
Xaa18＝Arg或Ala；
Xaa20＝His，Gln或Lys；
Xaa21＝Asp或Glu；
Xaa23＝IIe或Val；
Xaa24＝Glu或Gln；
Xaa27＝Met，Leu或Nle；
Xaa28＝Asn，Asp或Arg；
Xaa29＝Gly或Thr。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述Xaa10，Xaa16，Xaa17或Xaa20中至少一个为Lys，所述至少一个Lys或所述氨基酸序列的第12位Lys的侧链与亲脂性的取代基相连接，所述连接方式为所述亲脂性的取代基以其羧基与桥接基团的氨基形成酰胺键，所述桥接基团的羧基与所述母体肽的Lys的N-末端残基形成酰胺键以连接到所述母体肽上，所述桥接基团为Glu，Asp和/或(PEG)m，其中m为2-10的整数；所述亲脂性的取代基为选自CH3(CH2)nCO-或HOOC(CH2)nCO-的酰基，其中n是10-24的整数。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述桥接基团为Glu-(PEG)m或Asp-(PEG)m或(PEG)m。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述桥接基团在所述氨基酸序列的残基对12与16、16与20、17与21或者20与24侧链之间形成分子桥。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，与所述亲脂性的取代基连接的Lys被HomoLys、Orn、Dap或Dab代替。
6.根据权利要求2-5中任一项所述的应用，其特征在于，当所述氨基酸序列的第10、12、16、17或20位为Lys时，所述Lys侧链与所述亲脂性取代基及所述桥接基团连接为下述结构之一：
Figure FDA0002782141050000021
Figure FDA0002782141050000031
Figure FDA0002782141050000041
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述母体肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:7，SEQID NO:8，SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:13，SEQID NO:14，SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:16，SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18，SEQ ID NO:19，SEQ ID NO:20，SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:22，SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:24，SEQ ID NO:25母体肽的氨基酸序列。
8.一种药物组合物，其特征在于，包含权利要求1-7任一项所述的双靶点激动剂多肽和至少一种药学上可接受的药用载体和/或辅料。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为片剂、胶囊、糖衣片剂、粒剂、口服溶液、糖浆、用于皮肤表面的油膏和药贴、气雾剂、鼻喷剂以及用于注射的无菌溶液中的至少一种剂型。
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