CN112469423A - 经间充质基质细胞外排体处理的单核细胞及其用途 - Google Patents

Abstract

本文提供了使用分离的间充质干细胞(MSC)外排体调节单核细胞表型的方法。用MSC外排体处理的单核细胞可用于治疗纤维化疾病和自身免疫病。

Description

经间充质基质细胞外排体处理的单核细胞及其用途

相关申请

本申请根据35U.S.C.§119(e)要求于2018年5月9日提交的名称为“MESENCHYMALSTROMAL CELL EXOSOME-TREATED MONOCYTES AND USES THEREOF”的美国临时申请号62/669324的权益，其全部内容通过引用并入本文。

背景技术

特发性肺纤维化(IPF)是一种慢性进行性呼吸系统疾病，患病率为每100,000人每年0.5至27.9。缺少对这种疾病的潜在机制的完全了解可导致缺乏成功的治疗。尽管有两种新批准的药物，但IPF仍然是致命的，五年存活率小于10％。

发明内容

本文显示，单静脉内(IV)剂量的间充质干细胞(MSC)外排体逆转了博来霉素诱导的肺纤维化，其至少部分地是通过调节骨髓中的单核细胞表型和降低肺泡上皮细胞(AEC)凋亡。此外，当将用MSC外排体处理的单核细胞施用于患有肺纤维化的对象时，其对这种疾病是治疗有效的。

因此，本文在一些方面提供了调节单核细胞表型的方法，该方法包括使单核细胞与分离的间充质干细胞(MSC)外排体接触。在一些实施方案中，单核细胞来自骨髓。

在一些实施方案中，分离的MSC外排体分离自MSC条件培养基。在一些实施方案中，MSC来自沃顿胶(Wharton's Jelly)、骨髓或脂肪组织。在一些实施方案中，分离的MSC外排体基本不含蛋白质污染物。在一些实施方案中，分离的MSC外排体的直径为约50nm至150nm。

在一些实施方案中，接触是体外的。在一些实施方案中，接触是离体的。在一些实施方案中，接触是体内的。在一些实施方案中，接触持续至少2小时。

在一些实施方案中，单核细胞在与分离的MSC外排体接触之前是促炎性的，并且在与分离的MSC外排体接触之后是调节性的。

本公开内容的另一些方面提供了治疗纤维化疾病或自身免疫病的方法，该方法包括向有此需要的对象施用有效量的单核细胞，其中所述单核细胞在施用之前用分离的间充质干细胞(MSC)外排体处理。

在一些实施方案中，该方法还包括在用MSC外排体处理单核细胞之前分离单核细胞。在一些实施方案中，单核细胞分离自对象。在一些实施方案中，单核细胞分离自所述对象的骨髓。

在一些实施方案中，在施用于对象之前用MSC外排体处理单核细胞至少2小时。在一些实施方案中，单核细胞全身施用。在一些实施方案中，单核细胞通过静脉内输注施用。在一些实施方案中，单核细胞通过气管内或鼻内施用。在一些实施方案中，将单核细胞施用于对象一次。在一些实施方案中，将单核细胞施用于对象多次。

在一些实施方案中，该方法还包括向对象施用有效量的第二药剂。在一些实施方案中，第二药剂是分离的MCS外排体。在一些实施方案中，第二药剂是尼达尼布(nintedanib)、吡非尼酮(Pirfenidone)、抗纤维化剂、免疫抑制剂和/或抗炎剂。

在一些实施方案中，纤维化疾病选自：全身性硬化；肝纤维化、心脏纤维化、肾纤维化和骨髓纤维化。在一些实施方案中，纤维化疾病是肺纤维化。在一些实施方案中，肺纤维化是特发性肺纤维化(IPF)。在一些实施方案中，单核细胞降低与所述纤维化疾病相关的炎症。在一些实施方案中，单核细胞降低与所述纤维化疾病相关的凋亡。

在一些实施方案中，对象是哺乳动物。在一些实施方案中，对象是人对象。在一些实施方案中，人是新生儿、婴儿或成人。在一些实施方案中，人对象小于四周龄。在一些实施方案中，人对象为四周至3岁。在一些实施方案中，人对象为3至18岁。在一些实施方案中，人对象是成人。

在一些实施方案中，人对象是早产的。在一些实施方案中，人对象在妊娠37周之前出生。在一些实施方案中，人对象在妊娠26周之前出生。

在一些实施方案中，对象是啮齿动物。在一些实施方案中，啮齿动物是小鼠或大鼠。

在一些实施方案中，单核细胞在经分离的MSC外排体处理之前是促炎性的，并且在经分离的MSC外排体处理之后是调节性的。

本公开内容的另一些方面提供了用分离的间充质干细胞(MSC)外排体处理的单核细胞。在一些实施方案中，单核细胞来自骨髓。在一些实施方案中，分离的MSC外排体分离自MSC条件培养基。在一些实施方案中，MSC来自沃顿胶、骨髓或脂肪组织。在一些实施方案中，单核细胞在经分离的MSC外排体处理之前是促炎性的，并且在经分离的MSC外排体处理之后是调节性的。

还提供了包含本文所述的单核细胞的组合物。在一些实施方案中，组合物还包含第二药剂。在一些实施方案中，该组合物是药物组合物。在一些实施方案中，该组合物还包含药学上可接受的载体。

本文还提供了本文所述的单核细胞或包含单核细胞的组合物用于治疗纤维化疾病或自身免疫病的用途。

本文所述的单核细胞或包含单核细胞的组合物还可用于制造用于治疗纤维化疾病或自身免疫病的药物。

以上概述旨在以非限制性方式示出本文公开的技术的一些实施方案、优点、特征和用途。根据具体实施方式、附图、实施例和权利要求书，本文公开的技术的其他实施方案、优点、特征和用途将变得明显。

附图说明

附图不旨在按比例绘制。在附图中，在多个图中示出的每个相同或几乎相同的组件由相同的数字表示。为了清楚起见，并未在每个附图中标记了每个组件。专利或申请文件包含至少一张彩色附图。在请求并且支付必要的费用之后，官方将提供带有彩色附图的本专利或专利申请公开的副本。在附图中：

图1A至1D表明在炎症开始时的MEx处理阻止了纤维化。(图1A)10至14周龄的C57BL/6小鼠在第0天接受气管内博来霉素(60μg)或0.9％生理盐水(NS)，然后接受推注剂量的IV MEx(Bleo+MEx)、NS(bleo+NS)、FEx(Bleo+FEx)或碘克沙醇(IDX 1∶9稀释，bleo+IDX)。将结果与接受NS(载剂，对照)或NS然后一定剂量的MEx(对照+MEx)的对照组进行比较。在第14天处死小鼠。(图1B)将肺切片用Masson的三色染色剂进行染色。插图以100倍放大倍数拍摄。Bleo+NS、Bleo+FEx、Bleo+IDX表现出结构破坏、肺泡隔增厚和纤维化改变。(图1C)向博来霉素处理的小鼠施用MEx大幅降低了纤维化和肺泡变形。这些发现与对照或对照+Mex组相似。在第14天通过Ashcroft评分测量肺纤维化。(图1D)通过Sircol测定评估胶原蛋白沉积，并表示为mg/ml左肺匀浆。每组n＝3-4，与博来霉素处理组相比，*p＜0.05；****p＜0.0001。比例尺＝100μm。

图2A至2E表明MEx调节肺泡巨噬细胞表型并且减轻炎症。全肺RT-qPCR显示在第7天(图2A)和第14天(图2B)巨噬细胞Ccl-2和精氨酸酶1(Arg1)标志物的表达提高，而其水平与MEx处理的对照相似。白细胞介素-6的表达显示出相似的趋势，但是用MEx处理其降低没有达到统计学显著性。三组之间的TGF水平保持不变。结果相对于对照表达来表示。平均值±SEM，每组n＝4-8。与博来霉素暴露小鼠相比，*p＜0.05；**p＜0.01。(图2C和2D)使用针对M2样活化标志物Arg1(绿色)和CD206(红色)的抗体对肺切片进行的免疫荧光(IF)分析显示博来霉素小鼠中的平均荧光强度(MFI)增加，而强度与MEx处理的对照水平相似。用Dapi进行细胞核染色。图像以10倍放大倍数获得。针对细胞数(Dapi染色)将平均荧光强度归一化。通过图像J软件进行分析。每组N＝5，与博来霉素暴露小鼠相比，*p＜0.05；**p＜0.01。(图2E)累积数据和代表性图描述了CD206^+ve肺泡巨噬细胞(AM)(CD45^+veCD11b^-veCD11c^+veCD 206^+ve细胞)的百分比。CD206^+veAM的数目随着MEx处理而减少，但是与博来霉素暴露组相比没有达到统计学显著性。代表性直方图相对于众数进行归一化。每组n＝4-5的平均值±SEM，与博来霉素暴露小鼠相比，**p＜0.01。缩写：Dapi，40，6-二脒基-2-苯基吲哚。

图3A至3F表明MEx在系统水平上调节单核细胞和巨噬细胞表型。MEx恢复了肺中的肺泡巨噬细胞和炎性单核细胞群。(图3A)损伤后7天的全肺中细胞计数分析显示AM数目(表示为CD45^+veCD11b^-veCD11C^+ve细胞)减少。(图3B)这与Ly6Chi浸润或经典单核细胞(Ly6ChiCCR-2^+ve)的增加有关。(图3C)在第14天AM数目增加并且(图3D)经典单核细胞数目减少至在NS处理(对照)小鼠组中观察到的水平的大约一半(平均差异：1.7％±0.44，p＜0.01)。在第7天和第14天分析，MEx治疗不仅导致AM群数目的恢复，而且还将肺中单核细胞表型调节至与对照组相当的水平。每组n＝4-5的平均值±SEM，与博来霉素暴露小鼠相比，*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001。根据荧光减一对照进行设门策略(参见图8)。为了研究MEx的全身作用，通过流式细胞术分析了骨髓的髓样特征。尽管三个组中具有相似的CD45^+ve细胞数目(数据未显示)，(图3E和3F)但是与对照小鼠相比，在博来霉素暴露小鼠组中经典单核细胞增加(与博来霉素暴露小鼠相比，平均差异：17.6％±3.6，p＜0.001)，但是博来霉素暴露小鼠中调节性单核细胞表现为减少2倍(与博来霉素暴露小鼠相比，平均差异：18％±5.7，p＜0.05)。然而，MEx治疗导致炎性单核细胞减少并且从炎性表型转变为调节性(Ly6ClowCCR-2-ve)表型，与在对照组小鼠中观察到的水平相似(与博来霉素暴露小鼠相比，平均差异：10.25％±4.2，p＜0.05以及13.39％±5.76，p＜0.05)。每组n＝4-7，与博来霉素暴露小鼠相比，*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001。

图4A至4F表明，MEx预处理的骨髓来源单核细胞的过继转移保护小鼠免于肺纤维化。探索了离体经处理的BMDMo和AM在预防纤维化中的潜在治疗作用。(图4A)从6-8周龄的FVB小鼠中分离BMDMo，离体培养3天，并且在第1天D1和第2天D2用MEx(相当于由每100mm板1x 10⁶MSC产生的EV)或单独的培养基处理，并且在第3天D3用Dil染色。在气管内滴注博来霉素之后，在第0天和第3天以一比一的比例将细胞过继地静脉内转移至C57BL/6小鼠。在第14天处死小鼠。将数据与仅接受NS的博来霉素暴露小鼠(博来霉素)进行比较(图4B)培养3天后对BMDMo的流式细胞术分析显示了超过90％的CD45+veCD11b+ve细胞。(图4C)注射后14天在肺中检测到Dil标记的BMDMo。图像以20倍放大倍数获得。(图4D至4F)与NS(博来霉素)相比，在接受MEx预处理的单核细胞(BMDMo+MEx)的小鼠中纤维化得到改善。注射了MEx处理的AM(AM+MEx)的小鼠表现出明显的纤维化变化。与NS处理的小鼠组相比，施用未经处理的BMDMo(BMDM+培养基)轻度改善了纤维化和胶原蛋白水平。与NS处理的小鼠相比，胶原蛋白沉积的减少没有达到统计学显著性。在胶原蛋白水平上观察到相似的结果。箭头指示Dil标记的单核细胞。组间比较：*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.001。比例尺＝100μm。缩写：Dil，1，1′-双十八烷基-3，3，3′，3′-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐(′Dil′；DilC18(3))

图5A至5D表明MEx治疗降低了凋亡。(图5A和5B)全肺切片中的Tunel染色显示，与对照(NS)和博来霉素+MEx相比，博来霉素暴露小鼠组中的凋亡(绿色)增加。细胞核用Dapi染色。图像以20倍放大倍数获得。使用图像J软件对MFI进行量化并针对Dapi进行了归一化。与博来霉素暴露小鼠相比，*p＜0.05，**p＜0.01。(图5C)全肺中的膜联蛋白V/PI染色显示，与对照(NS)和博来霉素+MEx小鼠相比，博来霉素暴露小鼠中的凋亡(膜联蛋白V+PI-)增加。(图5D)使用

3/7测定法测量体外凋亡。在博来霉素暴露的人肺泡上皮细胞中发现更多的凋亡。MEx治疗消除了这种效果。相对发光单位用作凋亡的代表，Y轴表示相对于对照的发光。每组n＝8，与博来霉素暴露小鼠相比，**p＜0.01；****P＜0.0001。

图6A至6C示出了外排体的纯化、分离和表征。对来自BMSC或HDF的条件培养基(CM)进行差速离心并通过切向流过滤进行浓缩。使浓缩的(50x)CM漂浮在碘克沙醇(OptiPrep^TM，IDX)垫层梯度(cushion gradient)上。将级分9中纯化的EV群用于分析。(图6A)在透射电子显微术(TEM)上观察到的异质EV形态(x30,000g，比例尺＝100nm)。(图6B)使用纳米颗粒跟踪分析(NTA)评估EV浓度。级分9梯度中BMSC-EV和HDF-EV的代表性尺寸分布。(图6C)使用针对外排体标志物flotillin(FLOT-1)、CD63和Alix的抗体对IDX垫层梯度级分(7-10)进行Western印迹分析。

图7A至7D表明在炎症结束时的MEx处理逆转了纤维化。(图7A)在施用博来霉素后7天施用MEx，并在第14天处死小鼠。(图7B和7C)分析了来自对照、博来霉素和Bleo+MEx小鼠的肺切片的组织学和(图7D)胶原蛋白沉积。MEx治疗导致第7天的纤维化和胶原蛋白沉积减少。数据代表每组n＝4的平均值±SEM，与博来霉素暴露小鼠相比，*p＜0.05；****p＜0.0001。比例尺＝100μm。

图8显示了肺巨噬细胞、单核细胞和骨髓来源单核细胞的代表性体内设门策略。在酶促消化后从全肺分离细胞。基于前向和侧向散射参数排除肺聚集物和细胞碎片。通过CD45染色鉴定免疫细胞。使用顺序设门策略鉴定肺泡巨噬细胞(AM)，以鉴定CD45^+veCD11b^{- ve}CD11c^+ve群。随后对CD206^+ve AM进行设门。为了鉴定单核细胞亚群，对CD45^+ve细胞的非肺泡巨噬细胞亚群(CD11b^inint CD11C^low)进行了顺序设门策略，并对CCR-2^+veLy6C^high和CCR-2^{- ve}Ly6C^low群进行进一步设门以分别反映经典或非经典单核细胞表型。BMDMo设门策略与上述类似，但不包括CD11c和CD206(AM的标志物)染色。根据荧光减一对照进行设门策略。

图9表明可以在骨髓中检测到标记的MEx。将膜染料标记的EV IV注射到小鼠中，并在注射后2小时处死动物。在BM细胞离心涂片(cytospin)中检测到MEx(标记的MEx)。注射的游离染料和无染料染色的EV的上清液用作对照。使用Dapi进行复染。图像以60倍放大倍数获得。

具体实施方式

本公开内容至少部分地基于以下发现：当将间充质基质细胞(本文也可互换地称为“间充质干细胞”或“MSC”)外排体(本文也称为“Mex”)施用于对象(例如，全身)时，其可以调节骨髓中的单核细胞表型，导致更大的调节性单核细胞亚群，而不是促炎性单核细胞。此外，体外用MSC外排体处理的单核细胞(例如，骨髓来源的单核细胞)在施用于患有肺纤维化的对象时对纤维化肺具有治疗作用。

本公开内容的一些方面提供了用分离的间充质干细胞(MSC)外排体处理的单核细胞。“单核细胞”是一种白细胞(也称为“白血细胞”)，其可以分化为巨噬细胞和骨髓谱系树突状细胞。在脊椎动物中，单核细胞是先天免疫系统的一部分，但也可以影响适应性免疫过程。

单核细胞占人体所有白细胞的2％至10％，并且在免疫功能中起多种作用，例如但不限于在正常条件下补充定居巨噬细胞；响应于来自组织中感染部位的炎症信号而迁移；以及分化为巨噬细胞或树突状细胞以实现免疫应答。

单核细胞是异质细胞群，并且可以分为具有不同表型和功能的亚群。在一些实施方案中，基于脂多糖(LPS)受体(CD14)和CD16(Fcγ受体III)的表达将人单核细胞细分为表型和功能上不同的亚群(例如，Ziegler-Heitbrock et al.，Blood，vol.116，no.16，pp.e74-e80，2010和Gordon et al.，Nature Reviews Immunology，vol.5，no.12，pp.953-964，2005中所述，其通过引用并入本文)。在健康个体中，约80％至90％的单核细胞是高度CD14阳性和CD16阴性(CD14⁺⁺CD16^-)。CD14⁺⁺CD16^-单核细胞在本文中称为“经典单核细胞”或“调节性单核细胞”。其余10％至20％的单核细胞是CD16阳性并且被归类为“促炎性单核细胞”。促炎性单核细胞可进一步细分为CD14⁺⁺CD16⁺和CD14⁺CD16⁺⁺细胞。CD14⁺⁺CD16⁺单核细胞也称为“中间单核细胞”；并且CD14⁺CD16⁺⁺单核细胞也称为“非经典单核细胞”。与CD16阴性常规单核细胞相比，CD16阳性单核细胞(促炎性单核细胞)表达更高水平的主要组织相容性复合物(MHC)II类抗原、黏附分子、趋化因子受体和促炎性细胞因子(例如TNF-α)，但是较低水平的抗炎性细胞因子(例如IL-10)(例如，如Kawanaka et al.，Arthritis&Rheumatism，vol.46，no.10，pp.2578-2586，2002和Ziegler-Heitbrock et al.，Immunology Today，vol.17，no.9，pp.424-428，1996中所述，其通过引用并入本文)。促炎性单核细胞在多种病理状况下升高，包括炎性和感染性疾病、癌症以及冠心病。在小鼠中，单核细胞也可分为两个亚群：促炎性单核细胞(Cx3CR1^low、CCR2⁺、Ly6C^high)，其相当于人促炎性单核细胞；以及调节性单核细胞(Cx3CR1^high、CCR2^-、Ly6C^low)，其相当于人CD14⁺⁺CD16^-单核细胞。

单核细胞由骨髓从被称为成单核细胞的前体产生，后者是从造血干细胞分化的双潜能细胞。单核细胞在血流中循环约一至三天，然后通常进入整个身体的组织，在那里它们分化为巨噬细胞和树突状细胞。在一些实施方案中，本文所述的用MSC外排体处理的单核细胞来自骨髓(例如，分离自骨髓)。在一些实施方案中，本文所述的用MSC外排体处理的单核细胞来自特定组织(例如，分离自特定组织例如肺)。

“外排体”是从细胞(例如任何真核细胞)释放的膜(例如脂双层)囊泡。外排体存在于真核生物的流体中，包括血液、尿和细胞培养物的培养基。本公开内容的外排体从间充质干细胞(MSC)释放，并且可互换地称为“间充质干细胞外排体”或“MSC外排体”。

“间充质干细胞(MSC)”是具有分化为神经元细胞、脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞、心肌细胞、心脏组织和其他内皮或上皮细胞的能力的祖细胞。(参见例如Wang et al.，StemCells 2004；22(7)；1330-7；McElreavey；1991Biochem Soc Trans(1)；29s；Takechi，Placenta 19933月/4月；14(2)；235-45；Takechi，1993；Kobayashi；Early HumanDevelopment；1998；7月10日；51(3)；223-33；Yen；Stem Cells；2005；23(1)3-9.)。这些细胞可以通过基因或蛋白质表达在表型上定义。这些细胞已被表征为表达以下一种或更多种(并因此对其呈阳性)：CD13、CD29、CD44，CD49a、b、c、e、f，CD51、CD54、CD58、CD71、CD73、CD90、CD102、CD105、CD106、CDw119、CD120a、CD120b、CD123、CD124、CD126、CD127、CD140a、CD166、P75、TGF-bIR、TGF-bIIR，HLA-A、B、C，SSEA-3、SSEA-4、D7和PD-L1。这些细胞还被表征为不表达(并因此对其呈阴性)CD3、CD5、CD6、CD9、CD10、CD11a、CD14、CD15、CD18、CD21、CD25、CD31、CD34、CD36、CD38、CD45、CD49d、CD50，CD62E、L、S，CD80、CD86、CD95、CD117、CD133、SSEA-1和ABO。因此，可以根据其分化潜能在表型和/或功能上对MSC进行表征。

MSC可以从许多来源收获，包括但不限于骨髓、脂肪组织、血液、骨膜、真皮、脐带血和/或基质(例如沃顿胶)和胎盘。例如，MSC可以从市售的骨髓抽吸物中分离。细胞群内MSC的富集可以使用本领域已知的方法来实现，包括但不限于荧光激活细胞分选(fluorescence-activated cell sorting，FACS)。用于收获MSC的方法在本领域中有所描述，例如在美国专利号5486359中，其通过引用并入本文。

市售培养基可用于MSC的生长、培养和维持。这样的培养基包括但不限于Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)。在这样的培养基中可用于MSC、成纤维细胞和巨噬细胞的生长、培养和维持的组分包括但不限于氨基酸、维生素、碳源(天然和非天然)、盐、糖、植物来源的水解产物、丙酮酸钠、表面活性物质、氨、脂质、激素或生长因子、缓冲剂、非天然氨基酸、糖前体、指示剂、核苷和/或核苷酸、丁酸盐/酯或有机物、DMSO、动物来源产品、基因诱导物、非天然糖、细胞内pH调节物、甜菜碱或渗透保护剂、痕量元素、矿物质、非天然维生素。可用于补充市售组织培养基的另外的组分包括例如动物血清(例如胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、胎小牛血清(fetal calf serum，FCS)、马血清(HS))、抗生素(例如包括但不限于青霉素、链霉素、硫酸新霉素、两性霉素B、杀稻瘟素、氯霉素、阿莫西林、杆菌肽、博来霉素、头孢菌素、金霉素、吉欧霉素(zeocin)和嘌呤霉素)和谷氨酰胺(例如L-谷氨酰胺)。间充质干细胞的存活和生长还取决于适当的有氧环境、pH和温度的维持。可以使用本领域已知的方法来维持MSC，例如，如Pittenger et al.，Science，284：143-147(1999)中所述，其通过引用并入本文。

在一些实施方案中，分离了用于处理单核细胞的MSC外排体。如本文所用，“分离的外排体”是与其天然环境物理分离的外排体。分离的外排体可以从其天然存在的组织或细胞(例如，MSC)完全地或部分地物理分离。在一些实施方案中，分离的MSC外排体是从来自人骨髓、脐带沃顿胶或脂肪组织的MSC的培养基分离的。这样的培养基在本文中称为“MSC条件培养基”。在一些实施方案中，分离的外排体可以不含细胞，例如MSC，或者可以不含或基本上不含条件培养基，或者可以不含任何生物污染物，例如蛋白质。通常，以比未处理(un-manipulated)的条件培养基中存在的外排体更高的浓度提供分离的外排体。

在一些实施方案中，本文所述的分离的MSC外排体包含一种或更多种(例如1、2、3、4、5或更多种)已知的外排体标志物。在一些实施方案中，已知的外排体标志物选自：FLOT1(筏蛋白-1，Uniprot ID：O75955)、CD9(CD9抗原，Uniprot ID：P21926)和CD63(CD63抗原，Uniprot ID：P08962)。

在一些实施方案中，分离的MSC外排体基本不含污染物(例如，蛋白质污染物)。当分离的MSC外排体的制剂中包含少于20％、15％、10％、5％、2％、1％或少于1％的任何其他物质(例如蛋白质)时，分离的MSC外排体“基本不含污染物”。在一些实施方案中，当分离的MSC外排体的制剂为至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.9％纯(相对于污染物(例如，蛋白质))时，分离的MSC“基本不含污染物”。

“蛋白质污染物”是指与分离的外排体不相关并且对外排体的生物学活性没有贡献的蛋白质。蛋白质污染物在本文中也称为“非外体蛋白质污染物”。

在一些实施方案中，根据本公开内容使用的分离的MSC外排体的直径为约30-150nm。例如，分离的MSC外排体的直径可以为30-150nm、30-140nm、30-130nm、30-120nm、30-110nm、30-100nm、30-90nm、30-80nm、30-70nm、30-60nm、30-50nm、30-40nm、40-150nm、40-140nm、40-130nm、40-120nm、40-110nm、40-100nm、40-90nm、40-80nm、40-70nm、40-60nm、40-50nm、50-150nm、50-140nm、50-130nm、50-120nm、50-110nm、50-100nm、50-90nm、50-80nm、50-70nm、50-60nm、60-150nm、60-140nm、60-130nm、60-120nm、60-110nm、60-100nm、60-90nm、60-80nm、60-70nm、70-150nm、70-140nm、70-130nm、70-120nm、70-110nm、70-100nm、70-90nm、70-80nm、80-150nm、80-140nm、80-130nm、80-120nm、80-110nm、80-100nm、80-90nm、90-150nm、90-140nm、90-130nm、90-120nm、90-110nm、90-100nm、100-150nm、100-140nm、100-130nm、100-120nm、100-110nm、110-150nm、110-140nm、110-130nm、110-120nm、120-150nm、120-140nm、120-130nm、130-150nm、130-140nm或140-150nm。在一些实施方案中，分离的MSC外排体的直径可以为约50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、110nm、120nm、130nm、140nm或150nm。在一些实施方案中，分离的MSC外排体表现出双凹形态。

如本文所述，分离的MSC外排体可用于处理单核细胞以调节单核细胞表型(例如，在体外和体内两种情况下，例如在骨髓中)。“经分离的MSC外排体处理单核细胞”是指使单核细胞与MSC外排体接触(例如一段时间)。在一些实施方案中，处理(即接触)在体外进行。例如，可以在体外培养单核细胞，并且可以将分离的MSC外排体添加到培养物，以使得单核细胞接触分离的MSC外排体。在一些实施方案中，处理(即接触)离体进行。例如，可以从对象的骨髓分离单核细胞，并且可以将分离的MSC外排体添加至单核细胞，以使得单核细胞接触分离的MSC外排体。在一些实施方案中，处理(即接触)在体内进行。例如，分离的MSC外排体可以被施用于对象(例如，通过静脉内注射)，到达骨髓，并接触骨髓中的单核细胞。

在一些实施方案中，将单核细胞用MSC外排体处理(即接触)至少1小时(例如，至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100小时或更长时间)。在一些实施方案中，将单核细胞用MSC外排体处理(即接触)1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100小时或更长时间。

在一些实施方案中，由于环境或发育沉淀的损伤，单核细胞已被极化至促炎性状态，并且在与分离的MSC外排体接触之后其极性被调节为调节性表型。在一些实施方案中，单核细胞在经分离的MSC外排体处理(即接触)之前是促炎性单核细胞，并且在经分离的MSC外排体处理(即接触)之后是调节性单核细胞。在一些实施方案中，使促炎性单核细胞和调节性单核细胞的混合物与分离的MSC外排体接触，并且该处理导致经分离的MSC外排体处理的混合物中的调节性单核细胞的更高比例(例如，高至少10％)。例如，与经分离的MSC外排体处理之前相比，经MSC外排体处理之后调节性单核细胞的比例可以高至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少100倍或更高。在一些实施方案中，与经分离的MSC外排体处理之前相比，经MSC外排体处理之后调节性单核细胞的比例高10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、2倍、5倍、10倍、100倍或更高。

本文进一步提供了经分离的MSC外排体处理的单核细胞用于治疗疾病(例如，纤维化疾病(例如肺纤维化)或自身免疫病)的用途。在一些实施方案中，经分离的MSC外排体处理的单核细胞用于制造用于治疗疾病(例如纤维化疾病或自身免疫病)的药物。还提供了包含经分离的MSC外排体处理的单核细胞的组合物。在一些实施方案中，将经分离的MSC外排体处理的单核细胞配制成用于治疗疾病(例如，纤维化疾病或自身免疫病)的组合物。

在一些实施方案中，包含经分离的MSC外排体处理的单核细胞的组合物还包含第二药剂。在一些实施方案中，第二药剂是对单核细胞治疗的疾病有效的治疗剂。例如，第二药剂可以是可用于预防、治疗和/或控制纤维化疾病或自身免疫病(例如本文所述的那些)的任何药剂。在一些实施方案中，第二药剂是分离的MSC外排体。

在一些实施方案中，第二药剂是已知对纤维化疾病具有治疗作用的药剂。可用于治疗纤维化疾病的示例性第二药剂包括但不限于：尼达尼布(酪氨酸激酶抑制剂)、吡非尼酮、抗纤维化剂和/或抗炎剂。在一些实施方案中，对于肺纤维化，其他类型的疗法(例如氧补充剂)可以与本文所述的治疗剂结合使用。

在一些实施方案中，第二药剂是已知对自身免疫病具有治疗作用的药剂。这样的药剂包括但不限于非甾体抗炎药、糖皮质激素、甲氨蝶呤(metrotrexate)、来氟米特、抗TNF生物制剂(例如抗体，例如英夫利昔单抗(infliximab)、阿达木单抗(adalimumab)、golinumab或赛妥珠单抗(certolizumab pegol))。用于治疗自身免疫病的药物是本领域已知的，例如，如Li et al.，Front Pharmacol.2017；8：460中所述，其通过引用并入本文。

在一些实施方案中，经分离的MSC外排体处理的单核细胞和第二药剂被配制在相同的组合物中。在一些实施方案中，经分离的MSC外排体处理的单核细胞和第二药剂被配制在分开的组合物中。在一些实施方案中，将经分离的MSC外排体处理的单核细胞和第二药剂同时施用于对象。在一些实施方案中，将经分离的MSC外排体处理的单核细胞和第二药剂分开施用。在一些实施方案中，经分离的MSC外排体处理的单核细胞在第二药剂之前施用。在一些实施方案中，经分离的MSC外排体处理的单核细胞在第二药剂之后施用。

在一些实施方案中，包含经分离的MSC外排体处理的单核细胞的组合物是药物组合物。在一些实施方案中，组合物还包含药学上可接受的浓度的盐、缓冲剂、防腐剂或相容性载体。

药学上可接受的载体是参与携带或运输预防或治疗活性剂的药学上可接受的材料、组合物或载剂，例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料。在与制剂的其他成分相容并且对对象无害的意义上，每种载体必须是“可接受的”。可以用作药学上可接受的载体的材料的一些实例包括糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；二醇，例如丙二醇；多元醇，例如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；酯，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；无热原水；等渗盐水、林格溶液；乙醇；磷酸盐缓冲溶液；以及药物制剂中使用的其他无毒相容性物质。

组合物可以采取诸如在油性或水性载剂中的水溶性悬浮液、溶液或乳剂的形式，并且可以包含配制剂，例如助悬剂、稳定剂和/或分散剂。合适的亲脂性溶剂或载剂包括脂肪油，例如芝麻油，或合成脂肪酸酯，例如油酸乙酯或甘油三酯。水性注射悬浮液可包含提高混悬剂粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。任选地，悬浮液还可包含合适的稳定剂或增加溶解度的试剂。或者，外排体可以是冻干的或其他粉末或固体形式，以在使用前用合适的载剂(例如无菌的无热原的水)配制。

本公开内容的另一些方面提供了治疗疾病(例如，纤维化疾病或自身免疫病)的方法，该方法包括向有此需要的对象施用有效量的单核细胞，其中在使用本文所述的方法施用之前，用分离的间充质干细胞(MSC)外排体处理单核细胞(例如，至少2小时)。在一些实施方案中，该方法还包括从对象(例如，从对象的骨髓)分离单核细胞，以使得可以在向对象施用之前用经分离的MSC外排体处理单核细胞。

疾病(例如纤维化疾病或自身免疫病)的“治疗(“Treat”或“treatment”)”包括但不限于预防、降低或停止纤维化疾病或自身免疫病的发展，降低或消除纤维化疾病或自身免疫病的症状，或预防纤维化疾病或自身免疫病。

“有效量”是达到期望结果的药剂的量。绝对量将取决于多种因素，包括选择用于施用的材料，施用是单剂量还是多剂量，以及个体患者参数，包括年龄、身体状况、尺寸、体重和疾病阶段。这些因素是本领域普通技术人员公知的，并且仅通过常规实验即可解决。

在一些实施方案中，有效量是对对象不引起毒性的药剂的剂量。在一些实施方案中，有效量是对对象引起降低的毒性的药剂的剂量。用于测量毒性的方法是本领域公知的(例如，肝、脾和/或肾的活检/组织学；用于肝毒性的丙氨酸转移酶、碱性磷酸酶和胆红素测定；以及用于肾毒性的肌酐水平)。

对象应指人或脊椎动物或哺乳动物，包括但不限于啮齿动物，例如啮齿动物(例如大鼠或小鼠)、狗、猫、马、牛、猪、绵羊、山羊、火鸡、鸡和灵长类动物(例如猴)。在一些实施方案中，对象是人。在一些实施方案中，对象是伴侣动物。如本文所用，“伴侣动物”是指宠物和其他家畜。伴侣动物的非限制性实例包括狗和猫；家畜，例如马、牛、猪、绵羊、山羊和鸡；以及其他动物，例如小鼠、大鼠、豚鼠和仓鼠。本公开内容的方法可用于治疗有此需要的对象。对象可以是患有适合使用本公开内容中描述的单核细胞进行治疗的本文所述疾病的对象，或者其可以是具有发生这样的疾病的风险的对象。

在一些实施方案中，对象是人对象。在一些实施方案中，对象是人类婴儿。例如，对象可以是新生儿，特别是在低胎龄出生的新生儿。如本文所用，人类新生儿是指从出生到约4周龄的人。如本文所用，人类婴儿是指约4周龄至约3岁的人。如本文所用，低胎龄是指在给定物种的正常妊娠期之前发生的出生(或分娩)。在人中，完整妊娠期为约40周，并且可以为37周至超过40周。在人中，低胎龄(类似于早产)被定义为在妊娠37周之前出生。因此，本公开内容考虑了预防和/或治疗在妊娠37周之前出生的对象，包括以甚至更短的妊娠期出生的对象(例如，妊娠36周之前、35周之前、34周之前、33周之前、32周之前、31周之前、30周之前、29周之前、28周之前、27周之前、26周之前或25周之前)。

对于婴儿或新生儿，本公开内容涵盖了甚至超过新生儿阶段并进入儿童期和/或成年期的治疗。例如，在一些实施方案中，使用本公开内容的方法治疗的对象为3-18岁。在一些实施方案中，使用本公开内容的方法治疗的对象可以为3-18、3-17、3-16、3-15、3-14、3-13、3-12、3-11、3-10、3-9、3-8、3-7、3-6、3-5、3-4、4-18、4-17、4-16、4-15、4-14、4-13、4-12、4-11、4-10、4-9、4-8、4-7、4-6、4-5、5-18、5-17、5-16、5-15、5-14、5-13、5-12、5-11、5-10、5-9、5-8、5-7、5-6、6-18、6-17、6-16、6-15、6-14、6-13、6-12、6-11、6-10、6-9、6-8、6-7、7-18、7-17、7-16、7-15、7-14、7-13、7-12、7-11、7-10、7-9、7-8、8-18、8-17、8-16、8-15、8-14、8-13、8-12、8-11、8-10、8-9、9-18、9-17、9-16、9-15、9-14、9-13、9-12、9-11、9-10、10-18、10-17、10-16、10-15、10-14、10-13、10-12、10-11、11-18、11-17、11-16、11-15、11-14、11-13、11-12、12-18、12-17、12-16、12-15、12-14、12-13、13-18、13-17、13-16、13-15、13-14、14-18、14-17、14-16、14-15、15-18、15-17、15-16、16-18、16-17或17-18岁。在一些实施方案中，对象是成人，例如18岁或大于18岁。

某些对象可对本文所述的某些形式的疾病(或病症)(例如自身免疫病或纤维化疾病)具有遗传倾向，并且这些对象也可以根据本公开内容进行治疗。

关于新生儿，特别是低胎龄新生儿，本公开内容考虑了在出生1年、11个月、10个月、9个月、8个月、7个月、6个月、5个月、4个月、3个月、2个月、1个月、4周、3周、2周、1周、6天、5天、4天、3天、2天、1天、12小时、6小时、3小时或1小时内施用经分离的MSC外排体处理的单核细胞或包含其的组合物。在一些实施方案中，在出生1小时内(例如，1小时内、55分钟内、50分钟内、45分钟内、40分钟内、35分钟内、30分钟内、25分钟内、20分钟内、15分钟内、10分钟内、5分钟内或1分钟内)施用经分离的MSC外排体处理的单核细胞或包含其的组合物。在一些实施方案中，在出生之后立即向对象施用经分离的MSC外排体处理的单核细胞或包含这样的单核细胞的组合物。

本公开内容进一步预期了甚至在没有指示如本文所述的疾病或病症的症状的情况下施用经分离的MSC外排体处理的单核细胞或包含其的组合物。

在一些实施方案中，将经分离的MSC外排体处理的单核细胞或包含这样的单核细胞的组合物施用于对象(例如人对象)一次。在一些实施方案中，考虑了经分离的MSC外排体处理的单核细胞或包含这样的单核细胞的组合物的重复施用，包括经分离的MSC外排体处理的单核细胞或包含这样的单核细胞的组合物的两次、三次、四次、五次或更多次施用。在某些情况下，经分离的MSC外排体处理的单核细胞或包含其的组合物可以连续施用。重复或连续施用可以在数小时(例如1-2、1-3、1-6、1-12、1-18或1-24小时)、数天(例如1-2、1-3、1-4、1-5、1-6天或1-7天)或数周(例如1-2周、1-3周或1-4周)的一段时间进行，这取决于所治疗病症的严重程度。如果重复施用而不是连续施用，则施用之间的时间可以为数小时(例如4小时、6小时或12小时)、数天(例如1天、2天、3天、4天、5天或6天)或数周(例如1周、2周、3周或4周)。施用之间的时间可以相同或它们可以不同。

在一些实施方案中，经分离的MSC外排体处理的单核细胞或包含这样的单核细胞的组合物在出生24小时内施用至少一次，然后在出生1周内再施用至少一次。在一些实施方案中，经分离的MSC外排体处理的单核细胞或包含这样的单核细胞的组合物在出生1小时内施用至少一次，然后在出生3-4天内再施用至少一次。

经分离的MSC外排体处理的单核细胞或包含这样的单核细胞的组合物可以通过实现递送至纤维化器官和/或骨髓的任何途径施用。全身施用途径如静脉内注射或连续输注是合适的。其他合适的施用途径包括经口施用、鼻内施用、气管内施用、吸入、静脉内施用等。本领域普通技术人员将知道常规的施用途径。

经分离的MSC外排体处理的单核细胞或包含这样的单核细胞的组合物可以配制用于通过注射(包括例如通过推注或连续输注)进行肠胃外施用。注射用制剂可以存在于单位剂型中，例如在有或没有添加防腐剂的安瓿或多剂量容器中。组合物可以采取诸如在油性或水性载剂中的水溶性悬浮液、溶液或乳剂的形式，并且可以包含配制剂，例如助悬剂、稳定剂和/或分散剂。合适的亲脂性溶剂或载剂包括脂肪油，例如芝麻油，或合成脂肪酸酯，例如油酸乙酯或甘油三酯。水性注射悬浮液可包含提高混悬剂粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。任选地，悬浮液还可包含合适的稳定剂或增加溶解度的试剂。或者，外排体可以是冻干的或其他粉末或固体形式，以在使用前用合适的载剂(例如无菌的无热原的水)配制。

在一些实施方案中，如果第二药剂未与经分离的MSC外排体处理的单核细胞配制在同一组合物中，则本文所述的方法还包括施用有效量的第二药剂(例如，用于治疗纤维化疾病或自身免疫病的药剂)。第二药剂也可以通过任何合适的途径施用，包括全身施用(例如静脉内输注或注射)、经口施用、鼻内施用、气管内施用、吸入等。本领域普通技术人员将知道用于这样的第二药剂的常规施用途径。

“纤维化疾病”或“纤维化”是指在修复或反应过程以在器官或组织中形成过量的纤维结缔组织所表现出的病症。纤维化疾病的非限制性实例包括：系统性硬化(硬皮病)、肺纤维化(例如囊性纤维化或特发性肺纤维化)、肝纤维化(肝硬化或胆道闭锁)、心脏纤维化(例如心房纤维化、心内膜心肌纤维化或陈旧性心肌梗死)、脑纤维化(例如胶质瘢痕)、肾纤维化和骨髓纤维化。其他类型的纤维化疾病包括但不限于：动脉僵硬、关节纤维化(膝盖、肩膀、其他关节)、克罗恩病(crohn′s disease)(肠)、迪皮特朗挛缩(dupuytren′scontracture)(手、手指)，瘢痕疙瘩(皮肤)、纵隔纤维化(纵隔的软组织)、骨髓纤维化(骨髓)、佩伦涅病(peyronie′s disease)(阴茎)、肾源性全身纤维化(皮肤)、进行性块状纤维化(progressive massive fibrosis)(肺)；煤矿工人尘肺的并发症、腹膜后纤维化(腹膜后的软组织)、硬皮病/全身性硬化(皮肤、肺部)和某些形式的粘附性囊炎(肩)。

在一些实施方案中，纤维化疾病是肺纤维化。“肺纤维化”是指肺组织受损和瘢痕形成，导致肺组织增厚和僵硬并且肺功能下降的病症。肺纤维化可能有多种原因。肺纤维化通常见于支气管肺发育不良(BPD)患者。在一些实施方案中，肺纤维化是特发性肺纤维化(IPF)。特发性肺纤维化的特征是没有已知原因的肺部瘢痕形成或增厚。其最常发生在50-70岁的人中。其症状包括呼吸急促、经常咳嗽(通常是干咳)、胸痛和活动水平降低。对于纤维化疾病(例如，肺纤维化)，本文显示了在与纤维化相关的炎症的开始或晚期，施用经分离的MSC外排体处理的单核细胞在治疗上对疾病有效。

在一些实施方案中，经分离的MSC外排体处理的单核细胞降低了与纤维化疾病相关的炎症。本领域技术人员熟悉评估纤维化器官(例如肺)中的炎症程度的方法。在一些实施方案中，可以通过测量纤维化器官或血液中炎症的生物标志物的水平来评估炎症。在一些实施方式中，与尚未施用经分离的MSC外排体处理的单核细胞的对象相比，已经施用经分离的MSC外排体处理的单核细胞的对象中纤维化器官(例如，肺)中的炎症降低至少20％。例如，与尚未施用经分离的MSC外排体处理的单核细胞的对象相比，已经施用经分离的MSC外排体处理的单核细胞的对象中的炎症降低中的炎症可降低至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％。在一些实施方案中，与尚未施用经分离的MSC外排体处理的单核细胞的对象相比，已经施用经分离的MSC外排体处理的单核细胞的对象中的炎症降低中的炎症降低20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％。

在一些实施方案中，经分离的MSC外排体处理的单核细胞降低了纤维化器官中上皮细胞(例如，肺中的肺泡上皮细胞)的凋亡。“凋亡”是指作为生物体生长或发育的正常和受控部分而发生的细胞死亡。在一些实施方案中，当与尚未施用经分离的MSC外排体处理的单核细胞的对象相比，已经施用经分离的MSC外排体处理的单核细胞的对象中经历凋亡的肺泡上皮细胞的数目减少至少20％时，认为纤维化器官中的上皮细胞(例如，肺中的肺泡上皮细胞)的凋亡降低。例如，当与尚未施用经分离的MSC外排体处理的单核细胞的对象相比，已经施用经分离的MSC外排体处理的单核细胞的对象中经历凋亡的肺泡上皮细胞的数目减少至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％时，可以认为纤维化器官中的上皮细胞(例如，肺中的肺泡上皮细胞)的凋亡降低。在一些实施方案中，当与尚未施用经MSC外排体处理的单核细胞的对象相比，已经施用经分离的MSC外排体处理的单核细胞的对象中经历凋亡的肺泡上皮细胞的数目减少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％时，认为纤维化器官中的上皮细胞(例如，肺中的肺泡上皮细胞)的凋亡降低。

在一些实施方案中，经分离的MSC外排体处理的单核细胞降低了肺纤维化。当与尚未施用经MSC外排体处理的单核细胞的对象相比，已经施用经MSC外排体处理的单核细胞的对象中肺纤维化的程度(例如，通过肺组织胶原蛋白沉积所指示)降低至少20％时，认为肺纤维化降低。例如，当与尚未施用经MSC外排体处理的单核细胞的对象相比，已经施用经MSC外排体处理的单核细胞的对象中肺纤维化的程度(例如，通过肺组织胶原蛋白沉积所指示)降低至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％时，可以认为肺纤维化降低。在一些实施方案中，当与尚未施用经MSC外排体处理的单核细胞的对象相比，已经施用经MSC外排体处理的单核细胞的对象中肺纤维化的程度(例如，通过肺组织胶原蛋白沉积所指示)降低20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％时，认为肺纤维化降低。

“自身免疫病”是指自己免疫系统错误地攻击自己身体的情况。通常，免疫系统可以分辨外来细胞与自己细胞之间的差异。在自身免疫病中，免疫系统将自己身体的一部分(例如关节或皮肤)误认为是异物。其释放出被称为自身抗体的蛋白质攻击健康细胞。一些自身免疫病仅针对一个器官。1型糖尿病会损害胰腺。另一些疾病如狼疮会影响整个身体。自身免疫病的非限制性实例包括：失弛缓症(Achalasia)、艾迪生病(Addison's disease)、成年斯蒂尔病(Adult Still′s disease)、无丙种球蛋白血症(Agammaglobulinemia)、斑秃、淀粉样变性、强直性脊柱炎、抗-GBM/抗-TBM肾炎、抗磷脂综合征、自身免疫性血管性水肿、自身免疫性自主神经障碍、自身免疫性脑脊髓炎、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳疾病(AIED)、自身免疫性心肌炎、自身免疫性卵巢炎、自身免疫性睾丸炎、自身免疫性胰腺炎、自身免疫性视网膜病、自身免疫性荨麻疹、轴突和神经元神经病(AMAN)、Baló病、白塞病(Behcet's disease)、良性黏膜类天疱疮、大疱性类天疱疮、卡斯尔曼病(Castlemandisease，CD)、乳糜泻(Celiac disease)、美洲锥虫病(Chagas disease)、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(Chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy，CIDP)、慢性复发性多灶性骨髓炎(Chronic recurrent multifocal osteomyelitis，CRMO)、许尔-斯特劳斯综合征(Churg-Strauss Syndrome，CSS)或嗜酸性肉芽肿(EosinophilicGranulomatosis，EGPA)、瘢痕性类天疱疮(Cicatricial pemphigoid)、柯根综合征(Cogan's syndrome)、冷凝集素病(Cold agglutinin disease)、先天性心脏传导阻滞、柯萨奇心肌炎、CREST综合征、克罗恩病、疱疹样皮炎、皮肌炎、德维克病(Devic's disease)(视神经脊髓炎)、盘状狼疮(Discoid lupus)、心肌梗死后综合征(Dressler's syndrome)、子宫内膜异位症、嗜酸性食管炎(Eosinophilic esophagitis，EoE)、嗜酸性筋膜炎、结节性红斑(Erythema nodosum)、特发性混合型冷沉淀球蛋白血症(Essential mixedcryoglobulinemia)、Evans综合征、纤维肌痛(Fibromyalgia)、纤维化肺泡炎(Fibrosingalveolitis)、巨细胞动脉炎(颞动脉炎)、巨细胞心肌炎、肾小球肾炎、肺出血肾炎综合征(Goodpasture's syndrome)、肉芽肿性多血管炎、格雷夫斯病(Graves’disease)、格林-巴利综合征(Guillain-Barre syndrome)、桥本甲状腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、溶血性贫血、过敏性紫癜(Henoch-Schonlein purpura，HSP)、妊娠疱疹或妊娠类天疱疮(PG)、化脓性汗腺炎(Hidradenitis Suppurativa，HS)(反常性痤疮)、低丙种球蛋白血症(Hypogammalglobulinemia)、IgA肾病、IgG4相关硬化病、免疫性血小板减少性紫癜(Immunethrombocytopenic purpura，ITP)、包涵体肌炎(Inclusion body myositis，IBM)、间质性膀胱炎(Interstitial cystitis，IC)、青少年关节炎、青少年糖尿病(1型糖尿病)、青少年肌炎(JM)、川崎病(Kawasaki disease)、兰伯特-伊顿综合征(Lambert-Eaton syndrome)、白细胞破坏性脉管炎(Leukocytoclastic vasculitis)、扁平苔藓(Lichen planus)、硬化性苔藓(Lichen sclerosus)、木样结膜炎(Ligneous conjunctivitis)、线状IgA病(LAD)、狼疮、慢性莱姆病(Lyme disease chronic)、美尼尔病(Meniere's disease)、显微镜下多血管炎(Microscopic polyangiitis，MPA)、混合性结缔组织病(Mixed connective tissuedisease，MCTD)、蚕蚀性角膜溃疡(Mooren's ulcer)、Mucha-Habermann病、多灶性运动神经病(Multifocal Motor Neuropathy，MMN)或MMNCB、多发性硬化、重症肌无力、肌炎、发作性睡病、新生儿狼疮、视神经脊髓炎、中性粒细胞减少症、眼瘢痕性天疱疮、视神经炎、复发性风湿病(PR)、PANDAS、副肿瘤性小脑变性(Paraneoplastic cerebellar degeneration，PCD)、阵发性睡眠性血红蛋白尿症(Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria，PNH)、ParryRomberg综合征、Pars planitis(周边葡萄膜炎)、Parsonnage-Turner综合征、天疱疮、周围神经病变、周围性脑脊髓炎、恶性贫血(PA)、POEMS综合征、结节性多动脉炎、I型、II型、III型多腺综合征、风湿性多肌痛、多肌炎、心肌梗死后综合征(Postmyocardial infarctionsyndrome)、心包切开术后综合征、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、孕激素性皮炎(Progesterone dermatitis)、银屑病、银屑病关节炎、单纯红细胞再生障碍性贫血(Purered cell aplasia，PRCA)、坏疽性脓皮病(Pyoderma gangrenosum)、雷诺现象(Raynaud'sphenomenon)、反应性关节炎、反射性交感神经营养不良(Reflex sympatheticdystrophy)、复发性多软骨炎(Relapsing polychondritis)、不宁腿综合症(Restlesslegs syndrome，RLS)、腹膜后纤维化、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、施密特综合征(Schmidt syndrome)、巩膜炎(Scleritis)、硬皮病、干燥综合征(

syndrome)、精子和睾丸自身免疫、僵人综合征(Stiff person syndrome，SPS)、亚急性细菌性心内膜炎(Subacute bacterial endocarditis，SBE)、Susac综合征、交感性眼炎(SO)、大动脉炎(Takayasu's arteritis)、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、血小板减少性紫癜(Thrombocytopenic purpura，TTP)、托洛萨-亨特综合征(Tolosa-Hunt syndrome，THS)、横贯性脊髓炎(Transverse myelitis)、1型糖尿病、溃疡性结肠炎(UC)、未分化结缔组织病(Undifferentiated connective tissue disease，UCTD)、葡萄膜炎、血管炎、白癜风、Vogt-Koyanagi-Harada病、魏格纳肉芽肿(Wegener's granulomatosis)(或肉芽肿多发性血管炎(GPA))。

在一些实施方案中，自身免疫病选自：类风湿性关节炎(RA)、系统性红斑狼疮(SLE)、重症肌无力(MG)、格雷夫斯病、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、格林-巴利综合征、自身免疫性心肌炎、膜性肾小球肾炎、I型或II型糖尿病、青少年糖尿病、多发性硬化、雷诺综合征、自身免疫性甲状腺炎、胃炎、乳糜泻、白癜风、肝炎、原发性胆汁性肝硬化、炎性肠病、脊柱关节病(spondyloarthropathies)、实验性自身免疫性脑炎、免疫中性粒细胞减少，以及与由细胞因子、T淋巴细胞介导的迟发型超敏反应相关的免疫应答，其存在于结核病、结节病和多发性肌炎中，多动脉炎、皮肤血管炎、天疱疮(例如寻常性天疱疮、落叶状天疱疮(pemphigus foliaceus)或副肿瘤性天疱疮(paraneoplastic pemphigus))、类天疱疮、肺出血肾炎综合征、川崎病、全身性硬化、抗磷脂综合征和干燥综合征。

从下面的实施例中将更充分地理解本文公开的技术的一些实施方案、优点、特征和用途。实施例旨在说明本公开内容的一些益处并描述特定的实施方案，但不旨在例示本公开内容的全部范围，并且因此不限制本公开内容的范围。

实施例

特发性肺纤维化(IPF)是一种慢性进行性呼吸系统疾病，其潜在机制尚不完全清楚，并且目前尚缺乏有效的治疗。尽管用间充质基质细胞(MSC)治疗在预防肺纤维化中提供了有希望的结果，但细胞疗法的局限性继续使得无细胞疗法是非常期望的。在除IPF以外的临床前模型中，已证明从MSC分泌组分离的MSC细胞外囊泡(EV)或更具体地说外排体(MEx)可作为治疗载体。MEx的作用及其IPF中的作用机制(MOA)尚不清楚。

目的：研究MEx在博来霉素-IPF模型中的效力和MOA。

方法：在气管内博来霉素滴注后0或7天，将从人骨髓MCS分离的外排体(MEx)注射到成年C57BL/6小鼠中。在第7和14天收集肺和骨髓来源的单核细胞(BMDMo)，以进行组织学、基因表达或细胞计数分析。

测量和主要结果

在博来霉素暴露的同时或之后7天用MEx处理基本上预防了肺纤维化和胶原蛋白沉积。MEx处理减轻了炎症，并减少了肺中经典(Ly6Chi CCR-2+ve)单核细胞。对MEx上游作用的探索表明，MEx诱导了骨髓中从经典向调节性单核细胞表型的转变。有趣的是，MEx预处理的BMDMo的过继转移足以减轻纤维化。另外，MEx防止了肺泡上皮细胞凋亡。

结论：这表明如果在炎症的早期或晚期阶段施用，则利用MEx的全身治疗预防了纤维化。进一步表明，MEx通过调节骨髓中的单核细胞表型来发挥全身免疫调节作用，其保护肺免于纤维化。这些结果表明了MEx在纤维化肺部疾病的无细胞治疗中的潜在用途。

引言

特发性肺纤维化(IPF)是一种慢性进行性呼吸系统疾病，患病率为每100,000人每年中0.5至27.9(1，2)。缺少对这种疾病的潜在机制的完全了解可能导致缺乏成功的治疗。尽管有两种新批准的药物，但IPF仍然是致命的，五年存活率小于10％(3-6)。除药物疗法外，还研究了基于细胞的疗法，例如间充质基质细胞(MSC)(7-9)。尽管用MSC疗法在预防肺纤维化中提供了有希望的结果，但局限性例如不良的免疫反应、生存挑战、意外的植入、MSC向成纤维细胞分化的潜力等继续使得无细胞疗法是非常期望的(8-10)。

先前已经证明，MSC的治疗能力存在于其分泌组中，该分泌组由通常被封闭在细胞外囊泡(EV)中的生物活性分子的异质库构成。在除IPF以外的临床前模型中，例如支气管肺发育不良、肺动脉高压和急性肺损伤中，已证明从MSC分泌组分离的EV或更具体地说外排体(MEx)可作为治疗载体(7，11-19)。

MEx在IPF中的作用尚不清楚。越来越多的文献支持循环炎性单核细胞和肺泡M2样巨噬细胞在肺纤维化的发生和发展中的作用(20，21)。此外，博来霉素诱导的纤维化模型中的最新报道表明，肺损伤后存在于肺中的单核细胞来源的肺泡巨噬细胞(AM)具有有害作用(21，22)。MEx是否对单核细胞有任何全身和免疫调节作用尚不清楚。另外，尚未确定MEx作用的来源。

在这项研究中，其表明，如果在炎症的早期或晚期阶段(施用博来霉素后的第0天和第7天)施用，则利用纯化的MEx的全身治疗预防了肺纤维化。进一步揭示了MEx在调节巨噬细胞和单核细胞表型中的全身和器官水平作用。已证明MEx通过将骨髓中的单核细胞亚群从炎性表型改变为调节性表型来发挥抗凋亡和免疫调节作用。后一种发现导致发现，即使是MEx处理的骨髓来源单核细胞(BMDMo)的全身递送(过继转移)也预防肺纤维化。这项研究为MEx的作用提供了机制方面的见解，支持了全身免疫调节潜力，导致了肺部的继发性抗纤维化作用。

方法：

动物模型、组织学和细胞计数

所有小鼠在无病原体的设施中饲养和护理。所有动物实验均获得波士顿儿童医院动物护理和使用委员会(Boston Children's Hospital Animal Core and UseCommittee)的批准。在第0天，将10至14周龄的C57BL/6小鼠(Charles Laboratories)用异氟烷麻醉，并以3U/kg的剂量气管内注射50μl 0.9％生理盐水(NS)中的硫酸博来霉素或单独NS。在第0天和第7天，小鼠通过尾静脉注射接收200μl推注剂量的MEx(由5x 10⁶个MSC产生的EV，治疗组)、人皮肤成纤维细胞来源的外排体(FEx)(由5x 10⁶个人皮肤成纤维细胞产生的EV，第一对照组)或OptiPrep^TM(碘克沙醇，IDX，1∶9稀释)(载剂，第二对照组)或NS。

在设计时间点的博来霉素处理后，通过腹膜内注射戊巴比妥使小鼠安乐死。通过右心室向心脏灌注磷酸盐缓冲盐水(PBS，invitrogen)。

为了进行组织学分析，将气管插管，并用4％多聚甲醛充满肺。将右肺包埋在石蜡中，并切片以进行苏木精和曙红染色或Masson三色染色。将左肺在液氮中速冻并用于RNA和蛋白质分离，或新鲜用于胶原蛋白定量或细胞计数分析。使用Nikon Eclipse 80i显微镜(Nikon，Tokyo，Japan)以100倍和200倍放大倍数采集来自5μm厚肺切片的随机选择的区域(10-15个视野)。不对大气道和血管成像。对于组织学定量，以盲法使用Ashcroft评分。0-1的评分表示无纤维化，2-3的评分表示轻度纤维化，4-5的评分被认为是中度纤维化，并且6-8的评分表示严重纤维化(23)。

如先前所述(11)分离BMDMo。将细胞悬浮液用于细胞计数分析，并且培养3天的贴壁细胞用于过继转移实验(更多详细信息请参见在线补充材料)。

外排体分离和纯化

如先前所述使用OptiPrep^TM(碘克沙醇；IDX)垫层密度浮选(11)进行外排体的分离、纯化和表征。简单地说，将来自骨髓MSC或人皮肤成纤维细胞(HDF)的浓缩条件培养基漂浮在IDX垫层顶部上，并在4℃下以100,000xg离心3.5小时。

统计

在GraphPad Prism(v6.0；GraphPad，CA，US)上使用ANOVA和Fisher的LSD事后检验分析比较不同组之间的数据。使用FlowJo software v10.2(TreeStar，OR，US)进行流式细胞术数据分析。通过RT-qPCR评估mRNA水平，并相对于内源对照进行表示。ΔCT用于统计分析。数据表示为平均值±平均值的标准误差(SEM)。除非另有说明，否则关于p＜0.05阈值确定显著性。每组使用至少5只动物，以5％α水平获得＞90％的功效。

结果

早期炎症期间的MEx施用预防肺纤维化

将良好建立的博来霉素肺损伤模型用于肺纤维化，其以炎性阶段(第0至8天)然后是纤维化阶段(第9至32天)为特征(24)。

为了研究MEx在预防肺纤维化中的作用，10至14周龄的小鼠在第0天接受气管内博来霉素(3U/kg)或NS(载剂，对照)，然后通过尾静脉接收推注剂量的静脉内(IV)MEx。在第14天处死小鼠，并评估肺的纤维化定量和胶原蛋白含量(图1A)。与对照小鼠相比，博来霉素将Ashcroft评分提高超过三倍。与博来霉素组(Bleo+NS，图1B和1C)相比，MEx处理的小鼠(Bleo+MEx)中的纤维化评分显著降低。类似地，在Bleo+MEx小鼠中，由博来霉素引起的胶原蛋白沉积的增加大幅降低(图1D)。为了确保治疗效果是MEx特有的，还向博来霉素暴露小鼠注射了成纤维细胞外排体(Bleo+FEx)和碘克沙醇(Bleo+IDX)。在上述组中未见到纤维化或胶原蛋白沉积的改善。为了排除用MEx处理导致肺部结构改变的可能性，向对照小鼠注射MEx。该处理在小鼠中被很好地耐受，并且肺胶原蛋白含量和组织学与接受NS的对照小鼠中的相似(图1B至1D)。

这些结果表明，在炎性阶段开始时单剂量IV MEx预防了纤维化。这种作用是MSC外排体特有的，因为来源于成纤维细胞的外排体[和分离自培养基的外排体(碘克沙醇)]不能预防肺纤维化。

炎症结束时的MEx治疗逆转肺纤维化

为了评估MEx在炎症晚期阶段的作用，在博来霉素施用之后7天向小鼠注射MEx(图7A)。与在预防性治疗实验(在第0天进行MEx注射)中观察到的相似，在炎症阶段期间施用MEx导致纤维化评分改善和胶原蛋白沉积的统计学上显著降低(图7B、7C和7D)。因此，即使在炎症结束时施用，MEx治疗也改善了纤维化。

MEx调节肺泡巨噬细胞表型并且减轻炎症

为了研究MEx在博来霉素肺损伤模型中的作用机制，进行了预防性治疗实验(第0天进行MEx注射)。

单核细胞来源的巨噬细胞参与纤维化的发生和发展(20,21)，因此，通过调节炎性和促纤维化巨噬细胞表型来评估MEx在调节炎症中的作用。施用博来霉素之后7或14天全肺的基因表达分析显示，巨噬细胞炎症标志物Ccl-2和精氨酸酶-1(Arg1)的表达水平升高，而其mRNA水平与在MEx处理的对照肺中观察到的水平相当。白细胞介素-6mRNA水平显示出与Ccl-2和Arg1相似的趋势，尽管组之间的差异没有达到统计学显著性。此外，在所有三个实验组中的这两个时间点，TGF-β的表达相似(图2A和2B)。用巨噬细胞M2样活化的标志物CD206和Arg1抗体对肺组织切片进行免疫荧光(IF)染色显示，在接受博来霉素的小鼠中IF强度升高，但是当用MEx处理小鼠时保持与对照水平相似(图2C和2D)。全肺的流式细胞术分析还显示在博来霉素小鼠中表达CD206的肺泡巨噬细胞(AM)(CD45+veCD11b-veCD11c+veCD206+ve细胞)增加。尽管用MEx处理具有少量的表达CD206的AM，但是水平没有达到统计学显著性(图2E)。以上结果表明，MEx通过调节肺中AM表型发挥抗炎作用。

MEx恢复肺中的肺泡巨噬细胞和调节性单核细胞群

为了研究免疫细胞群随着博来霉素损伤和MEx治疗之后的动态变化，在施用博来霉素之后第7天或第14天对全肺进行细胞计数分析。在第7天，在博来霉素处理的小鼠中注意到AM数目(CD45+veCD11b-veCD11c+ve细胞)减少。这与Ly6Chi经典或炎性单核细胞(CD45+veCD11b+veMHC II-veLy6ChiCCR-2+ve细胞)的数目增加有关(图3B)。然而，在第14天，博来霉素滴注之后AM的比例增加(图3C)，而经典单核细胞的数目减少(图3D)。MEx治疗导致在第7天和第14天AM和浸润性单核细胞群恢复到与对照组相似的水平。这些结果表明，在肺部损伤后，MEx可以将AM与募集的单核细胞群之间的体内平衡恢复到与在对照小鼠中发现的水平和表型相似。

MEx可以调节骨髓中的单核细胞表型

在观察到博来霉素暴露小鼠的肺中炎性单核细胞增多且在MEx治疗后恢复到正常水平之后，并考虑到单核细胞发育是在骨髓(BM)中发生这一事实(25)，提出MEx可通过改变BM中的单核细胞表型来发挥免疫调节作用。为了回答这个问题，首先研究了MEx渗透BM的潜力。将染料标记的EV静脉内注射到对照小鼠中，并在注射后2、4、8和24小时处死动物。BM细胞离心涂片的Dapi染色显示在注射后多至8小时在BM中存在EV(图9，图像代表注射后2小时，其他时间点未示出)。

随后，通过观察BM中髓样细胞的特征来研究MEx的全身作用。有趣的是，在活动性炎症阶段(第7天)期间，从对照、博来霉素和MEx处理的小鼠的BM分离的髓样细胞的流式细胞术分析显示了与在肺中观察到的相似变化。尽管在三个实验组中获得的CD45+ve细胞的数目相当(数据未示出)，但是博来霉素暴露小鼠中的调节性单核细胞数目(Cd45+veCD11bhighMHC II-veLy6ClowCCR-2-ve)少于MEx处理的小鼠和对照小鼠中的一半(分别为14.18％vs 27.57％和32.3％±5.7，图3E)。相比之下，博来霉素暴露组中的单核细胞群由～70％(67.8％±1.7)的经典单核细胞组成，对比于MEx处理的小鼠和对照小鼠组中的约50％至60％(分别为57.5％±3.9和50.1％±3.2，图3F)。这些结果表明，在存在器官损伤的情况下，MEx通过将骨髓中的单核细胞群从促炎性转变为调节性表型而发挥免疫调节作用。

MEx对BMDMo的免疫调节作用足以预防肺纤维化

考虑到MEx治疗后BM调节性单核细胞增加，假设MEx对骨髓单核细胞的免疫调节作用可足以预防纤维化，并且肺中的进一步变化是改变的BM单核细胞亚群的结果。

为了检验该假设，探索了离体处理的BMDMo在预防纤维化中的作用。进行过继转移实验，其中从野生型FVB小鼠分离出原代Mos，并培养3天。在第1天和第2天用MEx(BMDMo+MEx)或单独的培养基(BMDMo+培养基)处理细胞(图4A)。在第3天，证实超过90％的骨髓细胞是CD45+veCD11b+ve(髓样亚群，图4B)。然后用Dil(荧光亲脂性染料)标记单核细胞，并且在滴注博来霉素之后在第0天和第3天静脉内过继转移至C57BL/6小鼠。在第14天处死小鼠，并评估肺的组织学和胶原蛋白含量。将结果与接受博来霉素和NS注射的小鼠(博来霉素)进行比较。施用博来霉素之后14天，在肺中鉴定了Dil标记的单核细胞(图4C)。有趣的是，与博来霉素和接受BMDMo+培养基的小鼠相比，在接受BMDMo+MEx的小鼠中通过组织学定量和胶原蛋白测定二者检测较少的纤维化。令人惊讶地，与博来霉素暴露小鼠相比，在BMDMo+培养基处理组中检测到组织学上纤维化评分的最小改善和统计学上不显著的胶原蛋白沉积(图4D、4E和4F)。为了研究抗纤维化作用是否反而可归因于定居AM，在博来霉素滴注之后气管内施用MEx处理的AM(AM+MEx)(详细信息在补充方法中介绍)。与博来霉素组相比，在接受预处理的AM的小鼠中未检测到纤维化的任何改善(图4E)。

这些数据强烈表明，用MEx处理BMDMo会促进调节性表型，其自身改善纤维化。这进一步证实了MEx的治疗作用不仅限于肺，并且MEx通过调节骨髓单核细胞表型发挥全身性抗炎作用，其导致减轻炎症并预防受损肺中的纤维化。

MEx治疗降低凋亡

肺泡上皮细胞凋亡(AEC)已被描述为受损肺中促纤维化信号的触发因素(26、27)。为了探索MEx保护免受肺损伤的其他机制，研究了MEx在博来霉素损伤之后在降低凋亡中的潜在作用。在来自对照、博来霉素和MEx处理的小鼠的肺切片上使用tunel染色对肺凋亡程度进行评估。在博来霉素暴露组中发现凋亡增加，而在Bleo+MEx和对照小鼠中凋亡水平相似(图5A，5B)。另外，在第14天进行全肺的膜联蛋白V/PI染色。与对照和MEx处理的小鼠相比，在博来霉素中存在的凋亡(膜联蛋白V+/PI-)再次增加(图5C)。

此外，评估了MEx对人肺泡上皮细胞(A549，AEC)的直接抗凋亡作用。设计了一种体外测定，其中通过用博来霉素处理A549细胞来诱导上皮细胞凋亡。一组博来霉素暴露的AEC用MEx处理24小时，并使用

3/7发光测定通过胱天蛋白酶3和7活性确定凋亡的变化。注意到博来霉素组中的凋亡增加，这在MEx处理的细胞中被消除(图5D)。上述发现支持MEx在体外和体内的重要抗纤维化作用。

讨论

这项研究表明，在博来霉素诱导的肺损伤的炎症阶段的诱导期或结束时，单IV剂量的人骨髓来源的MEx显著预防了纤维化并恢复了肺结构。MEx处理不仅减轻了肺部炎症，而且还将AM和募集的单核细胞数恢复至与对照小鼠相似的水平。前述观察和单核细胞发育源于骨髓(BM)的事实导致了通过研究BM髓样特征来研究MEx的上游免疫调节作用。除了BM中标记的MEx的可视化外，BM骨髓细胞的流式细胞术分析揭示了MEx处理的小鼠中单核细胞亚群从促炎性(Ly6ChiCCR-2+ve)转变为调节性(Ly6ClowCCR-2-ve)表型。

有趣的是，使用新的MEx预处理的BMDMo过继转移实验表明，MEx对BM单核细胞的免疫调节作用至少部分足以说明其在肺中的保护作用。最后，探索了在保护免受肺纤维化中的其他潜在机制，并注意到MEx处理小鼠的肺中凋亡降低。此外，体外实验表明，MEx通过靶向肺泡上皮细胞发挥抗凋亡作用。

为了合理解释博来霉素暴露小鼠中不同时间点(第7天和第14天)的细胞计数结果，先前的发现被认为，募集的炎性(Ly6Chi)单核细胞和单核细胞来源的替代性活化的巨噬细胞(M2样)与纤维化的发生和发展有关(20-22，28-31)。另外，这些结果表明博来霉素肺损伤后炎性单核细胞的增加起源于BM。似乎合理的是，博来霉素诱导的定居AM的损失向BM干细胞发信号以增加向促炎性单核细胞分化，然后这些细胞在炎症阶段存在于肺部(如模型第7天所示)。这些经典单核细胞在损伤的后期分化为M2样AM，并提供了进一步加剧纤维化反应的促纤维化环境。这解释了第14天AM及其炎症标志物的增加。

MSC-EV可以重新恢复受辐照小鼠的BM中的Sca-1阳性和c-kit低阳性干细胞(32)。在心肌炎模型中，其还被证明调节单核细胞运输(33)。在存在器官损伤的情况下，MSC-EV可重编程骨髓干细胞以分化为调节性表型。因此，BM中的调节性单核细胞增加且肺中的炎性单核细胞减少，并且因此较少分化为促纤维化巨噬细胞。用MEx处理的BMDMo的过继转移预防纤维化强烈表明，BM单核细胞表型的改变是随后MEx在肺部的抗纤维化作用的机制解释。气管内注射MEx处理的AM并没有重现这种效果。在Morrison和同事的最近研究中，向LPS诱导的急性肺损伤模型气管内施用MSC-EV处理的AM降低了炎症(17)。尽管这些结果也与MSC-EV对巨噬细胞的免疫调节作用相吻合，但在本实验中，AM转移之后纤维化改善的缺乏可由于疾病模型的不同以及因此不同的潜在病理生理。Van de Laar和同事证明，成熟的AM和BMDMo二者具有在空的AM生态位(niche)定居并发展为功能性组织定居巨噬细胞的能力(34)。炎症开始时(过继转移实验中的第0至3天)缺少空的AM生态位可能无法使移植的AM充分定植。

最后，使用不同的体内方法显示，除了免疫调节外，MEx还可以通过降低凋亡来潜在地预防纤维化。此外，本文所述的体外测定表明该作用是通过靶向肺泡上皮细胞产生的。

该研究存在局限性。当前的治疗剂量是根据先前的实验估算的。因此，应进行进一步的研究以调查剂量反应。

本研究在IPF实验模型中研究了MSC外排体的作用。这些发现为博来霉素肺损伤后的全身炎症反应以及骨髓中单核细胞表型的改变提供了新的见解。此外，本研究发现了MSC外排体的免疫调节作用及其作用源的新机制解释。如果在疾病过程早期施用，MSC外排体被认为是用于治疗纤维化肺疾病的有希望的无细胞疗法。

补充方法

细胞分离和培养

人骨髓间充质干细胞(BMSC)获自RoosterBio(RoosterBio，MD，US)。人包皮(皮肤)成纤维细胞(HDF)通过组织块法(tissue explant method)建立(36)。如前所述(37)对BMSC和HDF进行培养和扩增并进一步表征。在F-12K培养基(Thermo Fisher Scientific，Inc.，Waltham，MA)中培养A549肺泡上皮细胞(ATCC)。

透射电子显微术(TEM)

将5-10μl细胞外囊泡(EV)制备物的等分试样在formvar/碳包被的网格(ElectronMicroscopy Sciences，PA，US)上吸附15秒。在用Whatman 1级滤纸(Sigma)除去多余的液体后，将样品用2％乙酸双氧铀染色。然后，通过JEOL 1200EX透射电子显微镜(TEM)观察EV，并使用AMT 2k CCD相机记录图像。

纳米颗粒跟踪分析

如先前所述(37)，使用纳米颗粒跟踪分析(NTA，NanoSight LM10系统，Malvern仪器，MA，US)确定外排体的尺寸和浓度分布。

Western印迹分析

在4-20％的聚丙烯酰胺凝胶(Bio-Rad，Hercules，CA)上分离外排体制备物中的蛋白质，然后转移到0.45μm PVDF膜(Millipore，MA，US)上。基于制造商推荐的稀释度，使用兔多克隆抗脂阀结构蛋白-1(anti-flotillin-1)和抗CD63抗体(Santa Cruz Biotech，CA，US)和小鼠单克隆抗Alix抗体(Santa Cruz Biotech，CA，US)。

EV给药

将EV制备物在PBS上稀释至相当于5x 10⁶细胞当量。该剂量基于具有相应的NTA和蛋白质浓度的新生小鼠中的先前剂量计算(37)估计。

免疫荧光染色

将肺组织切片在二甲苯中脱蜡并且再水化。将组织载玻片用10mM柠檬酸盐缓冲液处理，并用血清和BSA封闭20分钟。然后将样品用指示的一抗精氨酸酶1(Santa CruzBiotech，CA，US)、CD206(Santa Cruz Biotech，CA，US)在40℃下孵育过夜，然后用二抗(Life technologies，MA，US)进一步孵育20分钟，然后用DAPI进行核染色10分钟。

使用Nikon Eclipse 80i显微镜(Nikon，Tokyo，Japan)对精氨酸酶1和CD206阳性细胞进行成像。使用图像J软件分析10-15个随机图像。

使用以下公式计算平均荧光强度(MFI)：MFI＝积分密度-(所选细胞的面积*背景读数的平均荧光)。

Sircol胶原蛋白测定

根据制造商的方案(Biocolor，Life Science Assays)将左肺用于胶原蛋白定量。简单地说，将左肺匀浆在含有0.6％胃蛋白酶的5ml 0.5M乙酸中于4℃下振摇过夜。将1ml染料试剂添加到100μl透明上清液，并将样品涡旋30分钟。用酸-盐洗涤缓冲液洗涤残留的沉淀物以消除未结合的胶原蛋白，并用碱化缓冲液将pH归一化。在酶标仪(microplatereader)中于550nm的波长处测量吸光度。将测得的胶原蛋白含量与标准曲线进行比较，并表示为mg/ml左肺匀浆。

小鼠全肺和骨髓的细胞计数分析

如先前所述(38)通过流式细胞术评估肺巨噬细胞群。在第7和14天收获肺。将左肺切成小块，并在5ml消化缓冲液中消化，所述消化缓冲液由RPMI-1640(Invitrogen，CA，US)以及来自Worthington Biochemical Corp，NJ，US的胶原酶IV(1.6mg/ml)和DNAsel(50单位/ml)组成。将肺在37℃下振摇30分钟，并使用RBC裂解缓冲液(Roche，IN，US)裂解红细胞(RBC)。将均浆肺通过40μm细胞过滤器(Corning，MA，US)以获得单细胞悬浮液。

为了评估肺泡巨噬细胞和单核细胞群，用以下抗体对细胞悬浮液进行染色：PE/Cy7缀合的抗小鼠CD45、FITC缀合的抗小鼠CD11b、PerCP Cy 5.5缀合的抗小鼠CD11c、BV421缀合的抗小鼠CD206、BV 605缀合的抗小鼠MHC II、BV 510缀合的抗小鼠Ly6C和Alexa647缀合的抗小鼠CCR-2。

为了评估骨髓来源单核细胞(BMDMo)，用以下对来自成年小鼠的股骨和胫骨的新鲜冲洗细胞进行染色：PE/Cy7缀合的抗小鼠CD45、FITC缀合的抗小鼠CD11b、BV 605缀合的抗小鼠MHC II、BV 510缀合的抗小鼠Ly6C和Alexa 647缀合的抗小鼠CCR-2(所有抗体获自Biolegend，CA，US)。体外培养3小时后，对收获的BMDMo进行类似的染色。

相应地调整了补偿，其得到了UltraComp ebeads(Affymetrix，CA，US)的支持。相应地使用荧光减一对照。根据图8所示的设门策略鉴定细胞群，并记录为总细胞群的百分比。

逆转录聚合酶链式反应分析

按照制造商的说明，使用

(Thermo Fisher Scientific，Inc.，Waltham，MA)从左肺中提取总RNA。用于PCR反应的

引物包括Ccl2、I16、TGF-β和精氨酸酶1，其获自Invitrogen。

核孔蛋白133用作内部对照。如先前所述与对照小鼠相比进行变化倍数的分析(39)。

膜联蛋白V/PI凋亡测定、tunnel染色和胱天蛋白酶3/7测定

将膜联蛋白V染色试剂盒(Sigma-Aldrich，MO，US)用于评估整个肺的凋亡。如上所述从左肺获得单细胞悬浮液。然后将细胞漂浮在1x结合缓冲液中并用FITC缀合的膜联蛋白V和PI抗体染色10分钟，并立即通过流式细胞术进行评估。

根据制造商的方案，使用

TdT in situ-Fluorescein tunnel assay(R&Dsystems，MN，US)在石蜡包埋的肺组织中评估凋亡。简单地说，使用Cytonin将脱蜡肺切片透化1小时，并用Mangenese阳离子、TdT dNTP Mix和TdT酶的组合进行标记，然后用Strep-Fluor溶液孵育20分钟。如上所述进行荧光成像和定量。

根据制造商的说明进行胱天蛋白酶3/7测定(G8090，Promega)。简单地说，将2x10⁴个A549肺泡上皮细胞在96孔板中铺板过夜。用0.1μg/孔的硫酸博来霉素或单独的培养基处理细胞24小时(每组8孔)。随后用1μl/孔的MEx(相当于由约2x 10⁴个MSC产生的EV)处理经博来霉素处理的细胞24小时。仅培养基处理的经博来霉素处理的细胞用作对照。所有实验在无血清培养基中进行。在第3天，用PBS洗涤细胞，并向每个孔添加50μl新鲜培养基。为了测量胱天蛋白酶3/7活性，在室温下将50μL胱天蛋白酶Glo3/7试剂添加到每个孔2小时，然后将板放置在板振荡器上。使用VICTOR Multilabel读板器测量发光。从每个读数中减去背景发光(在无细胞孔中测量的)。

MEx处理的骨髓来源单核细胞的过继转移

通过冲洗股骨和胫骨并将细胞在补充有10％FBS、含有30％v/v L929条件培养基的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)中培养3天来分离BMDMo(作为巨噬细胞集落刺激因子的来源；M-CSF)。在第1天和第2天用从1x10⁶个MSC产生的MEx或者仅培养基处理每个板。在第3天收获细胞，并且在用PBS洗涤两次之后，根据制造商的方案(Life technologies)用Dil进行染色。然后在气管内滴注博来霉素之后的第0天和第3天通过尾静脉注射以1∶1的比例施用BMDMo(将从一只小鼠分离的BMDMo注射到实验小鼠中)。

MEx处理的鼠来源肺泡巨噬细胞的过继转移

通过i.p.戊巴比妥注射对6至8周的FVB小鼠实施安乐死。将气管的前壁用21号针插管并用线绳(String)固定。使用1ml注射器用0.6ml无菌HBSS(补充有0.5mM EDTA和1mMHEPES)的5次冲洗收集支气管肺泡灌洗液(BALF)。将BALF以400xg离心5分钟，并吸出上清液。将鼠AM重悬于补充有1％青霉素/链霉素和10％FBS的新鲜RPMI培养基中，并以每板1x10⁶的接种密度接种在35mm的板中。每个板用从1x10⁶个细胞产生的MEx处理过夜。24小时之后收获细胞，用PBS洗涤两次，用Dil染色并重悬于50μl PBS中。在滴注博来霉素之后的第0天和第3天，以一比一的比例气管内施用AM(将从一只小鼠分离的AM施用到实验小鼠)。

离体EV标记和骨髓细胞离心涂片

从骨髓MSC的浓缩条件培养基中以100,000g将EV沉淀70分钟。使用微型BCA蛋白测定试剂盒(Thermo Fisher Scientific，Inc.，Waltham，MA)测定EV蛋白浓度。根据制造商的方案，通过ExoGlow-Membrane^TM EV标记试剂盒(System biosciences，CA，USA)对EV进行标记。简单地说，将50-100μg的EV添加到反应缓冲液和标记染料的混合物，并在室温下孵育30分钟。在100,000g下第二次超速离心70分钟之后，除去了游离的未标记的染料。将相当于1x10⁶个MSC产生的EV在200μl PBS中稀释，并使用尾静脉注射法注射到C57BL/6小鼠中。将200μl染色的无EV SN或稀释的游离染料用作对照。

在注射后2、4、8和24小时处死小鼠。用PBS冲洗股骨，并使用Shandon Cytospin 4(Thermo Fisher Scientific，Inc.，Waltham，MA)以300g将细胞悬浮液细胞离心5分钟。将载玻片风干，用4％多聚甲醛固定并用Dapi复染。使用Nikon Eclipse 80i显微镜(Nikon，Tokyo，Japan)获得图像。

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本文中(例如，在背景技术、发明内容、具体实施方式、实施例和/或参考文献部分中)提及的所有出版物、专利、专利申请、公布和数据库条目(例如，序列数据库条目)均通过引用在此整体并入如同每个单独的出版物、专利、专利申请、公布和数据库条目都是通过引用特别地和单独地并入本文。在冲突的情况下，以本申请(包括本文中的任何定义)为准。

等同方案和范围

本领域技术人员将认识到或仅使用常规实验能够确定本文中所述的一些实施方案的许多等同方案。本公开内容的范围不旨在限于以上描述，而是如所附权利要求书中所阐述的那样。

没有数量词修饰的名词可意指一个/种或多于一个/种，除非相反地指出或者以其他方式从上下文中显而易见。除非相反地指出或在其他情况下从上下文中明显看出，否则如果存在一个、多于一个或全部组成员，则在组的两个或更多个成员之间包含“或/或者”的权利要求或描述应被认为符合要求。在两个或更多个组成员之间包括“或/或者”的组的公开内容提供了其中存在恰好一个组成员的实施方案，其中存在多于一个组成员的实施方案以及其中存在全部组成员的实施方案。为了简洁起见，在本文中这些实施方案没有被单独地详细说明，但是应理解的是，这些实施方案中的每一个都在本文中提供并且可被具体地要求保护或放弃保护。

应当理解的是，本公开内容涵盖其中将来自一个或更多个权利要求或者来自说明书的一个或更多个相关部分的一个或更多个限制、要素、条款或描述性术语引入到另一个权利要求的所有改变、组合和排列。例如，引用另一权利要求的权利要求可以被修改为包含在引用相同基础权利要求的任何其他权利要求中找到的一个或更多个限制。此外，在权利要求中记载组合物的情况下，应理解的是，除非另有说明或者除非对于本领域普通技术人员明显的是将出现矛盾或不一致，否则包括根据本文公开的任何制备或使用方法或者根据本领域已知方法制备或使用组合物的方法(如果有的话)。

在要素以列表(例如，以马库什组格式)表示的情况下，应理解的是，还公开了要素的每个可能的亚组，并且任何要素或要素的亚组都可以从该组中移除。还应注意的是，术语“包含/括”意在为开放性的，并且允许包含另外的要素或步骤。应当理解的是，一般来说，在实施方案、产品或方法被称为包含特定要素、特征或步骤的情况下，还提供了由这样的要素、特征或步骤组成或基本上由其组成的一些实施方案、产品或方法。为了简洁起见，在本文中这些实施方案没有被单独地详细说明，但是应理解的是，这些实施方案中的每一个都在本文中提供并且可被具体地要求保护或放弃保护。

在给出范围的情况下，包括端点。此外，应理解的是，除非另有说明或根据上下文和/或本领域普通技术人员的理解另外明显的，否则表示为范围的值在一些实施方案中可以采用所述范围内的任何特定值至该范围下限的单位的十分之一，除非上下文另有明确规定。为了简洁起见，每个范围内的值没有在本文中被单独地详细说明，但是应理解的是，这些值中的每一个都在本文中提供并且可被具体地要求保护或放弃保护。还应理解的是，除非另有说明或根据上下文和/或本领域普通技术人员的理解另外明显的，否则表示为范围的值可假定给定范围内的任何子范围，其中该子范围的端点为以与该范围下限的单位的十分之一相同的精确度表示。

在提供网站的地方，URL地址提供为非浏览器可执行的代码，括号中带有相应网址的句点。实际的网址不包含括号。

另外，应当理解的是，本公开内容的任何特定实施方案可以明确地从任何一个或更多个权利要求中排除。在给出范围的情况下，该范围内的任何值可以明确地从任何一个或更多个权利要求中排除。本公开内容的组合物和/或方法的任何实施方案、要素、特征、应用或方面可以从任何一个或更多个权利要求中排除。为了简洁起见，本文中未明确阐述其中排除了一个或更多个要素、特征、目的或方面的所有实施方案。

Claims (56)

1.调节单核细胞表型的方法，所述方法包括使单核细胞与分离的间充质干细胞(MSC)外排体接触。

2.权利要求1所述的方法，其中所述单核细胞来自骨髓。

3.权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述分离的MSC外排体分离自MSC条件培养基。

4.权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述MSC来自沃顿胶、骨髓或脂肪组织。

5.权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述分离的MSC外排体基本不含蛋白质污染物。

6.权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述分离的MSC外排体的直径为约50nm至150nm。

7.权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述接触是体外的。

8.权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述接触是离体的。

9.权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述接触是体内的。

10.权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述接触持续至少2小时。

11.权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述单核细胞在与所述分离的MSC外排体接触之前是促炎性的，并且在与所述分离的MSC外排体接触之后是调节性的。

12.治疗纤维化疾病的方法，所述方法包括向有此需要的对象施用有效量的单核细胞，其中所述单核细胞在施用之前用分离的间充质干细胞(MSC)外排体处理。

13.治疗自身免疫病的方法，所述方法包括向有此需要的对象施用有效量的单核细胞，其中所述单核细胞在施用之前用分离的间充质干细胞(MSC)外排体处理。

14.权利要求12或权利要求13所述的方法，其还包括在用所述MSC外排体处理所述单核细胞之前分离所述单核细胞。

15.权利要求14所述的方法，其中所述单核细胞分离自所述对象。

16.权利要求15所述的方法，其中所述单核细胞分离自所述对象的骨髓。

17.权利要求12至16中任一项所述的方法，其中在施用于所述对象之前用所述MSC外排体处理所述单核细胞至少2小时。

18.权利要求12至17中任一项所述的方法，其中所述单核细胞全身施用。

19.权利要求18所述的方法，其中所述单核细胞通过静脉内输注施用。

20.权利要求12至18中任一项所述的方法，其中所述单核细胞通过气管内或鼻内施用。

21.权利要求12至20中任一项所述的方法，其中将所述单核细胞施用于所述对象一次。

22.权利要求12至21中任一项所述的方法，其中将所述单核细胞施用于所述对象多次。

23.权利要求12至22中任一项所述的方法，其中所述方法还包括向所述对象施用有效量的第二药剂。

24.权利要求23所述的方法，其中所述第二药剂是分离的MCS外排体。

25.权利要求23所述的方法，其中所述第二药剂是尼达尼布、吡非尼酮、抗纤维化剂、免疫抑制剂和/或抗炎剂。

26.权利要求12和14至25中任一项所述的方法，其中所述纤维化疾病选自：全身性硬化；肝纤维化、心脏纤维化、肾纤维化和骨髓纤维化。

27.权利要求26所述的方法，其中所述纤维化疾病是肺纤维化。

28.权利要求27所述的方法，其中所述肺纤维化是特发性肺纤维化(IPF)。

29.权利要求12和12至28中任一项所述的方法，其中所述单核细胞降低与所述纤维化疾病相关的炎症。

30.权利要求12和12至29中任一项所述的方法，其中所述单核细胞降低与所述纤维化疾病相关的凋亡。

31.权利要求12至30中任一项所述的方法，其中所述对象是哺乳动物。

32.权利要求31所述的方法，其中所述对象是人对象。

33.权利要求32所述的方法，其中所述人是新生儿、婴儿或成人。

34.权利要求32所述的方法，其中所述人对象小于四周龄。

35.权利要求32所述的方法，其中所述人对象为四周至3岁。

36.权利要求32所述的方法，其中所述人对象为3至18岁。

37.权利要求32所述的方法，其中所述人对象是成人。

38.权利要求32至37中任一项所述的方法，其中所述人对象是早产的。

39.权利要求38所述的方法，其中所述人对象在妊娠37周之前出生。

40.权利要求38所述的方法，其中所述人对象在妊娠26周之前出生。

41.权利要求31所述的方法，其中所述对象是啮齿动物。

42.权利要求41所述的方法，其中所述啮齿动物是小鼠或大鼠。

43.权利要求12至42中任一项所述的方法，其中所述单核细胞在用所述分离的MSC外排体处理之前是促炎性的，并且在用所述分离的MSC外排体处理之后是调节性的。

44.用分离的间充质干细胞(MSC)外排体处理的单核细胞。

45.权利要求44所述的单核细胞，其中所述单核细胞来自骨髓。

46.权利要求44或45所述的单核细胞，其中所述分离的MSC外排体分离自MSC条件培养基。

47.权利要求44至46中任一项所述的单核细胞，其中所述MSC来自沃顿胶或骨髓或脂肪组织。

48.权利要求44至47中任一项所述的单核细胞，其中所述单核细胞在用所述分离的MSC外排体处理之前是促炎性的，并且在用所述分离的MSC外排体处理之后是调节性的。

49.组合物，其包含权利要求42至48中任一项所述的单核细胞。

50.权利要求49所述的组合物，其还包含第二药剂。

51.权利要求49或50所述的组合物，其中所述组合物是药物组合物。

52.权利要求49至51中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含药学上可接受的载体。

53.权利要求44至48中任一项所述的单核细胞或权利要求49至52中任一项所述的组合物用于治疗纤维化疾病的用途。

54.权利要求44至48中任一项所述的单核细胞或权利要求49至52中任一项所述的组合物，其用于制造用于治疗纤维化疾病的药物。

55.权利要求44至48中任一项所述的单核细胞或权利要求49至52中任一项所述的组合物用于治疗自身免疫病的用途。

56.权利要求44至48中任一项所述的单核细胞或权利要求49至52中任一项所述的组合物，其用于制造用于治疗自身免疫病的药物。

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