CN112458014A - 一种以木薯渣为碳源制备耐酸和耐低温硫酸还原复合菌剂的方法及该菌剂的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种以木薯渣为碳源制备耐酸和耐低温的硫酸还原复合菌剂的方法及其应用，以酸性矿山废水底泥或酸性矿山废水污染土壤为菌群来源，在pH3~5的酸性矿山废水中添加木薯渣和少量其他碳源作为驯化培养基，分别在2种不同温度下（10℃和25℃）下静置富集培养，同时获得2种硫酸还原菌菌群；将这2种硫酸还原菌菌群经液体发酵培养后，添加还原剂和吸附剂，真空干燥制成菌粉，按比例混合制成固体复合菌剂保存。该酸性硫酸还原复合菌剂具有低温、低pH环境下保持高活性的特性，且同时适应木薯渣型缓释碳源和其他类型碳源，施用于处理酸性矿山废水的硫酸还原菌反应器，可有效缩短驯化时间，提高低温环境运行时的运行效率和稳定性。

Description

一种以木薯渣为碳源制备耐酸和耐低温硫酸还原复合菌剂的 方法及该菌剂的应用
技术领域
本发明属于微生物的应用领域，具体涉及一种以木薯渣为碳源制备耐酸和耐低温的硫酸还原复合菌剂的方法及其应用。
背景技术
矿山环境与矿业生产及生态环境密切相关，矿山开采等一系列矿业活动对矿山环境及其周围生态系统带来了巨大的环境影响，矿山环境也成为了重要的生态环境污染源，严重影响矿区及周边动植物生长和居民的生命健康。
矿山开采过程中形成的尾矿、酸性矿山废水 (acid mine drainage，AMD)、AMD 底泥 (sediment) 和 AMD 生物膜 (biofilm) 等构成了多种多样的矿山酸性环境。矿产开发会产生尾矿、废石和冶炼废渣等主要固体废弃物，这些固体废弃物尤其是尾矿堆、废石堆或硫化物矿石（以黄铁矿 FeS2为主）通常含有大量的金属硫化物，而这些金属硫化物随着开采活动的进行被暴露在空气中，就会立即在氧气-水-微生物相互作用下发生氧化反应生成大量的酸性矿山废水，酸性矿山废水中富含重金属和硫酸根，pH2～5，亟需处理。
目前国内外AMD的治理方法主要有中和法、硫化法、湿地法、渗透反应墙、微生物处理法等。
1. 中和法：中和法是向 AMD 中投入中和剂或碱性废水形成难溶的固体，从而提高 pH 和去除重金属。常用的中和剂有石灰、石灰石等，虽然目前中和方法得到不断改进，处理效果明显，是我们国家处理AMD的主流工艺。但是中和法产生了大量的固体废弃物难以处理，且产生的沉淀不稳定容易导致二次污染，有较大的环境隐患，此外，该方法需要大量石灰，石灰开采中进一步产生粉尘等环境危害，因此该方法已不适应日益严格的环保需求，亟需升级改造。
2. 硫化法：硫化法是指向 AMD 中加入硫化剂，使 AMD 中的金属离子形成硫化物沉淀而被除去。通常使用的硫化剂有硫化钠、硫化铵等，该方法金属去除率高，泥渣中金属品位高，但沉淀剂价格昂贵且产生的硫化氢有恶臭，管理不当会对人体和环境有害。
3. 人工湿地法：人工湿地法是利用由人工基质和重金属耐性水生植物（如香蒲、芦苇等）组成的生态系统处理AMD。虽然人工湿地法具有建设和运行费用低，易于管理等优点，但占地面地大，对 AMD 的处理效果不佳且周期长。
4. 微生物处理法：微生物处理法是利用硫酸盐还原菌（Sulfate-ReducingBacteria, SRB）在厌氧条件下还原过程产生的 S2- 与重金属结合形成金属硫化物（MS）沉淀，去除 AMD 中的重金属离子，同时生成的碱度可以提高废水 pH 值。该方法具有节约中和剂、无二次污染、可回收金属的特点，有很大应用前景(Johnson, 2013)。但各种生物因子、非生物因子（pH、溶解氧、温度、有机物、硫化物、重金属等）的改变都直接影响SRB的生长和代谢活性。由于缺乏合适SRB菌剂和合理工艺，现有SRB反应器尚存在启动慢、低温环境反应效率低、添加碳源费用昂贵等问题，严重限制了SRB反应器的实际应用。SRB反应器的运行问题，主要是SRB反应器中SRB菌群单一对低温和廉价缓释碳源降解慢导致。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：提供一种以木薯渣为碳源制备耐酸和耐低温的硫酸还原复合菌剂的方法及其应用，该方法利用廉价缓释固体碳源-木薯渣，制备得到适应低温环境耐酸的硫酸还原复合菌剂，该复合菌剂在SRB反应器中使用可以克服现有SRB反应器存在的启动慢、低温环境反应效率低、添加碳源费用昂贵等缺点。
解决上述技术问题的技术方案是：1、一种以木薯渣为碳源制备耐酸和耐低温的硫酸还原复合菌剂的方法，包括以下步骤：
（1）采集酸性重金属废水污染严重的矿区土壤或底泥，按1～25g/L比例接种到液体富集培养基中进行厌氧培养；所述液体富集培养基配方为：含10%～25%木薯渣和1%～3%葡萄糖的pH3～5的酸性矿山废水；
（2）接种后取两份培养基分别置于10℃和25℃恒温培养箱中避光静置培养，至培养液由澄清变为墨汁色，醋酸铅试纸检测有明显硫酸还原反应发生，表明培养基中有足量硫酸还原菌菌群，富集完成；
（3）将富集培养好的两种菌液按5～15%接种量分别接种到厌氧发酵罐中静止培养，培养温度与步骤（2）的富集培养温度相同，1～3次/天缓慢搅动混匀培养基10min，发酵培养基同富集培养基，至发酵液由澄清变为墨汁色，醋酸铅试纸检测培养基中有足量硫酸还原菌菌群，结束发酵；得到低温液体菌剂和常温液体菌剂。
进一步的，还包括有步骤（4），在步骤（3）发酵后得到的2种菌群中分别添加还原剂和吸附剂，对2种菌液分别离心，对离心所得固体进行真空干燥，获得菌粉，将2种菌粉按1～8∶1～8的比例混合成固体复合菌剂，装袋抽真空保存。
进一步的，所述还原剂包括葡萄糖、果糖、乳糖和麦芽糖中的至少一种，还原剂投加量为总菌剂质量的5%-30%。
进一步的，所述吸附剂包括硅藻土、高岭土、壳聚糖和活性炭中的至少一种，吸附剂投加量为总菌剂质量的5%-30%。
进一步的，步骤（3）中，厌氧发酵罐中的罐压为0.03～0.07 MPa。
本发明的另一技术方案是：上述方法制备得到的耐酸和耐低温的硫酸还原复合菌剂的应用，其特征在于：在处理酸性矿山废水的硫酸还原反应器中使用，具体步骤为：在处理酸性矿山废水的硫酸还原反应器的启动过程中，在反应器中充满pH3～5的酸性矿山废水，或是按5%～10%分别添加低温液体菌剂和常温液体菌剂或是按0.5～2%添加固体菌剂，并按5%～10%比例添加木薯渣，1%～2%添加糖蜜，1-2次/天反应器回流混匀2h，直至出水pH升高至6，开始连续进水，进水中按0.5%～3%比例添加木薯渣，0.2%～1%添加糖蜜。
当处理pH3～5酸性矿山废水的硫酸还原反应器在冬季10-15℃的低温运行时，每隔20d～50d或是按2%～10%分别添加低温液体菌剂和常温液体菌剂或是按0.1～1%添加固体菌剂。
本发明制备的复合菌剂主要有两种形式：一种是液体硫酸盐还原菌复合菌剂，另一种是包含硫酸还原菌群、还原剂及吸附剂的固体硫酸盐还原菌复合菌剂。
该复合菌剂主要包含能以木薯渣等缓释固体碳源为碳源的硫酸还原菌菌群。
该复合菌剂中硫酸还原菌菌群适应且能在低pH(3~5)和不同温度（10℃和20℃）下正常生长和维持活性。
由于采用上述技术方案，本发明具有以下有益效果：
1.本发明适用于处理AMD时使用的复合菌剂可以使用廉价固体缓释碳源木薯渣，且在低温和常温时均可保持较高活性。相对于单一菌株，由于菌株之间的相互协作关系，会对环境适应性更强。
2.本发明的酸性重金属污染修复复合菌剂的制备，在富集时通过设置不同温度梯度，可从环境中直接富集适应不同温度的硫酸还原菌菌群，富集出的菌群可以通过培养基变化和醋酸铅试纸简易快速检测其主要菌群种类和效果，不涉及单一纯菌株的分离、纯化、鉴定和保藏等工作，效果有保障，制备简单、成本低廉。
3.本发明的酸性重金属污染修复复合菌剂，除可制成液体菌剂外还可以制成固体菌剂，固体菌剂具有存贮运输方便且成本低的优点，在菌剂中添加还原剂和吸附剂保证在离心和干燥过程中菌体的还原环境，进而保证固体菌剂的活性和施用效果。
4.本发明的酸性重金属污染修复复合菌剂，使用方式灵活，可以在SRB反应器启动时、低温条件下和其他恶劣环境下使用，缩短启动时间，降低运行费用和提高运行稳定性。
下面，结合实施例对本发明之一种以木薯渣为碳源制备耐酸和耐低温的硫酸还原复合菌剂的方法及其应用的技术特征作进一步的说明。
具体实施方式
实施例1：一种以木薯渣为碳源制备耐酸和耐低温的硫酸还原复合菌剂的方法，包括以下步骤：
（1）采集酸性重金属废水污染严重的矿区土壤或底泥，按15g/L比例接种到液体富集培养基中进行厌氧培养；所述液体富集培养基配方为：含15%木薯渣和2%葡萄糖的pH4的酸性矿山废水，121℃高压灭菌20min；
（2）接种后取两份培养基分别置于10℃和25℃恒温培养箱中避光静置培养，至培养液由澄清变为墨汁色，醋酸铅试纸检测有明显硫酸还原反应发生，表明培养基中有足量硫酸还原菌菌群，富集完成；同时获得2种液体硫酸还原菌菌群：分别为耐低温硫酸盐还原菌菌群和常温硫酸盐还原菌菌群；
（3）将富集培养好的两种菌液按10%接种量分别接种到厌氧发酵罐中静止培养，罐压为0.03 MPa，培养温度与步骤（2）的富集培养温度相同，即步骤（2）在10℃培养获得的菌群，则厌氧发酵罐中的培养温度为10℃，步骤（2）在25℃培养获得的菌群，则厌氧发酵罐中的培养温度为25℃，2次/天缓慢搅动混匀培养基10min，发酵培养基同富集培养基，至发酵液由澄清变为墨汁色，醋酸铅试纸检测培养基中有足量硫酸还原菌菌群，结束发酵；
（4）在步骤（3）发酵后得到的2种菌群中分别添加还原剂和吸附剂，对2种菌液分别离心，对离心所得固体进行真空干燥，获得2种菌粉，将2种菌粉按1∶1的比例混合成固体复合菌剂，装袋抽真空保存。
本实施例中，所述还原剂是葡萄糖，还原剂投加量为总菌剂质量的10%。
本实施例中，所述吸附剂是硅藻土，吸附剂投加量为总菌剂质量的12%。
为验证低温菌剂组成，对菌剂进行高通量测序，发现其中含有Desulfovibrionales、Desulfovibrio和Desulfovibrionaceae等多种硫酸还原菌和Betaproteobacteria和Cytophagales等碳源降解菌。
实施例2：实施例1所述制备方法得到的耐酸和耐低温的硫酸还原复合菌剂的应用，该复合菌剂能够在处理酸性矿山废水的硫酸还原反应器中使用，具体步骤为：在处理酸性矿山废水的硫酸还原反应器的启动过程中，在反应器中充满pH3～5的酸性矿山废水，或是按5%%分别添加低温液体菌剂和常温液体菌剂或是按0.5%添加固体菌剂，并按8%比例添加木薯渣，1%添加糖蜜，2次/天反应器回流混匀2h，直至出水pH显著升高达到6，开始连续进水，进水中按0.5%比例添加木薯渣，0.2%添加糖蜜。
本发明制备的酸性硫酸还原菌复合菌剂具有低温、低pH环境下保持高活性的特性，且同时适应木薯渣型缓释碳源和其他类型碳源，施用于处理酸性矿山废水的硫酸还原菌反应器，可有效缩短驯化时间，并有效提高低温环境运行时的运行效率和稳定性。
对比试验：
试验1：大宝山矿山酸性废水处理使用。
在并联运行的两个1t/d反应器中，实际处理大宝山酸性矿山废水，在冬季10℃低温环境下，一个按1%比例每隔20d添加一次本发明实施例1制备的固体复合菌剂，一个不添加，添加菌剂的反应器出水（pH5.5-6）pH显著高于未添加菌剂反应器出水（pH4.5-5）。
试验2：实验室SRB小试反应器运行启动。
（1）并行运行两个1L左右SRB小试反应器，处理实际酸性矿山废水。
（2）运行启动时，其中一个反应器中仅加1%酸性矿山废水底泥，另外一个反应器中除添加1%酸性矿山废水底泥外，添加0.5%常温液体菌剂，添加菌剂的反应器，提前1周完成驯化（出水pH>6.5）。

Claims (8)

1.一种以木薯渣为碳源制备耐酸和耐低温的硫酸还原复合菌剂的方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）采集酸性重金属废水污染严重的矿区土壤或底泥，按1～25g/L比例接种到液体富集培养基中进行厌氧培养；所述液体富集培养基配方为：含10%～25%木薯渣和1%～3%葡萄糖的pH3～5的酸性矿山废水；
（2）接种后取两份培养基分别置于10℃和25℃恒温培养箱中避光静置培养，至培养液由澄清变为墨汁色，醋酸铅试纸检测有明显硫酸还原反应发生，表明培养基中有足量硫酸还原菌菌群，富集完成；
（3）将富集培养好的两种菌液按5～15%接种量分别接种到厌氧发酵罐中静止培养，培养温度与步骤（2）的富集培养温度相同，1～3次/天缓慢搅动混匀培养基10min，发酵培养基同富集培养基，至发酵液由澄清变为墨汁色，醋酸铅试纸检测培养基中有足量硫酸还原菌菌群，结束发酵；得到低温液体菌剂和常温液体菌剂。
2.根据权利要求1所述的一种以木薯渣为碳源制备耐酸和耐低温的硫酸还原复合菌剂的方法，其特征在于：还包括有步骤（4），在步骤（3）发酵后得到的2种菌群中分别添加还原剂和吸附剂，对2种菌液分别离心，对离心所得固体进行真空干燥，获得菌粉，将2种菌粉按1～8∶1～8的比例混合成固体复合菌剂，装袋抽真空保存。
3.根据权利要求2所述的一种以木薯渣为碳源制备耐酸和耐低温的硫酸还原复合菌剂的方法，其特征在于：所述还原剂包括葡萄糖、果糖、乳糖和麦芽糖中的至少一种，还原剂投加量为总菌剂质量的5%-30%。
4.根据权利要求2所述的一种以木薯渣为碳源制备耐酸和耐低温的硫酸还原复合菌剂的方法，其特征在于：所述吸附剂包括硅藻土、高岭土、壳聚糖和活性炭中的至少一种，吸附剂投加量为总菌剂质量的5%-30%。
5.根据权利要求1-4任一项所述的一种以木薯渣为碳源制备耐酸和耐低温的硫酸还原复合菌剂的方法，其特征在于：步骤（3）中，厌氧发酵罐中的罐压为0.03～0.07 MPa。
6.权利要求1-5任一项所述方法制备得到的耐酸和耐低温的硫酸还原复合菌剂的应用，其特征在于：在处理酸性矿山废水的硫酸还原反应器中使用。
7.根据权利要求6所述的一种耐酸和耐低温的硫酸还原复合菌剂的应用，其特征在于：该复合菌剂在处理酸性矿山废水的硫酸还原反应器中使用的具体步骤为：在处理酸性矿山废水的硫酸还原反应器的启动过程中，在反应器中充满pH3～5的酸性矿山废水，或是按5%～10%分别添加低温液体菌剂和常温液体菌剂或是按0.5～2%添加固体菌剂，并按5%～10%比例添加木薯渣，1%～2%添加糖蜜，1-2次/天反应器回流混匀2h，直至出水pH升高至6，开始连续进水，进水中按0.5%～3%比例添加木薯渣，0.2%～1%添加糖蜜。
8.根据权利要求7所述的一种耐酸和耐低温的硫酸还原复合菌剂的应用，其特征在于：当处理pH3～5酸性矿山废水的硫酸还原反应器在冬季10-15℃的低温运行时，每隔20d～50d或是按2%～10%分别添加低温液体菌剂和常温液体菌剂或是按0.1～1%添加固体菌剂。
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