CN112437670A - 含有重组蛋白酶抑制剂的组合物及其生产方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本文提供了用于口服施用治疗性蛋白和肽的组合物，该组合物含有分离的重组表达的Bowman‑Birk抑制剂(BBI)，并且该组合物提供了治疗性蛋白和肽的改进的持续活性。还提供了使用组合物的方法。

Description

含有重组蛋白酶抑制剂的组合物及其生产方法和用途
技术领域
本文提供了用于施用治疗性蛋白的口服组合物，其含有提供改进的持续活性的重组蛋白酶抑制剂。
背景技术
基于蛋白/肽的药物通常易于在胃肠道中降解和/或无法高效地以生物活性形式从小肠吸收到血流中。已经开发了基于蛋白的药物如胰岛素、艾塞那肽(exenatide)、其他激素等的口服递送制剂。
源自大豆(Glycine max)的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶抑制剂容易获得，且认为可安全用于人类食用。这种抑制剂的一个实例称为SBTI(大豆胰蛋白酶抑制剂)，其由抑制胰蛋白酶的KTI(Kunitz胰蛋白酶抑制剂)和抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的BBI(Bowman-Birk抑制剂)组成。SBTI已知有许多商业来源，并且用于分离活性成分的改进方法已描述于例如PCT国际申请公开号WO/2013/114369中，其全部通过引用以其全文并入本文。
在提供用于口服递送基于肽的治疗剂，特别是用于靶向代谢疾病的治疗剂的平台技术方面，已经取得了巨大的进步和成功，因此似乎很难想象能够对其进行改进以超越当前的技术水平。
发明概述
令人惊讶的是，现已证明，包含基于肽/蛋白的治疗剂、增强剂/稳定剂、omega-3脂肪酸和已证明在口服制剂中提供可持续功效的蛋白酶抑制剂的稳定口服组合物在所述蛋白酶抑制剂源自重组来源时可以得到改进。
经化学提取而分别获得纯化KTI和纯化BBI的单独制备物的SBTI，其具有已知量的BBI和KTI，当包含在口服制剂中时具有已知的纯度和活性，且已用于制备有效治疗已知疾病的含有蛋白治疗剂的口服制剂。例如，在PCT国际申请公开号WO/2013/114369(其通过引用以其全文并入本文)中，开发出了改进的SBTI纯化方法，在该方法中，每种产品根据自身的高活性水平的规格而制备，高分子量(MW)-污染物的水平最小化，并且获得了高纯度的工业产率的制备物。
令人惊讶的是，现已发现，当蛋白酶抑制剂制备自/源自重组异源生产手段时，即便化学纯化蛋白酶和重组表达蛋白酶间具有共同的下游纯化步骤，所得治疗性蛋白/肽在使用重组来源作为初始蛋白酶生产来源时的活性更大且持续更长时间。
本发明提供了一种口服药物组合物，其包含高达100千道尔顿的治疗性肽或治疗性蛋白、二价阳离子螯合剂和分离的重组表达的BBI。
在一些实施方案中，重组表达的BBI具有与SEQ ID NO:1中所示核苷酸序列有至少95％同一性的核苷酸序列，或在一些实施方案中，重组表达的BBI具有与SEQ ID NO:1中所示核苷酸序列有至少97％同一性的核苷酸序列，或在一些实施方案中，重组表达的BBI具有与SEQ ID NO:1中所示核苷酸序列有至少99％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，重组表达的BBI具有SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列。
在一些实施方案中，重组表达的BBI在酵母表达系统中表达，该酵母表达系统在一些实施方案中是巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统。
在一些实施方案中，重组表达的BBI在异源表达系统中表达，其中根据用作这种异源表达系统的生物体中的密码子使用，对编码该BBI的核苷酸序列进行优化。
在一些实施方案中，制剂进一步包含除所述BBI之外的胰蛋白酶抑制剂，在一些实施方案中其是KTI3，在一些实施方案中其被化学纯化，在一些实施方案中其是重组表达的。
在一些实施方案中，治疗性蛋白可用于治疗患有代谢疾病或病症的受试者。在一些实施方案中，治疗性肽或治疗性蛋白选自由以下组成的组：胰岛素、流感血凝素、流感神经氨酸酶、胰高血糖素、干扰素γ、干扰素β、干扰素α、生长激素、促红细胞生成素、GLP-1、GLP-1类似物、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、肾素、生长激素释放因子、甲状旁腺激素、促甲状腺激素、促卵泡激素、降钙素、黄体生成素、胰高血糖素、凝血因子、抗凝因子、心钠素(atrial natriuretic factor)、表面活性蛋白A(SP-A)、表面活性蛋白B(SP-B)、表面活性蛋白C(SP-C)、表面活性蛋白D(SP-D)、纤溶酶原激活剂、铃蟾肽(bombesin)、造血生长因子(集落刺激因子，多种)、肿瘤坏死因子(TNF)蛋白、脑啡肽酶、RANTES(调节激活正常T细胞表达和分泌细胞因子)、人巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1-α)、血清白蛋白、苗勒抑制物质(Mullerian-inhibiting substance)、松弛素、小鼠促性腺素释放激素、DNase、抑制素、激活素、血管内皮生长因子(VEGF)、神经营养因子、神经营养蛋白-3、-4、-5或-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)、神经生长因子、血小板衍生生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子、转化生长因子(TGF)、胰岛素样生长因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)、des(1-3)-IGF-1(脑IGF-1)、胰岛素样生长因子结合蛋白1(IGFBP-1)、IGFBP-2、IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-5、IGFBP-6、角质形成细胞生长因子、骨诱导因子、骨形态发生蛋白(BMP)-2、BMP-7、集落刺激因子(CSF)、白细胞介素(IL)、超氧化物歧化酶、衰变加速因子(decay accelerating factor)、趋化因子家族成员和补体因子。在一些实施方案中，治疗性肽或治疗性蛋白选自由胰岛素和GLP-1类似物组成的组。在一些实施方案中，治疗性肽或治疗性蛋白选自由以下组成的组：胰岛素和GLP-1类似物、瘦素(Leptin)、包括BMP-4的骨形态发生蛋白和包括NGF-1的神经生长因子。
在一些实施方案中，治疗性肽或治疗性蛋白是免疫调节的，并且在一些实施方案中，治疗性肽或治疗性蛋白是醋酸格拉替雷(Glatiramer acetate)。在一些实施方案中，提供治疗性肽或治疗性蛋白以提高对与自身免疫疾病有关的变应原或抗原的自身耐受。
在一些实施方案中，治疗性肽或治疗性蛋白可用于治疗、减轻、消除代谢疾病或病症，减少其发病率或严重性。
在一些实施方案中，本发明提供了如本文所述的口服药物组合物，用作用于向受试者口服施用治疗性肽或治疗性蛋白的药物。
在一些方面，本发明的口服药物组合物防止受试者中治疗性肽或治疗性蛋白的快速降解，或在一些实施方案中，提高受试者中口服施用的治疗性肽或治疗性蛋白的持续活性，或在一些实施方案中，提高受试者中口服施用的治疗性肽或治疗性蛋白的持续生物利用度。根据这个方面并且在一些实施方案中，口服施用的治疗性肽或治疗性蛋白的持续活性或持续生物利用度超过了使用包含化学纯化的BBI而不是所述分离的重组表达的BBI而其他方面相同的口服制剂后获得的持续活性或生物利用度。
在一些实施方案中，本发明提供了如本文所述的口服药物组合物用于向受试者口服施用治疗性蛋白的用途。在一些实施方案中，口服药物组合物防止所述受试者中所述治疗性肽或治疗性蛋白的快速降解。在一些实施方案中，口服药物组合物提高所述受试者中口服施用的治疗性肽或治疗性蛋白的持续活性。在一些实施方案中，口服药物组合物提高所述受试者中口服施用的治疗性肽或治疗性蛋白的持续生物利用度。在一些实施方案中，该用途提供了治疗有效量的所述肽或蛋白，且其中在所述制剂中提供的所述BBI、或高达100千道尔顿的所述治疗性肽或治疗性蛋白、或其组合的浓度低于包含化学纯化的BBI而不是所述分离的重组表达的BBI而其他方面相同的口服制剂中的治疗有效浓度，并且所述用途在所述受试者中达到相当的治疗效果。
在一些实施方案中，本发明提供了一种用于向受试者口服施用治疗性肽或治疗性蛋白的方法，该方法包括向受试者施用如本文所述的口服药物组合物的步骤，由此口服施用治疗性蛋白。
在一些实施方案中，本发明提供了一种用于防止受试者中口服施用的治疗性肽或治疗性蛋白降解的方法，所述方法包括向受试者施用如本文所述的口服药物组合物的步骤。
在一些实施方案中，本发明提供了一种提高受试者中口服施用的治疗性肽或治疗性蛋白的持续活性的方法，所述方法包括向受试者施用如本文所述的口服药物组合物的步骤。
在一些实施方案中，本发明提供了一种提高受试者中口服施用的治疗性肽或治疗性蛋白的持续生物利用度的方法，所述方法包括向受试者施用如本文所述的药物组合物的步骤。
在一些实施方案中，本发明提供了一种向受试者提供口服制剂中治疗有效量的肽或蛋白的方法，所述方法包括制备口服药物组合物，该口服药物组合物包含高达100千道尔顿的治疗性肽或治疗性蛋白、二价阳离子螯合剂和分离的重组表达的Bowman-Birk抑制剂(BBI)，其中所述制剂中提供的所述BBI或高达100千道尔顿的所述治疗性肽或治疗性蛋白或其组合的浓度，低于包含化学纯化的BBI而不是所述分离的重组表达的BBI而其他方面相同的口服制剂中的治疗有效的浓度，并且在所述受试者中达到相当的治疗效果。
附图简要说明
以下附图是说明性示例，并不意在将其视为限制要求保护的发明。
图1.纯化的rBBI的色谱图。显示了RPHPLC分析的结果连同其与可用标准的叠加图。
图2.通过BCA估算蛋白。称重冻干粉末样品并将其溶解在相应的缓冲液(SOP No:QC-006)中，使其最终浓度为1mg/ml以进行定量。使用BCA得到的蛋白结果为94％。
图3.rBBI的SDS-PAGE分析。实施电泳，扫描凝胶，并使用Syngene凝胶记录系统结合Genesys(用于捕获图像以进行光密度定量研究的基因工具的软件)对条带进行定量。将每毫升1毫克(mg./ml.)的样品上样到20％PhastgelTM上。泳道1：蛋白标记；泳道2：空；泳道3：还原条件下的rBBI 2μg；泳道4：还原条件下的rBBI 5μg；泳道5：还原条件下的rBBI 10μg；泳道6：空；泳道7：非还原条件下的rBBI 2μg；泳道4：非还原条件下的rBBI 5μg；泳道5：非还原条件下的rBBI 10μg。
图4.胰凝乳蛋白酶抑制测定。结果表明了样品显示2.3mg胰凝乳蛋白酶被1mg抑制剂抑制。
图5.胰蛋白酶抑制测定。结果表明了样品显示1.7mg胰蛋白酶被1mg抑制剂抑制。
图6.在施用口服胰岛素制剂后随时间的平均血糖图谱。体内研究在用口服胰岛素制剂(8mg)处理的空腹的猪中进行，该口服胰岛素制剂由源自天然来源或使用重组表达技术改造的蛋白酶抑制剂(BBI)制备。使用内镜检查术将制剂插入十二指肠，最终胰岛素剂量为4mg。在整个5小时的监测期内抽取血液样品以测定葡萄糖浓度。每种制剂除8mg胰岛素和150mg EDTA外，如所示还包含如在WO 2013/114369中描述的SBTI，或100mg重组BBI(rBBI)、100mg rBBI和25mg KTI，或50mg rBBI和25mg KTI。与接受来自SBTI起始原料的化学纯化的BBI的动物相比，施用含有rBBI的组合物的每组都经历了循环葡萄糖水平的更为急剧的下降。
具体实施方式
本发明提供了含有一种或多种治疗性肽或治疗性蛋白的改进的口服组合物，其中重组蛋白酶抑制剂BBI也包含在其中，该口服组合物令人惊讶地优于含有经化学纯化的相同蛋白酶抑制剂的组合物，尽管他们具有类似的下游纯化步骤。令人惊讶的是，现已证明，包含基于肽/蛋白的治疗剂、增强剂/稳定剂、omega-3脂肪酸和已证明在口服制剂中提供可持续功效的蛋白酶抑制剂的稳定口服组合物在所述蛋白酶抑制剂源自重组来源时可以得到改进。
本发明提供了包含基于油的液体制剂的口服药物组合物，其中所述基于油的液体制剂包含高达100千道尔顿的治疗性肽或治疗性蛋白、二价阳离子螯合剂和分离的重组表达的BBI。
在一些实施方案中，重组表达的BBI具有与SEQ ID NO:1中所示核苷酸序列有至少95％同一性的核苷酸序列，或在一些实施方案中，重组表达的BBI具有与SEQ ID NO:1中所示核苷酸序列有至少97％同一性的核苷酸序列，或在一些实施方案中，重组表达的BBI具有与SEQ ID NO:1中所示核苷酸序列有至少99％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，重组表达的BBI
术语“蛋白”和“肽”在本文中互换使用。除明确显示限制外，任何一个术语均不旨对存在的氨基酸数量的限制。
在一些实施方案中，本文所述的口服制剂含有重组表达的BBI，并且在一些实施方案中，可进一步包含其他的蛋白酶抑制剂，例如化学纯化的蛋白酶抑制剂，例如分离自大豆粉或分离自传统的市售SBTI制备物的KTI3，如所述。
如在本文实施例4中举例说明的，包含亚临床4mg胰岛素剂量的口服制剂提供了对于快速循环葡萄糖水平而言优秀的血糖控制，当制剂中包含25mg rBBI时其效果持续至少3小时以上。这个效果比对照动物中测量的效果持续时间长75％。类似地，当施用8mg胰岛素时，含有rBBI的制剂优于含有化学提取的SBTI的制剂。
对于含有rBBI的制剂中存在的抗胰蛋白酶活性和抗胰凝乳蛋白酶活性的比率，活性的范围在1.6:1和1:1之间，包含端值。对于含有rBBI的制剂中存在的抗胰蛋白酶活性与抗胰凝乳蛋白酶活性的比率，还证明活性的范围在1.5:1和1:1之间，包含端值。
除非另有所指，否则本文所指的抗胰凝乳蛋白酶活性是使用活性为40BTEE单位/毫克胰凝乳蛋白酶的胰凝乳蛋白酶测量的，并以每毫克被测试蛋白抑制的胰凝乳蛋白酶毫克数来表示。BTEE指N-苯甲酰-L-酪氨酸乙酯(参见Sigma-Aldrich产品编号B6125的说明书)。
除非另有所指，否则本文所指的抗胰蛋白酶活性是使用活性为10,000BAEE单位/毫克胰蛋白酶的胰蛋白酶测量的，并以每毫克被测试蛋白抑制的胰蛋白酶毫克数来表示。BAEE指钠-苯甲酰-L-精氨酸乙酯溶液(参见Sigma-Aldrich产品编号B4500的说明书)。例如，在典型的测定中，一个单位对应于将胰蛋白酶活性降低一个苯甲酰-L-精氨酸乙酯单位(BAEE-U)的抑制剂的量。一个BAEE-U是在pH 7.6和25℃下使在253nm的吸光度每分钟增加0.001的酶的量。参见，例如，K.Ozawa,M.Laskowski,1966,J.Biol.Chem.241:3955；和Y.Birk,1976,Meth.Enzymol.45:700。
在一个其他方面，提供了分离自大豆粉的KTI3，其中在各种实施方案中，通过SDS-PAGE、亮蓝染色或成像仪(imager)定量，KTI3的纯度为至少85％。
在还另一个方面，提供了分离自大豆粉的KTI3，其中如通过BCA测定法测定的，KTI3的蛋白含量大于95％。
在还另一个方面，提供了分离自大豆粉的KTI3，其中例如通过SDS-PAGE和成像仪定量所评价的，KTI3含有少于0.1％的高分子量污染物。
本领域技术人员将理解，通常在使KTI3与药物组合物的一种或多种其他组分混合之前，评价每个组分上述关于其蛋白含量、污染物水平或效力的纯度要求。
在进一步的实施方案中，上述药物组合物包含抵抗胃中降解的包衣。在甚至更具体的实施方案中，包衣是pH敏感的胶囊，或者是软胶囊。
在其他实施方案中，上述药物组合物进一步包含高达100千道尔顿的治疗性蛋白作为活性成分。在其他实施方案中，活性成分是对人消化道中的降解或失活敏感的非蛋白分子。
在另一个实施方案中，提供了一种口服药物组合物，其包含基于油的液体制剂，其中该基于油的液体制剂包含高达100千道尔顿(kDa)的治疗性蛋白、二价阳离子螯合剂和如本文所述的重组BBI，以及任选的其他蛋白酶抑制剂。在其他实施方案中，液体制剂基本上由高达100kDa的治疗性蛋白、二价阳离子螯合剂、如本文所述的重组BBI和油组成。在其他实施方案中，液体制剂基本上由高达100kDa的治疗性蛋白、二价阳离子螯合剂、如本文所述的重组BBI、油和乳化剂组成。在其他实施方案中，液体制剂基本上由高达100kDa的治疗性蛋白、二价阳离子螯合剂、如本文所述的重组BBI、油和两种乳化剂组成。
在另一个方面，提供了一种口服药物组合物，其包含基于油的液体制剂，其中该基于油的液体制剂包含高达100kDa的治疗性蛋白和二价阳离子螯合剂，以及本文所述的重组BBI，使得所述液体制剂具有每ml液体制剂中至少50mg胰凝乳蛋白酶被抑制的抗胰凝乳蛋白酶活性。在其他实施方案中，液体制剂具有每ml液体制剂中至少35、40、45、55或60mg胰凝乳蛋白酶被抑制的抗胰凝乳蛋白酶活性。在其他实施方案中，液体制剂具有每ml液体制剂中范围为35-70、40-70、45-70、50-70或40-60mg的胰凝乳蛋白酶被抑制的抗胰凝乳蛋白酶活性。在其他实施方案中，液体制剂进一步包含每ml液体制剂中至少25mg胰蛋白酶被抑制的抗胰蛋白酶活性。在其他实施方案中，液体制剂进一步包含每ml液体制剂中至少30、35、40、45或50mg胰蛋白酶被抑制的抗胰蛋白酶活性。或者，液体制剂进一步包含每ml液体制剂中范围为25-50、30-50、35-50、25-40或25-45mg的胰蛋白酶被抑制的抗胰蛋白酶活性。
在另一个方面，提供了一种制备药物组合物的方法，该方法包括以下步骤：(a)提供如本文所述的重组BBI、高达100千道尔顿的治疗性蛋白和二价阳离子螯合剂的制备物；和(b)将所述本文所述的重组BBI、治疗性蛋白和螯合剂混合成基于油的液体制剂。此外，其他成分以及可以存在的额外成分的本文所述的每个实施方案可以并入到这个方法中。在其他实施方案中，提供了通过这个方法制备的药物组合物。
如本文所用，“液体”指在20℃下具有在1-1000毫帕秒(包含端值)的范围内的粘度的组合物。例如，鱼油在环境条件下为液体。该术语包括基于油的溶液、悬浮液及其组合。
在某些实施方案中，BBI指Bowman-Birk抑制剂，Uniprot号P01055[2013年1月28日可访问数据库]。
BBI的代表性前体序列是：
MVVLKVCLVL LFLVGGTTSA NLRLSKLGLL MKSDHQHSND DESSKPCCDQ CACTKSNPPQCRCSDMRLNS CHSACKSCIC ALSYPAQCFC VDITDFCYEP CKPSEDDKEN(SEQ ID NO:2)。
在一些实施方案中，如本文所用的KTI指KTI3(Uniprot号P01070；2013年1月3日可访问数据库)。KTI3的代表性前体序列是：
MKSTIFFLFL FCAFTTSYLP SAIADFVLDN EGNPLENGGT YYILSDITAF GGIRAAPTGNERCPLTVVQS RNELDKGIGT IISSPYRIRF IAEGHPLSLK FDSFAVIMLC VGIPTEWSVV EDLPEGPAVKIGENKDAMDG WFRLERVSDD EFNNYKLVFC PQQAEDDKCG DIGISIDHDD GTRRLVVSKN KPLVVQFQKLDKESLAKKNH GLSRSESEQ ID NO:2)
在一些方面，如本文所述，包含在本文所述的口服组合物中的KTI3可以是化学纯化的，例如市售的、纯化自大豆粉的。在其他方面，KTI3还可以是重组产生的。
其他蛋白酶抑制剂
本领域已知的一些胰蛋白酶抑制剂对胰蛋白酶特异，而其他一些则抑制胰蛋白酶和其他蛋白酶，如胰凝乳蛋白酶。胰蛋白酶抑制剂可源自动物或植物来源：例如，大豆、玉米、利马(lima)和其他豆类、南瓜、向日葵、牛和其他动物的胰和肺、鸡和火鸡的蛋清、基于大豆的婴儿配方食品和哺乳动物血液。胰蛋白酶抑制剂也可以是微生物起源的，例如，抗痛素(antipain)；参见，例如，H.Umezawa,1976,Meth.Enzymol.45,678。胰蛋白酶抑制剂也可以是精氨酸或赖氨酸模拟物或其他合成化合物，例如芳基胍、苯甲脒、3,4-二氯异香豆素(3,4-dichloroisocoumarin)、二异丙基氟磷酸(diisopropylfluorophosphate)、甲磺酸加贝酯(gabexate mesylate)或苯甲基磺酰氟。如本文所用，精氨酸或赖氨酸模拟物是能够与胰蛋白酶的P1口袋结合和/或干扰胰蛋白酶活性位点功能的化合物。
在某些实施方案中，用于所述方法和组合物中的其他胰蛋白酶抑制剂选自由以下组成的组：利马豆(lima bean)胰蛋白酶抑制剂，抑肽酶(又名胰胰蛋白酶抑制剂或碱性胰胰蛋白酶抑制剂[BPTI]，Uniprot号P00974[2013年1月2日可访问数据库])，Kazal抑制剂(胰分泌胰蛋白酶抑制剂)，Kazal抑制剂(胰分泌胰蛋白酶抑制剂)，类卵粘蛋白(ovomucoid)，α1-抗胰蛋白酶，皮质醇结合球蛋白，Centerin([SERPINA9/GCET1(生殖中心B细胞表达转录本1(germinal centre B-cell-expressed transcript 1))]，PI-6(Sun等1995)，PI-8(Sprecher等1995)，Bomapin，进化枝A丝氨酸蛋白酶抑制剂(clade A serpin)[例如Serpina3(NCBI基因ID：12)、Serpina6(NCBI基因ID：866)、Serpina12(NCBI基因ID：145264)、Serpina10(NCBI基因ID：51156)、Serpina7(NCBI基因ID：6906)、Serpina9(NCBI基因ID：327657)、Serpina11(NCBI基因ID：256394)、Serpina13(NCBI基因ID：388007)、Serpina2(NCBI基因ID：390502)和Serpina4(NCBI基因ID：5104)]，Yukopin(Serpinb12，基因ID：89777)，抗痛素，苯甲脒(bezamidine)，3,4-二氯异香豆素，二异丙基氟磷酸和甲磺酸加贝酯。在其他实施方案中，选择上述抑制剂的其中一种。
抑肽酶的代表性前体序列是：
MKMSRLCLSV ALLVLLGTLA ASTPGCDTSN QAKAQRPDFC LEPPYTGPCK ARIIRYFYNAKAGLCQTFVY GGCRAKRNNF KSAEDCMRTC GGAIGPWENL(SEQ ID NO:3)。
在其他实施方案中，用于所述方法和组合物中的基于油的液体制剂包含重组BBI和分离或重组KTI，或分离和重组抑酶肽，或其组合。
在某些实施方案中，用于所述方法和组合物中的rBBI和任选的第二蛋白酶抑制剂如KTI(如果存在的话)已用防腐剂储存。在其他实施方案中，rBBI和任选的第二蛋白酶抑制剂如KTI已制备并储存而不用防腐剂。
治疗性蛋白
在一些实施方案中，用于本文所述的组合物和方法的治疗性蛋白在被包含在所述药物组合物中之前是分离的。“分离的”在这个方面不包括治疗性蛋白以均质化的组织制备物或含有显著量的污染蛋白的其他形式供应。分离的蛋白或肽的优选示例是重组蛋白或肽。甚至更优选的实施方案是合成蛋白，换句话说，是在无细胞仪器中生产的蛋白。本领域技术人员鉴于本公开将理解，可以利用野生型和突变的治疗性蛋白。
已知某些蛋白和肽是胰蛋白酶和/或胰凝乳蛋白酶的特异性抑制剂，包括但不限于本文描述为胰蛋白酶和/或胰凝乳蛋白酶抑制剂的那些。这些蛋白不旨在用作所述组合物中的治疗组分，并且被排除在如本文所用的“治疗性蛋白”的定义之外。
本领域技术人员鉴于本公开将理解，多种治疗性蛋白均可用于所述方法和组合物中。在某些实施方案中，治疗性蛋白的大小为高达100千道尔顿(kDa)，通常在1-100kDa之间，包含端值。在更具体的实施方案中，大小高达90kDa。在其他实施方案中，大小高达80kDa。在其他实施方案中，大小高达70kDa。在其他实施方案中，大小高达60kDa。在其他实施方案中，大小高达50kDa。优选地，大小在1-90kDa之间，包含端值。在其他实施方案中，大小在1-80kDa之间，包含端值。在其他实施方案中，大小在1-70kDa之间，包含端值。在其他实施方案中，大小在1-60kDa之间，包含端值。在其他实施方案中，大小在1-50kDa之间，包含端值。
适用于本文的治疗性蛋白包括经修饰(即，通过非氨基酸部分共价连接至所述蛋白)的衍生物。例如但不以限制的方式，所述蛋白包括例如通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、作为融合蛋白而在遗传学上添加的多肽或通过已知的保护/封闭基团的衍生化而已被修饰的蛋白。高分子量PEG可以使用多功能接头或不使用多功能接头与治疗性蛋白连接，或者通过PEG与所述蛋白N端或C端的位点特异性结合或者通过赖氨酸残基上存在的ε-氨基。另外，衍生物可含有一种或多种非经典氨基酸。
在某些更具体的实施方案中，用于所述方法和组合物中的治疗性蛋白选自由以下组成的组：胰岛素、流感血凝素、流感神经氨酸酶、胰高血糖素、干扰素γ、干扰素β、干扰素α、生长激素、促红细胞生成素、GLP-1、GLP-1类似物、瘦素、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、肾素、生长激素释放因子、甲状旁腺激素、促甲状腺素、促卵泡激素、降钙素、黄体生成素、胰高血糖素、凝血因子(例如因子VII、因子VIIIC、因子DC、组织因子(TF)和凝血酶)、抗凝血因子(例如蛋白C)、心钠素(atrial natriuretic factor)、表面活性蛋白A(SP-A)、表面活性蛋白B(SP-B)、表面活性蛋白C(SP-C)、表面活性蛋白D(SP-D)、纤溶酶原激活剂(例如尿激酶或人尿或组织型纤溶酶原激活剂(t-PA))、铃蟾肽、造血生长因子(又名集落刺激因子，多种)、肿瘤坏死因子(TNF)蛋白(例如TNF-α、TNF-β、TNF-β2、4-1BBL)、脑啡肽酶、RANTES(调节激活正常T细胞表达和分泌细胞因子)、人巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1-α)、血清白蛋白、苗勒抑制物质、松弛素、小鼠促性腺激素释放激素、DNase、抑制素、激活素、血管内皮生长因子(VEGF)、神经营养因子(例如脑源性神经营养因子[BDNF])、神经营养蛋白-3、-4、-5或-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)、神经生长因子、血小板衍生生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子(例如α-FGF和β-FGF)、转化生长因子(TGF)(例如TGF-α和TGF-β，包括TGF-1、TGF-2、TGF-3、TGF-4和TGF-5)、神经生长因子包括NGF-1、胰岛素样生长因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)、des(1-3)-IGF-1(脑IGF-1)、胰岛素样生长因子结合蛋白1(包括IGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-5和IGFBP-6)、角质形成细胞生长因子、骨诱导因子、骨形态发生蛋白(BMP)-2、BMP-7、BMP-4、集落刺激因子(CSF)(例如M-CSF和GM-CSF)、白细胞介素(IL)(例如IL-1至IL-13和IL-15、IL-18和IL-23)、超氧化物歧化酶、衰变加速因子、趋化因子家族成员(例如eotaxins和MCP-1)和补体因子(例如C3和C5)。
在其他方面，用于掺入本发明的口服制剂中的治疗性蛋白/肽包括在遭受例如遗传性代谢疾病的患者中用作酶替代疗法(ERT)的治疗性肽/蛋白，在该遗传性代谢疾病中，遗传缺陷导致对代谢途径至关重要的内源酶的结构缺陷或缺乏。这些代谢缺陷转而导致底物和/或其中间物的积累，从而导致病理状态。例如，在一些实施方案中，治疗性蛋白/肽可包括葡糖脑苷脂酶、α-半乳糖苷酶、酸性α-葡糖苷酶、α-L-艾杜糖醛酸酶、艾杜糖-2-硫酸酯酶、N-乙酰半乳糖胺4-硫酸酯酶、芳基硫酸酯酶A、酸性鞘磷脂酶、碱性磷酸酶、吡哆醛5-磷酸、胆色素原脱氨酶和苯丙氨酸氨裂解酶。
在其他实施方案中，治疗性蛋白/肽通过扩大现有的内源性途径或通过发挥新的催化功能，以缓解病理状况的症状。这些治疗性酶已成功用于多种病理状况中，范围从肿瘤学，到神经肌肉功能障碍，到止血法，甚至美容外科学。例如，在一些实施方案中，治疗性蛋白/肽可包括：
阿替普酶(Alteplase)、瑞替普酶(Reteplase)、替奈普酶(Tenecteplase)、人组织纤溶酶原激活剂、尿激酶、链激酶、阿尼普酶依米那酶(Anistreplace Eminases)、Drotrecognin-a、因子VIIa、人凝血因子VIIa、L-天冬酰胺酶、羧肽酶拉布立酶(Carboxypeptidase Rasburicase)、腺苷脱氨酶、肉毒杆菌毒素A型、透明质酸酶及其他。
在其他实施方案中，治疗性蛋白/肽可包括因子VIIa、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI、因子XIII、vWF、蛋白C、抗凝血酶III、纤维蛋白原、C1-酯酶抑制剂、α-1蛋白酶抑制剂(α1-PI)、葡糖脑苷脂酶、α-L-艾杜糖醛酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、N-乙酰半乳糖胺4-硫酸酯酶、N-乙酰半乳糖胺6-硫酸酯酶、硫酸乙酰肝素硫酸酯酶(Heparan sulfatesulfatase)、α-半乳糖苷酶A、α-葡糖苷酶、酸性鞘磷脂酶、α-甘露糖苷酶、芳基硫酸酯酶A、溶酶体酸酯酶(LAL)、蔗糖酶-异麦芽糖酶、腺苷脱氨酶、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、碱性磷酸酶、胆色素原脱氨酶或其组合。
在更具体的实施方案中，治疗性蛋白是胰岛素。或者，治疗性蛋白可以是GFP-1抑制剂。在一个更具体的实施方案中，治疗性蛋白是艾塞那肽。在其他实施方案中，所述组合物中同时存在胰岛素和艾塞那肽。在其他实施方案中，液体制剂基本上由胰岛素、艾塞那肽、二价阳离子螯合剂、分离的BBI和油组成。在其他实施方案中，液体制剂基本上由胰岛素、艾塞那肽、二价阳离子螯合剂、分离的BBI、至少一种乳化剂和油组成。在其他实施方案中，液体制剂基本上由胰岛素、艾塞那肽、二价阳离子螯合剂、分离的KTI3、抑肽酶和油组成。在还一些实施方案中，液体制剂基本上由胰岛素、艾塞那肽、二价阳离子螯合剂、分离的KTI3、抑肽酶、至少一种乳化剂和油组成。
本领域技术人员鉴于本公开将理解，各种类型的胰岛素均适用于所描述的方法和组合物。示例性胰岛素蛋白包括但不限于野生型和突变的胰岛素蛋白，包括合成人胰岛素、合成牛胰岛素、合成猪胰岛素、合成鲸胰岛素和胰岛素的金属复合物，如胰岛素的锌复合物、鱼精蛋白锌胰岛素和珠蛋白锌。
也可以使用各种种类的胰岛素，例如速效胰岛素(fast-acting insulin)、缓释胰岛素(lente insulin)、半慢胰岛素(semilente insulin)、特慢胰岛素(ultralenteinsulin)、NPH胰岛素、甘精胰岛素(glargine insulin)、赖脯胰岛素(lispro insulin)、门冬胰岛素(aspart insulin)或两种或更多种以上胰岛素类型的组合。
在一个特别优选的实施方案中，所述方法和组合物的胰岛素是野生型人胰岛素(Uniprot ID P01308)。在110个氨基酸中，1至24是信号肽，25至54形成胰岛素B链，57至87形成C肽，90至110形成胰岛素A链。在一个优选的实施方案中，人胰岛素在细菌细胞中作为重组蛋白产生。在另一个优选的实施方案中，人胰岛素是合成产生的。
GLP-1类似物在本领域中也被称为GLP-1模拟物。本领域技术人员鉴于本公开将理解，所述组合物可以包括以下GLP-1类似物的至少一种：艾塞那肽(ByettaTM；CAS号141732-76-5)、利司那肽(lixisenatide)(CAS号320367-13-3)、利拉鲁肽(liraglutide)(CAS号204656-20-2)、exendin-9(CAS号133514-43-9)、AC3174([Leu(14)]exendin-4，AmylinPharmaceuticals，Inc.)、他泊鲁肽(taspoglutide)(CAS号275371-94-3)、阿比鲁肽(albiglutide)(CAS号782500-75-8)、司美鲁肽(semaglutide)(CAS号910463-68-2)、LY2189265(度拉糖肽TM(dulaglutideTM)；CAS号923950-08-7)和CJC-1134-PC(偶联至由ConjuChemTM生产的重组人白蛋白的改良exendin-4类似物)。2011年12月19日可访问所有的CAS记录。因此，在某些实施方案中，所述方法或组合物利用任何的上列GLP-1类似物。在其他实施方案中，选择上列GLP-1类似物的其中一种。本领域技术人员鉴于本文提供的发现结果将理解，其他GLP-1类似物也可用于所述方法和组合物中。
在一些实施方案中，提及“治疗性肽”或“治疗性蛋白”旨在包括任何这样的分子，其在提供给需要的受试者时提供有益的效果。在某些情况下，该分子是治疗性的，因为其发挥作用以替代受试者中不存在或存在减少的此分子。在一个实施方案中，该分子替代了不存在的蛋白，如通过口服递送外源蛋白补偿内源无效突变体(null mutant)的情况。在其他实施方案中，内源蛋白被突变，并产生非功能性蛋白，通过口服递送异源功能性蛋白得到补偿。在其他实施方案中，异源蛋白的口服递送是对低内源水平的添加，导致给定蛋白的累积可用率增加。在其他实施方案中，该分子刺激信号转导级联，该信号转导级联提供对于细胞或宿主功能至关重要的元件的表达或分泌或其他。
乳化剂
本文所指的乳化剂和洗涤剂的“重量/重量”百分比利用制剂中油基料的量，例如鱼油，作为分母；因此，500mg鱼油中的60mg Gelucire被视为12％w/w，而不论其他组分的重量。同样地，50mg吐温-80与500mg鱼油混合被视为10％吐温-80。
在某些实施方案中，在所述方法和药物组合物中使用的基于油的液体制剂，或在其他实施方案中，每种存在的基于油的液体制剂除治疗性蛋白、螯合剂和BBI外，还包含脂肪酸的聚乙二醇(PEG)酯，例如单甘油酯、二甘油酯、三甘油酯或其混合物的PEG酯。在更具体的实施方案中，PEG酯可以作为以下的混合物被提供：(a)游离单酰基甘油、游离二酰基甘油、游离三酰基甘油或其混合物；和(b)脂肪酸的PEG酯，例如单甘油酯、二甘油酯、三甘油酯或其混合物的PEG酯。在这方面，术语“单酰基甘油”、“二酰基甘油”和“三酰基甘油”中的每个不必指单种化合物，而是能包括化合物的混合物，例如具有不同长度的脂肪酸的单酰基甘油、二酰基甘油或三酰基甘油的混合物。在某些优选的实施方案中，用于所述方法和组合物中的单酰基甘油、二酰基甘油或三酰基甘油，例如用于一般PEG酯的那些，来自通常认为安全(Generally Recognized As Safe，GRAS)的油来源。GRAS油的示例是椰子油、玉米油、花生油、大豆油、Myvacet 9-45(C-18脂肪酸的二乙酰单酰基甘油)。(a)的一个更具体的实施方案是C8-C18单酰基甘油、二酰基甘油和三酰基甘油的混合物。组分(b)的一个更具体的实施方案是一种或多种C8-C18脂肪酸的PEG单酯和二酯的混合物。
在更具体的实施方案中，液体制剂除脂肪酸的PEG酯之外，进一步包含游离PEG。在仍更具体的实施方案中，除PEG酯和游离PEG之外，还存在其他的非离子型洗涤剂，例如基于聚山梨酸酯的洗涤剂。
在所述方法和组合物的一个仍更具体的实施方案中，液体制剂包含：(a)C8-C18单酰基甘油、二酰基甘油和三酰基甘油的混合物；(b)C8-C18脂肪酸混合物的PEG-32单酯和二酯；(c)游离PEG-32。在甚至更具体的实施方案中，组分(a)与组分(b)+(c)之和的重量/重量比在10:90-30:70之间，包含端值；更具体地在15:85-25:75之间，包含端值；更具体地为20:80。在某些实施方案中，组分(a)-(c)共占基于油的液体制剂的8-16％(包含端值)重量/重量。在更具体的实施方案中，该量为9-15％(包含端值)。在更具体的实施方案中，该量为10-14％(包含端值)。在更具体的实施方案中，该量为11-13％(包含端值)。在更具体的实施方案中，该量为12％。
在其他实施方案中，在所述方法和药物组合物中使用的基于油的液体制剂除治疗性蛋白、螯合剂和BBI之外，还包含自乳化组分。尽管自乳化组分的一些实施方案是在前段落中描述的组分的混合物，但这些混合物不限制本文所用的术语“自乳化组分”的定义。如本文所用，“自乳化组分”指自发形成乳剂的组分。通常，这样的组分在与水性介质接触时将形成乳剂，从而形成精细分散系，即微乳剂(SMEDDS)。这样的组分的某些实施方案包含三酰基甘油的三酰基甘油混合物和高亲水性/亲脂性平衡(HLB；参见Griffin WC:"Calculationof HLB Values of Non-Ionic Surfactants,"J Soc Cosmetic Chemists5:259(1954))表面活性剂。自乳化组分的其他实施方案具有蜡质的半固体稠度。
优选地，用于所述方法和组合物中的自乳化组分的HLB为10或大于10。在其他实施方案中，其在11-19之间，包含端值。在其他实施方案中，其在12-18之间，包含端值。在其他实施方案中，其在12-17之间，包含端值。在其他实施方案中，其在12-16之间，包含端值，其指示油包水(O/W)乳化剂。在其他实施方案中，其在13-15之间，包含端值。在其他实施方案中，其为14。自乳化组分的仍更具体的实施方案的HLB为12-16(包含端值)，并包含偶联PEG的中链和长链三酰基甘油、游离三酰基甘油和游离PEG。在其他实施方案中，自乳化组分的HLB为12-16(包含端值)，并由偶联至PEG的中链和长链三酰基甘油、游离三酰基甘油和游离PEG的混合物组成。在其他实施方案中，自乳化组分的HLB为14，并包含偶联至PEG的中链和长链三酰基甘油、游离三酰基甘油和游离PEG。在其他实施方案中，自乳化组分的HLB为14，并由偶联至PEG的中链和长链三酰基甘油、游离三酰基甘油和游离PEG的混合物组成。
某些更具体的实施方案利用自乳化组分，该自乳化组分包含(a)单酰基甘油、二酰基甘油、三酰基甘油或其混合物；和(b)脂肪酸的聚乙二醇(PEG)酯。在这方面，术语“单酰基甘油”、“二酰基甘油”和“三酰基甘油”中的每个不必指单个化合物，而是可以包括化合物的混合物，例如具有不同长度的脂肪酸的单酰基甘油、二酰基甘油或三酰基甘油的混合物。一个更具体的实施方案是C8-C18单酰基甘油、二酰基甘油和三酰基甘油的混合物。组分(b)的一个更具体的实施方案是C8-C18脂肪酸混合物的PEG单酯和二酯的混合物。
在其他更具体的实施方案中，自乳化组分进一步包含游离PEG。
用于所述组合物和方法中的某些PEG部分含有5-100个单体。在更具体的实施方案中，PEG可含有15-50个单体。在仍更具体的实施方案中，PEG可含有25-40个单体。在更具体的实施方案中，PEG可含有32个单体。
在所述方法和组合物的仍更具体的实施方案中，其中使用的自乳化组分包含：(a)C8-C18单酰基甘油、二酰基甘油和三酰基甘油的混合物；(b)C8-C18脂肪酸混合物的PEG-32单酯和二酯；和(c)游离的PEG-32；并且组分(a)与组分(b)+(c)的重量/重量比为20:80。在某些实施方案中，这样的组分占基于油的液体制剂的8-16％重量/重量(包含端值)。在更具体的实施方案中，该量为9-15％(包含端值)。在更具体的实施方案中，该量为10-14％(包含端值)。在更具体的实施方案中，该量为11-13％(包含端值)。在更具体的实施方案中，该量为12％。
满足以上规格的自乳化组分的示例是GelucireTM 44/14、GelucireTM 53/10和GelucireTM 50/13。一个更具体的实施方案是GelucireTM 44/14。后缀44和14分别指其熔点和其亲水性/亲脂性平衡(HLB)。通过氢化椰子油(中链和长链三酰基甘油)与PEG-32的多糖酵解(polyglycolysis)获得GelucireTM 44/14(GattefosséSAS，圣普列斯特，法国)。GelucireTM 44/14的亲水性/亲脂性平衡为14。GelucireTM 44/14包含以下：C8-C18单、二和三酰基甘油的确定混合物(20％w/w)；PEG-32单酯和二酯以及游离PEG-32(80％w/w)。存在的主要脂肪酸是月桂酸，平均占总脂肪酸含量的45％。它是一种固体分散系，包含螺旋构象的
Figure BDA0002776284770000171
层状相下的PEG酯部分和在六边形堆积下的酰基甘油部分。GelucireTM 44/14的模拟胃肠道脂解的主要产物是PEG-32单酯和二酯。在更具体的实施方案中，所述组合物包含约12％的Gelucire 44/14作为唯一的乳化剂，或在其他实施方案中，与另一种乳化剂一起。在其他实施方案中，所述组合物包含约12％的Gelucire 44/14和约10％的吐温-80。
非离子型洗涤剂
在某些实施方案中，在所述方法和药物组合物中使用的基于油的液体制剂除自乳化组分之外进一步包含非离子型洗涤剂。在某些实施方案中，非离子型洗涤剂选自由以下组成的组：聚山梨酸酯-20，聚山梨酸酯-40，聚山梨酸酯-80，聚桂醇400，聚乙二醇40硬脂酸盐，聚氧乙烯氢化蓖麻油10、50和60，单硬脂酸甘油酯，聚山梨酸酯40、60、65和80，蔗糖脂肪酸酯，甲基纤维素，羧甲基纤维素，n-辛基葡糖苷，n-十二烷基葡糖苷，n-十二烷基麦芽糖苷，辛酰基-N-甲基葡糖酰胺，癸酰基-N-甲基葡糖酰胺，TritonTM-X-100，TritonTM-X-114，ThesitTM，异十三烷基聚(乙二醇醚)n(Isotridecypoly(ethylene glycol ether)n)，3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基氨基]-1-丙烷磺酸盐(CHAPS，3-[(3-cholamidopropyl)dimethylamminio]-1-propane sulfonate)，3-[((3-胆酰胺丙基)二甲基氨基]-2-羟基-1-丙烷磺酸盐(CHAPSO，3-[(3-cholamidopropyl)dimethylamminio]-2-hydroxy-1-propanesulfonate)和N-十二烷基＝N,N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸盐(N-dodecyl＝N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propane sulfonate)。在其他实施方案中，选择上列非离子型洗涤剂的其中一种。
在某些更具体的实施方案中，用于所述方法和组合物中的非离子型洗涤剂是基于聚山梨酸酯的洗涤剂。基于聚山梨酸酯的洗涤剂的示例是通过将聚乙氧基脱水山梨糖醇共价结合至脂肪酸衍生而来的洗涤剂。基于聚山梨酸酯的洗涤剂的更具体的实施方案是聚山梨酸酯-20、聚山梨酸酯-40和聚山梨酸酯-80。
例如，聚山梨酸酯80(吐温-80)是衍生自聚乙氧基脱水山梨糖醇和油酸的非离子型洗涤剂，具有以下结构：
Figure BDA0002776284770000181
就聚山梨酸酯80来说，右侧所示部分是脂肪酸的混合物，含有60-70％的油酸(如所示)，其余部分主要是亚油酸、棕榈酸和硬脂酸。
在一个更具体的实施方案中，聚山梨酸酯80占用于所述方法和组合物中的基于油的液体制剂的3-15％重量/重量(包含端值)。在一个更具体的实施方案中，该百分比为5-14％(包含端值)。在一个更具体的实施方案中，该百分比为7-12％(包含端值)。在更具体的实施方案中，该百分比是10％，或者5％。
二价阳离子螯合剂
在一个实施方案中，用于所述方法和组合物中的二价阳离子螯合剂是具有对钙、镁和锰离子中至少一种的高亲和力的任何生理学上可接受的化合物。在另一个实施方案中，螯合剂选自由以下组成的组：柠檬酸(citrate)或其盐；乙二胺四乙酸(EDTA)或其盐(例如EDTA二钠和EDTA钙二钠)；EGTA(乙二醇四乙酸)或其盐；二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)或其盐；和BAPTA(1,2-双(o-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N’,N’-四乙酸)或其盐。在其他实施方案中，使用上列螯合剂的其中一种。在更具体的实施方案中，螯合剂是EDTA。
油
根据目前的发现，本领域技术人员将理解，多种油均可以用作所述组合物的液相的基础。在某些实施方案中，油可以是在环境温度下为液体的任何生理学上可接受的油。
在更具体的实施方案中，油包含omega-3脂肪酸。在其他实施方案中，omega-3脂肪酸是omega-3多不饱和脂肪酸。在另一个实施方案中，omega-3脂肪酸是DHA，一种omega-3多不饱和22-碳脂肪酸，也被称为4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸。在另一个实施方案中，omega-3脂肪酸是-亚麻酸(9,12,15-十八碳三烯酸)。在另一个实施方案中，omega-3脂肪酸是十八碳四烯酸(6,9,12,15-十八碳四烯酸)。在另一个实施方案中，omega-3脂肪酸是二十碳三烯酸(ETA；11,14,17-二十碳三烯酸)。在另一个实施方案中，omega-3脂肪酸是二十碳四烯酸(8,11,14,17-二十碳四烯酸)。在一个实施方案中，omega-3脂肪酸是二十碳五烯酸(EPA；5,8,11,14,17-二十碳五烯酸)。在另一个实施方案中，omega-3脂肪酸是二十碳六烯酸(也被称为5,7,9,11,14,17-二十碳六烯酸)。在另一个实施方案中，omega-3脂肪酸是二十二碳五烯酸(DPA；7,10,13,16,19-二十二碳五烯酸)。在另一个实施方案中，omega-3脂肪酸是二十四碳六烯酸(6,9,12,15,18,21-二十四碳六烯酸)。
在其他实施方案中，油是包含omega-3脂肪酸的天然存在的油。在更具体的实施方案中，油选自由以下组成的组：鱼油、芥花油、亚麻籽油、藻油和大麻籽油。在更具体的实施方案中，油是鱼油。已经在所述组合物中测试了多种类型的鱼油，并且发现它们都同样有效。
在其他实施方案中，用于所述方法或组合物中的液体制剂是无水的。在某些实施方案中，“无水的”指没有水性组分被有意加入其中的制剂。这并不排除从大气中被吸收到其成分中的痕量水的存在。在另一个实施方案中，液体制剂不含水性组分。在还其他实施方案中，一种或多种油是液体制剂中唯一的液体组分。在更具体的实施方案中，鱼油是液体制剂中唯一的液体组分。
包衣
本领域技术人员鉴于目前的发现将理解，各种pH敏感的包衣都可用于所述方法和组合物中。在某些实施方案中，可以使用抑制组合物在受试者胃中消化的任何包衣。
在其他实施方案中，包衣包含可生物降解的多糖。在其他实施方案中，使用水凝胶。在其他实施方案中，包衣包含以下赋形剂中一种：壳聚糖(chitosan)、aquacoat ECD包衣、偶氮交联聚合物、纤维素乙酸邻苯二甲酸酯(cellulose acetate phthalate)、纤维素乙酸偏苯三酸酯(cellulose acetate trimellitate)(CAT)、纤维素乙酸丁酸酯(cellulose acetate butyrate)、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯(hydroxypropylmethylcellulose phthalate)或聚乙烯乙酸邻苯二甲酸酯(poly vinyl acetate phthalate)。
在其他实施方案中，使用如PulsincapTM的定时释放系统。
在优选的实施方案中，当pH达到肠中发现的范围(相对于胃中pH范围为碱性)时，所述包衣剂型释放核心(含有基于油的制剂)。在更具体的实施方案中，包衣包含pH敏感的聚合物。在各种实施方案中，可以使用单层或多层包衣。
在一个实施方案中，包衣是肠溶包衣。用于肠溶包衣的方法在本领域中是众所周知的(参见，例如，Siepmann F等人2005)。在更具体的实施方案中，使用EudragitTM包衣作为肠溶包衣。EudragitTM包衣是丙烯酸聚合物，其用途在本领域中是众所周知的。
在另一个实施方案中，利用微胶囊作为所述组合物的抗胃包衣。微胶囊化的方法在本领域中是众所周知的。
在其他实施方案中，包衣是胶囊，其中明胶胶囊是一个更具体的实施方案。用于将基于油的制剂加入明胶胶囊的方法在本领域中是众所周知的。在其他实施方案中，包衣是软胶肠溶胶囊。
在另一个实施方案中，提供了一种口服药物组合物，其包含基于油的液体制剂，其中该基于油的液体制剂包含高达100千道尔顿的治疗性蛋白、二价阳离子螯合剂、分离的胰凝乳蛋白酶/胰蛋白酶抑制剂、分离的胰蛋白酶抑制剂以及脂肪酸的PEG酯。在其他实施方案中，液体制剂具有每ml液体制剂抑制至少50mg胰凝乳蛋白酶的抗胰凝乳蛋白酶活性。在其他实施方案中，液体制剂具有每ml液体制剂抑制至少50mg胰凝乳蛋白酶的抗胰凝乳蛋白酶活性和每ml液体制剂抑制至少25mg胰蛋白酶的抗胰蛋白酶活性。在其他实施方案中，还存在游离PEG。在其他实施方案中，还存在非离子型洗涤剂。在其他实施方案中，液体制剂基本上由高达100千道尔顿的治疗性蛋白、二价阳离子螯合剂、胰凝乳蛋白酶/胰蛋白酶抑制剂、胰蛋白酶抑制剂和脂肪酸的PEG酯组成。在其他实施方案中，液体制剂基本上由高达100千道尔顿的治疗性蛋白、二价阳离子螯合剂、胰凝乳蛋白酶/胰蛋白酶抑制剂、胰蛋白酶抑制剂、脂肪酸的PEG酯和游离的PEG组成。在其他实施方案中，液体制剂基本上由高达100千道尔顿的治疗性蛋白、二价阳离子螯合剂、胰凝乳蛋白酶/胰蛋白酶抑制剂、胰蛋白酶抑制剂、脂肪酸的PEG酯、游离的PEG和非离子型洗涤剂组成。
代表性制剂
某些代表性的胰岛素制剂包含胰岛素、Gelucire 44/14、EDTA、SBTI和鱼油中的抑肽酶，被包衣在胶囊中。某些代表性的艾塞那肽制剂包含艾塞那肽、Gelucire 44/14、EDTA、SBTI和鱼油中的抑肽酶，被包衣在胶囊中。
在一些实施方案中，本发明提供了具有以下组分的制剂：8-20％的Gelucire 44/14；每个胶囊中25-50mg的rBBI，25-50mg分离的KTI；100-200mg EDTA；和治疗性蛋白，其可以是每个胶囊中2-32mg的胰岛素和/或每个胶囊中150-600mcg的艾塞那肽，全部合并在0.5-0.7ml鱼油中。
在一些实施方案中，本发明提供了具有以下组分的制剂：8-20％的Gelucire 44/14；每个胶囊12.5-25mg的rBBI，12.5-25mg分离的KTI；100-200mg EDTA；和治疗性蛋白，其可以是每个胶囊2-32mg的胰岛素和/或每个胶囊150-600mcg的艾塞那肽，全部合并在0.5-0.7ml鱼油中。
在一些实施方案中，本发明提供了具有以下组分的制剂：每个胶囊12.5-25mg的rBBI，12.5-25mg分离的KTI；100-200mg EDTA；和治疗性蛋白，其可以是每个胶囊2-32mg的胰岛素和/或每个胶囊150-600mcg的艾塞那肽，全部合并在0.5-0.7ml鱼油中。
在一些实施方案中，本发明提供了具有以下组分的制剂：每个胶囊中25-50mg的rBBI，25-50mg分离的KTI；100-200mg EDTA；和治疗性蛋白，其可以是每个胶囊2-32mg的胰岛素和/或每个胶囊150-600mcg的艾塞那肽，全部合并在0.5-0.7ml鱼油中。
在一些实施方案中，本发明提供了具有以下组分的制剂：每个胶囊50-100mg的rBBI，50-100mg分离的KTI；100-200mg EDTA；和治疗性蛋白，其可以是每个胶囊2-32mg的胰岛素和/或每个胶囊150-600mcg的艾塞那肽，全部合并在0.5-0.7ml鱼油中。
在一些实施方案中，本发明提供了具有以下组分的制剂：每个胶囊中75-125mg的rBBI，75-125mg分离的KTI；100-200mg EDTA；和治疗性蛋白，其可以是每个胶囊2-32mg的胰岛素和/或每个胶囊150-600mcg的艾塞那肽，全部合并在0.5-0.7ml鱼油中。
在一些实施方案中，所述含有重组BBI和胰岛素的制剂表现出更快速且定性上更大幅的循环葡萄糖水平下降，相比于用包含化学纯化自大豆制备物的BBI的制剂，该效果维持更长的时间。
在一些实施方案中，在持续效果方面，相比于包含化学纯化自大豆制备物的BBI的制剂，本文所述的含有重组BBI和基于治疗性蛋白或肽的治疗剂的制剂提供了更长时间的更大治疗窗口，这可以在施用后的局部效果，或在一些实施方案中在施用后的循环蛋白/肽水平中得到证明。
在一些实施方案中，本文所述的含有重组BBI和基于治疗性蛋白或肽的治疗剂的制剂在施用重组BBI后在相等或更长的时间内提供持续的作用，或提供相等或更高的蛋白/肽循环水平，重组BBI的浓度低于其他方面相同的制剂中化学纯化自大豆制备物的BBI的浓度。
根据这个方面并且在一些实施方案中，在本发明的制剂中提供的重组BBI浓度将为比用于其它方面相当或相同的制剂中的化学纯化自大豆制备物的BBI的浓度低至少30％，或在一些实施方案中，至少35％，或在一些实施方案中，至少40％，或在一些实施方案中，至少45％，或在某些实施方案中，至少50％，或在一些实施方案中，至少55％，或在一些实施方案中，至少60％，或在一些实施方案中，至少65％，或在一些实施方案中，至少70％，或在一些实施方案中，至少75％。
将理解的是，针对本发明的制剂提及的术语“其方面相当或相同”包括关键成分(包括蛋白/肽、BBI或KTI蛋白酶抑制剂、EDTA和/或鱼油或源自鱼油的omega-3脂肪酸)相同，而制剂的其他组分可以是相当的(如技术人员将理解的)。
在一个实施方案中，提供了一种具有以下组分的制剂：8-20％的Gelucire44/14；每个胶囊50-100mg rBBI，或rBBI/分离的或重组的KTI混合物；每个胶囊20-30mg抑肽酶；和100-200mg EDTA；以及治疗性蛋白，其可以是每个胶囊8-32mg胰岛素和/或每个胶囊150-600mcg艾塞那肽，全部合并在0.5-0.7ml鱼油中。
在另一个实施方案中，提供了代表性的液体胰岛素制剂，其在鱼油中含有胰岛素、Gelucire 44/14、EDTA、rBBI、KTI和抑肽酶。
在其他实施方案中，液体制剂基本上由胰岛素、Gelucire 44/14、EDTA、rBBI、KTI、抑肽酶和鱼油组成。
在一些实施方案中，制剂在0.5-0.7ml鱼油中含有8mg胰岛素、12％Gelucire 44/14、150mg EDTA、总共75mg的rBBI和KTI，以及24mg抑肽酶；或在一些实施方案中，在0.5-0.7ml鱼油中含有16mg胰岛素、12％Gelucire44/14、150mg EDTA、总共75mg的rBBI和KTI，以及24mg抑肽酶；或在一些实施方案中，在0.5-0.7ml鱼油中含有16mg胰岛素、12％Gelucire44/14、150mg EDTA、总共150mg的rBBI和KTI，以及24mg抑肽酶。
在一些实施方案中，本发明提供了一种制剂，其中组合物的抗胰蛋白酶活性与抗胰凝乳蛋白酶活性的比率是约1.28:1。在一些实施方案中，仅含有所述量的rBBI的制剂具有足够的蛋白酶抑制剂活性，并且在其中不包含其他蛋白酶。
在其他实施方案中，上述组合物进一步包含非离子型洗涤剂。在更具体的实施方案中，非离子型洗涤剂是基于聚山梨酸酯的洗涤剂。在甚至更具体的实施方案中，基于聚山梨酸酯的洗涤剂是聚山梨酸酯80。优选地，聚山梨酸酯80占基于油的液体制剂的3-10％(包含端值)重量/重量。
可以用软胶肠溶胶囊包衣液体制剂。在某些实施方案中，该段落中描述的具体制剂还包括按相同比率含有相同组分的按比例放大和按比例缩小的制剂。
一些代表性的口服艾塞那肽制剂在鱼油中包含艾塞那肽、EDTA、rBBI、KTI和抑肽酶。在其他实施方案中，液体制剂基本上由艾塞那肽、Gelucire44/14、EDTA、rBBI、KTI、抑肽酶和鱼油组成。更具体的制剂在0.5-0.7ml鱼油中含有150微克(mcg)艾塞那肽、150mgEDTA、总共75mg的rBBI和KTI，以及24mg抑肽酶；在0.5-0.7ml鱼油中含有300mcg艾塞那肽、150mg EDTA、总共75mg的rBBI和KTI，以及24mg抑肽酶；和在0.5-0.7ml鱼油中含有300mcg艾塞那肽、150mg EDTA、总共150mg的rBBI和KTI，以及24mg抑肽酶。在一些实施方案中，仅含有所述量的rBBI的制剂具有足够的蛋白酶抑制剂活性，并且在其中不包含其他蛋白酶。
在仍更具体的制剂中，组合物的抗胰蛋白酶活性与抗胰凝乳蛋白酶活性的比率在1.5:1至1:1之间，包含端值。在甚至更具体的实施方案中，该比率是约1.28:1。可以用软胶肠溶胶囊包衣液体制剂。在其他实施方案中，上述组合物进一步包含非离子型洗涤剂。在更具体的实施方案中，非离子型洗涤剂是基于聚山梨酸酯的洗涤剂。在甚至更具体的实施方案中，基于聚山梨酯的洗涤剂是聚山梨酸酯80。优选地，聚山梨酸酯80占基于油的液体制剂的3-10％(包含端值)重量/重量。可以用软胶肠溶胶囊包衣液体制剂。
治疗性病症
在另一个方面，提供了本文所述的rBBI在制备用于向受试者口服施用活性成分的药物中的用途。
在另一个方面，提供了一种用于制备药物组合物的方法，其包括以下步骤：(a)生产包含本文所述的rBBI和活性成分的混合物；和(b)将该混合物配制成药学上可接受的制剂。
如本文所指，配制步骤视目的药物组合物的情况包括任选加入赋形剂、研磨、包衣等步骤。这些步骤完全在本领域技术人员的能力范围内。
在某些实施方案中，本文所指的活性成分对人消化道中的降解或失活敏感。
在另一个方面，提供了一种本文所述口服药物组合物，用于向受试者口服施用活性成分。在某些优选的实施方案中，活性成分对人消化道中的降解或失活敏感。在更具体的实施方案中，活性成分可以是治疗性蛋白。在其他实施方案中，活性成分是对人消化道中的降解或失活敏感的非蛋白分子。
在另一个方面，提供了本文所述的口服药物组合物在制备用于向受试者口服施用治疗性蛋白的药物中的用途。
在另一个方面，提供了一种用于向受试者口服施用治疗性蛋白的方法，该方法包括以下步骤：向受试者施用本文所述的口服药物组合物，由此向受试者口服施用治疗性蛋白。
在另一个方面，提供了一种本文所述的药物组合物，用于治疗人的糖尿病，其中，在一些实施方案中，治疗性蛋白在各实施方案中均是胰岛素、艾塞那肽或其组合。
在另一个方面，提供了本文所述的成分的组合在制备用于治疗人的糖尿病的药物中的用途，其中，在一些实施方案中，治疗性蛋白在各实施方案均中是胰岛素、艾塞那肽或其组合。
在仍另一个方面，提供了一种用于治疗糖尿病的方法，该方法包括以下步骤：施用本文所述的药物组合物给需要这种治疗的受试者，其中，在一些实施方案中，治疗性蛋白在各实施方案中均是胰岛素、艾塞那肽或其组合，由此治疗糖尿病。在某些实施方案中，受试者是人受试者，而在其他实施方案中，受试者是非人哺乳动物。
在一个额外方面，提供了一种本文所述的药物组合物，用于治疗人的不稳定型糖尿病。在另一个方面，提供了一种本文所述的药物组合物，用于治疗人的空腹血糖水平升高。
还在另一个方面，提供了本文所述的成分的组合在制备用于治疗人的不稳定型糖尿病的药物中的用途。另外，还提供了本文所述的成分的组合在制备用于治疗人的空腹血糖水平升高的药物中的用途。
另外，提供了一种用于治疗不稳定型糖尿病的方法，该方法包括以下步骤：施用本文所述的药物组合物给需要这种治疗的受试者，由此治疗不稳定型糖尿病。进一步提供了一种用于降低空腹血糖水平升高的方法，该方法包括以下步骤：施用本文所述的药物组合物给需要这种治疗的受试者，由此降低空腹血糖升高。在某些优选的实施方案中，受试者是人受试者。
不稳定型糖尿病
本领域技术性医生将理解，可以通过若干可接受的标准程序来诊断不稳定型糖尿病(也被称为血糖不稳定)。一种这样的程序见于Ryan等人，2004中。在这个程序中，受试者被要求每天最少监测2次毛细血管葡萄糖读数以监测他们的血糖水平。患者在表单上记录4周内所有测量的葡萄糖数值和有关低血糖发生的详细信息。在葡萄糖被记录为<3.0mmol/l的任何情况下，受试者都被要求在调查表上描述事件细节，包括发生的症状以及是否从第三方获得外部帮助以鉴别或治疗低血糖反应。如果个体已经失去对状况的控制，并需要外部帮助来治疗低血糖事件，则认为该反应严重。其他此类方法包括计算MAGE指数(Service等，1970)或“M值”(Schlichtkrull等)，或使用连续葡萄糖监测系统(Kessler等)。不稳定型糖尿病通常与空腹血糖升高和/或低血糖事件有关。
应当理解，本发明涉及口服组合物，用于治疗本文所述的各种疾病/病症，包括任何形式的糖尿病(如技术人员所理解)。
在一个实施方案中，术语“治疗”包括预防性和病症缓解性治疗。术语“减少”和“抑制”具有其通常理解的含义，即减轻、或在另一个实施方案中降低、或在另一个实施方案中延迟、或在另一个实施方案中减少疾病、病症或病况的发生率(incidence)、严重性或病因(pathogenesis)。在一个实施方案中，术语治疗指对与疾病、病症或病况相关的症状的延迟进展、持续缓解、降低发病率或改善症状。在一个实施方案中，术语“治疗”、“减少”或“抑制”指对与所示疾病、病症或病状有关的发病率(morbidity)、死亡率或其组合的降低。在一个实施方案中，术语“进展”指范围或严重性的增加、发展、生长或恶化。在另一个实施方案中，术语“复发”意指缓解后疾病的回归。在一个实施方案中，本发明的治疗方法降低疾病的严重性，或在另一个实施方案中，减少与疾病有关的症状，或在另一个实施方案中，降低疾病期间表达的生物标志物的数量。
在一个实施方案中，术语“治疗”及其包括的方面，指施药给患有所示疾病、病症或病状的受试者，或在一些实施方案中，给易患所示疾病、病症或病状的受试者。术语“易患”认为尤其指与所示疾病的发生率、严重性等的趋势性的或统计学上的增加有关的遗传谱图或家族性关系。在一些实施方案中，术语“易患”被认为尤其指与所示疾病的风险增加有关的生活方式。在一些实施方案中，术语“易患”认为尤其指与所示疾病有关的生物标志物的存在，例如在癌症中，术语“易患”癌症可包括存在所示癌症的癌前的前体(precancerousprecursors)。
在一些实施方案中，术语“减少病因”应理解为包括减少与特定疾病、病症或病状有关的组织损伤或器官损伤。在另一个实施方案中，术语“减少病因”应理解为包括减少所讨论的相关疾病、病症或病状的发病率或严重性。在另一个实施方案中，术语“减少病因”应理解为包括减少具有所示症状或与其所相关的症状的相关疾病、病症或病状的数量。
生产药物组合物的方法
本文还提供了生产药物组合物的方法。在某些实施方案中，该方法包括以下步骤：任选地将融化的Gelucire(例如Gelucire 44/14)与鱼油组合，冷却混合物，然后以粉末形式加入EDTA、SBTI、抑肽酶和治疗性蛋白或肽，例如胰岛素，或在其他实施方案中为艾塞那肽，尽管本领域技术人员鉴于当前发现理解也可以使用其他治疗性蛋白或肽。在其他实施方案中，该方法包括以下步骤：任选地将融化的Gelucire(例如Gelucire 44/14)与鱼油组合，冷却其混合物，然后以粉末形式加入EDTA、BBI和治疗性蛋白或肽。在某些实施方案中，粉末组分以所列顺序加入。在其他实施方案中，任选地混合和/或均质化所得混合物。
如本文所用，“基本上由……组成”限制本发明的范围至指定的材料或步骤以及不会实质性影响要求保护的发明的基本的新颖特征的那些材料或步骤。
在一个实施方案中，术语“约”指与所述数值有1-10％的差异(variance)，或在另一个实施方案中，5-15％的差异，或在另一个实施方案中，至多10％的差异，或在另一个实施方案中，至多25％的差异，除非上下文指明差异不应导致数值超过100％。
在本发明的某些实施方案中，“重量”指“干重”。在其他实施方案中，“重量”指总重量。
在一些实施方案中，术语“包含”或其语法形式指包含本发明的所示成分，并包含其他活性剂以及药学上可接受的载体、赋形剂、润滑剂(emollients)、稳定剂等，如在制药业中公知的。
在一个实施方案中，本发明提供了组合的制备物(combined preparations)。在一个实施方案中，术语“组合的制备物”尤其定义为“试剂盒(kit of parts)”，表示如上定义的组合的部分可以单独或以不同组合(即同时地、并发地、单独地或顺序地)使用。
在一些实施方案中，本发明的组合物将基本上由本文所述的组分组成，以本文所述的任何形式或实施方案。在一些实施方案中，术语“包含”指包含本文所述的所示成分，如本发明的rBBI和治疗性肽或治疗性蛋白，以及包含其他活性剂和药学上可接受的载体、赋形剂、润滑剂、稳定剂等，如在制药业中公知的。在一些实施方案中，术语“基本上由……组成”指一种组合物，其仅有的活性成分是本发明的所示治疗性肽或治疗性蛋白和rBBI，但可以包含用于制剂稳定、保存等但不直接涉及所示活性成分的治疗效果的其他化合物，并且可以包含其他蛋白酶抑制剂，但是，已知包含的rBBI是该组合物中提高本发明治疗性肽或治疗性蛋白的长期、持续活性的重要成分。在一些实施方案中，术语“基本上由……组成”指一种组合物，其具有相当的作用模式或相当的分子靶标的仅有的活性成分是所示的活性成分，但是可以掺入其他活性成分，这种第二活性成分作用于不同靶标，或具有姑息能力且同样代表了本发明的治疗性肽或治疗性蛋白，并且这种组合物如所述仍将进一步包含rBBI。在一些实施方案中，术语“基本上由……组成”可以指除了如本文所述的提高本发明的治疗性肽或治疗性蛋白的持续递送/防止降解等的rBBI之外，还指促进活性成分的释放的组分。在一些实施方案中，术语“由……组成”指一种组合物，其含有如本文所述的作为仅有活性成分的本发明的治疗性肽或治疗性蛋白、rBBI和药学上可接受的载体或赋形剂。
虽然已经在本文中阐明和描述了本发明的某些特征，但本领域普通技术人员会想到许多修饰、取代、改变和等同物。因此，应当理解，所附权利要求旨在涵盖落入本发明的真实精神内的所有这些修饰和改变。
本领域技术人员理解，可以进行形式和细节上的各种改变，而不脱离所附权利要求所述的本发明的精神和范围。本领域技术人员将想到或仅使用常规实验就能够确定本文所述的发明的具体实施方案的许多等同方案。这些等同方案包含在权利要求的范围内。
本文提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用以其全文并入本文，如同明确地单独指明通过引用并入每个单独的出版物或专利。在本说明书与引用文献有冲突的情况下，以本说明书为准。在本文中给出数值范围之处，端点包括在该范围内。此外，应当理解，除非另有指明或另从上下文和本领域普通技术人员的理解可见，否则以范围表示的数值可采用所示范围内的任何具体数值或子范围，且在本发明的不同实施方案中，任选地包括或排除一个端值或两个端值，至该范围下限单位的十分之一，除非上下文另有明确指示。当所描述的一个百分比涉及的数值单位自身为整数时，任何所得分数都可以四舍五入为最接近的整数。
在权利要求中，诸如“a”、“an”和“the”的冠词意指一个或多于一个，除非另有相反指示或另从上下文可见。认为在组成员之间包括“或”或“和/或”的权利要求和说明书满足一个或多于一个或所有的组成员均存在于、被应用于、或涉及于一个给定产品或方法，除非另有相反指示或另从上下文可见。本发明包含其中组的仅一个成员存在于、被应用于、或涉及于一个给定产品或方法的实施方案。本发明还包含其中组的多于一个或全部成员存在于、被应用于、或涉及于一个给定产品或方法的实施方案。此外，应当理解，本发明在各种实施方案中均提供了所有的变化、组合和排列，其中来自一个或多个所列权利要求的一个或多个限定、元件、从句、描述性用语等被引入依赖于同一基本权利要求的另一个权利要求中，除非另有所指或除非对于本领域普通技术人员显而易见地将产生矛盾或不一致。当元件显示为列表，例如以马库什组的格式等等，应当理解为元件的每个子组也被公开，并且可以将任何元件从组中移出。
应当理解，通常，当本发明或本发明的方面被称为包含特定的元件、特征等时，本发明的某些实施方案或本发明的方面由或基本上由这些元件、特征等组成。为了简单起见，并未在每种情况下在本文中具体描述那些实施方案。为方便起见，某些权利要求以从属形式展现，但是申请人保留以独立格式改写任何从属权利要求的权利，以包含独立权利要求和这些权利要求依赖的任何其他权利要求的元件或限定，并且这些改写的权利要求在被改写成独立格式之前被认为在所有方面均等同于从属权利要求而无论其形式如何(修改或未修改)。
以下实施例描述了本发明的一些实施方案，并且不应被解释为以任何方式限制本发明所涵盖的范围。
实验细节部分
实施例1：重组BBI的产生
材料和方法
用于重组Bowman-Birk型蛋白酶抑制剂(rBBI)表达的基因经密码子优化，并合成于巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)系统中。用于BBI分泌表达的质粒是在宿主巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中表达的pPIC9K毕赤酵母表达载体(Invitrogen)。将经偏好化且优化的BBI DNA序列克隆在pPIC9K质粒中与酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)α-交配因子前序列(presequence,删除STE13切割位点)同框，以获得表达分泌BBI的克隆。
经巴斯德毕赤酵母宿主优化的BBI核酸序列如下：
Figure BDA0002776284770000301
分离自大豆(Glycine max，soybean)的BBI的氨基酸序列UniProtKB-P01055(IBB1_SOYBN)(110aa)如下：
Figure BDA0002776284770000302
粗体代表起始密码子，下划线代表信号肽，斜体部分代表前肽。常规字体的残基名称对应于E00124链，其序列针对毕赤酵母表达而进行了基因偏好化和优化，并且优化基因序列的计算机翻译产生与SEQ ID NO:2相同的序列。
将两个终止密码子添加到最终DNA序列的3’末端(SEQ ID NO:1中为带下划线的斜粗字体)。将经偏好化且优化的BBI DNA序列克隆在pPIC9K质粒中与酿酒酵母α-交配因子前序列(删除STE13切割位点)同框，以获得表达分泌BBI的克隆。然后通过测序重新表征重组构建体。
通过标准方法完成重组产物的表达。简而言之，将毕赤酵母在YPD培养基中于30℃振荡培养至OD600为0.8至1.0，随后对细胞进行收获、洗涤和悬浮，并洗涤在100mM LiCl中，然后转化。使用标准的转化方案。简而言之，随后洗涤LiCl-细胞溶液并将其重悬于50％PEG-4000溶液中，该溶液含有在无菌水中的1M LiCl单链片段化鲑鱼精DNA和质粒DNA(5-10μg；100-200ng/μl)。将细胞在30℃孵育30分钟，然后在42℃热激20-25分钟，随后洗涤细胞并将其重悬于YPD培养基中，在30℃下孵育，然后铺于YNB-His选择性平板上并在30℃下进一步孵育2-3天。
对约1000个推定的克隆进行筛选以获得高产克隆。放大约5-6个克隆，用于200ml、1L和5L发酵批次优化工艺。来自克隆B17的经纯化的分泌rBBI蛋白使用MALDI-TOF-MS进行N-末端和C-末端测序，观察到的N-末端和C-末端序列与预期相同。质谱数据确认了观察到的物质与预期物质相同，同质性为99％。因此，从克隆B17加工的rBBI是完整的，没有缺失或添加来自信号肽的任何额外残基。因此，选择克隆B17作为潜在的高产克隆，并进一步将其放大。
实施例2：重组BBI产物的表征
进一步研究了B17克隆在200ml、5L和50L规模下的表达、纯化和物质产生，并使用不同的分析方法对纯化蛋白进行表征。
通过标准方法进行RP-HPLC分析，结果如图1所示，该图示出了RP-HPLC分析和与可用标准的叠加。最终的纯化rBBI显示了与标准纯化BBI中观察到的相同的保留时间。
从纯化的rBBI制备冻干粉，并使用标准方法评估总蛋白含量的BCA定量(图2)，并且还原和非还原条件下15％凝胶的SDS-PAGE分析以及考马斯亮蓝染色证实了蛋白大小(图3)。
验证了重组产物的蛋白酶抑制剂酶活性，并且实现了胰凝乳蛋白酶活性的显而易见的抑制(图4)以及胰蛋白酶活性的抑制(图5)。令人惊讶地，这些实验的结果证明，相比于自大豆纯化的SBTI，使用重组蛋白时对酶活性的抑制远远更大。
实施例3：重组蛋白酶抑制剂产生了令人惊讶的功效
材料和方法
用异氟醚(2L/分钟O2和3-5％异氟醚)麻醉禁食的3-4月龄、体重25-30kg的非SPF的商购猪(获自Ibelin Farm(Israel)(n＝8))，加标签以便于识别和插管。可无限制地使用水。将动物左侧身放置，并且在内窥镜指导下通过内窥镜导管将制剂直接施用到十二指肠中。这项研究是获得以色列卫生部动物实验委员会(Israeli Council of AnimalExperimentation,Ministry of Health)的批准后进行的(方案号：IL-16-11-400)。
在注射1ml测试制剂后，注射150-180ml空气，以确保将制剂递送至十二指肠。在以下时间点从中央静脉导管(在实验第一天插入并根据需要更换)中抽取血液：施用前15分钟和施用紧前，施用后长达3小时内每15分钟，和施用后3:20、3:40、4:00和4:30。一小部分(5μl)血液样品用血糖仪测定葡萄糖浓度。当读数<10mg/dL时，再次测试样品，并显示两个读数的平均值。处理之间施行至少两天的清除期。
所实施的测试条件为，150mg EDTA、8mg胰岛素和如上文所述生产的纯化重组BBI或如PCT国际申请公开号WO/2013/114369中所述自从大豆粉提取的纯化SBTI纯化的BBI。
测试条件如下表1所述，每个测试项在4只不同的猪中进行测试：
Figure BDA0002776284770000321
所有测试项均制备于1mL鱼油中，并冷藏保存。使用前，将样品升至室温，并在施用前彻底混合。
数据分析包括以时间的函数来评价循环葡萄糖水平。
在研究期间观察动物，且在这个研究期间未观察到异常的临床观察结果，动物体重在整个研究中保持稳定。
结果：
尽管所有制剂均出现循环葡萄糖水平的降低(图6)，但重组BBI的使用却令人惊讶地一致出现了持续一段时间的较低葡萄糖水平。
如先前所示，含有SBTI的制剂在30分钟内使循环葡萄糖水平从50mg/dl降低至约35mg/dl，但在施用后不到三小时循环水平已基本上恢复至基线水平，并且恢复至基线水平是逐渐的，早在接受口服给药后一小时即开始。
非常令人惊讶的是，所有提供重组BBI的组均显示了循环水平更快速且定性上更大幅地下降至约20mg/dl，并且这种效果在施用后持续至少2小时，此后也可见逐渐增加，然而，给予100mg重组BBI(rBBI)和25mg KTI的动物经过4小时仍未恢复至基线，并且仅给予100mg rBBI的动物直到施用后经过超过3.5小时才恢复到基线。令人惊讶的是，仅施用50mgrBBI和KTI的动物直到施用后经过超过3小时才恢复至基线。
因此，结果令人惊讶的证实，与含有纯化的BBI的组合物相比，rBBI在降低循环葡萄糖水平上更有效，并且该优异效果可长期持续。
实施例4：重组蛋白酶抑制剂随时间提供了令人惊讶的功效
材料和方法
用异氟醚(2L/分钟O2和3-5％异氟醚)麻醉禁食的3-4月龄、体重25-30kg的非SPF的商购猪(获自Ibelin Farm(Israel)(n＝8))，加标签以便于识别和插管。可无限制地使用水。将动物左侧身放置，并且在内窥镜指导下通过内窥镜导管将制剂直接施用到十二指肠中。这项研究是获得以色列卫生部动物实验委员会(Israeli Council of AnimalExperimentation,Ministry of Health)的批准后进行的(方案号：IL-16-11-400)。
在注射1ml测试制剂后，注射150-180ml空气，以确保将制剂递送至十二指肠。在以下时间点从中央静脉导管(在实验第一天插入并根据需要更换)中抽取血液：施用前15分钟和施用紧前，按剂量施用后长达3小时内每15分钟，和施用后3:20、3:40、4:00、4:30和5小时。一小部分(5μl)血液样品用血糖仪测定葡萄糖浓度。当读数<10mg/dL时，再次测试样品，并显示两个读数的平均值。处理之间施行至少两天的清除期。
所实施的测试条件为，150mg EDTA和4mg胰岛素以及如上文所述生产的增加量的重组BBI。
测试条件如下表2所述，每个测试项在7-8只不同的猪中进行8-10次测试：
表2：处理方案
Figure BDA0002776284770000331
Figure BDA0002776284770000341
所有测试项目均制备于1mL鱼油中，并冷藏保存。使用前，将样品升至室温，并在施用前彻底混合。
针对每轮处理，进行数据分析，包括评价相比基线的变化以及相比基线葡萄糖曲线下面积(AUC)的变化百分比。另外，还测定了每个处理环节葡萄糖读数从第一次下降到第一次上升的时间。
在研究期间观察动物，且在这个研究期间未观察到异常的临床观察结果，动物体重在整个研究中保持稳定。
结果：
实施例3证实，rBBI提供了增强的血糖控制，当蛋白酶抑制剂是重组BBI时，在口服施用8mg胰岛素的受试者中循环葡萄糖水平有更大的下降，相比于化学纯化的BBI。为了进一步阐明rBBI的效果并扩展结果，进行rBBI优化并且随时间评估效果。为此，对仅含有4mg胰岛素但含有12.5、25、50和75mg rBBI的口服制剂进行了类似评价。表3提供了这些研究的结果：
表3：rBBI的血糖控制
Figure BDA0002776284770000342
Figure BDA0002776284770000351
相比于基线葡萄糖比率AUCs的最大降低是以25mg rBBI配制的ORMD-0801处理后的组，随后是含有75mgrBBI的制剂。当比较动物对用含有蛋白酶抑制剂的制剂处理的反应和对不含蛋白酶抑制剂的对照处理的反应时，同样是含有25mg rBBI制剂产生了相比于基线AUC的最大变化，随后是含有75mg rBBI的制剂(分别为-6,369和-4,640)，并且含有25mgrBBI制剂具有相应的相比于对照环节AUC计算值的最大变化，随后是含有75mg rBBI的制剂(分别为-4,989和-2,960)。
就效果的可持续性而言，相当令人惊讶的是，含有rBBI的制剂提供了延长的效果，从测试受试者中葡萄糖下降的第一个信号到其朝基线值恢复的第一个信号之间有平均140分钟的时长。这个效果比对照动物中测量的持续时间效果长75％。
因此，令人惊讶且出乎意料的是，尽管来自纯化学提取手段的BBI或重组表达蛋白的化学纯化的BBI的下游纯化步骤基本上相同，但当BBI的原料是rBBI时，在这些研究中发现了更持久的抑制剂活性。
因此，相当出乎意料的是，重组BBI作为单一蛋白酶抑制剂足以产生可持续的和定性更高的血糖控制。
序列表
<110> 奥拉姆德有限公司(Oramed, LTD.)
<120> 含有重组蛋白酶抑制剂的组合物及其生产方法和用途
<130> ORAMED20940PC
<150> 62/683,061
<151> 2018-06-11
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 219
<212> DNA
<213> 巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）
<400> 1
gatgacgaaa gctctaagcc atgctgcgat cagtgtgctt gtaccaagtc caacccacca 60
cagtgtagat gctccgacat gcgtttgaac tcctgtcact ccgcttgcaa gtcctgtatc 120
tgtgccttgt cctacccagc tcagtgtttc tgcgtcgaca tcaccgactt ctgctacgag 180
ccatgtaagc catctgagga cgataaggaa aactaataa 219
<210> 2
<211> 110
<212> PRT
<213> 大豆（Glycine max）
<400> 2
Met Val Val Leu Lys Val Cys Leu Val Leu Leu Phe Leu Val Gly Gly
1 5 10 15
Thr Thr Ser Ala Asn Leu Arg Leu Ser Lys Leu Gly Leu Leu Met Lys
20 25 30
Ser Asp His Gln His Ser Asn Asp Asp Glu Ser Ser Lys Pro Cys Cys
35 40 45
Asp Gln Cys Ala Cys Thr Lys Ser Asn Pro Pro Gln Cys Arg Cys Ser
50 55 60
Asp Met Arg Leu Asn Ser Cys His Ser Ala Cys Lys Ser Cys Ile Cys
65 70 75 80
Ala Leu Ser Tyr Pro Ala Gln Cys Phe Cys Val Asp Ile Thr Asp Phe
85 90 95
Cys Tyr Glu Pro Cys Lys Pro Ser Glu Asp Asp Lys Glu Asn
100 105 110
<210> 3
<211> 100
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 代表性序列
<400> 3
Met Lys Met Ser Arg Leu Cys Leu Ser Val Ala Leu Leu Val Leu Leu
1 5 10 15
Gly Thr Leu Ala Ala Ser Thr Pro Gly Cys Asp Thr Ser Asn Gln Ala
20 25 30
Lys Ala Gln Arg Pro Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Tyr Thr Gly Pro
35 40 45
Cys Lys Ala Arg Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asn Ala Lys Ala Gly Leu
50 55 60
Cys Gln Thr Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Lys Arg Asn Asn Phe
65 70 75 80
Lys Ser Ala Glu Asp Cys Met Arg Thr Cys Gly Gly Ala Ile Gly Pro
85 90 95
Trp Glu Asn Leu
100

Claims (77)

1.一种口服药物组合物，其包含高达100千道尔顿的治疗性肽或治疗性蛋白、二价阳离子螯合剂和分离的重组表达的Bowman-Birk抑制剂(BBI)。
2.如权利要求1所述的口服药物组合物，其中所述重组表达的BBI具有与SEQ ID NO:1中所示核苷酸序列有至少95％同一性的核苷酸序列。
3.如权利要求1所述的口服药物组合物，其中所述重组表达的BBI具有与SEQ ID NO:1中所示核苷酸序列有至少97％同一性的核苷酸序列。
4.如权利要求1所述的口服药物组合物，其中所述重组表达的BBI具有与SEQ ID NO:1中所示核苷酸序列有至少99％同一性的核苷酸序列。
5.如权利要求1所述的口服药物组合物，其中所述重组表达的BBI具有SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列。
6.如权利要求1所述的口服药物组合物，其中所述重组表达的BBI在酵母表达系统中表达。
7.如权利要求6所述的口服药物组合物，其中所述酵母表达系统是巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。
8.如权利要求1所述的口服药物组合物，其中所述制剂进一步包含除所述BBI以外的胰蛋白酶抑制剂。
9.如权利要求8所述的口服药物组合物，其中所述胰蛋白酶抑制剂是KTI3。
10.如权利要求9所述的口服药物组合物，其中所述KTI3已被化学分离并纯化至通过SDS-PAGE测得的纯度是至少85％，或者其中所述KTI3已被纯化至通过BCA测定测得的蛋白含量大于95％。
11.如权利要求9所述的口服药物组合物，其中所述KTI3已被重组表达。
12.如权利要求1至11任一项所述的口服药物组合物，其中所述治疗性蛋白可用于治疗患有代谢性疾病或病症的受试者。
13.如权利要求1至11任一项所述的口服药物组合物，其中所述治疗性肽或治疗性蛋白选自由以下组成的组：胰岛素、流感血凝素、流感神经氨酸酶、胰高血糖素、干扰素γ、干扰素β、干扰素α、生长激素、促红细胞生成素、GLP-1、GLP-1类似物、瘦素、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、肾素、生长激素释放因子、甲状旁腺激素、促甲状腺激素、促卵泡激素、降钙素、促黄体激素、胰高血糖素、凝血因子、抗凝血因子、心钠素、表面活性蛋白A(SP-A)、表面活性蛋白B(SP-B)、表面活性蛋白C(SP-C)、表面活性蛋白D(SP-D)、纤溶酶原激活剂、铃蟾肽、造血生长因子(集落刺激因子，多种)、肿瘤坏死因子(TNF)蛋白、脑啡肽酶、RANTES(调节激活正常T细胞表达和分泌细胞因子)、人巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1-α)、血清白蛋白、苗勒抑制物质、松弛素、小鼠促性腺素释放激素、DNase、抑制素、激活素、血管内皮生长因子(VEGF)、神经营养因子、神经营养蛋白-3、-4、-5或-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)、神经生长因子、血小板衍生生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子、神经生长因子、转化生长因子(TGF)、胰岛素样生长因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)、des(1-3)-IGF-1(脑IGF-1)、胰岛素样生长因子结合蛋白1(IGFBP-1)、IGFBP-2、IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-5、IGFBP-6、角质形成细胞生长因子、骨诱导因子、骨形态发生蛋白(BMP)-2、BMP-4、BMP-7、集落刺激因子(CSF)、白细胞介素(IL)、超氧化物歧化酶、衰变加速因子、趋化因子家族成员和补体因子。
14.如权利要求13所述的口服药物组合物，其中所述治疗性肽或治疗性蛋白选自由胰岛素和GLP-1类似物组成的组。
15.如权利要求13所述的口服药物组合物，其中所述治疗性肽或治疗性蛋白是免疫调节物。
16.如权利要求15所述的口服药物组合物，其中所述治疗性肽或治疗性蛋白是醋酸格拉替雷。
17.如权利要求1至16任一项所述的口服药物组合物，其中所述螯合剂是EDTA。
18.如权利要求1至17任一项所述的口服药物组合物，其中所述制剂是基于油的液体制剂。
19.如权利要求18所述的口服药物组合物，其进一步包含单甘油酯、二甘油酯、三甘油酯或其混合物的聚乙二醇(PEG)酯。
20.如权利要求19所述的口服药物组合物，其中所述PEG酯作为以下的混合物提供：(a)单酰基甘油、二酰基甘油、三酰基甘油或其混合物；和(b)脂肪酸的聚乙二醇(PEG)酯。
21.如权利要求20所述的口服药物组合物，其中所述混合物的(a)部分包含C8-C18单酰基甘油、二酰基甘油和三酰基甘油。
22.如权利要求20所述的口服药物组合物，其中所述混合物的(b)部分包含在遗传学上结合有多肽标签的C8-C18脂肪酸混合物的PEG单酯和二酯，或其组合。
23.如权利要求20所述的口服药物组合物，其中所述混合物的(a)部分包含C8-C18单酰基甘油、二酰基甘油和三酰基甘油；所述混合物的(b)部分包含C8-C18脂肪酸混合物的PEG-32单酯和二酯；所述基于油的液体制剂进一步包含(c)游离的PEG-32；并且所述混合物的(a)部分与所述混合物的(b)和(c)部分之和的重量/重量比在10:90和30:70之间，包含端值。
24.如权利要求23所述的口服药物组合物，其中(a)、(b)和(c)共占所述基于油的液体制剂的8-16％重量/重量，包括端值。
25.如权利要求18所述的口服药物组合物，其中所述基于油的液体制剂进一步包含游离的PEG。
26.如权利要求1至17任一项所述的口服药物组合物，其中所述制剂包含明胶和甘油。
27.如权利要求18至26任一项所述的口服药物组合物，其进一步包含非离子型洗涤剂。
28.如权利要求27所述的口服药物组合物，其中所述非离子型洗涤剂是基于聚山梨酸酯的洗涤剂。
29.如权利要求28所述的口服药物组合物，其中所述基于聚山梨酸酯的洗涤剂是聚山梨酸酯80。
30.如权利要求29所述的口服药物组合物，其中所述聚山梨酸酯80占所述基于油的液体制剂的3-10％重量/重量，包含端值。
31.如权利要求1至30任一项所述的口服药物组合物，其中所述油是鱼油。
32.如权利要求1至31任一项所述的口服药物组合物，其中所述基于油的液体制剂是无水的。
33.如权利要求1至32任一项所述的口服药物组合物，其进一步包含抵抗胃中降解的包衣。
34.如权利要求33所述的口服药物组合物，其中所述包衣是pH敏感的胶囊。
35.如权利要求33所述的口服药物组合物，其中所述包衣是软胶囊。
36.如权利要求1至35任一项所述的口服药物组合物，用于向受试者口服施用治疗性蛋白。
37.权利要求36所述的口服药物组合物，其中所述口服药物组合物防止所述受试者中所述治疗性肽或治疗性蛋白的快速降解。
38.权利要求36所述口服药物组合物，其中所述口服药物组合物提高所述受试者中口服施用的治疗性肽或治疗性蛋白的持续活性，或其中所述口服药物组合物提高所述受试者中口服施用的治疗性肽或治疗性蛋白的持续生物利用度。
39.权利要求38所述的口服药物组合物，其中所述口服施用的治疗性肽或治疗性蛋白的所述持续活性或所述持续生物利用度超过在使用包含化学纯化的BBI而不是所述分离的重组表达BBI而其他方面相同的口服制剂后获得的持续活性或持续生物利用度。
40.权利要求36所述的口服药物组合物，其中所述用途提供治疗有效量的所述肽或蛋白，并且其中提供在所述制剂中所述BBI、或所述高达100千道尔顿的治疗性肽或治疗性蛋白、或其组合的浓度低于包含化学纯化的BBI而不是所述分离的重组表达BBI而其他方面相同的口服制剂的治疗有效浓度，并且所述用途在所述受试者中达到相当的治疗效果。
41.一种向受试者口服施用治疗性肽或治疗性蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：向受试者施用如权利要求1至35任一项所述的口服药物组合物，由此向受试者口服施用治疗性蛋白。
42.一种防止受试者中口服施用的治疗性肽或治疗性蛋白降解的方法，所述方法包括向受试者施用如权利要求1至35任一项所述的口服药物组合物的步骤。
43.一种提高受试者中口服施用的治疗性肽或治疗性蛋白的持续活性的方法，所述方法包括向受试者施用如权利要求1至35任一项所述的口服药物组合物的步骤。
44.一种提高受试者中口服施用的治疗性肽或治疗性蛋白的持续生物利用度的方法，所述方法包括向受试者施用如权利要求1至35任一项所述的口服药物组合物的步骤。
45.一种向受试者提供口服制剂中治疗有效量的肽或蛋白的方法，所述方法包括制备口服药物组合物，所述口服药物组合物包含高达100千道尔顿的治疗性肽或治疗性蛋白、二价阳离子螯合剂和分离的重组表达的Bowman-Birk抑制剂(BBI)，其中提供在所述制剂的所述BBI、所述高达100千道尔顿的治疗性肽或治疗性蛋白或其组合的浓度低于包含化学纯化的BBI而不是所述分离的重组表达的BBI而其他方面相同并且在所述受试者中达到相当的治疗效果的口服制剂中的治疗有效浓度。
46.如权利要求45所述的方法，其中所述重组表达的BBI具有与SEQ ID NO:1中所示核苷酸序列有至少95-99％同一性的核苷酸序列。
47.如权利要求45所述的方法，其中所述重组表达的BBI具有SEQ ID NO：1中所示的核苷酸序列。
48.如权利要求45所述的方法，其中所述重组表达的BBI在酵母表达系统中表达。
49.如权利要求48所述的方法，其中所述酵母表达系统是巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)。
50.如权利要求45所述的方法，其中所述制剂进一步包含除所述BBI以外的胰蛋白酶抑制剂。
51.如权利要求50所述的方法，其中所述胰蛋白酶抑制剂是KTI3。
52.如权利要求51所述的方法，其中所述KTI3已被化学分离并纯化至通过SDS-PAGE测得的纯度是至少85％，或者其中所述KTI3已被纯化至通过BCA测定测得的蛋白含量大于95％。
53.如权利要求51所述的方法，其中所述KTI3已被重组表达。
54.如权利要求45至53任一项所述的方法，其中所述治疗性蛋白用于治疗患有代谢性疾病或病症的受试者。
55.如权利要求45至54任一项所述的方法，其中所述治疗性肽或治疗性蛋白选自由以下组成的组：胰岛素、流感血凝素、流感神经氨酸酶、胰高血糖素、干扰素γ、干扰素β、干扰素α、生长激素、促红细胞生成素、GLP-1、GLP-1类似物、瘦素、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、肾素、生长激素释放因子、甲状旁腺激素、促甲状腺激素、促卵泡激素、降钙素、促黄体激素、胰高血糖素、凝血因子、抗凝血因子、心钠素、表面活性蛋白A(SP-A)、表面活性蛋白B(SP-B)、表面活性蛋白C(SP-C)、表面活性蛋白D(SP-D)、纤溶酶原激活剂、铃蟾肽、造血生长因子(集落刺激因子，多种)、肿瘤坏死因子(TNF)蛋白、脑啡肽酶、RANTES(调节激活正常T细胞表达和分泌细胞因子)、人巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1-α)、血清白蛋白、苗勒抑制物质、松弛素、小鼠促性腺素释放激素、DNase、抑制素、激活素、血管内皮生长因子(VEGF)、神经营养因子、神经营养蛋白-3、-4、-5或-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)、神经生长因子、血小板衍生生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子、神经生长因子、转化生长因子(TGF)、胰岛素样生长因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)、des(1-3)-IGF-1(脑IGF-1)、胰岛素样生长因子结合蛋白1(IGFBP-1)、IGFBP-2、IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-5、IGFBP-6、角质形成细胞生长因子、骨诱导因子、骨形态发生蛋白(BMP)-2、BMP-4、BMP-7、集落刺激因子(CSF)、白细胞介素(IL)、超氧化物歧化酶、衰变加速因子、趋化因子家族成员和补体因子。
56.如权利要求56所述的方法，其中所述治疗性肽或治疗性蛋白选自由胰岛素和GFP-1类似物组成的组。
57.如权利要求56所述的方法，其中所述治疗性肽或治疗性蛋白是免疫调节物。
58.如权利要求57所述的方法，其中所述治疗性肽或治疗性蛋白是醋酸格拉替雷。
59.如权利要求45至58任一项所述的方法，其中所述螯合剂是EDTA。
60.如权利要求45至59任一项所述的方法，其中所述制剂是基于油的液体制剂。
61.如权利要求60所述的方法，其进一步包含单甘油酯、二甘油酯、酸甘油酯或其混合物的聚乙二醇(PEG)酯。
62.如权利要求61所述的方法，其中所述PEG酯作为以下的混合物提供：(a)单酰基甘油、二酰基甘油、三酰基甘油或其混合物；和(b)脂肪酸的聚乙二醇(PEG)酯。
63.如权利要求62所述的方法，其中所述混合物的(a)部分包含C8-C18单酰基甘油、二酰基甘油和三酰基甘油。
64.如权利要求63所述的方法，其中所述混合物的(b)部分包含在遗传学上结合有多肽标签的C8-C18脂肪酸混合物的PEG单酯和二酯，或其组合。
65.如权利要求63所述的方法，其中所述混合物的(a)部分包含C8-C18单酰基甘油、二酰基甘油和三酰基甘油；所述混合物的(b)部分包含C8-C18脂肪酸混合物的PEG-32单酯和二酯；所述基于油的液体制剂进一步包含(c)游离的PEG-32；并且所述混合物的(a)部分与所述混合物的(b)和(c)部分之和的重量/重量比在10:90和30:70之间，包含端值。
66.如权利要求65所述的方法，其中(a)、(b)和(c)共占所述基于油的液体制剂的8-16％重量/重量，包含端值。
67.如权利要求60所述的方法，其中所述基于油的液体制剂进一步包含游离的PEG。
68.如权利要求60至67任一项所述的方法，其中所述制剂包含明胶和甘油。
69.如权利要求45至68任一项所述的方法，其进一步包含非离子型洗涤剂。
70.如权利要求69所述的方法，其中所述非离子型洗涤剂是基于聚山梨酸酯的洗涤剂。
71.如权利要求70所述的方法，其中所述基于聚山梨酸酯的洗涤剂是聚山梨酸酯80。
72.如权利要求71所述的方法，其中所述聚山梨酸酯80占所述基于油的液体制剂的3-10％重量/重量，包含端值。
73.如权利要求45至72任一项所述的方法，其中所述油是鱼油。
74.如权利要求60至73任一项所述的方法，其中所述基于油的液体制剂是无水的。
75.如权利要求45至74任一项所述的方法，其进一步包含抵抗胃中降解的包衣。
76.如权利要求75所述的方法，其中所述包衣是pH敏感的胶囊。
77.如权利要求75所述的方法，其中所述包衣是软胶囊。
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