CN112430598A - 一种dna编码化合物库的活细胞膜蛋白筛选方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种针对活细胞膜蛋白进行DNA编码化合物库筛选的方法。本发明的方法适用于在蛋白难以纯化、蛋白纯化后发生改变、或需要在活细胞维持特殊构象的条件下进行的DNA编码化合物库筛选。

Description

一种DNA编码化合物库的活细胞膜蛋白筛选方法
技术领域
本发明属于药物筛选领域，具体涉及一种DNA编码化合物库基于活细胞膜蛋白的筛选方法。
背景技术
在新药研发领域，针对生物靶标的高通量筛选是快速获得先导化合物的主要手段之一。然而，基于单个分子的传统高通量筛选所需时间长、设备投入巨大、库化合物数量有限(数百万)，且化合物库的建成需要数十年的积累，限制了先导化合物的发现效率与可能性。近年来出现的DNA编码化合物库技术(WO2005058479、WO2018166532、CN103882532)，结合了组合化学和分子生物学技术，在分子水平上将每个化合物加上一个DNA标签，能在极短的时间内合成高达亿级的化合物库，而且化合物能够通过基因测序的方法进行识别，大幅度地增加了化合物库的大小和合成效率，成为下一代化合物库筛选技术的趋势。DNA编码化合物库技术正开始在制药行业广泛应用，并产生了诸多积极的效果(Accounts ofChemical Research,2014,47,1247-1255)。
传统的DNA编码化合物库筛选主要应用于纯化后的蛋白靶标，通常需要将靶标蛋白进行固定，然而由于某些靶标蛋白难以纯化，或纯化后构象发生改变，从而限制了DNA编码化合物库的应用范围。G蛋白偶联受体(GPCRs)是一类调节关键生理过程的蛋白，长期以来一直是有吸引力的药物靶点。GPCR是一类具有七次跨膜结构的蛋白受体，其膜蛋白表达纯化困难，并且纯化后的蛋白较难模拟其在细胞膜上的构象。因此开发出一种能够直接在活细胞膜蛋白上进行的筛选方法，能够扩大DNA编码化合物库可筛选靶标的范围，进一步提升DNA编码化合物库技术的应用价值。
发明内容
本发明公开了一种DNA编码化合物库的活细胞膜蛋白筛选方法，包括以下步骤：
a.将外源基因过表达至活细胞；
b.细胞培养，检测靶标蛋白在细胞膜上的表达量；
c.用筛选平衡液处理细胞后，将DNA编码化合物库与细胞孵育，然后清洗、解离。
进一步地，步骤a中所述外源基因为质粒或病毒。
进一步地，步骤a中所述过表达的方法为稳定转染或瞬时转染。
更进一步地，转染方法包括聚乙烯亚胺转染法、阳离子脂质体转染法、磷酸钙转染法、纳米颗粒转染、电穿孔转染法、病毒转染法以及其它能够将外源基因转运至活细胞内的方法。其中病毒转染法包括如腺病毒、慢病毒及人BacMam病毒等能够将外源基因转运至活细胞内的病毒转染法。
进一步具体地，所述聚乙烯亚胺转染法为：将10～100μg质粒、50～200μg聚乙烯亚胺加入到1～4×107的活细胞中，并孵育2～6小时。优选地，将50μg质粒、100μg聚乙烯亚胺加入到2×107的活细胞中，孵育时间为4小时。
进一步地，步骤b中细胞培养使用的培养基含有
Figure BDA0002648301110000021
F-68、L-谷氨酰胺和青链霉素。更进一步地，PF-68的浓度为0.01～0.2％、L-谷氨酰胺的浓度为1～20mM、青链霉素的浓度为0.1～5％。优选地，PF-68的浓度为0.05％、L-谷氨酰胺的浓度为2mM、青链霉素的浓度为1％。
进一步地，步骤b中利用靶标蛋白对应的阳性小肽配体通过流式检测靶标蛋白在细胞膜上的表达量。更进一步地，检测方法为取细胞1*106个，PBS洗涤细胞一次，加入阳性小肽配体在四维涡旋仪上孵育30分钟，PBS洗3次，进行流式检测。
进一步地，步骤b中细胞培养后，细胞膜上靶标蛋白的表达量达到平均每个细胞上10,000至25,000个。
进一步地，步骤c中平衡细胞和孵育的缓冲液含有鲑鱼精DNA。进一步地，鲑鱼精DNA的浓度为0.1～2mg/mL。优选地，缓冲液含有1mg/mL鲑鱼精DNA。
进一步地，步骤c中DNA编码化合物库中DNA编码化合物的总数量为2×1015～2×1016个，细胞总数量为2×107～108个。
进一步地，步骤c中孵育的时间为0.5～4小时，孵育的温度为4～30℃。优选地，孵育时间为1小时。
进一步地，步骤c中清洗为使用缓冲液清洗细胞2～5次。
进一步地，步骤c中解离为加热至90～100℃并维持10～30分钟，10000～15000rpm下离心将细胞碎片沉淀分离。优选地，加热温度为95℃，维持时间为20分钟，离心速率为13000rpm。
进一步地，在步骤c之后，取步骤c得到的上清液，通过qPCR定量DNA编码化合物数量，如果数量大于108，则将步骤c中的DNA编码化合物库替换为该上清，并重复步骤a到c，直到qPCR定量DNA编码化合物总数量为106～107。
本发明中所述的外源基因在细胞中可表达成靶标膜蛋白。在本发明的具体实施方案中，所述靶标膜蛋白为葡萄糖依赖性促胰岛素多肽受体(GIPR)蛋白。
本发明中
Figure BDA0002648301110000031
F-68是一种聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物，是泊洛沙姆的一种。
本发明方法以活细胞为载体，通过过表达膜蛋白进行亲和筛选，能够找到与膜蛋白具有亲和作用的DNA编码化合物，可后续通过对DNA标签进行扩增、测序、解析，从而获得具有亲和作用的化合物的具体结构。
本发明方法利用瞬时转染或稳定转染高表达细胞株，能够保持膜蛋白的原有结构和功能，从而使筛选的结果更加准确。
本发明方法通过控制细胞膜上膜蛋白的表达量，并增大筛选的细胞用量，以增加可供筛选的膜蛋白量，从而提高筛选的效率和准确度，可适用于各类膜蛋白的筛选。
本发明方法可适用于对膜蛋白过表达量较低的细胞筛选。具有较低膜蛋白过表达的细胞能够更加模拟天然细胞的状态，从而降低筛选的假阳性结果，提高筛选准确度。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步地详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1是本发明方法的流程示意图：包括准备过表达细胞；平衡液平衡细胞；细胞与化合物库孵育，使化合物与靶蛋白结合；细胞清洗，洗去未结合的化合物；细胞解离，通过高温使蛋白变性的方式，使化合物与细胞分离。
图2是本发明实施例1的qPCR结果示意图：对DNA编码的化合物库进行3轮筛选，每一轮qPCR定量结果表明经过3轮筛选以后，通过DNA定量的DNA编码化合物分子数处于约108，取二分之一进行纯化再定量，使分子总数约处于107。其中1组为对照细胞，2组为GIPR过表达细胞。
图3是本发明实施例1的测序结果示意图，显示潜在结合分子的库分布及富集强度：其中上图为对照组，下图为实验组，柱状明显升高处为可能与膜蛋白发生结合的DNA编码化合物库。
图4是本发明实施例2中化合物验证的结果示意图。功能学活性验证实施例1筛选出的代表化合物1具有拮抗作用，且拮抗作用存在浓度梯度效应，IC50值约为3.75μM。
具体实施方式
本发明实施例中所使用的DNA编码化合物库来源于成都先导药物开发股份有限公司的先导库，可按照WO2005058479、WO2018166532或CN103882532中所述的方法进行构建。本发明实施例中所使用的其它原料或试剂均可以通过商业途径购买获得。
实施例1、对GIPR受体进行DNA编码化合物库的筛选
将GIPR质粒瞬时转染至293F细胞，转染试剂为聚乙烯亚胺(PEI)，细胞用量2*107，培养基为CDM4HEK293与SMM 293-TII 1:1体积比例混合。待转染72h后，取细胞进行流式检测。
取1*106细胞/管，1000rpm离心3min，1mL PBS洗涤一次，加入100μL的100nM Cy5-GIP于四维振荡涡旋仪上孵育30min，2000rpm离心3min，200μL PBS洗三次，100μL PBS重悬细胞，进行流式检测，观察目标蛋白的表达量。
取4.5*107个细胞，1000rpm离心3min，1mL PBS洗涤一次，筛选缓冲液平衡细胞两次，第二次平衡离心前，进行细胞计数，检测细胞活率和密度。
将DNA编码化合物库加入对照组细胞和实验组细胞中，加入库后进行细胞计数，检测库加入后对于细胞活率和密度的影响，室温孵育60min后,进行细胞计数，检测库孵育后对于细胞活率和密度的影响，1000g离心3min，1mL PBS洗涤细胞3次，最后一次离心前，进行细胞计数，检测洗涤离心对细胞活率和密度的影响，350μL PBS缓冲液重悬细胞，95℃加热解离20min，13000rpm离心收集上清，进行qPCR定量。
保留上清液，将其完全投入到下一轮筛选，共进行三轮筛选，直到提取出的DNA编码化合物的数量在107数量级。取二分之一的上清进行纯化，再次进行qPCR定量，再进行PCR扩增，二代测序解码，测序分析结果如示意图3。
实施例2、筛选化合物活性验证
将筛选信号对应的化合物重新合成，使用cAMP-Glo试剂盒按照下述方法验证化合物的拮抗作用：
使用PEI转染试剂将GIPR质粒瞬时转染至293F细胞，待过表达72h后，取细胞进行化合物活性检测，用PBS洗细胞两次，然后将细胞重悬到诱导缓冲液(含500μM IBMX、100μMRo-201724的PBS)中。将4μL/孔细胞(约7500个细胞)转移到384孔板中，然后加入2.5μL相应浓度的化合物中，待化合物与细胞室温预孵1h后，加入1μL 10nM的GIP激活剂在室温孵育1h，加入7.5μL细胞裂解液裂解细胞，于摇床上(520rpm)裂解30分钟，使细胞完全裂解。在加入15μL PKA溶液在室温孵育20min，后加入30μL Kinase Glo孵育10min。在Tecan Spark20M读化学发光已检测化合物对激活剂的拮抗作用。代表化合物1效果如图4所示，数据用GraphPad Prism6软件分析作图，重复6次，结果均显示该化合物对GIPR激活剂存在拮抗作用。
本发明的方法可以对活细胞膜蛋白进行DNA编码化合物库筛选，进一步拓宽了DNA编码化合物库的应用范围，并且具有较高的筛选效率和准确度，可适用于各类膜蛋白的筛选。

Claims (14)

1.一种DNA编码化合物库的活细胞膜蛋白筛选方法，包括以下步骤：
a.将外源基因过表达至活细胞；
b.细胞培养，检测靶标蛋白在细胞膜上的表达量；
c.用筛选平衡液处理细胞后，将DNA编码化合物库与细胞孵育，然后清洗、解离。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤a中所述外源基因为质粒或病毒。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤a中所述过表达的方法为稳定转染或瞬时转染。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：转染方法包括聚乙烯亚胺转染法、阳离子脂质体转染法、磷酸钙转染法、纳米颗粒转染、电穿孔转染法、病毒转染法以及其它能够将外源基因转运至活细胞内的方法。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述聚乙烯亚胺转染法为：将10～100μg质粒、50～200μg聚乙烯亚胺加入到1～4×107的活细胞中，并孵育2～6小时。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤b中细胞培养使用的培养基含有
Figure FDA0002648301100000011
F-68、L-谷氨酰胺和青链霉素。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤b中利用靶标蛋白对应的阳性小肽配体通过流式检测靶标蛋白在细胞膜上的表达量。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤b中细胞培养后，细胞膜上靶标蛋白的表达量达到平均每个细胞上10000至25000个。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤c中筛选平衡液和孵育的缓冲液含有鲑鱼精DNA。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤c中DNA编码化合物库中DNA编码化合物的总数量为2×1015～2×1016个，细胞总数量为2×107～108个。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤c中孵育的时间为0.5～4小时，孵育的温度为4～30℃。
12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤c中清洗为使用缓冲液清洗细胞2～5次。
13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤c中解离为加热至90～100℃并维持10～30分钟，10000～15000rpm下离心将细胞碎片沉淀分离。
14.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在步骤c之后，取步骤c得到的上清液，通过qPCR定量DNA编码化合物数量，如果数量大于108，则将步骤c中的DNA编码化合物库替换为该上清，并重复步骤a到c，直到qPCR定量DNA编码化合物总数量为106～107。
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