CN115851606A - Btk突变细胞株及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及细胞工程技术领域，尤其是涉及BTK突变细胞株及其构建方法，包括如下步骤：S1、使用慢病毒载体质粒构建含有BTK基因及其突变基因的重组质粒；S2、使用转染试剂将步骤S1获得的重组质粒与慢病毒包装质粒转入HEK‑293T细胞；S3、收集步骤S2的病毒上清，过滤并收集含有病毒的滤出液，然后感染HEK‑293细胞；S4、将HEK‑293细胞消化后接种至新的培养皿中，同时加抗生素进行筛选，筛选出阳性细胞至细胞群出现，形成稳转细胞池；S5、将细胞池消化后接种到细胞孔板中，继续用抗生素筛选，至孔中单克隆长至一定汇合度时，挑取单克隆，进行扩大培养至新的细胞孔板中，最终获得BTK突变细胞株。本发明的方法能够得到稳定的BTK突变耐药株，用于癌症药物的筛选。
Description
技术领域
本发明涉及细胞工程技术领域，尤其是涉及BTK突变细胞株及其构建方法和应用。
背景技术
BTK隶属于非受体酪氨酸激酶Tec家族，为膜结合蛋白，是B细胞受体通路的重要信号分子，参与调控B淋巴细胞的发育、分化、活化、增殖及凋亡等过程，在恶性B细胞的生存及扩散中起着重要作用。
目前临床上常应用的BTK抑制剂主要有伊布替尼、阿卡替尼、泽布替尼、特布替尼(Tirabrutinib)、奥布替尼(Orelabrutinib)等，这些药物在淋巴瘤的治疗中取得了良好疗效。但随着广泛的临床应用，部分患者出现耐药，原发性或继发性的BTK突变是人体产生耐药的重要原因。为了筛选新型抗癌药物，需要建立BTK突变细胞株平台为新型药物筛选提供细胞模型，目前建立BTK突变模型的方法主要有三种：
一、建立分子动力学模拟模型：该方法主要是依靠牛顿力学来模拟分子体系的运动，有研究使用BIKI提取了BTK-SH2-KD配置，将得到的结构提交给突变研究数据，探测SH2结构域相对于KD的首选3D结构组织，使用SAXS拟合为SH2-KD配合物，最终完成所有可能的BTK激活分子模型的构建；
二、体外激酶筛选：该方法可用于直接检测荧光标记的底物和产物间转化比例关系，有研究采用均相时间分辨荧光(HTRF)技术，将具有单磷酸化位点的底物一端接上biotin端，biotin能与streptavidin-XL665相连，完成底物的标记。底物经过磷酸化之后，便能与抗磷酸化位点结合，从而产生FRET信号，开展体外激酶对化合物的筛选实验；
三、细胞因子诱导建立细胞模型：该方法是直接或间接增加细胞因子的表达量，使得细胞内BTK表达的变化。如有研究使用多西环素诱导rF10表达，导致细胞大量凋亡，与使用BTK抑制剂作用一致，通过Western Blot进一步检测BTK表达情况，完成细胞模型的构建。
综合比较上述三种方法，构建的分子动力学模拟模型为计算机模拟对接的产物，仅能进行小分子药物与蛋白结合位点的预测，并不能作为药物筛选的依据；采用体外激酶筛选的方法，容易出现脱靶效应，可能出现假阳性现象；采用细胞因子诱导建立细胞模型的方式，稳定性低、操作复杂，且成本较高，不利于靶向药物的筛选。
发明内容
本发明的目的在于提供一种BTK突变细胞株及其构建方法和应用，该方法能够得到稳定的BTK突变耐药株，用于癌症药物的筛选。
本发明的第一方面，提供BTK突变细胞株的构建方法，包括如下步骤：
S1、使用慢病毒载体质粒构建含有BTK基因及其突变基因的重组质粒；
S2、使用转染试剂将步骤S1获得的重组质粒与慢病毒包装质粒转入HEK-293T细胞；
S3、收集步骤S2的病毒上清，过滤并收集含有病毒的滤出液，然后感染HEK-293细胞；
S4、将HEK-293细胞消化后接种至新的培养皿中，同时加抗生素进行筛选，筛选出阳性细胞至细胞群出现，形成稳转细胞池；
S5、将细胞池消化后接种到细胞孔板中，继续用抗生素筛选，至孔中单克隆长至一定汇合度时，挑取单克隆，进行扩大培养至新的细胞孔板中，最终获得BTK突变细胞株。
优选的，步骤S1中所述的BTK基因及其突变基因包括：BTK基因及其T316A，T474S，T474M，T474M-E513G，C481A，C481Y，C481F，C481R位点突变的突变基因；
所述BTK基因序列如SEQ ID NO：1所示，
所述T316A位点突变的突变基因序列如SEQ ID NO：2所示，
所述T474S位点突变的突变基因序列如SEQ ID NO：3所示，
所述T474M位点突变的突变基因序列如SEQ ID NO：4所示，
所述T474M-E513G位点突变的突变基因序列如SEQ ID NO：5所示，
所述C481A位点突变的突变基因序列如SEQ ID NO：6所示，
所述C481Y位点突变的突变基因序列如SEQ ID NO：7所示，
所述C481F位点突变的突变基因序列如SEQ ID NO：8所示，
所述C481R位点突变的突变基因序列如SEQ ID NO：9所示。
进一步的，BTK基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示，
T316A位点突变的突变基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示，
T474S位点突变的突变基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示，
T474M位点突变的突变基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示，
T474M-E513G位点突变的突变基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示，
C481A位点突变的突变基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示，
C481Y位点突变的突变基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示，
C481F位点突变的突变基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：17所示，
C481R位点突变的突变基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：18所示。
优选的，步骤S1包括：使用Plvx-Puro载体质粒，构建含有BTK基因及其突变基因的重组质粒。
优选的，步骤S2包括：使用Lipo3000将步骤S1获得的重组质粒与PSPAX2质粒、PVSVG质粒转入HEK-293T细胞。
优选的，步骤S3包括：48小时后收集步骤S2的病毒上清，用2μm滤器过滤，然后感染HEK-293细胞8-12h。
优选的，步骤S4包括：第二天更换培养液，第三天将HEK-293细胞消化后接种至新的培养皿中，同时加抗生素进行筛选，每隔2～3天更换培养液，筛选出阳性细胞至细胞群出现，形成稳转细胞池。
优选的，所述的抗生素为嘌呤霉素。
优选的，步骤S5包括：将细胞池消化后接种到96孔板中，继续用嘌呤霉素筛选2-3周左右，至孔中单克隆长至50％以上汇合度时，挑取单克隆，进行扩大培养至24孔板中，最终获得BTK突变细胞株。
本发明的第二方面，提供了上述的BTK突变细胞株的构建方法获得的BTK突变细胞株。
本发明的第三方面，提供了上述的BTK突变细胞株的构建方法获得的BTK突变细胞株或上述的BTK突变细胞株在癌症药物筛选中的应用。
有益效果：
本发明的技术方案采用慢病毒感染的技术，使用慢病毒载体将BTK基因及其突变基因稳定整合在HEK-293细胞基因组，使用抗生素筛选后，得到稳定的BTK突变耐药株；本发明的构建方法操作简便，节约成本；能稳定表达整合基因，不易脱靶，能够用于大批量抗癌药物及先导化合物的筛选；为耐药机制的深入研究提供耐药株细胞模型。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明BTK突变细胞株的构建方法、鉴定方法实验流程图；
图2为本发明BTK-Plvx-Puro突变细胞株IFA检测结果示意图，其中，HEK293为人胚胎肾细胞293，BTK为BTK表达检测示意图，BTK+DAPI为DAPI染色后示意图；
图3为本发明BTK-Plvx-Puro突变细胞株Western Blot检测结果示意图，其中，HEK293为人胚胎肾细胞293，GAPDH为甘油醛-3-磷酸脱氢酶作为内参阳性对照；
图4为本发明BTK降解剂对BTK-Plvx-Puro突变细胞株的降解率以及BTK抑制剂对BTK-Plvx-Puro突变细胞株的抑制率示意图；
图5为本发明BTK-C481A突变细胞株IFA检测结果示意图，其中，HEK293为人胚胎肾细胞293，BTK为BTK表达检测示意图，BTK+DAPI为DAPI染色后示意图；
图6为本发明BTK-C481A突变细胞株Western Blot检测结果示意图，其中，HEK293为人胚胎肾细胞293，GAPDH为甘油醛-3-磷酸脱氢酶作为内参阳性对照；
图7为本发明BTK降解剂对BTK-C481A突变细胞株的降解率以及BTK抑制剂对BTK-C481A突变细胞株的抑制率示意图；
图8为本发明BTK-C481F突变细胞株IFA检测结果示意图，其中，HEK293为人胚胎肾细胞293，BTK为BTK表达检测示意图，BTK+DAPI为DAPI染色后示意图；
图9为本发明BTK-C481F突变细胞株Western Blot检测结果示意图，其中，HEK293为人胚胎肾细胞293，GAPDH为甘油醛-3-磷酸脱氢酶作为内参阳性对照；
图10为本发明BTK降解剂对BTK-C481F突变细胞株的降解率以及BTK抑制剂对BTK-C481F突变细胞株的抑制率示意图；
图11为本发明BTK-C481Y突变细胞株IFA检测结果示意图，其中，HEK293为人胚胎肾细胞293，BTK为BTK表达检测示意图，BTK+DAPI为DAPI染色后示意图；
图12为本发明BTK-C481Y突变细胞株Western Blot检测结果示意图，其中，HEK293为人胚胎肾细胞293，GAPDH为甘油醛-3-磷酸脱氢酶作为内参阳性对照；
图13为本发明BTK降解剂对BTK-C481Y突变细胞株的降解率以及BTK抑制剂对BTK-C481Y突变细胞株的抑制率示意图；
图14为本发明BTK-C481R突变细胞株IFA检测结果示意图，其中，HEK293为人胚胎肾细胞293，BTK为BTK表达检测示意图，BTK+DAPI为DAPI染色后示意图；
图15为本发明BTK-C481R突变细胞株Western Blot检测结果示意图，其中，HEK293为人胚胎肾细胞293，GAPDH为甘油醛-3-磷酸脱氢酶作为内参阳性对照；
图16为本发明BTK降解剂对BTK-C481R突变细胞株的降解率以及BTK抑制剂对BTK-C481R突变细胞株的抑制率示意图；
图17为本发明BTK-T474M突变细胞株IFA检测结果示意图，其中，HEK293为人胚胎肾细胞293，BTK为BTK表达检测示意图，BTK+DAPI为DAPI染色后示意图；
图18为本发明BTK-T474M突变细胞株Western Blot检测结果示意图，其中，HEK293为人胚胎肾细胞293，GAPDH为甘油醛-3-磷酸脱氢酶作为内参阳性对照；
图19为本发明BTK降解剂对BTK-T474M突变细胞株的降解率以及BTK抑制剂对BTK-T474M突变细胞株的抑制率示意图；
图20为本发明BTK-T474M-E513G突变细胞株IFA检测结果示意图，其中，HEK293为人胚胎肾细胞293，BTK为BTK表达检测示意图，BTK+DAPI为DAPI染色后示意图；
图21为本发明BTK-T474M-E513G突变细胞株Western Blot检测结果示意图，其中，HEK293为人胚胎肾细胞293，GAPDH为甘油醛-3-磷酸脱氢酶作为内参阳性对照；
图22为本发明BTK-T316A突变细胞株IFA检测结果示意图，其中，HEK293为人胚胎肾细胞293，BTK为BTK表达检测示意图，BTK+DAPI为DAPI染色后示意图；
图23为本发明BTK-T316A突变细胞株Western Blot检测结果示意图，其中，HEK293为人胚胎肾细胞293，GAPDH为甘油醛-3-磷酸脱氢酶作为内参阳性对照；
图24为本发明BTK降解剂对BTK-T316A突变细胞株的降解率以及BTK抑制剂对BTK-T316A突变细胞株的抑制率示意图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一细胞株的构建
如图1所示，使用慢病毒载体质粒Plvx-Puro构建含有BTK基因及其T316A，T474S，T474M，T474M-E513G，C481A，C481Y，C481F，C481R位点突变的突变基因的重组质粒，用Lipo3000转染试剂将重组质粒与PSPAX2、PVSVG转入HEK 293T细胞，48小时后收集病毒上清，2.2μm滤器过滤，然后感染HEK-293细胞8-12h。第二天更换培养液，第三天消化后接种至新的培养皿中，同时加嘌呤霉素进行筛选。每隔2～3天更换培养液，筛选出阳性细胞至细胞群出现，形成稳转细胞池。将细胞池消化后接种到96孔板中，继续用嘌呤霉素筛选2-3周左右，至孔中单克隆长至50％以上汇合度时，挑取单克隆，进行扩大培养至24孔板,最终获得BTK突变细胞株。
具体的，BTK基因序列如SEQ ID NO：1所示，
T316A位点突变的突变基因序列如SEQ ID NO：2所示，
T474S位点突变的突变基因序列如SEQ ID NO：3所示，
T474M位点突变的突变基因序列如SEQ ID NO：4所示，
T474M-E513G位点突变的突变基因序列如SEQ ID NO：5所示，
C481A位点突变的突变基因序列如SEQ ID NO：6所示，
C481Y位点突变的突变基因序列如SEQ ID NO：7所示，
C481F位点突变的突变基因序列如SEQ ID NO：8所示，
C481R位点突变的突变基因序列如SEQ ID NO：9所示。
进一步的，BTK基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示，
T316A位点突变的突变基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示，
T474S位点突变的突变基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示，T474M位点突变的突变基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示，
T474M-E513G位点突变的突变基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示，
C481A位点突变的突变基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示，
C481Y位点突变的突变基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示，C481F位点突变的突变基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：17所示，C481R位点突变的突变基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：18所示。
实施例二细胞株的表达鉴定
a.IFA：将每个单克隆细胞铺至384孔板，第二天固定，透膜，封闭，在4℃条件下孵育BTK抗体过夜。第三天孵育二抗，通过高内涵成像分析单克隆细胞中BTK表达情况，选取高表达的细胞扩大培养。
b.Western Blot：收集IFA鉴定成功的细胞团，裂解细胞，测定蛋白浓度，上样、电泳、转膜，封闭2小时、一抗4℃孵育过夜。第二天，孵育二抗后，用显影液显影，检测BTK相关蛋白表达情况。选取目的蛋白表达水平高及细胞状态好的单克隆细胞，进一步扩大培养。
c.测序：收集已通过Western Blot鉴定的单克隆细胞，试剂盒提取DNA后送样测序。将测序正确的单克隆细胞进一步扩大培养，建立细胞库。
实施例三细胞株的功能性验证
a.降解剂：使用BTK降解剂(DD03171)梯度处理鉴定成功的单克隆细胞2h，IFA检测BTK表达情况，选取验证成功的单克隆细胞扩大培养，冻存。
b.小分子抑制剂：使用BTK抑制剂(Ibrutinib)梯度处理鉴定成功的单克隆细胞24h，IFA检测p-BTK表达情况，选取验证成功的单克隆细胞扩大培养，冻存。
实施例四结果与分析
(1)构建BTK-Plvx-Puro突变细胞株
采用实施例一至三的方法建立稳定过表达的BTK-Plvx-Puro突变耐药株，并采用BTK降解剂和小分子抑制剂验证该耐药株的功能性。
如图2所示，IFA检测结果表明：编号为Plvx-Puro7#的BTK突变耐药株实现了对BTK基因的过表达。
如图3所示，Western Blot检测结果表明：编号为Plvx-Puro4#、Plvx-Puro5#、Plvx-Puro6#、Plvx-Puro7#、Plvx-Puro8#、Plvx-Puro14#、Plvx-Puro17#的BTK突变耐药株实现了对BTK基因的过表达。
如图4所示，功能性验证结果表明：DD03171对编号为Plvx-Puro7#、Plvx-Puro8#的BTK突变耐药株具有降解作用，依鲁替尼(Ibrutinib)对编号为Plvx-Puro7#、Plvx-Puro8#的BTK突变耐药株具有抑制作用。
以上结果表明BTK-Plvx-Puro突变细胞株构建成功。
(2)构建BTK-C481A突变细胞株
采用实施例一至三的方法建立稳定过表达的BTK-C481A突变耐药株，并采用BTK降解剂和小分子抑制剂验证该耐药株的功能性。
如图5所示，IFA检测结果表明：编号为C481A17#的BTK突变耐药株实现了对BTK基因的过表达。
如图6所示，Western Blot检测结果表明：编号为C481A1#、C481A4#、C481A17#、C481A18#、C481A21#、C481A29#、C481A32#、C481A33#的BTK突变耐药株实现了对BTK基因的过表达。
测序结果显示，编号为C481A1#、C481A4#、C481A17#、C481A18#、C481A21#、C481A29#、C481A33#的BTK突变耐药株的突变位置是正确的。
如图7所示，功能性验证结果表明：DD03171对编号为C481A1#和C481A17#的BTK突变耐药株具有降解作用，依鲁替尼对编号为C481A1#和C481A17#的BTK突变耐药株具有抑制作用。
此外，对比依鲁替尼给药组中BTK-C481A和BTK-Plvx-Puro两种突变细胞株的DC50值，结果显示BTK-C481A的DC50值为BTK-Plvx-Puro的5倍以上，说明构建的BTK-C481A突变细胞株既突变成功且具有耐药性。
(3)构建BTK-C481F突变细胞株
采用实施例一至三的方法建立稳定过表达的BTK-C481F突变耐药株，并采用BTK降解剂和小分子抑制剂验证该耐药株的功能性。
如图8所示，IFA检测结果表明：编号为C481F15#的BTK突变耐药株实现了对BTK基因的过表达。
如图9所示，Western Blot检测结果表明：编号为C481F2#、C481F3#、C481F4#、C481F5#、C481F6#、C481F13#、C481F15#、C481F16#、C481F18#、C481F28#、C481F41#的BTK突变耐药株实现了对BTK基因的过表达。
测序结果显示，编号为C481F2#、C481F3#、C481F4#、C481F5#、C481F13#、C481F15#、C481F16#、C481F18#的BTK突变耐药株的突变位置是正确的。
如图10所示，功能性验证结果表明：DD03171对编号为C481F15#的BTK突变耐药株具有降解作用，依鲁替尼对编号为C481F15#的BTK突变耐药株具有抑制作用。
此外，分别对比依鲁替尼给药组中BTK-C481F与BTK-Plvx-Puro两种突变细胞株的DC50值，结果显示BTK-C481F的DC50值为BTK-Plvx-Puro的几百倍以上，说明构建的BTK细胞株既突变成功且具有耐药性。
(4)构建BTK-C481Y突变细胞株
采用实施例一至三的方法建立稳定过表达的BTK-C481Y突变耐药株，并采用BTK降解剂和小分子抑制剂验证该耐药株的功能性。
如图11所示，IFA检测结果表明：编号为C481Y53#的BTK突变耐药株实现了对BTK基因的过表达。
如图12所示，Western Blot检测结果表明：编号为C481Y5#、C481Y15#、C481Y16#、C481Y37#、C481Y45#、C481Y53#、C481Y54#、C481Y56#、C481Y77#的BTK突变耐药株实现了对BTK基因的过表达。
测序结果显示，C481Y5#、C481Y15#、C481Y53#、C481Y54#、C481Y56#、C481Y77#的BTK突变耐药株的突变位置是正确的。
如图13所示，功能性验证结果表明：DD03171对编号为C481Y53#的BTK突变耐药株具有降解作用，依鲁替尼对编号为C481Y53#的BTK突变耐药株具有抑制作用。
此外，对比依鲁替尼给药组中BTK-C481Y和BTK-Plvx-Puro两种突变株的DC50值，结果显示BTK-C481Y的DC50值为BTK-Plvx-Puro的几百倍以上，说明构建的BTK-C481Y突变细胞株既突变成功且具有耐药性。
(5)构建BTK-C481R突变细胞株
采用实施例一至三的方法建立稳定过表达的BTK-C481R突变耐药株，并采用BTK降解剂和小分子抑制剂验证该耐药株的功能性。
如图14所示，IFA检测结果表明：编号为C481R2#的BTK突变耐药株实现了对BTK基因的过表达。
如图15所示，Western Blot检测结果表明：编号为C481R2#、C481R4#、C481R6#、C481R7#、C481R8#、C481R10#、C481R12#、C481R24#的BTK突变耐药株实现了对BTK基因的过表达。
测序结果显示，C481R2#、C481R4#、C481R6#、C481R7#、C481R8#、C481R10#、C481R12#、C481R24#的BTK突变耐药株的突变位置是正确的。
如图16所示，功能性验证结果表明：DD03171对编号为C481R2#的BTK突变耐药株具有降解作用，依鲁替尼对编号为C481R2#的BTK突变耐药株具有抑制作用。
此外，对比依鲁替尼给药组中BTK-C481R和BTK-Plvx-Puro两种突变株的DC50值，结果显示BTK-C481R的DC50值为BTK-Plvx-Puro的10倍以上，说明构建的BTK-C481R突变细胞株既突变成功且具有耐药性。
(6)构建BTK-T474M突变细胞株
采用实施例一至三的方法建立稳定过表达的BTK-T474M突变耐药株，并采用BTK降解剂和小分子抑制剂验证该耐药株的功能性。
如图17所示，IFA检测结果表明：编号为T474M4#的BTK突变耐药株实现了对BTK基因的过表达。
如图18所示，Western Blot检测结果表明：编号为T474M1#、T474M2#、T474M3#、T474M4#、T474M5#的BTK突变耐药株实现了对BTK基因的过表达。
测序结果显示，T474M1#、T474M4#、T474M5#的BTK突变耐药株的突变位置是正确的。
如图19所示，功能性验证结果表明：DD03171对编号为T474M4#的BTK突变耐药株具有降解作用，依鲁替尼对编号为T474M4#的BTK突变耐药株具有抑制作用。
此外，对比依鲁替尼给药组中BTK-T474M和BTK-Plvx-Puro两种突变株的DC50值，结果显示BTK-T474M的DC50值为BTK-Plvx-Puro的10倍以上，说明构建的BTK-T474M突变细胞株既突变成功且具有耐药性。
(7)构建BTK-T474M-E513G突变细胞株
采用实施例一至三的方法建立稳定过表达的BTK-T474M-E513G突变耐药株，并采用IFA和Western Blot验证BTK表达情况。
如图20所示，IFA检测结果表明：编号为T474M-E513G2#的BTK突变耐药株实现了对BTK基因的过表达。
如图21所示，Western Blot检测结果表明：编号为T474M-E513G1#、T474M-E513G2#、T474M-E513G 6#的BTK突变耐药株实现了对BTK基因的过表达。
测序结果显示，T474M-E513G1#、T474M-E513G2#、T474M-E513G6#的BTK突变耐药株的突变位置是正确的。
(8)构建BTK-T316A突变细胞株
采用实施例一至三的方法建立稳定过表达的BTK-T316A突变耐药株，并采用BTK降解剂和小分子抑制剂验证该耐药株的功能性。
如图22所示，IFA检测结果表明：编号为T316A25#的BTK突变耐药株实现了对BTK基因的过表达，表明BTK-T316A突变细胞株构建成功。
如图23所示，Western Blot检测结果表明：编号为T316A4#、T316A7#、T316A10#、T316A13#、T316A14#、T316A24#、T316A25#、T316A30#、T316A31#的BTK突变耐药株实现了对BTK基因的过表达。
测序结果显示，T316A4#、T316A7#、T316A10#、T316A13#、T316A14#、T316A24#、T316A25#、T316A30#、T316A31#的BTK突变耐药株的突变位置是正确的。
如图24所示，功能性验证结果表明：DD03171对编号为T316A25#的BTK突变耐药株具有降解作用，依鲁替尼对编号为T316A25#的BTK突变耐药株具有抑制作用。
此外，对比依鲁替尼给药组中BTK-T316A和BTK-Plvx-Puro两种突变株的DC50值，结果显示BTK-T316A的DC50值为BTK-Plvx-Puro的7倍以上，说明构建的BTK-T316A突变细胞株既突变成功且具有耐药性。
(9)构建BTK-T474S突变细胞株
设计合成BTK-T474S质粒，并将质粒测序，结果为正确突变的BTK-T474S质粒。
综上，本实施例的技术方案采用慢病毒感染的技术，使用慢病毒载体将BTK基因及其突变基因稳定整合在HEK-293细胞基因组，使用抗生素筛选后，得到稳定的BTK突变耐药株；本发明的构建方法操作简便，节约成本；能稳定表达整合基因，不易脱靶，能够用于大批量抗癌药物及先导化合物的筛选；为耐药机制的深入研究提供耐药株细胞模型。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.BTK突变细胞株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、使用慢病毒载体质粒构建含有BTK基因及其突变基因的重组质粒；
S2、使用转染试剂将步骤S1获得的重组质粒与慢病毒包装质粒转入HEK-293T细胞；
S3、收集步骤S2的病毒上清，过滤并收集含有病毒的滤出液，然后感染HEK-293细胞；
S4、将HEK-293细胞消化后接种至新的培养皿中，同时加抗生素进行筛选，筛选出阳性细胞至细胞群出现，形成稳转细胞池；
S5、将细胞池消化后接种到细胞孔板中，继续用抗生素筛选，至孔中单克隆长至一定汇合度时，挑取单克隆，进行扩大培养至新的细胞孔板中，最终获得BTK突变细胞株。
2.根据权利要求1所述的BTK突变细胞株的构建方法，其特征在于，步骤S1中所述的BTK基因及其突变基因包括：BTK基因及其T316A，T474S，T474M，T474M-E513G，C481A，C481Y，C481F，C481R位点突变的突变基因；
所述BTK基因序列如SEQ ID NO：1所示，
所述T316A位点突变的突变基因序列如SEQ ID NO：2所示，
所述T474S位点突变的突变基因序列如SEQ ID NO：3所示，
所述T474M位点突变的突变基因序列如SEQ ID NO：4所示，
所述T474M-E513G位点突变的突变基因序列如SEQ ID NO：5所示，
所述C481A位点突变的突变基因序列如SEQ ID NO：6所示，
所述C481Y位点突变的突变基因序列如SEQ ID NO：7所示，
所述C481F位点突变的突变基因序列如SEQ ID NO：8所示，
所述C481R位点突变的突变基因序列如SEQ ID NO：9所示。
3.根据权利要求1所述的BTK突变细胞株的构建方法，其特征在于，步骤S1包括：使用Plvx-Puro载体质粒，构建含有BTK基因及其突变基因的重组质粒。
4.根据权利要求1所述的BTK突变细胞株的构建方法，其特征在于，步骤S2包括：使用Lipo3000将步骤S1获得的重组质粒与PSPAX2质粒、PVSVG质粒转入HEK-293T细胞。
5.根据权利要求1所述的BTK突变细胞株的构建方法，其特征在于，步骤S3包括：48小时后收集步骤S2的病毒上清，用2μm滤器过滤，然后感染HEK-293细胞8-12h。
6.根据权利要求1所述的BTK突变细胞株的构建方法，其特征在于，步骤S4包括：第二天更换培养液，第三天将HEK-293细胞消化后接种至新的培养皿中，同时加抗生素进行筛选，每隔2～3天更换培养液，筛选出阳性细胞至细胞群出现，形成稳转细胞池。
7.根据权利要求6所述的BTK突变细胞株的构建方法，其特征在于，所述的抗生素为嘌呤霉素。
8.根据权利要求7所述的BTK突变细胞株的构建方法，其特征在于，步骤S5包括：将细胞池消化后接种到96孔板中，继续用嘌呤霉素筛选2-3周左右，至孔中单克隆长至50％以上汇合度时，挑取单克隆，进行扩大培养至24孔板中，最终获得BTK突变细胞株。
9.根据权利要求1-8任一项所述的BTK突变细胞株的构建方法获得的BTK突变细胞株。
10.根据权利要求1-8任一项所述的BTK突变细胞株的构建方法获得的BTK突变细胞株或权利要求9所述的BTK突变细胞株在癌症药物筛选中的应用。
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|---|---|---|---|
| CN202211635171.2A CN115851606A (zh) | 2022-12-19 | 2022-12-19 | Btk突变细胞株及其构建方法和应用 |
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| CN115851606A true CN115851606A (zh) | 2023-03-28 |
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| CN (1) | CN115851606A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117711616A (zh) * | 2023-11-23 | 2024-03-15 | 北京爱思益普生物科技股份有限公司 | 基于基因表达数据的阿尔兹海默预测模型建立方法及系统 |
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2022
- 2022-12-19 CN CN202211635171.2A patent/CN115851606A/zh active Pending
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