CN112426527B - 一种具有抗肿瘤功能的二维红磷纳米材料 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种具有抗肿瘤功能的二维红磷纳米材料，具体涉及生物医药领域，S1、将碘化磷(PI3)与半胱氨酸反应，并在反应体系中加入十六烷基三甲基溴化铵(CATB)和聚吡咯烷酮(PVP，MW10000)，剧烈搅拌混合均匀；S2、搅拌结束后，反应体系在室温条件下静置24h，离心收集沉淀；S3、将沉淀物进一步分散到无水乙醇了中，水浴超声2h，离心收集沉淀，并用乙醇洗涤沉淀3次，冷冻干燥即可获得目产品。本发明能够高效诱导肿瘤细胞自噬，引起细胞内自噬紊乱，从而发挥抗肿瘤功能，并且在活体上表现出优异的抑瘤效果。

Description

一种具有抗肿瘤功能的二维红磷纳米材料

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种具有抗肿瘤功能的二维红磷纳米材料。

背景技术

众所周知，磷广泛存在于动植物组织中，也是人体含量较多的元素之一，它不但构成人体成分，且参与生命活动中非常重要的代谢过程，是机体不可或缺的一种元素。在人体中平均含有0.5kg的磷/元素，其中大部分以磷酸盐的形式存在，以维持我们骨骼和牙齿的正常形态；磷元素还参与生物体的遗传物质组成，构成生物体主要的遗传物质并实现蛋白质翻译，以维持生命过程的延续；细胞的细胞膜也是由磷脂双分子层组成的，维持细胞的正常形态并参与调控物质进出细胞；磷元素还通过对蛋白质磷酸化来调节蛋白质的功能，进而参与调节一系列的生命过程。

随着纳米科学研究的不断深入，涌现出越来越多的具有优异性能和广泛应用前景的纳米材料。大量的研究结果表明，纳米材料凭借独特的结构特性在生物、化学和医学等领域中扮演着不可或缺的角色。其中，磷基材料是纳米科学中一个重要的研究领域(图1)。含磷纳米材料，尤其是二维材料，很容易与氧气和水发生反应，最终降解为无毒的磷酸盐和膦酸酯，而磷是人体的组成元素之一，这些降解的磷氧化物与机体具有很好的相容性，对人体无害。在众多的磷基材料中，黑磷是其中一个典型的代表，其作为一种新兴的纯磷材料，独特的褶皱分子结构，优异的光热转换效率使得黑磷成为生物医药领域中一个重要的研究热点。2015年中国科技大学Yi Xie课题组研究结果表明，黑磷纳米片在激光照射下能够高效产生单线态氧用于杀伤肿瘤细胞，并在荷瘤小鼠模型中验证了黑磷纳米片优异的抗肿瘤效果。然而黑磷的制备过程需要特殊的设备，苛刻的反应条件，同时基于黑磷制备黑磷烯的过程较繁琐难以实现工业化生产，大大限制了黑磷纳米片的进一步发展。因此，亟需开发一种具有优异性能且简单易得的磷基二维材料。

磷元素在自然界中有3种同素异形体，其单质的主要存在形式为：白磷、红磷和黑磷三种。白磷易燃，并且毒性较大，难以应用。黑磷作为一种新兴材料，化学性质稳定，结构特殊，其在光电化学及生物医药领域都展现出极大的潜力，但是黑磷制备条件苛刻且易氧化降解，这限制了它进一步的发展。红磷相比于白磷，化学性质更加稳定，相比于黑磷则廉价、易得。同时，红磷的带隙在1.4-2.0eV之间，对太阳光吸收范围宽。这些优势使得红磷在光催化和电化学等领域中具有广阔的应用前景。如来自复旦大学结果显示，将纳米级红磷材料负载到石墨烯表面后能够显著提高钠离子电池性能。目前红磷在科学研究中主要的形态为球状或纳米级无规则状。众所周知，在各种形态的纳米材料中，二维材料能够暴露出最多的活性位点，能够显著提高纳米材料的性能。但是，二维红磷还尚未见报道，红磷纳米材料与生物系统之间的相互作用仍待研究。这一现状也提示我们，设计一套能够高效快速，简单易行的红磷烯合成方法是深入拓展红磷纳米材料的首要目标。

红磷的结构较为复杂，其化学结构尚不清楚。目前，将红磷分为五型。具体分别为：非晶相(I型)，六角相(II型)，亚稳态相(III型)，纤维相(IV型)，希托夫相(V型)18。其中，最常见的是I型非晶相。其他相的红磷只有IV型和V型的化学结构被报道，如图2所示。近期，山东大学Lijie Ci课题组以碘化磷为磷源、乙二醇为还原剂、石墨烯为模板剂，通过简单的氧化还原反应制备出红磷纳米颗粒用于钠离子电池的相关研究。另一方面，在贵金属纳米片的合成中，研究者已经成功开发出作为抑制剂引入的表面活性剂或CO作为最成功的的合成策略之一。CO在制备贵金属纳米片还原动力学上的影响被认为是行程高质量纳米片的主要因素。CO在金属元素不同晶面上选择性的吸附会抑制该面金属原子的沉积，导致纳米晶的各项异性生长获得相应的纳米片。以上的种种证据表明，通过氧化还原释放磷原子，进一步引入小分子抑制剂来调节红磷纳米材料的二维生长生成红磷烯可能是二维红磷制备的新策略。

几个世纪以来，癌症一直是人类生命健康的主要威胁之一，虽然在过去的几十年中，我们对癌症的起源和发展有了逐渐深刻的理解，也开发出一系列用于癌症诊疗的方法，但是其仍维持较高的死亡率。目前的治疗手段主要依赖于化疗和放疗，不仅手术不能完全切除人体中的所有癌细胞，而且化疗和放疗的毒副作用也会对患者产生严重影响。因此，研究者一直致力于开发高效的治疗剂和治疗方式，期望可以通过安全高效的方式选择性的治疗癌症。根据以往的研究表明，黑磷在近红外区域具备较大的消光系数和较高的光热转换效率和活性氧产率，是一种理想的光热疗试剂，且最新的研究表明黑磷本身能作为一种活性磷疗试剂直接应用于肿瘤治疗。然而，黑磷的难制备，难保存的缺点限制了其进一步的实际应用。红磷作为黑磷的同素异形体，简单易得，部分性质与黑磷相近，且氧化降解后的产物有较好的生物安全性，具有良好的生物应用前景。但是，关于红磷纳米材料在生物医药领域，尤其是肿瘤治疗方面的应用尚无人报道。因此，基于二维红磷的肿瘤治疗值得深入研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种能有效抑制肿瘤发生和发展的二维红磷纳米材料及制备方法，该二维红磷能够高效诱导肿瘤细胞自噬，引起细胞内自噬紊乱，从而发挥抗肿瘤功能，并且在活体上表现出优异的抑瘤效果。

本发明提供了如下的技术方案：

一种具有抗肿瘤功能的二维红磷纳米材料，其形态结构如图1，制备方法如下：

S1、将碘化磷(PI3)与半胱氨酸反应，并在反应体系中加入十六烷基三甲基溴化铵(CATB)和聚吡咯烷酮(PVP，MW10000)，剧烈搅拌混合均匀

S2、搅拌结束后，反应体系在室温条件下静置24h，离心收集沉淀

S3、将沉淀物进一步分散到无水乙醇了中，水浴超声2h，离心收集沉淀，并用乙醇洗涤沉淀3次，冷冻干燥即可获得目产品。

优选的，S1步骤中，需调整半胱氨酸和CATB的浓度。

优选的，S3步骤中，进行水浴超声分散。

优选的，S1具体步骤如下，在二甲基甲酰胺(DMF，1.6ml)中加入CATB的乙醇溶液(250mM，0.4ml)，搅拌均匀后加入聚吡咯烷酮(MW10000，10mg)继续搅拌。

优选的，S2步骤具体如下，加入L型半胱氨酸(1M，0.04ml)后继续搅拌，同时逐滴加入碘化磷的碘苯溶液(1.6M，0.1ml)，剧烈搅拌30s，待反应结束后，将黄色溶液室温下静置24h。

本发明的有益效果：

本发明的二维红磷纳米材料在体内外均具有优异的抗肿瘤活性，通过引起细胞内剧烈的自噬从而导致细胞自噬紊乱实现肿瘤杀伤，与其他磷基纳米材料的抗肿瘤机制不同。该方法还可以进行有效的金属元素掺杂，以简单高效的手段拓展磷基材料的应用范围。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为二维红磷的透射电镜表征图

图2为二维红磷的高分辨透射电镜表征途和选区电子衍射图

图3为二维红磷的原子力显微镜表征图

图4为二维红磷和商业红磷的XRD图谱对比

图5为二维红磷和商业红磷的拉曼图谱对比

图6为二维红磷的XPS图谱

图7为二维红磷对肿瘤细胞和正常组织细胞毒性分析

图8为二维红磷引起肺癌细胞A549自噬的免疫荧光分析(左)和生物电镜分析(右)

图9为作用机理图

具体实施方式

二维红磷纳米材料的制备

S1、在二甲基甲酰胺(DMF，1.6ml)中加入CATB的乙醇溶液(250mM，0.4ml)，搅拌均匀后加入聚吡咯烷酮(MW10000，10mg)继续搅拌

S2、加入L型半胱氨酸(1M，0.04ml)后继续搅拌，同时逐滴加入碘化磷的碘苯溶液(1.6M，0.1ml)，剧烈搅拌30s，待反应结束后，将黄色溶液室温下静置24h

搅拌结束后，反应体系在室温条件下静置24h，离心收集沉淀

S3、离心收集得到黄色沉淀后分散于无水乙醇中，在水浴超声中进行超声分散2h，再离心收集沉淀，并用无水乙醇洗涤沉淀3次后，真空干燥得到黄色粉末状产物

二维红磷纳米材料的物理化学性质表征

对制备得到的红磷纳米材料进行透射电镜和原子力显微镜表征分析其形貌结构结构，如图2和3所示；

利用X射线衍射仪对制备得到的红磷纳米材料进行分析，并与商业红磷进行对比，获得二维红磷的晶体信息，如图4所示

利用拉曼光谱仪对制备得到的红磷纳米材料进行分析，并与商业红磷进行对比，获得二维红磷的原子结构信息，如图5所示

利用X射线光电子能谱分析仪对制备得到的红磷纳米材料进行分析，获得二维红磷的化学成分信息，如图6所示

二维红磷的细胞毒性测试

对制备得到的纳米材料进行细胞毒活性测试，分别以肺癌细胞(A549)，胶质瘤细胞(U87)、宫颈癌细胞(Hela)和乳腺癌细胞(4T1)为模型，以上述合成的红磷纳米材料为待检测物，将所述检测物作用于细胞后，观察细胞的存活情况，以噻唑蓝(MTT)方法测试细胞存活率，具体操作步骤如下：

S1、收集上述对数期细胞，调整细胞悬液浓度，加入96孔板中，每孔细胞数约为5000；

S2、将上述细胞置于二氧化碳培养箱中培养12h；

S3、用含有10％FBS的完全培养基分别配置不同浓度的红磷材料悬液，加入培养板中，每个浓度设置3个平行复孔，药物孵育24h；

S4、每孔加入MTT溶液(5mg/ml，20μl)，继续孵育4h，移除培养基，随后每孔加入二甲亚砜(DMSO，150μl)；

S5、用酶标仪检测每孔在490nm处的吸光度值(O.D.)；

S6、设置空白对照孔，按照以下公式计算细胞存活率：

存活率(％)＝O.D.(sample)/O.D.(control)x100％

其中，O.D.(sample)为实验组细胞的吸光度值；O.D.(control)为空白对照孔的吸光度值，结果如图7所示。

二维红磷诱导自噬的检测

对制备得到的纳米材料诱导细胞自噬能力的测试。以A549细胞为模型，以上述合成的红磷纳米材料为待检测物，将所述检测物作用于细胞后，通过免疫荧光和生物电镜分析的方法检测细胞内自噬水平的变化，具体操作步骤如下：

S1、收集上述对数期细胞，调整细胞悬液的浓度，以每皿1.5x105个细胞的密度接种于共聚焦培养皿中，再以每皿1.0x107个细胞的密度接种于细胞培养皿中；

S2、将上述细胞置于二氧化碳培养箱中培养12h；

S3、将红磷纳米材料(15μg/ml)加入细胞培养液中并继续孵育24h；

S4、免疫荧光实验：

a.移除培养基后用多聚甲醛(4％)于室温下固定细胞15min；

b.PBS洗涤三次后加入通透剂(0.2％Triton X-100的PBS溶液)于室温条件下通透细胞15min；

c.PBS洗涤三次后加入封闭液(5％BSA的PBS溶液)与室温条件下封闭细胞30min；

d.移除封闭液，加入一抗溶液于室温条件下孵育细胞1h；

e.PBS洗涤三次后加入二抗溶液于室温条件下孵育细胞1h；

f.PBS洗涤三次后可置于荧光显微镜下观察细胞内荧光变化，结果如图8所示。

生物电镜分析实验：

a.移除培养基后用PBS洗涤三次，加入戊二醛(2.5％)于4℃条件下固定细胞12h；

b.PBS洗涤三次后，用梯度浓度的乙醇溶液(50％,70％,90％)依次进行脱水，每一次20min；

c.将细胞转移到包埋液中于37℃条件下进行包埋3h；

d.随后转移到37℃烘箱中进行固化处理；

e.用超薄切片机对细胞进行切片，厚度70nm；

f.切片经过醋酸铀-枸橼酸铅(3％)双染色后可置于透射电镜下观察细胞内亚细胞结构，结果如图8所示。

活体抑瘤测试

S1、向Balb/c裸鼠皮下种植人源肺癌细胞A549(2x106cells/只)，待成瘤后将小鼠随机分组，每组5只；

S2、对小鼠进行瘤内注射给药，给药剂量为0.5mg/kg，1mg/kg和2mg/kg，每三天给药一次，同时每两天测量肿瘤体积并称取小鼠肿瘤。

免疫组化检测

分别切取小鼠的肿瘤组织，在多聚甲醛中固定组织，随后经过洗涤、脱水、固定和包埋等步骤后制作组织切片，随后进行免疫组化实验，结果如图9所示。

磷基材料具有反应活性较低及生物安全性高等特点。目前关于黑磷纳米材料的研究是磷基材料研究领域的热点。但是黑磷的制作方法复杂，需要高温高压等苛刻的条件。相比之下红磷作为黑磷的同素异性形体，在保留有相似的性质的同时制备条件和过程更加简单可行。本发明所涉及的二维红磷纳米材料可以选择性且高效地诱导肿瘤细胞内部自噬的发生，导致细胞内自噬紊乱，从而杀伤肿瘤细胞，其肿瘤治疗效果也通过小鼠肿瘤模型得到验证，其作用机理如图9所示。

以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种具有抗肿瘤功能的二维红磷纳米材料，其特征在于,制备过程如下：S1、将三碘化磷与半胱氨酸反应，并在反应体系中加入十六烷基三甲基溴化铵和聚乙烯吡咯烷酮，搅拌混合均匀，需调整半胱氨酸和十六烷基三甲基溴化铵的浓度；

S2、搅拌结束后，反应体系在室温条件下静置24 h，离心收集沉淀；

S3、将沉淀物进一步分散到无水乙醇中，水浴超声2 h，离心收集沉淀，并用乙醇洗涤沉淀3次，冷冻干燥即可获得目标产品。

2.根据权利要求1所述的一种具有抗肿瘤功能的二维红磷纳米材料，其特征在于：S3步骤中，进行水浴超声分散。

3.根据权利要求1所述的一种具有抗肿瘤功能的二维红磷纳米材料，其特征在于：S1具体步骤如下，在1.6 ml的二甲基甲酰胺中加入250 mM，0.4 ml的十六烷基三甲基溴化铵的乙醇溶液，搅拌均匀后加入分子量为10000，质量为10 mg的聚乙烯吡咯烷酮，继续搅拌。

4.根据权利要求1所述的一种具有抗肿瘤功能的二维红磷纳米材料，其特征在于：S1和S2步骤具体如下，加入1M，0.04 ml的L型半胱氨酸后继续搅拌，同时逐滴加入1.6 M，0.1 ml的三碘化磷的碘苯溶液，剧烈搅拌30 s，待反应结束后，将黄色溶液室温下静置24 h。

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