CN112399852A - 固体和液体恶性肿瘤中多重抗原受体t细胞对多种抗原的靶向 - Google Patents

固体和液体恶性肿瘤中多重抗原受体t细胞对多种抗原的靶向 Download PDF

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Abstract

本发明揭示一种用于治疗以实体瘤存在为特征的癌症的组合物和方法，其使用单一CAR T构建体同时靶向癌细胞上的多个靶点。

Description

固体和液体恶性肿瘤中多重抗原受体T细胞对多种抗原的 靶向
相关申请
基于35U.S.C.§119(e)，本申请主张2018年6月28日提交的美国临时申请U.S.S.N.62/691,486的优先权以及2018年7月13日提交的美国临时申请U.S.S.N.62/697,526的优先权，该临时申请通过引用并入本文。
政府授权
本发明是在美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)许可号DK105602-01和T32AI007386的政府支持下完成的。政府拥有本发明的特定权利。
背景技术
临床试验业已证明，癌症免疫疗法可于晚期癌症患者中诱发持久响应。已有许多使用嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)T细胞成功治疗B细胞源性白血病，淋巴瘤和多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)的报道。这些经过遗传工程改造的T细胞对分化簇19(Cluster of Differentiation，CD19)，CD22和B细胞成熟抗原(B-cellmaturation antigen，BCMA)受体具有特异性，这种受体普遍存在于癌性B细胞表面，但也存在于正常的非B细胞表面。尽管对于这些癌症的响应速率仍然很高，但仍需要更加可控的CAR T细胞系统(Kochenderfer et al.J.Clin Oncol.33:540–9(2015),Maude et al.,Blood 125:4017–23(2015),Friedman et al.,Hum Gene Ther.29(5):585-601(2018),Raje et al.,N Engl J Med.380(18):1726-37(2019),Fry et al.,Nat Med 24:20-8(2018)).
脑癌对于有意义和持久治疗是特别强大的敌人。例如就胶质母细胞瘤(glioblastoma，GBM)而言，目前所有FDA批准可用的治疗方法基本上都是保守疗法。13年前，结合放射治疗和替莫唑胺化学疗法被确定为针对新诊断患者的当前标准治疗(Stuppet al.,N Engl J Med,352:987-96(2005))，其仅产生15个月的中位生存期，且没有挽救疗法可延长复发患者的生存期。
目前对于关键的基因突变和驱动GBM肿瘤生长的细胞信号路径失调的中介体已获得深刻了解。然而，由于多种原因，阻断癌症驱动途径的生物疗法一直未能为GBM患者提供临床益处，原因包括途径激活的冗余机制、肿瘤内异质性、获得抗性以及通过血脑屏障进入中枢神经系统(CNS)的递送不良。同样地，尽管GBM是最具血管生成性的癌症之一，但有效抑制血管内皮生长因子并不能改善患者的生存率，这很可能是由于其它促血管生成因子的代偿性上调以及GBM肿瘤在缺氧、营养缺乏的微环境中逐渐形成适应和发展的能力。尽管令人失望，但这种结果对GBM而言并非空前未有，因而凸显这种疾病的复杂性。
多种包括免疫检查点封锁，嵌合抗原受体(CAR)T细胞，疫苗和溶瘤病毒免疫疗法方法已在各种癌症适应症中取得令人兴奋的结果。不幸的是，针对GBM患者评估此类方法的大型随机三期试验的近期结果为阴性，包括靶向新诊断患者的单一肿瘤特异性突变(表皮生长因子受体变体III(epidermal growth factor receptor variant III，EGFRvIII))的疫苗(Weller et al.,Lancet Oncol,18:1373-85(2017))和对复发患者施用抗程序性死亡1(PD-1)抗体(Reardon et al.,World Federation of Neuro-Oncology Societies(WFNOS)Zurich,Switzerland:Oxford University Press(2017))。
越来越多的数据表明GBM的免疫生物学高度复杂，具有多种内在和适应性因子，可拮抗抗肿瘤免疫响应。因此，针对成功的GBM患者的免疫疗法将需要进一步发现并深入了解导致这种复杂性的关键因素，亦需要针对这些具挑战性的因素进行优化治疗策略的后续设计。
另一类脑癌是高度小儿神经胶质瘤，是儿童期最恶性的肿瘤之一。曾针对儿童神经胶质瘤的患儿进行数百项临床试验，但对于响应速率或长期治疗结果的改善有限。尤其是对于弥漫性内生性脑桥胶质瘤(DIPG)，一种在脑干的脑桥中发现的神经胶质瘤。DIPG通常在4至6岁的患者中被诊断出，这些孩子中的大多数会在诊断后一年内死亡。
迄今为止，CAR T细胞疗法在对抗包括脑瘤的固体瘤方面仅取得了中度的成功。此外，控制CAR T细胞活性可以增强血液性恶性肿瘤的治疗，因此，仍然需要针对例如MM和固体瘤的血液癌症，特别是GBM和DIPG以及其它形式的脑癌，更有效的基于CAR T细胞的抗癌疗法。
发明内容
本发明的第一方面涉及双官能化合物，其包含小分子，所述小分子于本文中亦称为合成抗原，其与结合到肿瘤细胞上存在的肿瘤相关的靶向部分(于本文中也称为靶向配体)共价连接。
在某些实施方案中，所述靶向部分特异性结合脑瘤相关抗原。在某些实施方案中，所述肿瘤相关抗原选自由双唾液酸神经节苷脂GD2(GD2)、环状二磷酸腺苷(ADP)核糖水解酶(CD38)、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM)家族成员7(SLAM7；CS1)、白介素-13受体α2(IL13Rα2)、人类表皮生长因子受体2(HER2)、血小板衍生生长因子受体α(PDGFRα)、表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)、硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4)、ephrin A型受体2(EphA2)、prominin-1(CD133)、B细胞成熟抗原(BCMA)、B淋巴细胞抗原CD20(CD20)、B淋巴细胞抗原CD19(CD19)和B细胞受体CD22(CD22)所组成群组。
在某些实施方案中，所述合成抗原是荧光染料，例如荧光素(FL)。在其它实施方案中，所述合成抗原是4-[(6-甲基吡嗪-2-基)氧基]苯甲酸酯(MPOB)，蒽醌-2-羧酸酯(AQ)或四氧杂环十二烷(tetraxetan，DOTA)。
在某些实施方案中，所述合成抗原包含例如可于特定情况下移除的保护基团，例如，于存在光(可见光(VIS)、近红外光(NIR)或紫外光(UV))或者活性氧或氮物质(ROS、RNS)。在这样的实施方案中合成抗原于本文中称为原始抗原。所述原始抗原无法接近结合实体，如抗体或者其功能性片段。移除保护基团(例如，通过裂解)可使未掩蔽或未老化的合成抗原易于结合。
本发明的另一个方面涉及药物组合物，其包含治疗有效量的双官能化合物和药学上可接受的载体。在某些实施方案中，所述药物组合物包含多个(二个或更多)双官能化合物的亚群，其中在每个亚群中，所述合成抗原可为相同，但是各自的靶向部分结合相同肿瘤相关抗原的不同表位。在某些实施方案中，所述药物组合物包含多个(二个或更多个)双官能化合物的亚群，其中在每个亚群中，所述合成抗原可为相同，但是各自的靶向部分结合到存在于肿瘤细胞上的不同肿瘤相关抗原。因此，所述药物组合物可包含具有第一靶向部分的双官能化合物的第一亚群，其特异性结合第一肿瘤相关抗原，以及具有第二靶向部分的双官能化合物的第二亚群，其特异性结合第二肿瘤相关抗原，其中，所述第一和第二靶向部分结合不同的肿瘤相关抗原。在其它实施方案中，所述双官能化合物的多个亚群包含双官能化合物的第三、第四、第五等亚群，其各自结合存在于肿瘤细胞上的不同肿瘤相关抗原。因此，在某些实施方案中，给定的组合物可以靶向相同肿瘤相关抗原的一个或多个表位。在其它实施方案中，组合物可靶向二或多种肿瘤相关抗原(以及两种或多种肿瘤相关抗原中任一种或多种的二个或多个抗原表位)。
在某些实施方案中，所述第一和第二靶向部分特异性地结合脑肿瘤相关抗原。在某些实施方案中，肿瘤相关抗原选自由GD2、IL13Rα2、HER2、PDGFRα、EGFRvIII、CSPG4、EphA2和CD133所组成的群组，其中所述第一和第二靶向部分结合脑肿瘤相关抗原。
在某些实施方案中，所述第一和第二靶向部分特异性地结合血液肿瘤相关抗原。在某些实施方案中，所述双官能化合物的亚群所靶向的血液肿瘤相关抗原是选自由CD38、CS1、BCMA、CD20、CD19、CD22、CD30、CD38、CD138、CD40、CD56、CD70和CD74所组成的群组。
在某些实施方案中，所述第一或第二靶向部分特异性地结合HER2+恶性肿瘤上的HER2，例如，乳癌、肺癌、结肠直肠癌、脑癌、卵巢癌和胰腺癌。
本发明的另一方面涉及一种治疗癌症的方法，所述方法包括向有此需要的受试者共同施用a)多个双官能分子的亚群，其中所述多个双官能分子的亚群包括a1)治疗有效量的双官能化合物的第一亚群，其包含与第一靶向部分共价连接的合成抗原，所述第一靶向部分特异性地结合第一肿瘤相关抗原；和a2)治疗有效量的双官能化合物的第二亚群，其包含与第二靶向部分共价连接的合成抗原，所述第二靶向部分特异性地结合第二肿瘤相关抗原，或者其药学上可接受的盐或立体异构体，其中所述第一和第二靶向部分特异性结合不同的肿瘤相关抗原；以及
b)治疗有效量的CAR-T细胞，其中CAR-T细胞包含特异性结合所述合成抗原的胞外配体。
可同时或依序施用治疗有效量的多个所述双官能化合物亚群。在某些实施方案中，同时施用所述双官能化合物的亚群，其中由于肿瘤相关抗原中的一种或两种抗原的不均匀表达(在同一患者内或患者之间)，可能导致多种肿瘤抗原的靶向功效增加。在其它实施方案中，依序施用所述双官能化合物的亚群，例如，当患者不再对第一(组)双官能化合物有反应并且需要第二线的双官能化合物来维持治疗功效时。
在某些实施方案中，所述癌症的特征在于实体瘤的存在。在某些实施方案中，癌症是脑癌，例如，GBM或DIPG，且存在于所述第一和第二亚群中的双官能化合物的靶向部分特异性结合脑肿瘤相关抗原。在某些实施方案中，脑肿瘤相关抗原是选自GD2、IL13Rα2、HER2、PDGFRα、EGFRvIII、CSPG4、EphA2和CD133，其中所述第一和第二靶向部分结合不同的脑肿瘤相关抗原。
在某些实施方案中，所述癌症是HER2+恶性肿瘤，例如，乳癌、肺癌、结肠直肠癌、脑癌、卵巢癌和胰腺癌。
在某些实施方案中，所述癌症是血液癌症。在某些实施方案中，所述血液癌症是多发性骨髓瘤、白血病和淋巴瘤，且存在于所述第一和第二亚群中的双官能化合物的靶向部分特异性结合血液肿瘤相关抗原。在某些实施方案中，血液肿瘤相关抗原选自CD38、CS1、BCMA、CD20、CD19、CD22、CD30、CD138、CD40、CD56、CD70和CD74，其中所述第一和第二靶向部分结合不同的血液肿瘤相关抗原。
在某些实施方案中，所述方法可涉及施用多于一种双官能化合物的亚群。在这种情况下，所述多个双官能化合物的(例如，第一和第二)亚群的每一个中的各自靶向部分可为相同，因为其结合至靶向肿瘤相关抗原上的相同表位。在一些其它实施方案中，可扩增或修饰所述双官能化合物的任何亚群，使得所述亚群包括或进一步包括结合相同靶向肿瘤相关抗原上的不同表位的靶向部分。因此，本发明的实施方案可包括第一次施用所述双官能化合物的亚群和至少第二次施用，其与第一次施用的不同处在于任何一个或多个亚群的靶向部分结合相同肿瘤相关抗原的不同表位，其中所述第一和第二次施用可为同时或连续的。所述附加特征可以减轻抗原丢失/逸出或改善毒性。在某些实施方案中，所述方法可能需要施用所述双官能化合物的第三、第四、第五等亚群，其中每个亚群靶向不同的肿瘤相关抗原。
本发明的另一方面进一步涉及包含双官能化合物的多个亚群的系统和CAR T细胞。
本发明的另一方面进一步涉及试剂盒，其包含a)治疗有效量的双官能化合物的多个亚群，其中第一亚群中的每个双官能化合物均包含与第一靶向部分共价连接的第一合成抗原，所述第一靶向部分特异性结合第一肿瘤相关抗原，且其中第二亚群中的每个双官能化合物均包含与第二靶向部分共价连接的第一合成抗原，所述第二靶向部分特异性结合第二肿瘤相关抗原或其药学上可接受的盐或立体异构体，其中所述第一和第二靶向部分特异性结合不同的肿瘤相关抗原；其中所述多个双官能化合物所述亚群置于相同或分开的容器中；b)印刷说明，用于对癌症患者共同施用治疗有效量的多个双官能化合物的亚群和治疗有效量的CAR-T细胞，其中所述CAR-T细胞包含胞外配体，所述细胞外配体特异性结合合成抗原。如上所述，在某些实施方案中，药物组合物可包含多个(两个或更多个)所述双官能化合物的亚群，其中在每个亚群中，所述合成抗原可为相同，但是各自的靶向部分结合相同肿瘤相关抗原的不同表位。因此，在某些实施方案中，给定的组合物可以靶向相同肿瘤相关抗原的一个或多个表位。在其它实施方案中，所述组合物可以靶向两种或更多种肿瘤相关抗原(以及两种或多种肿瘤相关抗原中任一种或多种的二个或多个抗原表位)。
如在图1A至图1D中所示，本发明可为描述可多重和可调剂量的CAR T细胞平台。不同于目前针对特征为实体瘤或血液肿瘤的癌症的CAR T细胞方法，包括如DIPG和GBM的脑癌或如多发性骨髓瘤、白血病和淋巴瘤等的血液肿瘤，本发明可仅以一个CAR T结构同时靶向多种肿瘤相关抗原。如此相对于临床使用的靶点，本发明可以提供增强的细胞毒性，降低抗原逃逸的可能性并提供更大的多功能性，反过来说，这可以提高CAR T细胞于脑癌或血液癌中观察到的不同患者间和患者内异质性的功效，尤其是GBM和多发性骨髓瘤。此外，本发明不需要为每个作为选定靶点的肿瘤相关抗原的CAR T细胞进行遗传工程改造。此外，通过组合具有不同空间分布的多种不同的靶向肿瘤的抗体，本发明可通过在全身分布低剂量抗原以减少甚至消除对健康组织的毒性。因此，这种治疗实体瘤或血液肿瘤的方法可以增加效力，延长治疗持久性并减少不良副作用。
附图说明
图1A至图1E是说明可调剂量和多重抗小分子CAR T细胞的优点的一系列图式。图1A显示，与常规CAR T细胞设计相比，抗小分子CAR T细胞系统使识别肿瘤细胞与杀灭肿瘤细胞两者脱钩。图1B显示图1A所示系统中的多重抗体-小分子缀合物。图1C显示所述系统以可使细胞得以在无活性水平上以及毒性水平下运作给药。图1D显示，本发明能具有更大的多功能性以预防和抵抗抗原逃逸变体。使用抗小分子CAR T细胞，可以同时或相继提供多种抗体以防止癌症复发。图1E显示所述系统得分别控制抗体-小分子缀合物和CAR T细胞的施用途径。
图2A至图2H是一系列折线图和条状图，显示使用小分子的CAR T细胞的弹性。图2A显示两个不同的CAR T细胞(抗MPOB和抗FL CAR T细胞)的代表性示例，其分别杀灭各自的靶点。图2B至图2D显示小分子CAR T细胞可以重新定向到在不同类型的肿瘤细胞中表达的许多不同靶点。图2E证明随着CAR T细胞浓度的增加，CAR T细胞的剂量反应性细胞毒性。图2F和图2G显示随着小分子缀合抗体浓度的增加，CAR T细胞的剂量反应性细胞毒性，并证明不同的CAR T细胞设计随着小分子缀合抗体量的增加，提供相似的细胞毒性增量。图2H证明相同的CAR T细胞可重新用于靶向一种或多种肿瘤类型。条状图显示将抗小分子CAR T细胞与两个不表达相同抗原的肿瘤群体共同培养的杀灭效率的比较：多形胶质母细胞瘤(GBM)和多发性骨髓瘤(MM)。当肿瘤细胞完全被小分子缀合抗体涂覆时，两个种群体都可以被靶向并杀灭。
图3A至图3B显示指定蛋白质表达水平的热图。图3A显示A172(GBM细胞系)、BT145、BT333(H3.3 WT患者来源的成年GBM细胞系)和BT869(H3-K27M患者来源的儿科DIPG)中GD2、PDGFRα和IL13Rα2表达水平的热图。图3B显示多个骨髓瘤细胞系中CD38，CD20和CS1表达水平的热图。
图4A至图4B分别是化学模型和条状图，其显示小分子抗原可以保护位点特异性CAR T细胞的活性。图4A显示抗荧光素抗体与未掩蔽的荧光素(PBD ID：1X9Q)的结合的化学模型。抗荧光素抗体氨基酸的极性接触以黄色虚线表示。以紫色表示的氨基酸侧链的接触可用保护部分掩蔽，以防止其结合。图4B显示人类抗荧光素CAR T细胞的体外细胞毒性的图，其中肿瘤靶向抗体与具有光响应性邻硝基苄基保护基团的“笼罩/掩蔽”或“未笼罩/未掩蔽”的荧光素衍生物缀合。CAR T细胞特异性地杀灭商购抗体所结合的靶细胞，所述商购细胞与异硫氰酸荧光素(FITC)或紫外线(UV)“未笼罩/未掩蔽”荧光素衍生物缀合。但是，CAR T细胞能够杀灭“笼罩/掩蔽”的荧光素衍生物所结合的靶细胞。
具体实施方式
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本领域技术人员所通常理解的相同含义。如说明书和所附权利要求书中所使用的，为使本发明容易理解，除非有相反的说明，否则下列术语具有以下所指示的含义。
除非上下文另外明确指出，如说明书和所附权利要求书中所用，单数形式“一”、和“所述”包括复数指示物，。因此，举例而言，提及“组合物”包括两种或更多种所述组合物的混合物，提及“抑制剂”包括两种或更多种所述抑制剂的混合物等等。
除非另有说明，否则术语“约”表示经术语“约”修饰的特定值的10％以内(例如，在5％、2％或1％以内)。
过渡术语“包含”与“包括”，“包含”或“由...表征”同义，是包含性的或开放式的，不排除其它未述及的要素或方法步骤。相反地，过渡短语“由……组成”不包括权利要求中未指定的任何要素、步骤或成分。过渡短语“基本上由……组成”将权利要求的范围限制为指定的材料或步骤“以及那些不实质上影响要求保护的发明的基本特征和新颖特征的”。
关于本发明的化合物，以下术语在本文中用于进一步描述其范围，适用以下定义。
术语“特异性结合”是指实质上为特异性的分子间相互作用，因为其涉及靶向部分和实体瘤相关抗原之间的相互作用，且因为靶向部分与存在细胞表面的其它蛋白质实体的结合可能在功能上无关紧要。
术语“特异性结合”是指实质上为特异性的分子间相互作用，因为其涉及合成抗原(或未掩蔽的原始抗原)与CAR T细胞上的细胞外配体之间的相互作用，且因为这些实体与任何其它内源蛋白质的结合可能在功能上无关紧要。
双官能化合物
本发明的一个关键方面是肿瘤细胞靶向与肿瘤细胞杀灭的分离。如图1A示意性所示，CAR T细胞杀灭肿瘤细胞而不直接结合到肿瘤细胞。这通过使用双官能化合物来实现，其中双官能化合物的一个功能部分(合成抗原或未掩蔽的原始抗原)被CAR T细胞结合，而其第二功能部分特异性结合实体瘤相关抗原。
合成抗原
合成抗原是充当CAR-T细胞靶点的小分子或替代性表位。抗原是合成的，因为其未天然存在于人体的任何正常细胞中，并且在CAR T细胞可被设计与其结合的意义上具有抗原性。
通常，“小分子”在本领域中应理解为尺寸小于约5千道尔顿(kDa)的有机分子。在某些实施方案中，所述小分子小于约4kDa、约3kDa、约2kDa或约1kDa。在某些实施方案中，小分子小于约800道尔顿(Da)、约600Da、约500Da、约400Da、约300Da、约200Da或约100Da。
可能适用于本发明的合成抗原的代表性实例包括荧光素、蒽、罗丹明、罗丹、AlexaFluo、吖啶、氧杂蒽(xanthene)、吡嗪、苯丙胺、苯二氮平(benzodiazepine)、苯甲酰基芽子碱(benzoylecgonine)、丁丙诺啡、阿片类药物、大麻素、苯环利定、三环抗抑郁药、右美沙芬、芬太尼、异丙基氨基甲酸酯、美沙酮、甲基苯丙胺、羟考酮、四氢大麻酚(THC)、曲马多(tramadol)、唑吡坦(zolpidem)、氯氨酮(ketamine)、二乙基麦角酰胺(lysergic aciddiethylamide，LSD)、4-亚甲基二氧基甲基苯丙胺(MDMA)、甲喹酮(methaqualone)、丙氧芬(propoxyphene)或去甲基氯氨酮(norketimine)和4-[(6-甲基吡嗪-2-基)氧基]苯甲酸酯(MPOB)、蒽醌-2-羧酸酯(AQ)、四氧杂环十二烷(DOTA)和人类中免疫原性低的肽、糖苷或核苷酸来源的任何抗体(例如，L-α-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯或阿斯巴甜，13-[(2-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]–映-贝壳杉基-16-烯-19-羧基β-D-吡喃葡萄糖基酯(13-[(2-O-β-D-glucopyranosyl-β-D-glucopyranosyl)oxy]-ent-kaur-16-en-19-oicacidβ-D-glucopyranosyl ester)或甜菊苷以及例如诺西那生钠(nusinersen)或spinraza的通用核苷酸)。合成抗原的其它代表性实例是本领域已知的。
可以适用于本发明的荧光素(即，荧光素及其衍生物)的代表性实例包括5-羧基荧光素，6-羧基荧光素，5-(碘乙酰胺基)荧光素，5-([4,6-二氯三嗪-盐酸2-基]氨基)荧光素，5-(溴甲基)荧光素，荧光素5(6)-异硫氰酸酯和荧光素5-氨基甲酰基甲基硫代丙酸。
因此，在某些实施方案中，所述合成抗原是荧光素，所述双官能化合物可以具有由式(I)或(II)表示的结构(若存在连接子，以(L)表示，并且一般表示靶向部分)：
Figure BDA0002859572230000101
R1和R2各自独立为O、OH或H；R1’代表C＝O、O、OH或者H；R3代表
Figure BDA0002859572230000111
Figure BDA0002859572230000112
Figure BDA0002859572230000121
或者
Figure BDA0002859572230000122
其中
Figure BDA0002859572230000123
不存在或为连接子且n为1至12；或其药学上可接受的盐或立体异构体。
适合用作本发明合成抗原的蒽的代表性实例包括蒽醌，蒽醌-2-羧酸酯，2-氨基蒽醌，2-碘蒽醌，2-氯蒽醌，2-溴蒽醌，2-乙炔基蒽醌，2-氰基蒽醌，蒽醌-2-磺酸盐，蒽醌-2-羰基氯和2-羟基蒽醌。
L.在某些实施方案中，所述合成抗原是蒽，所述双官能化合物可具有由式(III)表示的结构(如果存在连接子的话，以(L)表示，且一般显示靶向部分)：
Figure BDA0002859572230000134
R4、R4’各自独立为O或者OH；以及R5为
Figure BDA0002859572230000132
Figure BDA0002859572230000133
Figure BDA0002859572230000141
Figure BDA0002859572230000151
或者
Figure BDA0002859572230000152
其中
Figure BDA0002859572230000153
不存在或者为连接子并且n为1至12；或者为药学上可接受的盐或者立体异构物。
一些其它实施方案中，其中所述小分子是蒽，所述双官能化合物可具有由式(III-1)表示的结构：
Figure BDA0002859572230000154
R4、R4’、和R5如前述定义或者为药学上可接受的盐或者立体异构物。
在某些实施方案中，所述合成抗原是MPOB，所述双官能化合物可具有如(IV)所示的结构：
Figure BDA0002859572230000161
其中R6为
Figure BDA0002859572230000162
Figure BDA0002859572230000163
Figure BDA0002859572230000171
Figure BDA0002859572230000181
或者
Figure BDA0002859572230000182
其中
Figure BDA0002859572230000183
不存在或者为连接子，并且n是1至12；或者为药学上可以接受的盐或者立体异构物。
原始合成抗原(原始抗原)
在某些实施方案中，所述合成抗原包含保护基团。被保护的合成抗原在本文中称为“原始抗原”。所述保护基团在本文中也称为“掩蔽”或“笼罩”。抗原是惰性的，其不会结合CAR-T细胞并引起活化，除非且直到暴露于适当的刺激下使其变得未掩蔽或未笼罩时为止，其例子包括某些波长的光和反应性化学物质﹐导致保护基团的移除。因此，在某些实施方案中，“掩蔽”或“笼罩”阻却实体瘤部位之外的CAR T细胞反应性。
在某些实施方案中，保护基团的结构域是对反应性化学物质(即活性氧物质(ROS)和/或活性氮物质(RNS))敏感的硼酸酯。当组织暴露于外部射线辐射(例如X射线、γ射线、更高的紫外线)时，高水平的ROS和/或RNS与原始抗原发生反应，从而导致原始抗原不被掩蔽，进而产生CAR T细胞可近的合成抗原。
在某些实施方案中，硼酸酯基团是硼酸频那醇酯(boronic pinacol)或硼酸频烷二醇(boronic pinanediol)。硼酸酯的代表性实例包括
Figure BDA0002859572230000191
因此，在原始抗原是荧光素的某些实施方案中，所述双官能化合物可具有由式(V)或(VI)表示的结构(若连接子存在，以(L)表示，并一般表示靶向部分)：
Figure BDA0002859572230000192
R1独立为O、OH或者一个保护基团，R1’独立为C＝O、O、OH或者一个保护基团，R2独立地为O、OH或者一个保护基团；以及
R3为
Figure BDA0002859572230000193
Figure BDA0002859572230000194
Figure BDA0002859572230000201
Figure BDA0002859572230000211
、或者
Figure BDA0002859572230000212
其中
Figure BDA0002859572230000213
不存在或者为连接子且n为1至12；条件是R1、R1’和R2中至少一个是保护基团；或其药学上可接受的盐或立体异构体。在某些实施方案中，R1和R2或R1'和R2均为保护基团。
在某些实施方案中，其中原始抗原是含有硼酸酯保护基团的荧光素，所述双官能化合物可具有由式(VII)表示的结构：
Figure BDA0002859572230000221
其中R1是O、OH或硼酸酯保护基团；
R2是O、OH或硼酸酯保护基团；条件是R1和R2中至少一个是硼酸酯保护基团；以及
R3为
Figure BDA0002859572230000222
Figure BDA0002859572230000223
Figure BDA0002859572230000231
Figure BDA0002859572230000241
或者
Figure BDA0002859572230000242
其中
Figure BDA0002859572230000243
不存在或者为连接子且n为1至12；其中硼酸酯保护基团是
Figure BDA0002859572230000244
Figure BDA0002859572230000251
或其药学上可接受的盐或立体异构体。在某些实施方案中，R1和R2均为硼酸酯保护基团。
在某些实施方案中，所述双官能化合物具有式(VIIa)表示的结构：
Figure BDA0002859572230000252
或其药学上可接受的盐或立体异构体。
在某些实施方案中，所述双官能化合物具有式(VIIa1)表示的结构：
Figure BDA0002859572230000253
Figure BDA0002859572230000254
或其药学上可接受的盐或立体异构体。
在某些实施方案中，所述双官能化合物具有式(VIIb)表示的结构：
Figure BDA0002859572230000255
或其药学上可接受的盐或立体异构体。
在某些实施方案中，双官能化合物具有由下式表示的结构：
Figure BDA0002859572230000261
或其药学上可接受的盐或立体异构体。
在某些实施方案中，所述原始抗原是蒽，所述双官能化合物可具有由式(VIII)表示的结构(若存在连接子，以(L)表示，并且一般表示靶向部分)：
Figure BDA0002859572230000262
其中R4和R4’分别独立地是O或保护基团，条件是R4和R4’中至少一个为保护基团；以及R5为
Figure BDA0002859572230000263
Figure BDA0002859572230000271
Figure BDA0002859572230000281
、或者
Figure BDA0002859572230000282
其中
Figure BDA0002859572230000283
不存在或者为连接子且n为1至12；或其药学上可接受的盐或立体异构体。在某些实施方案中，R4和R4’均为保护基团。
在某些实施方案中，所述原始抗原是含有硼酸酯保护基团的蒽，所述双官能化合物可以具有式(VIII-1)表示的结构：
Figure BDA0002859572230000291
其中R4和R4’各自独立地是O或硼酸酯保护基团；条件是R4和R4’中至少一个是保护基团；以及R5为
Figure BDA0002859572230000292
Figure BDA0002859572230000293
Figure BDA0002859572230000301
Figure BDA0002859572230000311
、或者
Figure BDA0002859572230000312
其中
Figure BDA0002859572230000313
不存在或者为连接子且n为1至12；其中硼酸酯保护基团为
Figure BDA0002859572230000314
或其药学上可接受的盐或立体异构体。
在某些实施方案中，R4和R4’各自为硼酸酯保护基团。因此，在某些实施方案中，所述双官能化合物具有式(VIII-1a)表示的结构：
Figure BDA0002859572230000321
或者药学上可接受的盐类或者立体异构物。
在一些其它实施方案中，所述双官能化合物具有式(VIII-1b)表示的结构：
Figure BDA0002859572230000322
或其药学上可接受的盐或立体异构体。
在一些其它实施方案中，保护基团全部或部分是光敏的，即，光可裂解的。如本文所用的术语“光敏的”和“光可裂解的”是可互换的。在某些实施方案中，保护结构域由一个或多个光可裂解的基团组成。当将光可裂解基团暴露于适当波长的光时，原始抗原被掩蔽的部位被打开，从而产生所述合成抗原。本领域技术人员能够根据本领域已知的通常知识确定合适的光保护基团和相应的波长选择去保护基团。参见，例如，Hansen，et al.，Chem.Soc.Rev.44：3358-77(2015)。
光可裂解基团的代表性实例包括基于邻硝基苄基的基团，基于苯甲酰酯的基团，8-喹啉基苯磺酸酯基，双香豆素基团，6-溴-7-烷氧基香豆素-4-基甲氧基羰基，基于bimane的基团以及含双-芳基腙(hydrazone)的基团。一般结构和裂解条件如下(虚线表示裂解位点)：
Figure BDA0002859572230000331
基于邻硝基苄基的连接子在300-365nm处裂解、
Figure BDA0002859572230000332
基于苯甲酰酯的连接子可在254nm处裂解、
Figure BDA0002859572230000333
8-哇啉基苯磺酸酯连接子可在313nm处裂解、
Figure BDA0002859572230000341
双香豆素连接子可在532nm处裂解、
Figure BDA0002859572230000342
6-溴-7-烷氧基香豆素-4-基甲氧基羰基连接子可在330nm处裂解、
Figure BDA0002859572230000343
基于bimane的连接子，在MALDI条件下可裂解、以及
Figure BDA0002859572230000351
基于双-芳基腙的连接子，在MS条件下可在355nm处裂解。
在某些具体实施例中，光可裂解的保护基团为
Figure BDA0002859572230000352
其中X为NH或O，R为C1-4烷基或H，且n为0-3。在某些实施方案中，含邻硝基苄基的基团在300-365nm处被切割。
Figure BDA0002859572230000353
在某些实施方案中，具有光可裂解的保护基团的双官能化合物具有由式(IX)表示的结构：
Figure BDA0002859572230000354
其中R6为
Figure BDA0002859572230000355
Figure BDA0002859572230000356
Figure BDA0002859572230000361
Figure BDA0002859572230000371
、或者
Figure BDA0002859572230000372
其中
Figure BDA0002859572230000373
不存在或者为连接子且n为1至12的整数。
在某些实施方案中，具有光可裂解保护基团的双官能化合物具有由式(IX-1)表示的结构：
Figure BDA0002859572230000381
Figure BDA0002859572230000382
或其药学上可接受的盐或立体异构体。
本领域已知可用于合成本发明的双官能化合物的方法描述于Lin et al.,Meth.Enzymol.526:19-43(2013)(以及其中引用的出版物)；Chang et al.,J.Am.Chem.Soc.126(47):15392-3(2004)(以及其中引用的出版物)；Dickinson et al.,J.Am.Chem.Soc.132(16):5906-15(2010)(以及其中引用的出版物)；Debowska et al.,Chemical Research in Toxicology 29(5):735-46(2016)；Rios et al,Free RadicalBiology&Medicine 101:284-95(2016)；和Wang et al.,ACS Applied Materials&Interfaces 7(43):24110-18(2015)。
靶向部分
靶向部分构成本发明的双官能化合物的功能形式之一，特异性结合实体瘤相关抗原。
根据本发明，靶向部分对可能存在于肿瘤细胞上的实体肿瘤相关抗原具有结合特异性。相对于其在正常、未患病的细胞中的表达，这些与肿瘤相关的抗原可能在肿瘤细胞中过度表达。在正常组织上的较低表达会更有效地减少合成抗原在正常组织上的可用性。因此，本发明增加了“靶上、肿瘤上”的可靶向抗原的数量，还通过降低“靶上、肿瘤外”的毒性来实现更好的控制。
在某些实施方案中，肿瘤抗原是在癌细胞中不当合成的细胞表面分子。例如，与正常细胞上表达的分子相比，其包含缺失、添加或突变的分子。在某些实施方案中，肿瘤相关抗原是主要组织相容性复合物(MHC)呈递的肽。通常，源自内源性蛋白质的肽充满MHC I类分子的袋状构造，并被CD8+T淋巴细胞上的T细胞受体(TCR)识别。MHC I类复合物由所有有核细胞组成性表达。在癌症中，具病毒特异性和/或肿瘤特异性的肽/MHC复合物代表用于免疫治疗的一类独特的细胞表面靶点。在某些实施方案中，肿瘤抗原是与正常细胞相比在癌细胞中过度表达的细胞表面分子，例如，与正常细胞相比过度表达1倍，过度表达2倍，过度表达3倍或更多。
所述靶向部分的代表性实例包括抗体分子及其功能性(即，抗原结合)片段，受体配体，肽，半抗原，适体，亲和物，T细胞受体四聚体和本领域技术人员已知的其它靶向分子。例如，靶向部分可以包括核酸，多肽，糖蛋白，碳水化合物或脂质。
在某些具体实施例中，所述靶向部分是抗体或抗体片段。抗体的代表性实例包括单克隆抗体，多克隆抗体，Fv，Fab，Fab’和F(ab’)2免疫球蛋白片段，合成稳定的Fv片段，例如单链Fv片段(scFv)，二硫键稳定的Fv片段(dsFv)，单可变区结构域(dAbs)微型抗体，组合抗体和多价抗体(例如双抗体和多重-scFv)，骆驼科动物或工程改造人类等效物的单域。术语“抗体”还包括具有与免疫球蛋白结合结构域同源或很大程度上同源的结合结构域的任何蛋白质。这样的蛋白质可以源自天然来源，或部分或全部合成产生。
在某些具体实施例中，所述靶向部分是亲和体。亲和体蛋白由支架组成，支架是基于胱抑素蛋白折叠的稳定蛋白，其显示两个肽环和一个N端序列，可以将其随机化以与抗体相似的高亲和力和特异性结合不同的靶蛋白。肽在蛋白质支架上的稳定作用限制所述肽可能采取的构象，因此与游离肽资料库相比增加了结合亲和力和特异性。
在某些具体实施例中，所述靶向部分是与细胞类型特异性标志物结合的核酸分子(例如，适体)。适体是短的合成单链寡核苷酸，其特异性结合各种分子靶点，例如小分子、肽、蛋白质、核酸，甚至细胞和组织。这些小核酸分子可以形成能够特异性结合蛋白质或其它细胞靶点的二级和三级结构，并且实质上是抗体的化学等同物。适体是高度特异性的，相对较小，并且是非免疫原性的。适体通常选自被称为SELEX(通过指数富集的配体的系统进化)的生物淘选方法(Ellington et al.Nature 346(6287):818-822(1990)；Tuerk etal.,Science 249(4968):505-510(1990)；Ni et al.,Curr Med Chem.(2011)；18(27):4206-14)。产生用于任何给定靶点的适体的方法是本领域众所周知的。
在某些实施方案中，所述靶向部分是细胞表面受体的天然存在或合成的配体。
在某些实施方案中，所述靶向部分是碳水化合物。碳水化合物可以是天然的或合成的。所述碳水化合物可以是衍生的天然碳水化合物。在某些实施方案中，所述碳水化合物包括单糖或双糖，包括但不限于葡萄糖、果糖、半乳糖、核糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、海藻糖、纤维素二糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、葡糖酸、半乳糖醛酸、甘露糖醛酸、葡萄糖胺、半乳糖胺或神经氨酸。在某些实施方案中，所述碳水化合物是多糖，例如但不限于支链淀粉、纤维素、微晶纤维素、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟纤维素(HC)、甲基纤维素(MC)、葡聚糖、环葡聚糖、糖原、淀粉、羟乙基淀粉、角叉菜胶、糖蛋白、直链淀粉、壳聚糖、N、,O-羧甲基壳聚糖、海藻酸和藻酸、淀粉、甲壳质、魔芋、葡甘露聚糖、脓疱素、肝素、透明质酸、柯德兰和黄原胶。在某些实施方案中，碳水化合物是糖醇，例如但不限于甘露醇、山梨糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇或乳糖醇。
在某些实施方案中，所述靶向部分被定向到由产生升高水平的ROS和/或RNS的实体瘤表达的TAA。在几乎所有癌症中都检测到活性化学物质(ROS/RNS)的产生增加，其中它们促进肿瘤发展和进程的许多面向(Liou et al.,Free Radic.Res.44:479-496(2010)；Trachootham et al.,Nat.Rev.Drug Discov.8:579-591(2009))。细胞代谢改变被认为是癌症的标志，并迅速成为治疗干预的途径。线粒体最近被视为促进癌细胞新陈代谢需求的重要细胞区室，因为线粒体是满足癌细胞的生物能和生物合成需求所必需的ATP和代谢产物的主要来源。此外，线粒体是细胞死亡的关键，也是产生活性氧的主要来源(ROS；Chowdhury,et al.,Oxid.Med.Cell.Longev.2018:1-10(2018)；Zhang,et al.,Oxid.Med.Cell.Longev.2016:1616781(2016))。体外对肿瘤细胞系的广泛分析表明，它们通常具有以下特征：i)细胞外超氧阴离子的产生和ii)膜相关过氧化氢酶的表达，所述酶保护细胞免受细胞间ROS信号传导和细胞凋亡。
靶向部分及其在肿瘤细胞上的相应受体的代表性实例列于表1中：
表1
Figure BDA0002859572230000411
Figure BDA0002859572230000421
Figure BDA0002859572230000431
Figure BDA0002859572230000441
Figure BDA0002859572230000451
Figure BDA0002859572230000461
Figure BDA0002859572230000471
Figure BDA0002859572230000481
Figure BDA0002859572230000491
Figure BDA0002859572230000501
在某些实施方案中，靶向配体结合血液肿瘤相关抗原。例如，存在于多发性骨髓瘤细胞上的肿瘤相关抗原并可被本发明双官能化合物靶向的，包括CD38、CS1、BCMA、CD20、CD19、CD22、CD30、CD138、CD40、CD56、CD70、CD70和CD74的任何和所有组合。例如，CD38、CS1、BCMA、CD20、CD19、CD22、CD30、CD138、CD40、CD56、CD70和CD74中的两个或多个的组合。
在某些实施方案中，靶向配体结合脑肿瘤相关抗原。例如，存在于GBM细胞上的肿瘤相关抗原，包括ACVR1，EGFRvIII、IL13R132和HER2。例如，图1B表示了用于治疗脑癌，同时靶向EGFRvIII、IL13Rα2和HER2的复用方法。与脑癌相关联并且可以被本发明的双官能化合物靶向的其它蛋白质包括EphA2、CSPG4、GD2、PDGFRα和GRP78。结合脑肿瘤相关抗原的抗体和/或其功能片段是本领域已知的。参见，例如上表1，其尤其描述了结合ACVR1、PDGFRα、GD2和EphA2的抗体和/或其片段。结合PDGFR 1的靶向部分可包括基于Olaratumab的scFv(及其结合变体)。
在某些实施方案中，靶向配体与HER2+恶性肿瘤上的HER2结合，例如乳腺癌、肺癌、结肠直肠癌、脑癌、卵巢癌和胰腺癌。可用于本发明的与HER结合的代表性靶向配体，包括曲妥珠单抗(Trastuzumab)和帕妥珠单抗(Pertuzumab)，它们分别结合HER的细胞外结构域IV和II以及它们的HER结合片段(例如，scFv)。
结合EGFRvIII的抗体片段在O'Rourke,et al.,Sci.Transl.Med.9(399):eaaa0984(2017)中有所描述。结合EGFRvIII的其它抗体或其片段是可商购的siltuximab和mAb DH8.3(Novus Biologicals)。在美国专利申请公开2015/0259423中已找到可用于本发明编码靶向EGFRvIII的scFv的氨基酸或基因序列的其它代表性实例。
结合IL13R 12的抗体片段在Brown,et al.,N.Engl J Med.375(26):2561-2569(2016)中有所描述。结合IL13Rα2的其它抗体或其片段可自Abnova和Millipore商购获得。
与HER2结合的抗体片段在Ahmed,et al.,JAMA Oncol.3(8):1049-1101(2017)有所描述。与HER2结合的其它抗体或其片段是可商购的，包括曲妥珠单抗(trastuzumab)和FRP5。在美国专利申请公开号2011/0313137中已找到可用于本发明编码靶向HER2的scFv的氨基酸或基因序列的其它代表性实例。
与EphA2结合的抗体片段的另一个例子在Chow,et al.,Mol Ther.21(3):629-637(2013)中有所描述。与EphA2结合的其它抗体或其片段可自Thermo Fisher(mAb4H5和mAb1C11A12)和RND Systems商购获得。美国专利申请公开2010/436783中描述了可用于本发明的编码靶向EphA2的scFv的氨基酸或基因序列的其它代表性实例。
与CSPG4结合的抗体片段在Pellegatta,et al.,Sci Transl Med,10:eaao2731(2018)中有所描述。与CSPG4结合的另一种抗体描述于Fenton et al.,Oncol Res.22(2):117-21(2015)。与CSPG4结合的其它抗体或其片段是可商购获得的贝伐单抗(bevacizumab)和Creative Biolabs mAb 225.28。与CSPG4结合的其它抗体或其片段可购自AvivaSystems Biology。美国专利9,801,928和美国专利申请公开号2019/0008940中描述了可在本发明中使用的编码靶向CSPG4的scFv的氨基酸或基因序列的其它代表性实例。
与GD2结合的抗体片段的另一个实例在Mount et al.,Nat Med.24:572-579(2018)中有所描述。与GD2结合的其它抗体或其片段包括Dinutuximab、mAb 3F8、mAb 14g2a和mAb 14.18。美国专利4,675,287中描述了可在本发明中使用的编码靶向GD2的scFv的氨基酸或基因序列的其它代表性实例。
与PDGFRα结合的抗体片段的另一个实例在Brennan et al.,PLoS One,4(11):e7752(2009)中有所描述。与PDGFRα结合的其它抗体或其片段可自Abcam，LifeSpan Bio，Santa Cruz(sc-338)和Thermo Fisher(mAb APA5)商购获得。美国专利申请公开号2012/0027767中描述了可在本发明中使用的编码靶向PDGFR 3的scFv的氨基酸或基因序列的其它代表性实例。
与GRP78结合的抗体片段在Kang et al.,Sci Rep.6:34922(2016)中有所描述。与GRP78结合的其它抗体或其片段可商购自Thermo Fisher(PA1-014A)和Abcam(N-20)。美国专利10,259,884中已描述编码靶向GRP78的scFvs的氨基酸或基因序列的其它代表性实例。
与脑癌相关联并且可被本发明的双功能化合物靶向的其它蛋白质包括神经细胞粘附分子(NCAM)，分化簇276(CD276)和神经外胚层干细胞标记物(Nestin)。
与NCAM结合的抗体于Modak et al.,Cancer Res.61:4048-4054(2001)中有所描述。与NCAM结合的其它抗体或其片段是mAb UJ13A和mAb ERIC-1。在美国专利7,402,560中已描述可在本发明中使用的编码靶向NCAM的scFv的氨基酸或基因序列的其它代表性实例。
与CD276结合的抗体于Majzner et al.,Clin Cancer Res.25(8):2560-2574(2019)中有所描述。与CD276结合的其它抗体或其片段可自Creative Biolabs(mAb 8H9)商购获得。美国专利申请公开号2018/0186890中已描述可用于本发明的编码靶向CD276的scFv的氨基酸或基因序列的其它代表性实例。
与巢蛋白结合的抗体或其片段可购自Abcam(ab6142)和Novus Biologicals(NB100-1604)。与βIII-微管蛋白结合的抗体或其片段可自Abcam(2G10)和RND Systems(mAB 1195)商购获得。
结合CD38的抗体片段的另一个实例描述于Mihara et al.,J Hematol Oncol.10:1–4(2017)。结合CD38的其它抗体或其片段包括购自Miltenyi(REA572和REA671)，Biolegend(HIT2和HB-7)的市售抗体。美国专利9,249,226中描述了可用于本发明的编码靶向CD38的scFv氨基酸或基因序列的其它代表性实例。
结合CS-1的抗体片段的另一个实例描述于Chu et al.,Blood,122:14(2013).。结合CS-1的其它抗体或其片段是可商购的，包括REA150(Miltenyi)或162.1(Biolegend)。国际公开号WO 2004/100898 A2中描述了可在本发明中使用的编码靶向CS-1的scFv的氨基酸或基因序列的其它代表性实例。
结合CD138的抗体片段的另一个例子在Sun et al.,Oncotarget 10(24):2369–2383(2019)中进行了描述。结合CD138的其它抗体或其片段可商购获得，包括44F9(Miltenyi)或DL-101和MI15(Biolegend)。国际公开号WO 2009/080829A1中描述了可在本发明中使用的编码靶向CD138的scFv的氨基酸或基因序列的其它代表性实例。
结合CD20的抗体片段的另一个实例在Wang et al.,Clin Immunol.,155(2):160-75(2014)Wang et al.,Clin Immunol.,155(2):160-75(2014)中有所描述。结合CD20的其它抗体或其片段是可商购的，包括LT20和REA780(Miltenyi)或2H7和SA271G2(Biolegend)。国际公开号WO 2004/056312A2中描述了可在本发明中使用的编码靶向CD20的scFv的氨基酸或基因序列的其它代表性实例。
结合BCMA的抗体片段的另一个实例描述于Raje et al.,N Engl J Med.380(18):1726-1737(2019)。结合BCMA的其它抗体或其片段可商购获得，包括REA315(Miltenyi)和19F2(Biolegend)。国际公开号WO 2010/104949A2和WO 2003/014294A2中描述了可在本发明中使用的编码靶向BCMA的scFv的氨基酸或基因序列的其它代表性实例。
结合CD19的抗体片段的另一个实例描述于Lee et al.,Lancet.385(9967):517-528(2015)。结合CD19的其它抗体或其片段是可商购的，包括LT19，REA675(Miltenyi)或4G7，HIB19，SJ25C1(Biolegend)。国际公开号WO 2005/052004A2中描述了可在本发明中使用的编码靶向CD19的scFv的氨基酸或基因序列的其它代表性实例。
结合CD22的抗体片段的另一个实例描述于Haso et al.,Blood 121(7):1165-1174(2013)。结合CD22的其它抗体或其片段是可商购的，包括REA340(Miltenyi)或HIB22和S-HCL-1(Biolegend)。美国专利5,484,892中描述了可在本发明中使用的编码靶向CD22的scFv的氨基酸或基因序列的其它代表性实例。
结合CD30的抗体片段的另一个实例在Ramos et al.,Blood 132:680(2018)中有所描述。结合CD30的其它抗体或其片段是可商购的，包括REA1085和Ki-2(Miltenyi)或BY88(Biolegend)。美国专利7,090,843中描述了可用于本发明的编码靶向CD30的scFv的氨基酸或基因序列的其它代表性实例。
结合CD40的抗体片段的另一个例子在Hussein et al.,Haematologica 95:845–848(2010)中有所描述。结合CD40的其它抗体或其片段是可商购的，包括REA733和HB14(Miltenyi)或5C3或HB14(Biolegend)。国际专利申请WO 2012/075111 A1和WO 2016/069919 A1中描述了可在本发明中使用的编码靶向CD40的scFv的氨基酸或基因序列的其它代表性实例。
结合CD70的抗体片段的另一个实例在Shaffer et al.,Blood 117:4304–14(2011)中有所描述。结合CD70的其它抗体或其片段可商购获得，包括REA292(Miltenyi)或113-16(Biolegend)。国际专利申请WO 2004/073656 A2中描述了可在本发明中使用的编码靶向CD70的scFv的氨基酸或基因序列的其它代表性实例。
结合CD74的抗体片段的另一个实例在Kaufman et al.,Br J Haematol.163:478–486(2013)描述。结合CD74的其它抗体或其片段是可商购获得的，包括5-329和REA1103(Miltenyi)和LN2(Biolegend)。在国际专利申请WO 2003/074567 A2中描述了可在本发明中使用的编码靶向CD74的scFv的氨基酸或基因序列的其它代表性实例。
本发明的双官能化合物可以根据本领域已知的方法合成。参见如WO2010/008519。例如，合成抗原可以衍生为具有与一级胺(例如，多肽的N-端胺或赖氨酸)或巯基(例如，多肽的半胱氨酸)反应的化学基团，所述多肽构成靶向部分双官能化合物。可以通过使用诸如化学偶联和化学交联剂的技术将靶向部分与合成抗原(或原始抗原)缀合来制备双官能化合物。在某些实施方案中，合成抗原可以通过连接子与靶向部分缀合。可能需要连接子的一些因素包括：必须重建用于产生针对未修饰的原始抗原(即标签)的抗体的微环境，所述抗原用于基因工程化CAR-T细胞，必须暴露小分子于溶剂使其可进入CAR-T细胞的细胞外标签结合结构域，特别是疏水性小分子可受益于亲水/极性连接子的使用，例如聚乙二醇(PEG)。连接子的长度可以变化，但是以较短的连接子为佳，因为靠近靶细胞的标签可以更好地引发针对靶细胞的CAR-T细胞应答。疏水/非极性连接子的代表性实例包括脂族连接子，例如甘氨酸，氨基庚酸，氨基己酸，氨基戊酸和氨基四酸。极性连接子的代表性实例包括具有例如1至12个重复单元(例如2、4、6、8、10或12个重复单元)的聚乙二醇部分。
例如，如方案1所示，可使6-氨基荧光素与马来酰亚胺-PEG-N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS酯)反应以形成化合物(1)。
方案1：
Figure BDA0002859572230000551
如方案2所示，马来酰亚胺荧光素衍生物化合物(1)再与靶向部分的巯基反应，通过硫醚键形成稳定的缀合物。
方案2：
Figure BDA0002859572230000561
方案3和4所示，具有被掩蔽的原始抗原的双官能化合物的合成的代表性实例：
方案3：
Figure BDA0002859572230000562
方案4：
Figure BDA0002859572230000571
接着可以如方案2中所示，将化合物(2)和(3)分别代替化合物(1)，以产生本发明的双官能化合物。
如方案5中所示，另一个代表性实例为使用具荧光素的NHS-酯衍生物合成具有被掩蔽的原始抗原的双官能化合物：
方案5：
Figure BDA0002859572230000572
其中OR被硼酸酯取代并且R’是靶向部分。
如本文所述，双官能化合物可以是游离酸或游离碱或药学上可接受的盐的形式。本文中所用的术语“药学上可接受的”是指化合物的盐，所述化合物的生物学活性或性质未消除，相对是无毒的，即可将盐形式的化合物施用给受试者，且不会引起不良生物学效应(例如头晕或胃部不适)或以有害的方式与组合物中所含的任何其它组分相互作用。术语“药学上可接受的盐”是指通过本文所述的化合物与合适的酸或碱反应获得的产物。本文所述化合物的药学上可接受的盐的实例，包括衍生自合适的无机碱的盐，例如Li、Na、K、Ca、Mg、Fe、Cu、Al、Zn和Mn盐。药学上可接受的无毒酸加成盐的实例是与无机酸形成的氨基的盐，所述无机酸可为例如盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硝酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、异烟酸盐、乙酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐、富马酸盐、葡萄糖酸盐、古洛糖酸盐、蔗糖酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、4-甲基苯磺酸盐或对甲苯磺酸盐等。本文所述的某些化合物可以与各种有机碱例如赖氨酸、精氨酸、胍、二乙醇胺或二甲双胍形成药学上可接受的盐。合适的碱式盐包括铝、钙、锂、镁、钾、钠或锌的盐。
如本文揭示的各种结构，本文所述的双官能化合物可以呈立体异构体的形式，如本领域已知的，是指仅其原子在空间中的取向不同的单个化合物的异构体。因此，术语立体异构体包括化合物的镜像异构体(对映异构体)，化合物的镜像异构体的混合物(对映异构体的物理混合物，外消旋体或外消旋混合物)，几何(顺/反或E/Z，R/S)化合物的异构体以及具有大于一个的手性中心的化合物的异构体，彼此互不镜像(非对映异构体)。本文所述的化合物可以是单独的异构体的形式，并且基本上没有其它异构体，或者是各种异构体的混合物的形式，例如立体异构体的外消旋混合物。
药物成分
药物组合物包含治疗有效量的双官能化合物和药学上可接受的载体。在某些实施方案中，药物组合物可进一步包含另一种(例如，第二种)双官能化合物，其包含第一合成抗原，共价连接至第二靶向部分，所述第二靶向部分结合相同(例如，第一)肿瘤相关抗原的不同表位，或包含药学上可接受的盐或立体异构体。因此，所述组合物可以包含两种或更多种双官能化合物，可全部结合相同的肿瘤相关抗原，但是其中至少两种双官能化合物结合相同肿瘤相关抗原上的不同表位。在其它实施方案中，药物组合物可以进一步包括另一种(例如，第二种)双官能化合物，其包含与第二靶向部分共价连接的合成抗原，其中第二靶向部分与不同的肿瘤相关抗原(例如，与第一肿瘤相关抗原不同的)结合，或者包括药学上可接受的盐或其立体异构体。因此，所述组合物可以包含两种或更多种双官能化合物，其全部结合不同的肿瘤相关抗原，并且其中至少两种双官能化合物结合不同肿瘤相关抗原上的不同表位。
本发明的第二个关键方面涉及治疗有效量的双官能化合物的多个亚群的用途，其中每个亚群对不同的肿瘤相关抗原具有特异性，但是所有亚群对CAR T细胞具有相同的特异性(例如，所有双官能化合物均含有相同的合成抗原)。因此，在某些实施方案中，药物组合物包含治疗有效量的双官能化合物的多个亚群，其中在每个亚群中，合成抗原(或原始抗原)相同，但是各自的靶向部分不同之处在于它们结合存在于肿瘤细胞上的不同的肿瘤相关抗原。因此，所述药物组合物可包含双官能化合物的第一亚群，所述双官能化合物的第一亚群具有与特异性结合第一肿瘤相关抗原的第一靶向部分共价连接的合成抗原(或原始抗原)，以及所述双官能化合物的第二亚群，其分别具有共价连接到第二靶向部分的合成抗原(或原始抗原)，其中第一和第二肿瘤相关抗原是不同的。
在一些实施方案中，第一和第二靶向部分特异性结合脑肿瘤相关抗原。在一些实施方案中，脑肿瘤相关抗原选自GD2、IL13Rα2、HER2、PDGFRα、EGFRvIII、CSPG4、EphA2、CD133、GRP78、NCAM、CD276和Nestin，其中第一和第二靶向部分结合相同的肿瘤相关抗原或者不同的脑肿瘤相关抗原上的不同表位。在一些实施方案中，双官能化合物的多个亚群被设计成靶向两种或更多种脑肿瘤相关抗原，所述抗原选自GD2、IL13Rα2、HER2、PDGFRα、EGFRvIII、CSPG4、EphA2和CD133。在一些实施方案中，多个亚群靶向IL13Rα2、EGFRvIII和HER2中的两个或更多个，并且在一些其它实施方案中，多个亚群靶向GD2、PDGFRα和CD133中的两个或更多个。在另外的实施方案中，双官能化合物的多个亚群靶向EphA2和CSPG4。
在某些实施方案中，第一和第二靶向部分特异性结合血液肿瘤相关抗原。在某些实施方案中，血液肿瘤相关抗原选自CD38、CS1、BCMA、CD20、CD19、CD22、CD30、CD138、CD40、CD56、CD70和CD74，其中第一和第二靶向部分结合相同肿瘤相关抗原或不同血液肿瘤相关抗原的不同表位。在某些实施方案中，双官能化合物的多个亚群被设计为靶向两种或更多种血液肿瘤相关抗原，所述抗原选自CD38、CS1、BCMA、CD20、CD19、CD22、CD30、CD138、CD40、CD56、CD70和CD74。在某些实施方案中，多个亚群靶向CD38、CS1和BCMA中的两个或更多个，并且在一些其它实施方案中，多个亚群靶向CD19、CD20和CD22中的两个或更多个。在另外的实施方案中，多个亚群靶向CD30、CD40、CD56、CD70、CD74和CD138。
在某些实施方案中，药物组合物可以依据不同施用方法而不同。因此，本发明的具体实施例可以包括如上所述的第一组合物，和与第一组合物不同的第二组合物，不同点在于任何一个或多个亚群的靶向部分与相同的肿瘤相关抗原上的不同表位结合。所述附加特征可以减轻抗原丢失/逸出或改善毒性。
CAR T细胞
对CAR T细胞进行工程改造以结合合成抗原或未掩蔽的原始抗原，这两种抗原都不是天然存在于任何正常或癌细胞上的。因此，通过使对肿瘤细胞的靶向与肿瘤细胞的杀死脱钩，具有单一特异性(针对合成抗原或未掩蔽的原始抗原)的CAR T细胞可以同时靶向多种肿瘤相关抗原。
可将作用细胞用于本发明的方法。作用细胞可以是自体的，同源或同种异体的，其选择取决于待治疗的疾病和可用的手段。可以在所述方法中使用的作用细胞的合适群体包括任何具有细胞溶解活性的免疫细胞，例如T细胞。T细胞的示例性亚群包括表达CD3+等，例如CD3+CD8+T细胞，CD3+CD4+T细胞和NKT细胞。尽管在某些实施方案中，T细胞是HLA-A2+外周血单核细胞(PBMC)，但是它们可以是来自PBMC的任何HLA背景，并且可以用于自体，同源或同种异体系统。T细胞也可以从任何来源分离，包括从被治疗对象的肿瘤外植体或被治疗对象的肿瘤内T细胞中分离。为了方便起见，在下文中将作用细胞称为T细胞，但是应当理解，除非另外指出，否则本文对T细胞的任何提及是对本文定义的所有作用细胞类型的提及。
本发明中使用的基因工程T细胞对特定未掩蔽的原始抗原(在本文中也称为标签)具有结合特异性，所述特定未掩蔽的原始抗原与靶向部分(例如抗体或其功能片段)缀合，所述靶向部分与肿瘤相关抗原结合。CAR的其它特征可包括一个激活域，所述激活域可在与T细胞结合和激活后诱导有效的靶点溶解，以及具有以对本发明的任何未掩蔽的原始抗原或标签具有特异性者替代或替换所述CAR的scFv部分的能力。就CAR T细胞的设计和特异性观点而言，可以称为通用CAR-T细胞或二元活化T细胞(BAT-CARs)。
BAT-CAR多肽通常包括三个结构域。第一个结构域是细胞外配体或标签结合结构域；第二个结构域是跨膜(TM)域；第三个结构域是T细胞激活域。
胞外配体
第一结构域通常存在于BAT-CAR多肽的氨基末端，因此位于T细胞外部，从而允许标签结合结构域不受约束地进入与靶细胞结合的标签蛋白。标签结合结构域通常是抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，抗体是人或人源化抗体或其抗原结合片段。
标签结合域被设计成可特异性结合合成抗原，所述合成抗原共价连接靶向部分，所述靶向部分与靶细胞(例如癌细胞)结合。例如，当合成抗原是荧光素或被保护基团衍生的荧光素衍生物时，标签结合结构域会特异性结合未遮蔽或未掩蔽的荧光素或荧光素衍生物，但不结合遮蔽的分子。此类结合部分的实例是本领域已知的，例如，4M5.3 ScFv，揭示于Midelfort et al.J.Mol.Biol.343:685-701(2004)和2D12.5,2D12.5ds或C8.2.5，揭示于Orcutt et al.Nucl.Med.Biol.38(2):223-233(2011).
抗体的类型可以是多克隆的、单克隆的、嵌合的或人源化的。抗体可得自任何动物物种，例如人、猿猴、小鼠、大鼠、兔、豚鼠、马、牛、绵羊、山羊、猪、狗或猫。对可以使用的特定类别的抗体也没有限制，包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE抗体。也可以使用的抗体片段包括单链可变片段(scFv)、单链抗体、F(ab’)2片段，Fab片段和Fab表达资料库产生的片段，但前提是抗体片段保留结合所选标签的能力。
本发明的BAT-CARs可以使用市售的细胞外配体来制备，至少合成抗原要为已知的。或者，可以使用标准技术制备特异性结合合成抗原的抗体及其片段，例如培养用于单克隆抗体制备的连续细胞系。代表性技术包括最初由Koehler和Milstein描述的杂交瘤技术(Nature 256：495-497(1975))，人类B细胞杂交瘤技术(Kosbor et al.,Immunol Today 4:72(1983)；Cote et al.,Proc Natl.Acad.Sci 80:2026-2030(1983))和EBV杂交瘤技术(Cole et al.,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss Inc,NewYork N.Y.,pp 77-96(1985))。也可以使用为制备“嵌合抗体”而开发的技术，即，将小鼠抗体基因与人抗体基因剪接以获得具有适当抗原特异性和生物学活性的分子(Morrison etal.,Proc Natl.Acad.Sci 81:6851-6855(1984)；Neuberger et al.,Nature 312:604-608(1984)；Takeda et al.,Nature 314:452-454(1985))。如本领域已知，人源化抗体或具有一个或多个氨基酸残基的抗体片段，通常来自非人类来源的抗体的可变结构域。人源化抗体或抗体片段可包含一个或多个非人类免疫球蛋白分子的CDR，以及完全或大部分源自人类种系的框架区。人源化抗体或抗体片段的技术是众所周知的，包括CDR嫁接，饰面或表面重铺以及链改组。亦参见Jones et al.,Nature 321:522-525(1986)；Riechmann et al.,Nature 332:323-327(1988)；Verhoeyen et al.,Science 239:1534-1536(1988)).
在某些实施方案中，BAT-CAR-T的标签结合结构域是单链可变片段(scFv)。scFv包括抗体的重链(VH)和轻链(VL)的可变区，并且通常包含多达约50个，例如约10个氨基酸残基。连接子可以将VH的N端与VL的C端相连，反之亦然。ScFv可以根据本领域已知的方法制备(参见，例如，Bird et al.,Science 242:423-426(1988)和Huston et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883(1988))。在某些实施方案中，连接子序列包括氨基酸甘氨酸和丝氨酸，并且在某些情况下，是甘氨酸和丝氨酸重复序列的集合，例如(Gly4Ser)n，其中n是等于或大于1的整数。连接子的长度和氨基酸的组成可以变化，例如为了实现VH和VL之间的最佳折叠和相互作用以产生功能性表位。参见，例如Hollinger etal.,Proc Natl Acad.Sci.U.S.A.90:6444-6448(1993)。
可用于本发明的对未掩蔽的原始抗原具有特异性的其它类型的抗体片段包括Fv、Fab和(Fab’)2片段。参见，例如美国专利4,946,788。
第二结构域是跨膜(TM)结构域，其允许BAT-CAR锚定到T细胞的细胞膜中。BAT-CAR可以被设计为包含有连接至CAR胞外域的跨膜结构域。跨膜结构域可以衍生自相同的蛋白质或不同的蛋白质，CAR的其它结构域(例如，信号传导结构域，共刺激结构域和铰链结构域)是从所述蛋白质衍生的。跨膜结构域可以源自天然或重组来源。如果来源是天然的，则所述结构域可源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。可用于本发明的跨膜结构域的代表性实例包括T细胞受体的α、β或ζ链的跨膜区域、CD28、CD27、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154。
在某些实施方案中，跨膜结构域经由铰链(例如来自人蛋白的铰链)连接至CAR的细胞外区域，例如CAR的抗原结合结构域。铰链结构域的来源包括人Ig(免疫球蛋白)铰链(例如IgG4铰链，IgD铰链)和CD8(例如CD8α铰链)。
BAT-CAR的第三个结构域是T细胞活化结构域，也称为细胞内信号传导结构域，其在CAR结合至靶细胞上的标记蛋白结合后有助于T细胞活化。细胞内信号传导结构域通常负责激活已引入CAR的作用细胞的至少一种正常作用功能。用于本发明的CAR中的细胞内信号传导结构域的实例包括T细胞受体(TCR)的细胞质序列和共同受体，其协同作用以在抗原受体参与之后启动信号转导。仅通过TCR产生的信号不足以完全激活T细胞。因此，还需要次级或共刺激信号。因此，T细胞活化是由两类不同的细胞质信号传导序列介导的，意指通过TCR启动抗原依赖性一级活化的细胞质传导序列(即一级细胞内信号传导结构域)和以抗原非依赖性方式发挥作用的细胞质次级或共刺激信号(即次级细胞质结构域或共刺激结构域)。一级信号传导结构域以刺激方式或抑制方式调节TCR复合物的一级活化。以刺激方式起作用的一级细胞内信号传导结构域可能包含信号传导基序，称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。可能适用于本发明的含ITAM的一级细胞内信号结构域的代表性实例包括CD3ζ、常见FcRγ(FCER1G)、Fc-γRIIa、FcR-β(Fc-εR1b)、CD3γ、CD3δ和CD3ε。在某些实施方案中，BAT-CAR包括包含CD3ζ的一级信号传导结构域的细胞内信号传导结构域。
BAT-CAR的细胞内信号传导结构域还可包括至少一个其它细胞内信号传导或共刺激结构域。共刺激分子是淋巴细胞对抗原的有效应答所需的除抗原受体或其配体以外的细胞表面分子。可用于本发明的BAT-CAR的共刺激结构域的代表性实例包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、HVEM(LIGHTR)、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C和B7-H3。以CD27共刺激结构域为例，已证明其可于体外增强人类CART细胞的扩增，效应子功能和存活，并增强体内人类T细胞的持久性和抗肿瘤活性(Song,et al.,Blood 119(3):696-706(2012))。
细胞内信号传导域可以被设计为包括一个或多个，例如1、2、3、4、5或更多个共刺激信号传导域，其可以通过连接子分子任意选择以指定或随机顺序彼此连接。长度约为1至10个氨基酸的多肽连接子可以连接连续的细胞内信号传导序列。这样的连接子的例子包括诸如Gly-Ser的双氨基酸，以及诸如Ala和Gly的单氨基酸。可能构成T细胞活化结构域的组合可能基于CD28，CD137(4-1BB)，OX40和HVEM的胞质区域，这些区域可增强T细胞的存活和增殖；以及CD3CD3ζ和FcRε诱导T细胞活化。例如，包含3个ITAM的CD3ζ是CAR最常用的细胞内结构域组分，在抗原结合后将激活信号传递给T细胞。然而，为了提供额外的共刺激信号传导，可以将CD28和OX40结构域与CD3ζ一起使用，从而使BAT-CAR T细胞能够传递增生/存活信号。
编码抗FL CAR-CD28-4-1BB-CD3ζ的多核苷酸的代表性实例具有指定为SEQ IDNO：1的序列：
ATGGCTCTGCCTGTGACAGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTTCTGCATGCCGCCAGACCTGACGTGGTCATGACACAGACACCTCTGAGCCTGCCTGTGTCTCTGGGAGATCAGGCCAGCATCAGCTGCAGATCTAGCCAGAGCCTGGTGCACAGCAACGGCAACACCTACCTGCGGTGGTATCTGCAGAAGCCCGGCCAGTCTCCTAAGGTGCTGATCTACAAGGTGTCCAACAGAGTGTCCGGCGTGCCCGATAGATTTTCTGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCAATAGAGTGGAAGCCGAGGACCTGGGCGTGTACTTCTGTAGCCAGTCTACCCACGTGCCATGGACCTTTGGCGGCGGAACAAAGCTGGAAATCAAGAGCAGCGCCGACGACGCCAAGAAGGACGCCGCTAAGAAGGATGACGCCAAAAAAGACGATGCCAAAAAGGATGGCGGCGTGAAGCTGGACGAAACAGGCGGAGGACTTGTTCAGCCTGGCGGAGCCATGAAGCTGAGCTGTGTGACCAGCGGCTTCACCTTCGGCCACTACTGGATGAACTGGGTCCGACAGAGCCCTGAGAAAGGCCTGGAATGGGTCGCCCAGTTCAGAAACAAGCCCTACAACTACGAAACCTACTACAGCGACAGCGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACGACAGCAAGTCCAGCGTGTACCTGCAGATGAACAACCTGCGCGTGGAAGATACCGGCATCTACTACTGTACCGGCGCCAGCTACGGCATGGAATATCTCGGCCAGGGCACCAGCGTGACCGTGTCTACAACAACCCCTGCTCCTCGGCCTCCTACACCAGCTCCTACAATTGCCAGCCAGCCACTGTCTCTGAGGCCCGAAGCTTGTAGACCTGCTGCAGGCGGAGCCGTGCATACAAGAGGACTGGATTTCGCCTGCGACTTCTGGGTGCTCGTGGTTGTTGGCGGAGTGCTGGCTTGTTACTCCCTGCTGGTTACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTCCGAAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCTAGACGGCCCGGACCTACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCTCCTCCTAGAGACTTCGCCGCCTACAGATCCAAGCGGGGCAGAAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGCGGCCCGTGCAGACCACACAAGAGGAAGATGGCTGCTCCTGCAGATTCCCCGAGGAAGAAGAAGGCGGCTGCGAGCTGAGAGTGAAGTTCAGCAGATCCGCCGACGCTCCTGCCTATCAGCAGGGACAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGGAGAAGAGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGAGATCCTGAGATGGGCGGAAAGCCCCAGCGGAGAAAGAATCCTCAAGAGGGCCTGTATAATGAGCTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGAATGAAGGGCGAGCGCAGAAGAGGCAAGGGACACGATGGACTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGATACCTATGATGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCACCTAGATGATGA(SEQ ID NO:1)
可以根据已知技术工程改造T细胞以表达BAT-CAR。通常，构建编码BAT-CAR的多核苷酸载体，并将所述载体转染到T细胞群中。然后使细胞在促进T细胞表达编码BAT-CAR的多核苷酸的条件下生长。可以通过标准技术以T细胞进行成功的转染(或涉及病毒介导的基因整合的转导)和展示BAT-CARs。
在某些实施方案中，可以通过首先构建编码所选BAT-CAR的逆转录病毒载体来工程改造T细胞以产生BAT-CAR。逆转录病毒转导可以使用已知技术进行(例如，Johnson,etal.Blood 114:535-546(2009))。BAT-CAR在转导的T细胞上的表面表达可以通过例如流式细胞术确定。
可使用已知技术配制BAT-CAR T细胞群体以施用于受试者。包括表达BAT-CAR的T细胞群体的制剂可以包括一种或多种药学上可接受的赋形剂。制剂中包括的赋形剂可以具有不同的目的，取决于例如标签结合结构域的性质，所用T细胞的亚群以及给药模式。赋形剂的代表性实例包括盐水，缓冲盐水，右旋糖，感染水，甘油，乙醇及其组合，稳定剂，增溶剂和表面活性剂，缓冲剂和防腐剂，张度剂，填充剂和润滑剂。通常在不存在任何非人类组分如动物血清(例如牛血清白蛋白)的情况下制备和培养包括BAT-CAR T细胞群体的制剂。
系统和试剂盒
本发明的另一个方面涉及一种系统，其包含多个双官能化合物亚群和CAR T细胞，其可以是自体的，同种异体的或同基因的。
试剂盒中可以包含本文所述的任何组合物。试剂盒可包括：a)治疗有效量的双官能化合物的多个亚群，其中第一亚种群中的每个双官能化合物包含共价连接至特异性结合第一肿瘤相关抗原的第一靶向部分的第一合成抗原，并且其中第二亚群中的每个双官能化合物包含共价连接至特异性结合第二肿瘤相关抗原的第二靶向部分的第一合成抗原，或其药学上可接受的盐或立体异构体，其中第一靶向部分和第二靶向部分特异性结合不同的肿瘤相关抗原，其中施用于患者的每个双功能化合物的亚群均包含第一合成抗原，但特异性结合不同的实体瘤相关抗原；其中多个双官能化合物亚群被置于相同或分开的容器中
b)印刷说明，用于对癌症患者共同施用治疗有效量的多个双官能化合物的亚群和治疗有效数量的CAR-T细胞，其中CAR-T细胞包含特异性结合合成抗原的胞外配体。
在某些实施方案中，试剂盒可进一步包括一种或多种用于细胞治疗的细胞和/或在试剂盒或系统中包含用于产生具有重组表达载体的用于细胞疗法的一种或多种细胞的试剂。在其它实施方案中，试剂盒进一步包括治疗有效数量的同种异体CAR-T细胞。在任何上述具体实施例中，试剂盒包括任选地裂解原始抗原中包含的保护基团的试剂(例如，ROS/RNS产生剂)。试剂盒组分以一种或多种合适容器的方式提供。
试剂盒的某些组分可以包装在水性介质中或冻干形式。试剂盒的容器方式通常将包括至少一个小瓶，试管，烧瓶，瓶，注射器或其它容器方式，可以将组分放置在其中，并且优选适当地等分。如果试剂盒中有多个组分，则试剂盒通常还将包含第二，第三或其它附加容器，可以将附加组件单独放置在其中。但是，小瓶中可以包含各种组分的组合。本发明的试剂盒通常还将包括一种包含组分的密闭包装的方式以用于商业销售。这样的容器可以包括将需求的小瓶保留在其中的注射或吹塑塑料容器。
当试剂盒的组分以一种和/或多种液体溶液提供时，液体溶液是水溶液，而无菌水溶液是特别有用的。在某些情况下，容器装置本身可以是注射器，移液器和/或其它类似装置，从中可以将制剂施用于身体的感染区域，注入动物中，和/或甚至施用和/或与试剂盒的其它组件混合。
然而，试剂盒的组分可以干燥粉末的形式提供。当试剂和/或组分以干粉形式提供时，粉末可以通过添加合适的溶剂来重新构成。可以设想的到溶剂也可以在另一个容器中提供。试剂盒还可包含第二容器，用于容纳无菌的，药学上可接受的缓冲液和/或其它稀释剂。
在特定的具体实施例中，试剂盒中有一种或多种装置适合于从个体中提取一种或多种样品。所述装置可以包括注射器，手术刀等。
在某些实施方案中，试剂盒可进一步包括以分开的容器配制的第二抗癌剂，其可以与药学上可接受的载体一起配制。
方法
本发明的方法涉及治疗癌症的方法。所述方法包含：向有需要的受试者共同施用a)多个双官能分子的亚群，其中所述多个亚群包含a1)治疗有效量的双官能化合物的第一亚群，其包含与第一靶向部分共价连接的合成抗原，所述第一靶向部分特异性结合第一肿瘤相关抗原；以及a2)治疗有效量的双官能化合物的第二亚群，其包含与第二靶向部分共价连接的合成抗原，所述第二靶向部分特异性结合第二肿瘤相关抗原，或其药学上可接受的盐或立体异构体，其中所述第一和第二靶向部分特异性结合不同的肿瘤相关抗原；和b)治疗有效数量的CAR-T细胞，其中CAR-T细胞包含特异性结合合成抗原的细胞外配体。如本文所用，术语“共同施用”如其涉及双官能化合物的多个亚群包括在相同治疗方案期间施用。它们可以同时或相继给药(例如，在患者不再对CAR T细胞和双官能化合物的第一亚群的组合反应后)给药。
如本文所用，术语“治疗(treat)”，“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”具有其常规和通常含义，并且包括阻断，改善或降低受试者癌症症状的严重性和/或频率的一种或多种。在某些实施方案中，接受治疗的受试者是人。在其它实施方案中，受试者是非人类的动物，例如非人类的灵长类动物、鸟、马、牛、山羊、绵羊例如狗、猫或啮齿动物等伴生动物，或其它哺乳动物。
可适用于本发明治疗方式治疗的癌症，特征在于实体瘤或血液肿瘤的存在。广泛地，它们包括成年人和小儿一样的腺瘤，癌，肉瘤和血液系统恶性肿瘤，例如多发性骨髓瘤，白血病和淋巴瘤。癌症可以是血管化的或尚未实质上血管化的或非血管化的肿瘤。
可被治疗的癌症包括原发性肿瘤和继发性或转移性肿瘤，例如从肺、乳腺、脑或前列腺转移的肿瘤，以及复发性或难治性肿瘤。复发性肿瘤包括似乎被此类药物治疗所抑制的肿瘤，但在中断治疗后复发长达五年，甚至长达十年，或更长时间。难治性肿瘤是对一种或多种针对特定肿瘤类型的常规，批准或实验性疗法无反应或有抵抗力的肿瘤·。
本发明的治疗方法可以是“一线”，即尚未接受任何单独或与其它治疗组合的抗癌治疗的患者的初始治疗。本发明的治疗方法也可以有利地用作“二线”疗法，因为它们被施用于已经历至少一种先前抗癌治疗方案的患者，例如化学疗法、放射免疫疗法、毒素疗法、前驱药激活酶疗法、抗体疗法、外科疗法、免疫疗法、放射疗法、靶向疗法或其单独或与其它疗法组合的任何组合。在某些情况下，先前的治疗可能不成功或部分成功，但是患者对特定的治疗方法变得不耐受，特别是在前线治疗由于抗原丢失/逃逸而不再有效的情况下。本发明的方法也可以用作辅助治疗，例如，抑制目前没有可检测疾病的患者或手术切除肿瘤后癌症的复发。
依据本发明可治疗的以实体瘤为特征的癌症的代表性实例，包括乳癌(包括HER2+和转移性)，结肠直肠癌(例如结肠)，食道癌，胆管癌，肺癌(包括小细胞和非小细胞肺癌肿瘤、肺腺癌和肺鳞状上皮癌)、肝、表皮样肿瘤、例如头颈部肿瘤的鳞状肿瘤、上皮鳞状细胞癌、甲状腺、宫颈、卵巢、神经内分泌肿瘤、嗜铬细胞瘤、肝癌腹膜、肝母细胞瘤、肝细胞癌、膀胱癌、肝癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾癌或肾癌、骨癌、软组织肉瘤(包括胚胎和肺泡横纹肌肉瘤、直肠、胰腺、前列腺、胃肠道(胃部的和胃)、肺泡软部分肉瘤和透明细胞肉瘤)、胆管癌、胆囊癌、骨髓瘤、外阴癌、阴茎癌、视网膜、雄激素依赖性肿瘤、非雄激素依赖性肿瘤、Kaposi肉瘤、滑膜肉瘤、分泌血管活性肠肽的肿瘤、中枢神经系统(CNS)肿瘤、黑色素瘤、威姆氏(Wilm's)癌、尤因氏癌、骨肉瘤、PNT、横纹肌瘤、成视网膜细胞肾上腺癌、肾上腺肿瘤、平滑肌肉瘤和横纹肌肉瘤、包括胚胎性横纹肌肉瘤、肺泡横纹肌肉瘤、葡萄状横纹肌肉瘤、多形横纹肌肉瘤、多发性骨髓瘤(MM)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓细胞白血病(AML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、霍奇金淋巴瘤和大颗粒性淋巴细胞(LGL)白血病。
产生高ROS/RNS的癌症可能特别适用于双官能化合物治疗，所述双官能化合物包含带有一个或多个对ROS/RNS具有反应性的硼酸酯保护基团的原始抗原(例如，硼酸酯)，其代表性实例包括胰腺癌，前列腺癌，卡波济肉瘤，肝癌，乳腺癌，胆管癌，胃癌，肺癌，肺腺癌，胰腺导管癌，乳癌，肺癌，甲状腺癌和肉瘤，黑素瘤，肾癌，胃癌，结肠癌，肝癌，胰腺癌和膀胱癌，神经母细胞瘤，前列腺癌，卵巢癌，人乳头瘤病毒(HPV)阳性子宫颈癌，成骨肉瘤，尤因肉瘤，横纹肌肉瘤，纤维肉瘤，软骨肉瘤和神经内分泌肿瘤(Bauer,et al.,AnticancerRes.34:1467-1482(2014))。
在某些实施方案中，本发明的方式(modality)用于治疗脑癌。脑癌的代表性例子包括DIPG，毛细血管血管母细胞瘤，脑膜瘤和脑转移瘤，神经胶质瘤，多形胶质母细胞瘤(GBM)和神经母细胞瘤，髓母细胞瘤和室管膜瘤。
在某些实施方案中，本发明的方式用于治疗血液癌症。血液癌症的代表性实例包括多发性骨髓瘤(MM)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、霍奇金淋巴瘤和大颗粒淋巴细胞(LGL)白血病。
用本发明的方式可治疗的神经胶质瘤的代表性实例包括复发性高级(high-grade)神经胶质瘤，包括胶质母细胞瘤，间变性星形细胞瘤和间变性少突胶质神经胶质瘤，以及高级儿科神经胶质瘤，例如DIPG。
用本发明的方式可治疗的胶质母细胞瘤的代表性实例包括II级(低级(low-grade)星形细胞瘤)，III级(间变性星形细胞瘤)和IV级(胶质母细胞瘤)胶质母细胞瘤和多形胶质母细胞瘤(GBM)。
在某些实施方案中，用本发明的方式治疗脑癌可能需要同时靶向两种或更多种选自GD2、IL13Rα2、HER2、PDGFRα、EGFRvIII、CSPG4、EphA2和CD133的脑肿瘤相关抗原。在某些实施方案中，脑癌的治疗可能需要同时靶向IL13Rα2、EGFRvIII和HER2。在一些其它实施方案中，脑癌的治疗可能需要同时靶向GD2、PDGFRα和CD133。在一些其它实施方案中，脑癌的治疗可能需要同时靶向EphA2和CSPG4。在一些实施例中，以相继的方式完成多个靶向。
在某些实施方案中，用本发明的方式治疗血液癌症可能需要同时靶向两种或更多种选自CD38、CS1、BCMA、CD20、CD19、CD22、CD30、CD138、CD40、CD56、CD70和CD74的血液肿瘤相关抗原。在某些实施方案中，血液癌症的治疗可能需要同时靶向CD38、CS1和BCMA。在一些其它实施方案中，血液癌症的治疗可能需要同时靶向CD19，CD20和CD22。在一些其它实施方案中，血液癌症的治疗可能需要同时靶向CD30、CD40、CD56、CD70、CD74和CD138。在某些实施方案中，以相继的方式完成多个靶向。
制剂包含对特定癌症有效治疗数量的BAT-CAR T细胞。因此，向受试者施用治疗有效的BAT-CAR T细胞群体。给予受试者的BAT-CAR T细胞的数量将在很大的范围内变化，具体取决于癌症的位置，类型和严重性，待治疗个体的年龄和状况等。医生最终将确定适当的使用的剂量。通常，给予施用的制剂包含约1x 104至约1x 1010个BAT-CAR T细胞。在某些实施方案中，所述制剂包含约1x 105至约1x 109个BAT-CAR T细胞，约5x 105至约5x 108个BAT-CAR T细胞或约t 1x106至约1x 107个BAT-CAR T细胞。
根据可接受的医学实践，可以将BAT-CAR T细胞的制剂给予有需要的受试者。一种示例性的给药方式是静脉内注射。其它模式包括肿瘤内，皮内，皮下(s.c，s.q，sub-Q，Hypo)，肌内(i.m)，腹膜内(i.p)，动脉内，髓内，心内，关节内(关节)，滑膜内(关节液区域))，颅内(包括对流增强分娩)，脊柱内和鞘内(脊液)。可用于肠胃外注射或输注制剂的任何已知装置可用于影响这种施用模式。这样的制剂可包含缓冲剂，例如中性缓冲盐溶液，磷酸盐缓冲盐溶液等。碳水化合物，例如葡萄糖，甘露糖，蔗糖或葡聚糖，甘露醇；蛋白质多肽或氨基酸，例如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，例如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如氢氧化铝)；和防腐剂。
将双官能化合物和BAT-CAR T细胞共同施用给受试者，出于本发明的目的，其包括在相同治疗方案期间的施用。可以在施用BAT-CAR T细胞之前或同时(例如，同一时点)或之后将化合物施用给受试者，使得化合物将结合靶细胞并且BAT-CAR细胞将结合未掩蔽原始抗原或标签。在某些实施方案中，双官能化合物将用掩膜保护，BAT-CAR细胞将仅在抗原未被掩蔽时与化合物结合。
包含双官能化合物的制剂可以有效治疗特定癌症的量施用于受试者。可以使用本领域技术人员已知的技术将化合物配制成用于对受试者的施用。化合物的制剂可以包括药学上可接受的载体，其可以基于诸如靶向部分的性质，原始抗原和施用方式等因素进行选择。常用载体的代表性实例包括盐水，缓冲盐水，右旋糖，感染水，甘油，乙醇及其组合，稳定剂，增溶剂和表面活性剂，缓冲剂和防腐剂，张力剂，填充剂和润滑剂。
通常，给予受试者的双官能化合物的治疗有效量将在很宽的范围内变化，这取决于癌症的位置，来源，身份，程度和严重性，所要治疗的个体的年龄和状况等。医生等将最终确定要使用的适当剂量。通常，考量到施用途径，症状等，制剂可含有约0.1mg/kg至约100mg/kg体重的化合物，并且在某些实施方案中，约1mg/kg至约10mg/kg体重的化合物。通常，将本申请化合物给予受试者以治疗疾病或病症例如癌症的剂量在0.01至500mg/kg的范围内，例如在0.1mg/kg至100mg/kg的受试者体重的范围内。例如，给予受试者的化合物的剂量可以在受试者体重的0.1mg/kg至50mg/kg或1mg/kg至50mg/kg的范围内，更优选在患者体重的0.1mg/kg至25mg/kg，或1mg/kg至25mg/kg。在另一个例子中，向受试者施用以预防，治疗和/或控制患者癌症的本发明化合物的剂量是等于或小于500mg/kg，优选是等于或小于250mg/kg，等于或小于100mg/kg，等于或小于95mg/kg，等于或小于90mg/kg，等于或小于85mg/kg，等于或小于80mg/kg，等于或小于75mg/kg，等于或小于70mg/kg，等于或小于65mg/kg，等于或小于60mg/kg，等于或小于55mg/kg，等于或小于50mg/kg，等于或小于45mg/kg，等于或小于40mg/kg，等于或小于35mg/kg，等于或小于30mg/kg，等于或小于25mg/kg，等于或小于20mg/kg，等于或小于15mg/kg，等于或小于10mg/kg，等于或小于5mg/kg，等于或小于2.5mg/kg，等于或小于2mg/kg，等于或小于1.5mg/kg，等于或小于1mg/kg的受试者体重。
根据可接受的医学实践，可以将双官能化合物给予需要的受试者。一种示例性的给药方式是静脉内注射。其它模式包括肿瘤内，皮内，皮下(s.c，s.q，sub-Q，Hypo)，肌内(i.m)，腹膜内(i.p)，动脉内，髓内，心内，关节内(关节)，滑膜内(关节液区域)，颅内，脊柱内和鞘内(脊液)。可用于肠胃外注射或输注制剂的任何已知装置可用于实现双官能化合物的施用。
在一具体实施例中，其中双官能化合物包含原始抗原，其含有可通过ROS/RNS去除的保护基团，在癌症治疗的某些实施方案中，由于在肿瘤微环境中ROS/RNS的水平升高，原始抗原的激活可以简单地实现。但是，并非所有肿瘤都能自然产生升高的ROS/RNS量。因此，在本发明的某些实施方案中，所述方法还需要在肿瘤部位处或附近局部施用一种或多种试剂，以升高ROS/RNS水平以激活或掩蔽原始抗原。在某些实施方案中，可以通过辐射有利地增加肿瘤的微环境中ROS/RNS的量。可以以外束的形式或通过近距离放射疗法或放射性核素的形式进行放射。当递送到肿瘤微环境时可以增加ROS/RNS水平的放射性核素的代表性实例包括镓68、镥177、碳11、铟111和钇90。在其它实施方案中，可以通过施用镧系元素纳米颗粒来增加ROS/RNS的水平。此类纳米颗粒的使用可能是有利的，因为它们减少了产生ROS/RNS水平的增加所需的辐射量。在某些实施方案中，镧系元素纳米颗粒可以优先地被某些脑细胞例如小胶质细胞吸收，导致这些细胞中ROS/RNS增加，从而使它们成为BAT-CAR-T细胞的优先靶标。
作为替代或与辐射结合，本发明方法可能需要施用ROS/RNS产生剂。这样的试剂是本领域已知的。参见，例如，美国专利申请公开第2014/0228290号；和2006/0235080。
在某些实施方案中，ROS/RNS产生剂是CD44的抑制剂。通常会发现所述蛋白质及其剪接变体在肿瘤和肿瘤起始细胞上过表达。表达或过表达CD44或CD44变体的肿瘤的代表性实例包括胆管癌，胃癌，成胶质细胞瘤，肺腺癌，干和干样癌细胞，乳腺癌，胰腺导管腺癌和神经内分泌肿瘤。CD44充当半胱氨酸/谷氨酰胺的反向转运蛋白，将谷氨酰胺泵出细胞并泵入半胱氨酸，导致细胞内产生谷胱甘肽，这有助于肿瘤细胞应对升高的ROS/RNS。与肿瘤细胞相比，正常细胞不需要额外的谷胱甘肽，这是因为正常细胞中内源性抗氧化剂能够处理正常水平的ROS/RNS。
包含BAT-CAR-T细胞群的制剂和化合物的制剂以及任选的ROS/RNS产生剂的施用频率将可能根据包括所治疗疾病，BAT-CAR细胞及其化合物的结构以及给药方式的因素而变化。每种制剂可以分别每4、3、2或1次，隔天一次，每三天，每四天，每五天，每六天，每六天，每周一次，每八天，每九天，每十天一次给药，每两周，每月和每两月一次。治疗的持续时间也将变化，基于例如所治疗的疾病,并且将由主治医师最佳地确定。但是，治疗的持续时间预计持续数天，数周甚至数月。
本申请的方法可能需要将化合物，BAT-CAR-T细胞和任选的ROS/RNS产生剂以单次，一次剂量或以独立剂量或共同施用给受试者多次剂量(例如2、3、4、5、6、7、8、10、15、20或更多剂量)。因此，共同给药的频率范围可以从一次到大约每八周一次。在另一个例子中，施用频率从每周一次至大约每六周一次。在某些实施方案中，施用频率范围从大约每三周一次到大约每四周一次。在其它实施方案中，BAT-CAR-T细胞可以单次，一次剂量，而双官能化合物和任选的ROS/RNS产生剂的给药频率可以从单次剂量到每日一次，每周一次，到大约每4至6周一次。因此，在其它实施方案中，多次施用BAT-CAR-T细胞，即以多次剂量施用(例如2、3、4、5、6、7、8、10、15、20或更多剂量)。
在某些实施方案中，所述方法需要同时施用多种药物组合物，每种药物组合物包含治疗有效量的双官能化合物和药学上可接受的载体，其中在每种组合物中，靶向部分与不同的肿瘤相关抗原结合。在一些其它实施方案中，同时施用需要使用包含多个(两个或更多个)双官能化合物亚群的单一药物组合物，其中在每个亚群中，合成抗原可以是相同的，但是各自的靶向部分结合存在于肿瘤细胞上的不同的肿瘤相关抗原。因此，药物组合物可以包含具有特异性结合第一肿瘤相关抗原的第一靶向部分的双官能化合物的第一亚群，和具有特异性结合第二肿瘤相关抗原的第二靶向部分的双官能化合物的第二亚群。其中第一和第二靶向部分结合不同的肿瘤相关抗原。在其它实施方案中，双功能化合物的多个亚群包含双功能化合物的第三，第四，第五等亚群，每个亚群结合存在于肿瘤细胞上的不同的肿瘤相关抗原。
某些实施方案要求相继施用任何一种类型的组合物，其中在至少一种此类相继施用中，修饰双官能化合物的组合物或亚群中的至少一种，以取代结合在其上的不同表位的靶向部分，相对于先前施用的相同的肿瘤相关抗原。因此，本发明的具体实施例可以包括“单一”组合物的第一次施用和与第一次不同的至少第二次施用，其不同之处在于任何一个或多个亚群的靶向部分与相同肿瘤相关抗原的不同表位结合。所述附加特征可以减轻抗原损丢失/逃逸或改善毒性。
联合疗法
在某些具体实施例中，本发明的治疗癌症的方法可以是联合疗法的一部分，其中所述受试者也用另一种抗癌剂治疗。“抗癌”剂能够负面影响受试者的癌症，通过例如杀死癌细胞，诱导癌细胞的凋亡，降低癌细胞的生长速率，降低转移的发生率或数量，减小肿瘤大小，抑制肿瘤生长，减少向肿瘤或癌细胞的血液供应，促进针对癌细胞或肿瘤的免疫反应，预防或抑制癌症的进展或延长患有癌症的受试者的寿命。更一般地，将以有效杀死或抑制细胞增殖的组合量提供这些其它组合物。所述过程可能涉及使癌细胞与表达构建体和一种或多种试剂或多种因子同时接触。这可以通过使细胞与包含两种试剂的单一组合物或药理制剂接触，或通过使细胞与两种不同的组合物或制剂同时接触来实现，其中一种组合物包含表达构建体，另一种包含表达构建体试剂。
肿瘤细胞对化学疗法和放射疗法剂的抗性代表了临床肿瘤学中的主要问题。当前癌症研究的一个目标是找到将化学疗法和放射疗法与其它疗法结合起来以提高其疗效的方法。在本发明的上下文中，预期细胞疗法可类似地与化学疗法，放射疗法或免疫疗法干预以及促凋亡或细胞周期调节剂联合使用。
可替代地，本发明的治疗可以在其它药剂治疗之前或之后，间隔从几分钟到几周。在将另一种药剂和本发明分别应用于个体的具体实施例中，通常将确保在每次递送的时间之间不存在明显的时间段，使得所述药剂和本发明的疗法仍将能够发挥作用。对细胞有利地组合作用。在这种情况下，可以预期的是，人们可以在约12至24小时内，更优选地在约6至12小时内以两种方式接触细胞。在某些情况下，可能希望显着延长治疗时间，但是，将几日(2、3、4、5、6或7)延长到几周(1、2、3、4、5、6、7或8)之间的间隔。
预期将根据需要重复治疗周期。还预期可以将各种标准疗法以及外科手术干预与本发明的细胞疗法组合应用。
化学疗法
癌症疗法还包括基于化学和放射疗法的多种组合疗法。组合化学疗法包括，例如，紫杉烷，奥曲他明，多西他赛，赫赛汀，甲氨蝶呤，诺万酮，唑来得昔，顺铂(CDDP)，卡铂，前卡巴嗪，甲乙乙胺，环磷酰胺，喜树碱，异环磷酰胺，美法仑，苯丁酸氮芥，丁磺草胺，环丁草胺，白消安阿霉素，博来霉素，通古霉素，丝裂霉素，依托泊苷(VP16)，他莫昔芬，雷洛昔芬，雌激素受体结合剂，紫杉醇，吉西他滨，那韦尔滨，法呢基蛋白丹参转移酶抑制剂，跨铂，5-氟尿嘧啶，长春新碱，长春花碱或长春花碱或甲氨蝶呤或甲氨蝶呤前述的派生变体及其组合。
在特定的具体实施例中，例如在施用本发明之前，期间和/或之后，将与个体有关的化学疗法与本发明结合使用。
放射疗法
引起DNA损伤并已被广泛使用的其它因素包括通常所知为γ射线，X射线和/或放射性同位素向肿瘤细胞的定向递送。也可以考虑其它形式的DNA破坏因子，例如微波和紫外线辐射。所有这些因素很可能对DNA，DNA的前体，DNA的复制和修复以及染色体的组装和维护造成广泛的损害。X射线的剂量范围从长时间(3-4周)的50至200伦琴的日剂量到2000至6000伦琴的单剂。放射性同位素的剂量范围差异很大，并且取决于同位素的半衰期，所发射辐射的强度和类型以及肿瘤细胞的吸收。
免疫疗法
免疫治疗剂通常依靠使用免疫效应细胞和分子来靶向和破坏癌细胞。免疫效应子可以是例如对肿瘤细胞表面上的某些标志物具有特异性的抗体。单独的抗体可以充当治疗的效应子，或者可以募集其它细胞来实际实现细胞杀灭。抗体也可以与药物或毒素(化学治疗剂，放射性核素、蓖麻毒蛋白A链、霍乱毒素、百日咳毒素等)缀合，仅用作靶向剂。备选地，效应子可以是携带表面分子的淋巴细胞，所述所述表面分子直接或间接与肿瘤细胞靶相互作用。各种效应细胞包括细胞毒性T细胞和NK细胞。
除本文所述的发明性疗法外，免疫疗法可以与本发明的细胞疗法一起用作联合疗法的一部分。可能被单克隆抗体靶向的常见肿瘤标志物包括PD-1、PD-L1、CTLA4、癌胚抗原、前列腺特异性抗原、泌尿肿瘤相关抗原、胎儿抗原、酪氨酸酶(p97)、gp68、TAG-72，HMFG、唾液酸化刘易斯抗原、MucA、MucB、PLAP、雌激素受体、层粘连蛋白受体、erb B和p155。
基因
在另一个具体实施例中，二级治疗是基因治疗，其中在本发明临床具体实施例之前，之后或同时施用治疗性多核苷酸。本发明涵盖多种表达产物，包括细胞增殖的诱导剂，细胞增殖的抑制剂或程序性细胞死亡的调节剂。
手术
大约60％的癌症患者将接受某种类型的手术，包括预防，诊断或分期，治愈和姑息手术。根治性手术是可以与其它疗法(例如本发明的疗法，化学疗法，放射疗法，激素疗法，基因疗法，免疫疗法和/或替代疗法)结合使用的癌症疗法。
根治性手术包括切除术，其中全部或部分癌组织被物理去除，切除和/或破坏。肿瘤切除是指至少部分切除肿瘤。除肿瘤切除外，手术治疗还包括激光手术，冷冻手术，电外科手术和镜控手术(莫氏手术)。进一步预期本发明可以与浅表癌，癌前癌或偶然量的正常组织的去除结合使用。
在切除所有癌细胞，组织或肿瘤的一部分后，体内可形成空腔。可以通过对所述区域进行灌注，直接注射或局部应用其它抗癌疗法来完成治疗。例如，可以每1、2、3、4、5、6或7天，或者每1、2、3、4、5周或每1、2、3、4、5等重复这种治疗，6、7、8、9、10、11或12个月。这些治疗也可以具有不同的剂量。
其它试剂
预期可以将其它试剂与本发明组合使用以改善治疗的疗效。这些附加试剂包括免疫调节剂，影响细胞表面受体和GAP连接的上调的试剂，细胞生长抑制和分化试剂，细胞粘附抑制剂或增加过度增殖细胞对凋亡诱导剂敏感性的试剂。免疫调节剂包括肿瘤坏死因子，干扰素α、β和γ；IL-2和其它趋化因子；F42K和其它趋化因子类似物；或MIP-1、MIP-1beta、MCP-1、RANTES和其它趋化因子。进一步考虑到细胞表面受体或其配体例如Fas/Fas配体，DR4或DR5/TRAIL的上调将通过在过度增殖细胞上建立自分泌或旁分泌作用来增强本发明的凋亡诱导能力。通过增加GAP连接数来增加细胞间信号传导，将增加对邻近的过度增殖细胞群的抗过度增殖作用。在其它实施方案中，细胞抑制剂或分化剂可以与本发明组合使用以改善治疗的抗过度增殖功效。预期细胞粘附抑制剂可改善本发明的功效。细胞粘附抑制剂的实例是粘着斑激酶(FAKs)抑制剂和洛伐他汀。还预期可以将增加过度增殖细胞对凋亡的敏感性的其它试剂，例如抗体c225，与本发明组合使用，以改善治疗功效。
在某些实施方案中，其中本发明用于治疗脑癌，例如DIPG或GBM，一种或多种其它活性剂可被包括作为整体疗法的一部分。例如，在DIPG的情况下，治疗还可以包括放射治疗。对于GBM，治疗还可能包括替莫唑胺化疗。已知可用于治疗脑癌并且可以与本发明一起使用的其它药物的代表性实例包括卡马斯汀，BiCNU，丙卡巴肼，马杜兰，拉帕替尼二甲苯磺酸盐，特拉美普洛尔，吲哚莫德，美法仑，卡铂，依托泊苷磷酸酯，咪贝拉地尔二盐酸盐，OKN-007，AQ4N和奈非那韦甲磺酸盐。
通过考虑以下实施例，将进一步理解本发明的这些和其它方面，这些实施例旨在说明本发明的某些特定具体实施例，但无意限制权利要求书所定义的范围。
例子
实施例1：使用不同的小分子CAR T细胞的滴定活化。
收获健康的供体外周血单核细胞(PBMC)并用表达针对所述荧光素分子(4M5)的第三代CAR的逆转录病毒载体进行转导，如(Newrzela et al.,Methods Mol Biol.(2009))所述。3scFv-CD8α铰链CD28跨膜–CD28细胞内结构域–41BB胞内结构域–CD3z细胞内结构域)或针对4-[(6-甲基吡嗪-2-基)氧基]苯甲酸分子(αMPOBscFv-CD8α铰链CD28跨膜)–CD28细胞内结构域–41BB细胞内结构域–CD3z细胞内结构域)。共表达报道基因的阳性转导细胞用FACS(BD FACSAriaTMII，BD Biosciences，新泽西州(美国))纯化，并在37℃，5％CO2下共孵育4小时，并使带有CTV标记的BT145 GBM肿瘤细胞或EL4淋巴瘤细胞避光(CellTraceTMViolet，ThermoFisher Scientific)。这些肿瘤细胞被标记有荧光素(FITC)或MPOB的抗GD2或抗小鼠H-2Kb抗体涂覆。当将CAR Ts(效应细胞，E)和肿瘤细胞(靶细胞，T)以0.5：1至20：1的E：T比率孵育一式三份时开始分析。共温育后，所有细胞均用eBioscienceTM可固定活力染料eFluorTM780(马萨诸塞州(美国)，InvitrogenTM)染色，并用1：1稀释的固定缓冲液(美国加利福尼亚州，
Figure BDA0002859572230000791
)固定在无菌PBS中/5％FBS。按照以下公式计算死亡靶细胞的百分比：杀灭效率＝[((死亡细胞百分比)样品-(死亡细胞百分比)对照]/[100-(死亡细胞百分比)对照]x 100为了进行对照，使用了用适当的靶向抗体染色但没有CAR T细胞的细胞。
结果清楚地表明，可以用不同的CAR构建体工程改造人类T细胞，以等同的效率和特异性杀死它们的肿瘤靶标。这些结果也证明，可以设计具有针对不同小分子的特异性的CAR T细胞(图2A至图2B)。
实施例2：特定CAR T细胞的靶标的鉴定和验证。
如实施例1中所述测定CAR T细胞的杀灭特性。在这种情况下，将CAR与衍生自不同肿瘤类型的细胞共孵育：A673(尤因肉瘤细胞)，HCC1954(乳腺癌细胞)，BT145和BT286(GBM单元)，BT869和DIPG13(DIPG单元)和H929(MM单元)。靶向的表面抗原是HLA，CD99，HER2，GD2，CD133，IL13Rα2，CS-1和CD38。数据表明，用第三代抗荧光素CAR T细胞工程改造的人类T细胞(参见实施例1)有效地杀死了涂有荧光素的肿瘤靶标，而与癌症的类型和靶向的表面抗原无关(图2C-图2E)。
实施例3：使用小分子CAR T细胞的滴定活化。
如实施例1中所述制备CAR T细胞用于共温育杀灭测定。将DIPG，GBM或MM细胞与抗荧光素第三代CAR T和增加浓度的抗GD2，CD133，IL13Rα2和CD38的荧光素标记的抗体共温育。结果证明了本发明的灵敏度和柔韧性是抗原涂覆量的函数。CAR T细胞表现出超过2-4个数量级的平台杀灭效率和超过四个数量级的可滴定反应。这表明本发明可以在可变的抗体浓度下操作，并且可以调节其活性以优化治疗反应以控制功效相对于毒性(图2F至图2G)。
实施例4：使用小分子滴定活化不同世代的CAR T细胞。
如实施例1所述制备CAR T细胞用于共温育杀死测定。将涂覆有浓度增加的与FITC缀合的抗人类HLA抗体的GBM细胞与两个不同的第二代CAR T细胞(4M5)共同培育。.3scFv-CD8α铰链CD28跨膜–CD28细胞内结构域–CD3z细胞内结构域和4M5.3 scFv–CD8α铰链CD28跨膜–41BB细胞内结构域–CD3z细胞内结构域)。结果表明，有可能独立于CAR产生而对CAR T细胞应答进行剂量分配(图2H)。
如实施例1中所述制备CAR T细胞用于共温育杀灭测定。将抗荧光素第三代CAR T细胞与源自GBM或不具有相同肿瘤抗原的MM肿瘤的细胞以20：1的比例共同培育。数据表明，通过简单地交换荧光素标记的肿瘤靶向部分，就可以轻松地将相同的CAR T细胞针对不同的肿瘤抗原重新靶向：当仅存在MM靶向抗体(抗CD38或抗CS-1)时，仅MM细胞被杀死(图2I)。类似地，当仅存在GBM靶向部分(抗GD2或抗IL13Rα2)时，仅脑细胞被靶向。仅当存在针对每个系的至少一种抗体时，才能获得细胞的最大杀灭力。与数据一致，当肿瘤特异性抗体被针对普遍存在的HLA分子的抗体取代时，所有细胞都被靶向并杀死。结果，使用本发明可以靶向高度异质性肿瘤(图2I)。
实施例5：FL-特异性CAR T细胞的靶标的鉴定和验证。
针对肿瘤细胞系(GBM：A172；MM：ARP1，H929，U266，U266MS，JJN3，XG1，KMS12，H929-luc)和患者来源的培养物(GBM：BT145和BT333；DIPG：BT869)进行分析。通过流式细胞术测量一组感兴趣的靶标和染色强度。在U型底96孔板的孔中等分约100,000个靶细胞系细胞，并将其重悬于1μg肿瘤靶向抗体在100μlFACS缓冲液(无菌过滤的PBS，5％FBS)中的溶液中。在黑暗中，将细胞与抗体在4℃下孵育20分钟。孵育后，将细胞用FACS缓冲液洗涤并用1：1稀释的固定缓冲液(
Figure BDA0002859572230000801
California(USA))在无菌PBS，5％FBS中固定。分析了每种抗体/荧光团的组合及其匹配的同种型对照。对于每个肿瘤标志物，都应根据公式log2((MFI)样品–(MFI)同种型)计算出一个分数。分数近似于第一个小数点，颜色代码由
Figure BDA0002859572230000802
软件确定。
结果证明了在细胞系和患者来源的培养物中，尤其是脑肿瘤之间，肿瘤抗原的巨大变异性。不仅“规范性”肿瘤无处不在，而且它们的表达水平也各不相同。本发明可以通过下一代CAR T细胞平台提供一种解决方案，其可以有效地适应具有患者内和患者间变异性的抗原。
实施例6：CAR T细胞的滴定活化仅针对未掩蔽的小分子。
将人类α-荧光素CAR T细胞与涂有抗CD99或阴性对照抗体的人CD99+尤因肉瘤细胞系(A673)以效应子与靶标比率为20：1共培养约4小时，如实施例1中所述。A673肿瘤细胞涂有市售的αCD99-FITC，具有匹配的同种型，或涂有直接与遮蔽的荧光素缀合的αCD99抗体(遮蔽的FL)，或用365nm紫外线预处理(未遮蔽FL)。当通过未掩蔽的抗CD99荧光素进行靶向时，A673肿瘤细胞被特异性杀死，但如果抗CD99抗体的遮蔽仍然完整，则不会杀死A673肿瘤细胞。在用遮蔽的抗CD99荧光素靶向的A673细胞和阴性对照抗体(IgG同种型对照FITC)之间未观察到统计学上的显着差异。使用Kruskal-Wallis的单向方差分析以及预先选择的成对比较(*p<0.05)来计算统计显着性。进行了4次重复实验。
结果显示在图4B，具有人类第三代抗荧光素CAR-T细胞对未掩蔽荧光素衍生物的特异性体外细胞毒性。结果表明，CAR-T细胞可特异性杀死未掩蔽的荧光素衍生物，但不会杀死受保护的荧光素衍生物结合的靶标。
所有专利出版物和非专利出版物均指示了本发明所属领域的技术人员的技术水平。所有这些出版物(包括所引用的任何特定部分)都以相同的程度通过引用并入本文，就如同每个单独的出版物均被明确地和单独地指示通过引用并入一样。
尽管已经参考特定实施例描述了本发明，但是应当理解，这些实施例仅是本发明的原理和应用的说明。因此，应当理解，在不脱离由所附权利要求限定的本发明的精神和范围的情况下，可以对示例性实施例进行多种修改，并且可以设计其它布置。

Claims (45)

1.一种双官能化合物，其包含第一合成抗原或所述第一合成抗原与第一肿瘤相关抗原结合的第一靶向部分共价连接，或其药学上可接受的盐或立体异构体。
2.根据权利要求1所述的双官能化合物，其中所述靶向部分特异性结合脑肿瘤相关抗原。
3.根据权利要求2所述的双官能化合物，其中所述靶向部分特异性结合选自由GD2、IL13Rα2、HER2、PDGFRα、EGFRvIII、CSPG4、EphA2和CD133所组成群组的脑肿瘤相关抗原。
4.根据权利要求1所述的双官能化合物，其中所述靶向部分特异性结合血液肿瘤相关抗原。
5.根据权利要求4所述的双官能化合物，其中所述靶向部分特异性结合选自由CD38、CS1、BCMA、CD20、CD19、CD22、CD30、CD138、CD40、CD56、CD70和CD74所组成群组的血液肿瘤相关抗原。
6.根据权利要求1所述的双官能化合物，其中所述靶向部分特异性结合HER2。
7.根据权利要求1所述的双官能化合物，其中所述合成抗原是荧光分子。
8.根据权利要求7所述的双官能化合物，其中所述荧光分子是荧光素或蒽。
9.根据权利要求1所述的双官能化合物，其中所述合成抗原是4-[(6-甲基吡嗪-2-基)氧基]苯甲酸酯(MPOB)，蒽醌-2-羧酸酯(AQ)或四氧杂环十二烷(DOTA)。
10.根据权利要求1所述的双官能化合物，其中所述合成抗原包含可移除的保护基团。
11.根据权利要求10所述的双官能化合物，其中所述可移除的保护基团是硼酸酯基。
12.根据权利要求10所述的双官能化合物，其中所述可移除的保护基团是光可裂解基团。
13.根据权利要求1所述的双官能化合物，其中所述合成抗原是肽、糖苷或核苷酸抗原。
14.一种药物组合物，其包含治疗有效量的根据权利要求1的双官能化合物或其药学上可接受的盐或立体异构体，以及药学上可接受的载体，其中所述双官能化合物是第一双官能化合物。
15.根据权利要求14所述的药物组合物，还包含第二双官能化合物或其药学上可接受的盐或立体异构体，所述第二双官能化合物包含所述第一合成抗原，其与结合第一肿瘤相关抗原的第二靶向部分共价连接。
16.根据权利要求14所述的药物组合物，其包含多种治疗有效量的双官能化合物的亚群，其包含所述第一双官能化合物的第一亚群，且还包含至少一第二双官能化合物的第二亚群或其药学上可接受的盐或立体异构体，所述第二双官能化合物包含第一合成抗原，其与特异性结合第二肿瘤相关抗原的第二靶向部分共价连接，其中所述第一和第二靶向部分特异性结合不同的肿瘤相关抗原，且其中所述组合物中的所述双官能化合物的每个亚群与所述组合物中的其它亚中包含的双官能化合物所结合的肿瘤相关抗原不同。
17.根据权利要求16所述的药物组合物，其中所述第一和第二靶向部分特异性结合的脑肿瘤相关抗原选自由GD2、IL13Rα2、HER2、PDGFRα、EGFRvIII、CSPG4、EphA2和CD133所组成的群组。
18.根据权利要求17所述的药物组合物，其中所述第一和第二靶向部分各自特异性结合选自由IL13Rα2、EGFRvIII和HER2所组成的群组的脑肿瘤相关抗原，或者其中所述第一和第二靶向部分各自特异性结合选自由GD2、PDGFRα和CD133所组成的群组的脑肿瘤相关抗原，或者其中第一和第二靶向部分各自特异性结合选自由EphA2和CSPG4所组成的群组的脑肿瘤相关抗原。
19.根据权利要求14所述的药物组合物，其中所述第一和第二靶向部分特异性结合选自由CD38、CS1、BCMA、CD20、CD19、CD22、CD30、CD138、CD40、CD56、CD70和CD74所组成的群组的血液肿瘤相关抗原。
20.根据权利要求19所述的药物组合物，其中所述第一和第二靶向部分各自特异性结合选自由CD38、CS1和BCMA所组成的群组的血液肿瘤相关抗原，或者其中所述第一和第二靶向部分特异性结合结合选自由CD19、CD20和CD22所组成的群组的血液肿瘤相关抗原，或者其中所述第一和第二靶向部分各自特异性结合选自由CD30、CD40、CD56、CD70、CD74和CD138所组成的群组的血液肿瘤相关抗原。
21.一种治疗癌症的方法，其包括向有此需要的受试者共同施用a)多个双官能分子的亚群，其中所述多个双官能分子的亚群包括a1)治疗有效量的双官能化合物的第一亚群，其包含合成抗原，其与特异性结合第一肿瘤相关抗原第一靶向部分共价连接；以及a2)治疗有效量的双官能化合物的第二亚群，其包含所述合成抗原，其与特异性结合第二肿瘤相关抗原的第二靶向部分共价连接，或其药学上可接受的盐或立体异构体，其中所述第一和第二靶向部分特异性结合不同的肿瘤相关抗原；和b)治疗有效数量的CAR-T细胞，其中所述CAR-T细胞包含特异性结合所述合成抗原的胞外配体。
22.根据权利要求21所述的方法，其中同时施用治疗有效量的所述多个双官能化合物的亚群。
23.根据权利要求21所述的方法，其中依序施用治疗有效量的所述多个双官能化合物的亚群。
24.根据权利要求22所述的方法，其中所述多个双官能化合物的亚群以单一组合物施用。
25.根据权利要求22所述的方法，其中所述多个双官能化合物的亚群以不同组合物施用。
26.根据权利要求21所述的方法，还包括至少一次随后施用治疗有效量的双官能化合物的第一和/或第二亚群。
27.根据权利要求26所述的方法，其中于至少一次随后施用双官能化合物的第一和/或第二亚群中，其中第一靶向部分结合相对于先前施用中的第一靶向部分的相同肿瘤相关抗原上的不同表位，且其中第二靶向部分结合在先前施用中相对于第二靶向部分的相同肿瘤相关抗原上的不同表位。
28.根据权利要求21所述的方法，还包含共同施用双官能化合物的第三亚群，所述双官能化合物包含与第三靶向部分共价连接的所述合成抗原，所述第三靶向部分结合相对于所述第一和第二靶向部分不同的肿瘤相关抗原。
29.根据权利要求21所述的方法，其中所述合成抗原包含可移除的保护基团，且于所述可移除的保护基团移除后，所述CAR T细胞的胞外配体结合所述合成抗原。
30.根据权利要求21所述的方法，其中所述受试者患有脑癌，且其中所述第一和第二靶向部分特异性结合不同的脑肿瘤相关抗原。
31.根据权利要求30所述的方法，其中各个所述第一和第二靶向部分特异性结合选自由GD2、IL13Rα2、HER2、PDGFRα、EGFRvIII、CSPG4、EphA2和CD133所组成群组的脑肿瘤相关抗原。
32.根据权利要求30所述的方法，其中各个所述第一和第二靶向部分特异性结合选自由IL13Rα2，EGFRvIII和HER2所组成群组的的脑肿瘤相关抗原，或者其中各个所述第一和第二靶向部分特异性结合选自由GD2，PDGFRα和CD133所组成群组的的脑肿瘤相关抗原，或其中各个所述第一和第二靶向部分特异性结合选自由EphA2和CSPG4所组成群组的的脑肿瘤相关抗原。
33.根据权利要求30所述的方法，其中所述脑癌是神经胶质瘤。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述神经胶质瘤是弥漫性内生性脑桥胶质瘤(DIPG)。
35.根据权利要求30所述的方法，其中所述脑癌是胶质母细胞瘤(GBM)。
36.根据权利要求21所述的方法，其中所述受试者患有血液癌症，且其中所述第一和第二靶向部分特异性结合不同的血液肿瘤相关抗原。
37.根据权利要求36所述的方法，其中各个所述第一和第二靶向部分特异性结合选自由CD38、CS1、BCMA、CD20、CD19、CD22、CD30、CD138、CD40、CD56、CD70和CD74所组成群组的血液肿瘤相关抗原。
38.根据权利要求37所述的方法，其中各个所述第一和第二靶向部分特异性结合选自由CD38，CS1和BCMA所组成群组的的血液肿瘤相关抗原，或者其中各个所述第一和第二靶向部分特异性结合选自由CD19、CD20和CD22所组成群组的的血液肿瘤相关抗原，或者其中各个所述第一和第二靶向部分特异性结合选自由CD30、CD40、CD56、CD70、CD74和CD138所组成群组的的血液肿瘤相关抗原。
39.根据权利要求36所述的方法，其中所述血液肿瘤癌症是多发性骨髓瘤(MM)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)，霍奇金淋巴瘤或大颗粒淋巴细胞(LGL)白血病。
40.根据权利要求21所述的方法，其中所述癌症是HER2+癌症。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述癌症是乳腺癌、肺癌、结肠直肠癌、脑癌、卵巢癌或胰腺癌。
42.根据权利要求21所述的方法，其中在a)和b)之前，所述受试者接受一线癌症治疗。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述一线癌症治疗由于抗原逃逸而变得无效。
44.根据权利要求21所述的方法，其中所述受试者是人类。
45.一种试剂盒，其包含治疗有效量的多个双官能化合物的亚群，其中第一亚群中的每个双官能化合物包含第一合成抗原，其共价连接至特异性结合第一肿瘤相关抗原的第一靶向部分，且其中第二亚群中的每个双官能化合物包含第一合成抗原，其共价连接至特异性结合第二肿瘤相关抗原的第二靶向部分，或其药学上可接受的盐或立体异构体，其中所述第一靶向部分和第二靶向部分特异性结合不同的肿瘤相关抗原，其中施用于患者的双官能化合物的各个亚群包含所述第一合成抗原，但特异性结合不同的肿瘤相关抗原；其中多个双官能化合物的亚群置于相同或分开的容器中；和
b)印刷说明，用于对癌症患者共同施用治疗有效量的多个双官能化合物的亚群和治疗有效数量的CAR-T细胞，其中所述CAR-T细胞包含特异性结合所述合成抗原的胞外配体。
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