CN112391160B - 一种用于细胞内n2h4检测的近红外荧光探针及其制备方法 - Google Patents

一种用于细胞内n2h4检测的近红外荧光探针及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于具有强吸电子性质的乙酰基作为识别基团、氧杂蒽作为分子基本骨架并修饰强吸电子性质的三氰基呋喃基团的荧光探针分子结构，该荧光探针分子在N2H4存在情况下，羰基被肼亲核进攻，游离出具有强给电子性质的羟基，进而形成具有强推拉电子结构的共轭大π键，探针分子荧光发射红移及荧光显著增强，具有大的斯托克斯位移(186nm)，同时溶液的颜色由紫色变为浅黄色，实现肼的可视化检测以及细胞内的肼检测。

Description

一种用于细胞内N2H4检测的近红外荧光探针及其制备方法
技术领域
本发明属于化学分析检测领域，具体涉及一种检测N2H4的近红外荧光探针及其制备方法。
背景技术
肼又称联氨，是一种重要的工业原料，广泛应用于农药、药品、聚合物、乳化剂、纺织品、高能燃料等各行各业中。肼是一种易挥发的有毒物质，可通过呼吸或接触进入人体，对人体的组织、器官和系统造成不可逆的损伤，并影响核酸的结构和功能。由于肼的毒性和致癌性，美国环境保护署已经将肼归类为B2化学物质，并将其阈值限制在10ppb，因此，开发高选择性、高灵敏度检测肼含量的方法，尤其是能够在细胞或组织器官中可视化检测肼的方法十分重要。
现有技术中检测肼的经典方法有质谱法、电化学法、气相色谱法等，这些方法均需要使用昂贵的精密仪器和复杂的操作，检测时间长、耗费多、并且无法实现细胞内的检测。而荧光探针成像的方法，具有高灵敏度、无创伤检测生物体中的微量肼的优点。到目前为止，已经许多的研究小组分别独立地披露了各种不同的用于检测肼的荧光探针分子，在这些荧光探针分子结构设计中，连接在荧光团上的肼识别基团主要有乙酰基、4-溴丁酰基、醛基、丙二腈基等，利用肼的亲核性与这些识别基团反应，引起探针分子的荧光变化进而实现肼的检测。然而，这些荧光探针受限于其结构，大都吸收和发射在可见光范围内，而许多的生物组织在可见光激发下产生自发荧光，这导致在生物成像与应用时不可避免地造成背景干扰，从而导致探针灵敏度和分析结果的准确性降低，同时在生物成像时不可避免地造成自身荧光吸收和光损伤，因而现有技术中这些探针分子往往只能应用于水溶液中的肼检测。近红外波长本身具有低的自身光吸收和较强的光穿透性，受到的背景干扰小、且组织受到的光损伤小和更深组织的成像，因此开发近红外荧光探针检测肼、特别是能用于细胞或活体可视化检测肼的探针成为了本领域亟待解决的技术难题之一。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种基于具有强吸电子性质的乙酰基作为识别基团、氧杂蒽作为分子基本骨架并修饰强吸电子性质的三氰基呋喃基团的荧光探针分子结构，该荧光探针分子在N2H4存在情况下，羰基被N2H4亲核进攻，游离出具有强给电子性质的羟基，进而形成具有强推拉电子结构的共轭大π键，探针分子荧光发射红移及荧光显著增强，具有大的斯托克斯位移(186nm)，同时溶液的颜色由紫色变为浅黄色，实现N2H4的可视化检测以及细胞内的肼检测。
本发明首要目的在于提供的一种用于检测N2H4的近红外荧光探针，其结构如式A所示：
Figure BDA0002804489850000021
本发明的另一目的在于提供一种前述用于检测N2H4的近红外荧光探针的制备方法，所述制备方法如下：
步骤(1)：将化合物1与4-甲氧基水杨醛在碳酸铯存在下，在DMF中反应，得到式I所示的中间体，反应式如下：
Figure BDA0002804489850000031
步骤(2)：将式I所示的中间体与式3所示的三氰基呋喃化合物在碳酸钾、乙酸酐存在的条件下存在的条件下加热搅拌反应，得到式II所示的中间体，反应式如下：
Figure BDA0002804489850000032
步骤(3)：将式II所示的中间体与BBr3在二氯甲烷中反应，制备获得式III所示的中间体，反应式如下：
Figure BDA0002804489850000033
步骤(4)：将式III所示中间体与乙酰氯在三乙胺为碱、二氯甲烷为溶剂的条件下反应，制备获得式A所示的用于检测N2H4的近红外荧光探针，反应式如下：
Figure BDA0002804489850000041
其中步骤(1)中，式1化合物、式2化合物与碳酸铯的投料摩尔比为1: (0.8～1):(1.5～2.5)，反应温度为室温～50℃。
步骤(2)中，式I所示的中间体、式3所示的三氰基呋喃化合物与碳酸钾的投料摩尔比为1:(1～1.5):(1.5～2.5)，反应温度为80℃～100℃。
步骤(3)中，式II所示的中间体与BBr3的投料摩尔比1:(8-12)，反应温度为0℃～室温。
步骤(4)中，式III所示的中间体、乙酰氯和三乙胺的投料摩尔比为1: (1.5～2.5):(1.5～2.5)，反应温度为0℃～室温。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明前次报道一种基于具有强吸电子性质的乙酰基作为识别基团、氧杂蒽作为分子基本骨架并修饰强吸电子性质的三氰基呋喃基团的荧光探针分子结构，该荧光探针分子本身在580nm激发下，在739nm处有微弱的荧光信号，当在N2H4存在情况下，羰基首先被N2H4亲核进攻，游离出具有强给电子性质的羟基，进而形成具有强推拉电子结构的共轭大π键，探针分子荧光发射红移至766nm及荧光显著增强约35倍，斯托克斯位移186nm。
(2)在溶液中检测N2H4的试验表明，本发明的探针分子用于溶液中检测时颜色由蓝紫色变为浅黄色，可以实现N2H4的可视化检测。
(3)本发明的探针分子可以用于细胞内的N2H4检测，背景干扰小、且组织受到的光损伤小，准确度高。
(4)本发明的探针分子应用于N2H4检测，灵敏度高，检测限低至0.02μM；选择性好，对各种常见金属离子(K+,Na+,Ca2+,Mg2+,Cu2+,Zn2+,Al3+,Fe3+,Hg2+)、无机阴离子(F-,Br-,Cl-,ClO4-,SO4 2-,AcO-,CO3 2-,H2PO4-)、无机/有机小分子 (Cys,GSH,Glu,NH2OH,尿素)无响应，无干扰；响应时间快，本发明探针分子与 N2H4的动力学研究表明，探针与不同浓度的N2H4在10min左右即可达到平衡，荧光不再变化，表明本发明的探针分子可以应用于高效、快速地检测N2H4。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步详述，在下文中，如无特殊说明，所使用的方法均为本领域的常规方法，所使用的试剂均可以通过本领域常规商业途径购买获得或者经过已知的有机合成途径制备获得。
实施例1荧光探针分子的制备
步骤(1)式I中间体的制备
Figure BDA0002804489850000051
将0.95化合物1(约5mmol)和0.73g 4-甲氧基水杨醛(约4.8mmol) 溶于10mL DMF中，加入3.26g Cs2CO3(约10mmol)加入100mL圆底烧瓶中，随后置于40℃下搅拌反应过夜(约8-12h)，反应完全后过滤除，滤液浓缩得到粗产品，以正己烷/乙酸乙酯(体积比为10:1)混合液为洗脱溶剂，经硅胶层析柱纯化得黄色固体产物I(0.99g，产率85.2％)。
步骤(2)式II中间体的制备
Figure BDA0002804489850000061
在100mL的圆底烧瓶中，将化合物I(0.73g，约3.0mmol)溶于10mL乙酸酐，随后向其加入式3所示的三氰基呋喃化合物(0.72g，约3.6mmol)和碳酸钾(0.83g，6.0mmol)，用N2置换反应气氛后，将圆底烧瓶于85℃下搅拌过夜 (约8-12h)，过滤，液液通过减压蒸馏除去溶剂，粗产品用体积比为20:1二氯甲烷/正己烷洗脱剂进行硅胶柱层析，得到式II所示的中间体化合物(1.12g，产率：88.3％)。
步骤(3)式III中间体的制备
Figure BDA0002804489850000062
在100mL的圆底烧瓶中，将式II所示的中间体0.80g(约1.89mmol)溶于10mL二氯甲烷，在冰浴和氮气保护条件下，用注射器加入BBr3(1.9mL,约 19.5mmol)，缓慢升至室温并搅拌反应过夜，随后在冰浴条件下，将所得混合物倒入饱和碳酸氢钠中，用二氯甲烷/甲醇(体积比10:1)混合溶剂萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，有机相真空浓缩得到粗产品，随后粗产品用二氯甲烷/甲醇(体积比10:1)混合溶剂作为洗脱溶剂经硅胶柱层析分离得到蓝色固体的式III所示的中间体(0.69g,产率89.3％)。
步骤(4)式A的探针分子的制备
Figure BDA0002804489850000071
在100mL的圆底烧瓶中，将式III所示的中间体0.69g(约1.69mmol) 溶于10mL二氯甲烷，加入三乙胺(0.5mL,约3.6mmol)，在室温和搅拌的条件下缓慢加入乙酰氯(0.2mL,约2当量)，约5min加完，随后室温搅拌反应30min，将反应液真空浓缩，用二氯甲烷/甲醇(体积比25:1)混合溶剂作为洗脱溶剂经硅胶柱层析分离得到的式A所示的用于检测N2H4的近红外荧光探针(蓝紫色固体M.p.283-285℃，0.67g,产率87.9％)。1H NMR(500MHz,DMSO-d6): δ＝8.51(d,J＝14.1Hz,1H),7.37(s,1H),7.21(s,1H)，7.06(s,1H),6.54 (d,J＝14.1Hz,2H),2.92～2.81(m,2H),2.65(t,J＝8.5Hz,2H),2.32(s,3H), 1.79(dt,J＝12.2Hz,2H),1.67(s,6H)。
试验例1探针分子的光谱性质及特异性研究试验
将探针分子溶于DMSO中(浓度为10-3mol/L)。分析物(N2H4、金属离子K+,Na+,Ca2+,Mg2+,Cu2+,Zn2+,Al3+,Fe3+,Hg2+、无机阴离子 F-,Br-,Cl-,ClO4 -,SO4 2-,AcO-,CO3 2-,H2PO4 -、无机/有机小分子Cys,GSH,Glu,NH2OH, 尿素)溶于去离子水中，浓度为10-3mol/L。检测溶液包括20μL浓度为10-3mol/L 探针溶液、适量的DMSO、一定量的PBS缓冲液(10mM,pH＝7.45)和适量体积的分析物溶液，最终体积为2.0mL。使用光子技术国际(PTI)光谱仪记录检测液的荧光光谱和测定荧光强度。测试条件：激发波长为580nm。
结果表明，本发明的荧光探针分子本身在580nm激发下，在739nm处有微弱的荧光信号。其余待分析物均不改变探针的荧光性质，荧光光谱未发生明显变化，加入N2H4后，溶液的颜色由蓝紫色变为浅黄色，说明书本发明的探针分子可以实现N2H4的可视化检测。加入N2H4后，由于羰基被N2H4亲核进攻，游离出具有强给电子性质的羟基，进而形成具有强推拉电子结构的共轭大π键，探针分子荧光发射红移至766nm及荧光显著增强约35倍，斯托克斯位移186nm。
试验例2探针分子的灵敏度及定量分析测试试验
利用探针溶液(10-3mol/L，DMSO/PBS(v/v＝6:4),pH＝7.45)进行N2H4的定量分析检测(响应时间10min)，加入不同浓度的N2H4(0，0.5，1.5，2.5，5， 10，15，25，40，50，100，150，250，500μM)，在25℃反应10min后在766nm 处具有明显的荧光增强，并且探针(10-3mol/L)与N2H4(0-50μM)的响应存在线性关系，线性回归方程Y＝0.0314+0.0041X(R2＝0.0994)，检测限低至0.008μM，说明本发明的探针分子对N2H4灵敏度高、响应迅速、并能实现定量检测溶液中的N2H4含量。
试验例3探针分子的细胞培养及荧光成像试验
将HeLa细胞置于96孔玻底板共聚焦培养皿中贴壁培养24h，经过PBS 洗涤三次后加入探针(10μM，1％DMSO)，继续培养30min，再用PBS洗涤三次，利用倒置荧光显微镜对细胞进行荧光成像，然后分别添加含有0、25、 50和100μM的N2H4溶液，在培养箱中继续孵育细胞1小时，用PBS洗涤三次以除去多余的N2H4，在倒置荧光显微镜下对细胞进行荧光成像分析。
结果表明本发明的探针分子应用于细胞荧光成像可以清晰地看出细胞荧光随着水合N2H4浓度的增加而增强，证明本发明的荧光探针具有良好的膜透过性并可用于细胞内的N2H4检测。

Claims (3)

1.一种用于检测N2H4的近红外荧光探针，其特征在于，具有如式A所示的结构：
Figure FDA0003806843020000011
2.根据权利要求1所述的用于检测N2H4的近红外荧光探针的制备方法，其特征在于，所述制备方法如下：
步骤(1)：将化合物1与4-甲氧基水杨醛在碳酸铯存在下，在DMF中反应，得到式I所示的中间体，反应式如下：
Figure FDA0003806843020000012
步骤(2)：将式I所示的中间体与式3所示的三氰基呋喃化合物在碳酸钾、乙酸酐存在的条件下加热搅拌反应，得到式II所示的中间体，反应式如下：
Figure FDA0003806843020000013
步骤(3)：将式II所示的中间体与BBr3在二氯甲烷中反应，制备获得式III所示的中间体，反应式如下：
Figure FDA0003806843020000021
步骤(4)：将式III所示中间体与乙酰氯在三乙胺为碱、二氯甲烷为溶剂的条件下反应，制备获得式A所示的用于检测N2H4的近红外荧光探针，反应式如下：
Figure FDA0003806843020000022
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，式1化合物、式2化合物与碳酸铯的投料摩尔比为1:(0.8～1):(1.5～2.5)，反应温度为室温～50℃；
步骤(2)中，式I所示的中间体、式3所示的三氰基呋喃化合物与碳酸钾的投料摩尔比为1:(1～1.5):(1.5～2.5)，反应温度为80℃～100℃；
步骤(3)中，式II所示的中间体与BBr3的投料摩尔比1:(8-12)，反应温度为0℃～室温；
步骤(4)中，式III所示的中间体、乙酰氯和三乙胺的投料摩尔比为1:(1.5～2.5):(1.5～2.5)，反应温度为0℃～室温。
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