CN112375737B - 一种生物吸附材料及制备方法、病毒吸附系统和辅助透析循环系统 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生物吸附材料及制备方法、病毒吸附系统和辅助透析循环系统，涉及病毒吸附技术领域。提供的生物吸附材料及病毒吸附系统主要针对有高病毒血症并且本身肾脏受损就需要透析的新冠肺炎危重症感染者。本发明只需前期采用基因编辑技术构建好稳定细胞株，细胞便可大规模培养，接种生物反应器前，只需用QNZ短时间处理，与现有技术相比，具有操作简便，成本低廉，直接高效清除患者血液中病毒的优势。

Description

一种生物吸附材料及制备方法、病毒吸附系统和辅助透析循 环系统

技术领域

本发明涉及病毒吸附技术领域，具体而言，涉及一种生物吸附材 料及制备方法、病毒吸附系统和辅助透析循环系统。

背景技术

目前，新型冠状病毒(如下简称新冠病毒，SARS-CoV-2)危重 症感染者，部分患者出现病毒血症，即患者血液中的病毒含量一直很 高。已有研究发现SARS-CoV-2会通过hACE2受体感染血管内皮细 胞，通过直接损伤内皮细胞和介导血栓性炎症，引发心血管系统损伤， 并且SARS-CoV-2会随着血液到达全身各个组织器官，如肾脏、肝管、 胰腺、肠道和呼吸道内侧的细胞都布满了hACE2受体(参照 Immunology of COVID-19:Current Stateof the Science文章)，病毒可 以利用这些受体进入宿主细胞，造成全身性疾病。因此及时清除或降 低血液中SARS-CoV-2病毒含量，对新冠肺炎患者的治疗具有非常积 极地意义。可以由危重症转重症或中症，为治疗赢得宝贵的时间。

在有效疫苗尚未进入临床应用，以及疫苗长期疗效仍未知的情况 下，目前还是以对症治疗为主，至今还没有药物或治疗方法能短时间 安全有效地清除或降低血液中病毒含量。

根据国家卫生健康委新冠肺炎的治疗指南，在条件许可的情况 下，可适时开展血液净化治疗。CRRT治疗的患者大致分为新冠肺炎 合并维持性透析血液透析患者和新冠肺炎合并MODS、AKI、脓毒血 症患者，应该把握危重症患者治疗指征，适时进行CRRT治疗；医护人员需充分利用新机器的功能，开展多种治疗模式，如血浆置换、血 液吸附治疗等。

虽然血液透析、血浆置换和血液吸附一定程度上可以减少体内有 害代谢物和炎症因子，减轻炎症因子风暴，但无法去除或减少血液中 SARS-CoV-2病毒含量。

目前，一种抑制SARS-CoV-2感染人体细胞的治疗方法是，体外 合成可溶性的hACE2分子，注射入体内，通过竞争性结合 SARS-CoV-2的S蛋白，抑制SARS-CoV-2感染人体细胞。此方案存 在如下缺陷：加入外源hACE2蛋白，会导致人体本该和ACE2结合、 并发挥正常生物学功能的细胞因子如Ang2也都被中和，进而会影响 很多信号通路(正常肾素-血管紧张素系统)，导致人体机能失常，其 治疗带来的危害可能大于病毒本身的危害。况且ACE2原本是细胞膜 上的跨膜蛋白，做成可溶性分子(非跨膜形式)后，其在体内的降解 情况也尚不清楚，存在一定的安全隐患。此外，这种可溶性hACE2 分子，其空间结构和其跨膜形式相比存在差异，虽然在实验中可以结 合SARS-CoV-2的S蛋白，然而当病毒的S蛋白发生变异，其拮抗能 力就有可能失去。

此外还有鸡尾酒双抗疗法，其是通过多靶点阻断SARS-CoV-2 的S蛋白和ACE2受体结合，但这种方法的缺点在于抗体制作纯化成 本高，同样不能完全避免S蛋白突变后的脱靶效应，即S蛋白突变 后的治疗效果会降低或失效，对于其他以ACE2为受体的病毒可能无效。

另一种治疗方案是在纳米颗粒的外边，套上了来自人类肺上皮细 胞的细胞膜，或是巨噬细胞的细胞膜。这些细胞膜上，也带有与 SARS-CoV-2结合的受体，包括(hACE2、hTMPRSS2、CD147和CD26)。治疗时，只需在体内输入大量纳米颗粒，就可以把细胞周围 的SARS-CoV-2给“吸走”。此方案的不足之处在于，如要应用于临床， 研究中所用的肺上皮细胞和巨噬细胞均需来自患者本身，否则会有排 斥反应。而取材及获得大量患者的细胞膜本身就是个难题，再将这种 纳米粒注射人体后其排出和降解也存在一定的问题，因此，该治疗方 案的安全性和高成本都是后期要考虑的问题。

近期，复旦大学姜世勃阐述纳米诱饵通过两步中和作用有效干预 病毒感染及其相关的炎性因子风暴等免疫疾病，为新冠肺炎治疗药物 的设计提供了全新的策略。这种方法的缺点在于，纳米材料本身的抗 原性，且制备成本高，制备步骤复杂，不能直接清除病毒。

药物公司Apeiron Biologics研制了一种注射剂药物APN01。该 治疗方案是基于ACE2受体合成的冠状病毒刺突蛋白的“诱饵”。体外 实验表明APN01可以阻止冠状病毒和呼吸道细胞结合，计划今年开 始临床实验，此方案的缺点在于，药物生产以及分离纯化成本高，在 体内的注射后也会影响患者本身的肾素血管紧张素系统，并且其免疫 原性、安全性及是否能快速降解均未知。此外，由于ACE2原本是跨 膜蛋白，通过真核表达系统，提取、分离、纯化后很难保持其原有的 空间结构，即使纯化后的跨膜蛋白可以和现在的新冠病毒S蛋白结 合，但当S蛋白发生突变，其结合效能可能大幅下降。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种生物吸附材料及制备方法、病毒吸附 系统和辅助透析循环系统以解决上述技术问题。

本发明是这样实现的：

一种生物吸附材料，该生物吸附材料是高表达hACE2、 hTMPRSS2、hCD55和hCD59蛋白的细胞株，且细胞株为敲除了组 织凝血激酶的人血管内皮细胞。

本发明以人源血管内皮细胞系为基础，结合基因编辑技术，提供 了一种可快速、廉价制备，并且能在体外短时间安全有效地清除或降 低血液中病毒的生物吸附材料。该生物吸附材料可在体外快速扩增， 且原材料的成本较低。

在进行血液中的病毒(通过hACE2受体感染人体的病毒)去除 时，只需通过血浆分离器，将血细胞和血浆分离，将分离出的血浆引 入至本发明提供的生物吸附材料上，通过生物吸附材料上的hACE2 受体吸附病毒。这个吸附过程并不接触血液中的免疫细胞，也就不会 引起免疫排斥反应，而且此过程在体外进行，吸附时所用的生物吸附 材料不进入人体，不会对人体产生代谢负担，安全性高。

此外，上述高表达hACE2的生物吸附材料吸附SARS-CoV-2， 模拟的就是SARS-CoV-2感染人体细胞的过程，生物吸附材料上表达 的hACE2受体和人体中的hACE2受体完全相同。即使后续病毒的S 蛋白结构发生突变，只要冠状病毒还是通过hACE2受体感染细胞， 本发明提供的生物材料就能实现冠状病毒的有效吸附。因此，本发明 提供的生物吸附材料避免了病毒突变后吸附效果下降的问题的发生。

现有的吉满生物科技-SARS-CoV-2(2019-nCoV)S蛋白假病毒 说明书中，多种S蛋白突变假病毒亦能和高表达hACE2受体的293T 细胞高效结合。也即，本申请中高表达hACE2受体的生物吸附材料， 除SARS-CoV-2和SARS-CoV-2的S蛋白突变体外，其他通过hACE2 受体感染人体的病毒，也可以被吸附。

进一步地，本发明提供的生物吸附材料以人血管内皮细胞为基 础。由于血管内皮细胞在体内与血浆直接接触，适应血浆中的渗透压、pH、血糖及二氧化碳和氧气浓度，因此，可以在血浆环境下依然能 维持正常的形态和功能。

有研究表明，SARS-CoV-2感染者有多发血栓和血管炎症的现 象，病毒感染内皮细胞，或内皮细胞受到血浆中炎症因子刺激会释放 组织凝血激酶，从而启动外源性凝血途径(参考Ramlall,Vijendra,et al."Immune complement and coagulation dysfunction inadverse outcomes of SARS-CoV-2infection."Nature medicine(2020).)。

虽然血液净化时会注射抗凝剂(如依诺肝素，达贝和希弗全等)， 但为防止本发明提供的生物吸附材料受到血浆及病毒影响后，释放的 组织凝血激酶超过注射入抗凝限度。发明人在基因组水平上直接敲除 组织凝血激酶(即凝血因子3)，从根本上阻断了外源性凝血途径。 而在正常生理情况下，血管内皮细胞不表达组织凝血激酶，因此敲除 组织凝血激酶不会对血管内皮细胞正常的生长增殖造成影响。

本发明提供的生物吸附材料高表达hACE2和hTMPRSS2蛋白。 SARS-CoV-2的高传染性和高致病性主要源于其较强的膜融合性， SARS-CoV-2主要通过这两个分子感染细胞。S蛋白和膜ACE2结合 后，来自人体的细胞蛋白酶把S蛋白切断为S1和S2，S1与ACE2 结合，S2被细胞膜表面TMPRSS2切断，从而促进膜融合。从S蛋 白结合ACE2到病毒和细胞膜融合，大约只需要10min，病毒进入细 胞后，复制、包装到释放大约需要10小时。

正常的内皮细胞中虽然也表达这两个蛋白，但其含量明显低于心 脏、肾脏和睾丸细胞，通过转基因技术在血管内皮细胞中高表达 hACE2和hTMPRSS2可以富集血液中的SARS-CoV-2。而且正因为 hACE2和hTMPRSS2原本在内皮细胞中就有表达，有完整的转录翻译和翻译后修饰系统，所以过表达后的hACE2和hTMPRSS2可以被 正确折叠修饰，形成有效的跨膜蛋白，该跨膜蛋白具有完整正确的天 然结构。

本发明提供的生物吸附材料还同时高表达hCD55和hCD59两种 膜蛋白。这三种膜蛋白主要起补体调节作用，CD55可以抑制细胞膜 上的C3转化酶活性，促进其解离，CD59可以抑制攻膜复合物(MAC) 的形成，防止补体的细胞溶破作用，因此同时高表达这三个蛋白可以 有效抑制补体对生物吸附材料的影响。已有文献报道通过高表达 CD55和CD59可以有效抑制体内补体激活，减轻补体激活对内皮细 胞的损伤(参考王菁，2014；姚旭东，2002；桂军胜，2006)。由于 SARS-CoV-2感染患者体内补体系统是被激活的(参考Ramlall,Vijendra,et al."Immune complement and coagulation dysfunction in adverseoutcomes of SARS-CoV-2infection."Nature medicine(2020).)， 激活的补体可以作用于被病毒感染的细胞，导致细胞崩解。虽然本发 明提供的生物吸附材料每次作用时间只有1小时，但为了防止本发明 的细胞株被补体系统损伤，需要高表达补体抑制因子。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述人血管内皮细胞为人脐静 脉内皮细胞；

优选地，上述人脐静脉内皮细胞为EAhy926。在其他实施方式中， 其他通过基因编辑或细胞融合方式制得的人源血管内皮细胞株也具 有可行性，如HUVEC细胞(TERT过表达的人脐静脉内皮细胞)细 胞，HMEC-1细胞(人真皮微血管内皮细胞)，和HBEC-5i细胞(人 脑微血管内皮细胞)等。

一种生物吸附材料的制备方法，其包括如下步骤：采用基因敲除 的方法敲除人血管内皮细胞的组织凝血激酶，然后在敲除组织凝血激 酶的人血管内皮细胞株中，通过慢病毒转染，获得稳定高表达 hACE2、hTMPRSS2、hCD55和hCD59蛋白的细胞株。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述基因敲除的方法为 CRISPR-Cas9基因编辑技术，通过CRISPR-Cas9基因编辑技术敲除 人血管内皮细胞的组织凝血激酶，然后通过慢病毒转染构建同时高表 达hACE2和hTMPRSS2的细胞株，然后以高表达hACE2和 hTMPRSS2的细胞株为基础，通过慢病毒转染构建同时稳定高表达 hCD55和hCD59的细胞株。

在其他实施方式中，上述基因敲除的方法还可以是TALEN技术。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述制备方法还包括将敲除凝 血因子3并同时高表达hACE2、hTMPRSS2、hCD55和hCD59蛋白 的细胞株用NF-κB信号通路抑制剂进行处理；

优选地，NF-κB信号通路抑制剂为QNZ，此抑制剂的使用浓度 范围为0.3-0.7μmol/L，优选的使用浓度为0.5μmol/L；

优选地，在体外用QNZ处理8-12h；

优选地，用QNZ处理8-12h后，用无血清培养基清洗细胞，消 化收集细胞。

此外，在其他实施方式中，NF-κB信号通路抑制剂也可以是如下 中的任意一种：

二氢杨梅素、硼替佐米、BX795、BX320、Benzoyloxypaeoniflorin (苯甲酰氧化芍药苷)、Ethacrynic acid D5(Ethacrynic acid的氘代 物)、Ethacrynic acid、Caffeicacid phenethyl ester(咖啡酸苯乙酯)、 CID-2858522、Pyrrolidinedithiocarbamateammonium(吡咯烷二硫代 氨基甲酸铵)、B022、Kamebakaurin、Licochalcone D(甘草查尔酮D)、 Oxaprozin、JSH-23、Isovitexin(异牡荆黄素)、PTD-p65-P1 Peptide TFA、WithaferinA(醉茄素A)、Andrographolide(穿心莲内酯)、 SP-100030、Betulinic acid(白桦脂酸)、GS143和Chelidonic acid(白 屈菜酸)。

使用QNZ以外的其他抑制剂时，需选用不影响细胞活性并能有 效发挥NF-κB信号通路抑制功能的剂量。

已有报道显示新冠肺炎患者体内会发生炎症因子风暴，其中 TNF-α和IL-6是主要的炎症因子，SARS-CoV-2感染细胞后会介导炎 症反应，诱导细胞分泌TNF-α和IL-6，所以如果本发明提供的生物 吸附材料吸附了SARS-CoV-2却释放炎症因子，这无疑是加重患者炎症因子风暴，NF-κB是调控TNF-α和IL-6表达的主要的信号通路 (WAN，2017；郭峰，2012；Chen，2017)，并且QNZ是其安全有 效高特异性的抑制剂，不会影响正常细胞活性，预处理10h后其抑制 效应可维持24h(Zhang，2019)，因此我们采用QNZ预处理方式， 防止我们的生物材料吸附SARS-CoV-2后释放炎症因子。由于IL-6 和TNF-α在正常血管壁内皮细胞中有本底表达，若选择直接从基因 组水平上敲除可能会影响细胞正常的生长和增殖，所以发明人采用了 加入NF-κB信号通路特异性抑制剂的方式。

一种病毒吸附系统，其包括生物反应器，生物反应器中接种有生 物吸附材料或由上述制备方法制得的生物吸附材料。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述生物反应器为生物人工肝 系统中的生物反应器。

上述病毒吸附系统与生物人工肝系统的设计理念相同，区别在 于，将生物人工肝系统中生物反应器中的外源肝细胞换成了本发明中 的生物吸附材料，并且需选择是将患者血浆与外源肝细胞进行直接接 触的反应器。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述病毒吸附系统是吸附通过 ACE2感染人体的病毒的吸附系统；

优选地，病毒吸附系统是吸附新型冠状病毒的吸附系统。

一种辅助透析循环系统，其包括辅助透析循环装置，辅助透析循 环装置中连接有病毒吸附系统；

优选地，辅助透析循环装置为免疫吸附机(包括体外辅助透析循 环和免疫吸附柱冲洗装置)或者生物人工肝系统的辅助透析循环装 置。例如用来清除肾移植病人体内HLA抗体的免疫吸附机。

一种包被有生物吸附材料或由上述制备方法制得的生物吸附材 料的免疫吸附器。

在一种实施方式中，在吸附柱后面还可以加上炎症因子吸附柱， 确保患者的治疗效果。

根据患者血液中SARS-CoV-2的含量，调整吸附时间，一般体外 连续使用1-3小时，可以每1小时更换一个吸附器。

此吸附器不同于常用的免疫吸附柱，为一次性使用，实际临床使 用时无需间断性对吸附器进行洗脱，平衡以及测pH值，这样可以减 少医护人员的负担，同时也减少病毒气溶胶的扩散，增强医护人员及 病人的安全性。

上述免疫吸附器可以和血液透析(CRRT)、免疫吸附和ECMO (人工肺)联合使用，减轻患者负担，并为医疗人员救治争取更多时 间。

本发明提供的生物吸附材料及病毒吸附系统主要针对有高病毒 血症并且本身肾脏受损就需要透析的新冠肺炎危重症感染者。本发明 只需前期采用基因编辑技术构建好稳定细胞株，细胞便可大规模培 养，接种生物反应器前，只需用QNZ短时间处理，与现有技术相比， 具有操作简便，成本低廉，快速高效的优势。

本发明具有以下有益效果：

本发明以人源血管内皮细胞系为基础，结合基因编辑技术，提供 了一种可快速、廉价制备，并且能在体外短时间安全有效地清除或降 低血液中病毒的生物吸附材料。该生物吸附材料可在体外快速扩增， 且原材料的成本低廉。与现有技术相比，具有操作简便，直接高效清 除患者血液中病毒的优势。本发明采用hACE2原始的天然跨膜结构， 无需顾虑冠状病毒的S蛋白突变造成的影响，并且本发明提供的生物 吸附材料也适用于其他以hACE2为结合受体的病毒吸附。本发明提 供的生物吸附材料及病毒吸附系统，在吸附过程时并不接触血液中的 免疫细胞，也就不会引起免疫排斥反应，而且此过程在体外进行，吸 附时所用的生物吸附材料不进入人体，不会对人体产生代谢负担，安 全性高。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中 所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发 明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通 技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图 获得其他相关的附图。

图1为EAhy926和Work EAhy926在无血清培养基培养条件下 细胞形态和细胞活性图；

图2为采用RT-PCR的方法检测Work EAhy926在外源刺激下抑 制炎症因子的mRNA表达水平；

图3为采用ELISA的方法检测Work EAhy926在外源刺激下抑 制炎症因子的分泌水平；

图4为人血浆+50转/min培养1h对EAhy926和Work EAhy926 对细胞形态和细胞活性的影响；

图5为人血浆+50转/min+SARS-CoV-2的S蛋白假病毒处理1h 对EAhy926和WorkEAhy926细胞形态和细胞活性的影响；

图6为人血浆+50转/min+SARS-CoV-2的S蛋白假病毒处理1h 后，再用无血清培养基培养48h后的荧光显微图；

图7A为Work EAhy926对血浆中SARS-CoV-2的S蛋白假病毒 吸附效率检测的荧光显微图和统计图；

图7B为进一步验证图7A中Work EAhy926对SARS-CoV-2的S 蛋白假病毒吸附效率的实验结果图(图1、图4、图5、图6、图7A 和图7B中的显微图片均为放大100倍后拍摄的图片)。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对 本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明 具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪 器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供了一种生物吸附材料的制备方法，其包括如下步 骤：

1.运用CRISPR-Cas9基因编辑技术敲除人脐静脉内皮细胞 (EAhy926，购于美国ATCC细胞库)中的组织凝血激酶(即凝血因 子3)。该敲除过程具体包括：

(1)本实施例中针对凝血因子3(简写为TF)CDS区域第1外 显子设计合成了靶向sgRNA序列，在编码链模板5’端添加CACC， 非编码链3’端添加AAAC，具体序列如下：

TFsgRNAspoligo1：

5’-caccgCTCGGCTGGGTCTTCGCCC-3’

TFsgRNAspoligo2：

3’-aaacGGGCGAAGACCCAGCCGAGc-5’

在其他实施例中，也可以根据需要替换为其他能有效实现凝血因 子3敲除的sgRNA序列，并不限于本实施例中提供的上述sgRNA序 列。

(2)Oligo退火形成duplex。

(3)选择lentiCRISPRV2质粒(购于Addgene公司)，用BsmB I酶切，胶回收。

(4)将退火形成的oligo双链和酶切后的lentiCRISPRV2载体用 T4 DNA连接酶连接。

(5)将连接后的质粒转化感受态细胞，用Amp抗性筛选阳性克 隆，摇菌，抽提质粒，测序鉴定，得到lentiCRISPRV2-TF质粒。

(6)包装慢病毒，转染293T细胞，并于转染后48h和72h收 集病毒上清。

慢病毒包装体系为：慢病毒包装辅助质粒混合物为GM easy^TM Lentiviral Mix(由上海吉满生物科技有限公司提供)，表达质粒 lentiCRISPRV2-TF-Puro，包装质粒购于Addgene公司；

转染试剂为Lipofectamine^TM 3000和POTI-MEM(购于美国 Thermo公司)。

(7)病毒感染EAhy926细胞，病毒感染EAhy926细胞后用 Puromycin(嘌呤霉素)进行筛选阳性克隆细胞，并使用有限稀释法 挑选单克隆敲除细胞株。

(8)稳定细胞株鉴定：

提取各组敲除TF的单克隆细胞株基因组DNA进行测序，选择 具有TF基因缺失或插入突变的稳定细胞株，并将这些细胞株分别用 0.1μg/ml LPS处理6h，收集各组细胞蛋白及培养上清，用Western blot (购于Abcom公司)及ELISA法(购于ADI公司)分别检测细胞及培养上清中TF含量，选择在LPS刺激后TF含量均未有显著上升的 细胞株，继续后续实验。

2.在步骤1敲除凝血因子3的细胞株中，通过慢病毒转染，构建 同时稳定高表达hACE2和hTMPRSS2的细胞株。具体构建步骤包括：

(1)慢病毒获取：

此步骤中的包装好的慢病毒由上海吉满生物科技有限公司制备 提供，其中过表达hACE2和hTMPRSS2的载体为 GMlenti-hACE2-hTMPRSS2-Neo(由上海吉满生物科技有限公司构 建)，慢病毒包装辅助质粒混合物为GM easy^TM Lentiviral Mix(由上 海吉满生物科技有限公司提供)。

(2)病毒感染EAhy926细胞：

病毒感染EAhy926细胞后用G418进行筛选阳性克隆细胞，并使 用有限稀释法挑选单克隆过表达细胞株。

(3)稳定细胞株鉴定：

用流式法检测各组细胞表面hACE2和hTMPRSS2的表达量，选 取hACE2和hTMPRSS2表达量均较高的细胞株，提取膜蛋白用 Western blot法进一步检测hACE2和hTMPRSS2的蛋白表达量，选 取这两个蛋白表达量最高的细胞株进行后续实验。

Western blot抗体购于Abcom公司，流式抗体购于Biolegend公 司。

3.在步骤2构建的同时稳定高表达hACE2和hTMPRSS2的细胞 株的基础上，通过慢病毒转染，构建同时稳定高表达hCD55和hCD59 的细胞株。具体构建步骤包括：

(1)慢病毒获取：

该步骤中的包装好的慢病毒由上海吉满生物科技有限公司制备 提供，其中过表达hCD55和hCD59的载体为 GMlenti-hCD55-hCD59-Bsr(由上海吉满生物科技有限公司构建)， 慢病毒包装辅助质粒混合物为GM easyTM Lentiviral Mix(由上海吉 满生物科技有限公司提供)。

(2)病毒感染EAhy926细胞：

病毒感染EAhy926细胞用Blasticidin S(杀稻瘟菌素)进行筛选 阳性克隆细胞，并使用有限稀释法挑选单克隆过表达细胞株。

(3)稳定细胞株鉴定：

用流式法检测各组细胞表面hCD55和hCD59的表达量，选取 hCD55和hCD59表达量均较高的细胞株，提取膜蛋白用Western blot 法进一步检测hCD55和hCD59的蛋白表达量，选取这两个蛋白表达 量最高的细胞株进行后续实验。

Western blot抗体购于Abcom公司，流式抗体购于Biolegend公 司。

需要说明的是，本实施例中慢病毒载体，转染，阳性克隆筛选， 单克隆株挑选及鉴定方法均为本发明中的优选方法，在其他实施方式 中，其他能达制得相同细胞株的试剂和方法亦可，也在本发明的保护 范围内。

进一步地，在其他实施方式中，也可以在步骤1敲除凝血因子3 的细胞株的基础上，选择先构建同时稳定高表达hCD55和hCD59的 细胞株，然后在此基础上再构建同时稳定高表达hACE2和 hTMPRSS2的细胞株，并不限于本实施例提供的构建顺序及方法。

4.将上述步骤3构建的同时稳定高表达hACE2、hTMPRSS2、 hCD55和hCD59并且敲除凝血因子3的细胞株，在体外用无血清培 养基培养至合适密度(培养2d)，加入NF-κB信号通路抑制剂 0.5μmol/L QNZ(购于美国MCE公司)，用QNZ处理10h后换用无 血清培养基清洗2遍细胞，消化收集细胞后接种到合适的生物反应器 内(本实施例中生物反应器选择的是上海赛业生物人工肝系统的3D 气液交互式反应器)。

5.将步骤4包被有SARS-CoV-2特异性生物吸附材料的生物反应 器接入辅助透析循环装置。

在其他实施例中，步骤4获得的同时稳定高表达hACE2、 hTMPRSS2、hCD55和hCD59并且敲除凝血因子3的细胞株亦可和 免疫吸附器联用，使用时根据患者血液中SARS-CoV-2病毒的含量， 调整吸附时间，一般建议体外连续使用1-3小时，可以每1小时更换 一个吸附器。吸附器包括：生物反应器以及同时稳定高表达hACE2、 hTMPRSS2、hCD55和hCD59并且敲除凝血因子3的细胞株。

使用上述吸附器进行SARS-CoV-2吸附工作流程包括：将患者血 液先经血浆分离柱使得血细胞和血浆分离，血浆流入步骤4的生物反 应器中，经生物材料吸附后，去除SARS-CoV-2的血浆再和最开始分 离出的血细胞一起汇入患者血管，完成一次吸附，每隔1小时更换一 次吸附器。更换吸附器时，用生理盐水低速冲洗吸附器，冲洗液和吸 附器内剩余血浆会输到病人体内，尽量避免患者体液流失。

本实施例中制备的敲除凝血因子3(TF敲除)且同时高表达 hACE2、hTMPRSS2、hCD55和hCD59的细胞株命名为Work EAhy926。且Work EAhy926为实施例1步骤(4)用0.5μmol/L QNZ 处理10h后细胞株。EAhy926为正常的细胞株。

实验例1

检测正常培养条件下EAhy926和Work EAhy926细胞形态和活 性的差异。

EAhy926和Work EAhy926细胞以相同细胞数铺板，在无血清培 养基培养条件下，24h后用显微镜观察形态，用CCK-8检测细胞活 性，如图1所示，Work EAhy926和EAhy926相比，细胞形态和活性 均无明显差异，表明上述基因编辑和QZN药物处理对细胞形态和活 性没有明显影响。

实验例2

本实验例检测TF的敲除效果。

Work EAhy926为实施例1步骤(4)用0.5μmol/L QNZ处理10h 后细胞株。EAhy926为正常的细胞株。

以下细胞实验中的细胞除特别说明外均用无血清培养基培养。

实验方法：根据文献(张园，PTX3对LPS诱导内皮细胞表达 TF的影响，2005)中诱导内皮细胞TF表达的方法，采用0.1μg/ml LPS 孵育细胞6h。

TF表达量测量：收集细胞，用ELISA法(采用ADI公司生产的 TF含量ELISA检测试剂盒)检测TF表达量。

TF促凝活性测量：细胞用冰PBS洗3次，每孔加入200μl凝血 缓冲液，刮下细胞，加入100μl正常人血清和100μl 200mmol/L CaCl₂， 用凝血计测量凝血时间，与标准曲线比较，即可检测出每孔细胞的 TF凝血活性。

实验结果参照表1所示：正常培养的EAhy926和Work EAhy926 基本不表达TF，也无促凝活性，两组无明显差异；EAhy926加0.1 μg/ml LPS处理后，与EAhy926正常培养组相比，TF表达量和TF 促凝活性显著升高，而Work EAhy926加0.1μg/ml LPS处理前后TF 表达量和TF促凝活性均无明显差异，Work EAhy926+0.1μg/ml LPS 处理组的TF表达量和TF促凝活性明显低于EAhy926+0.1μg/ml LPS 处理组，说明Work EAhy926细胞在TF敲除后，在外源刺激下不会 表达TF，也不会有凝血活性。

表1.0.1μg/ml LPS处理前后对TF表达量和促凝活性的影响。

a表示：与EAhy926组相比，p<0.01；

b表示：与EAhy926+0.1μg/ml LPS相比，p<0.01。

实验例3

本实验例检测高表达hCD55和hCD59后对补体激活的影响。

实验方法参照(王菁，补体受体1对补体激活的氧化应激状态下 人视网膜色素上皮单层细胞屏障的保护作用，2014)中第1.4节TER 值及VEGF、CCL2、C3a、C5a、MAC蛋白量检测方法。用ELISA 法(采用美国Quidel公司生产的C3a、C5a和MAC含量ELISA试 剂盒)检测培养上清中游离C3a和C5a，以及细胞膜表面MAC蛋白 含量的方法，可以表明补体激活情况。

实验方法：无血清培养基+10％正常人血浆分别与EAhy926和 Work EAhy926培养1h后，检测C3a、C5a和MAC蛋白含量，空白 对照为无血清培养基+10％正常人血浆。

实验结果参照表2所示，与空白对照组相比，EAhy926组和Work EAhy926组均未发现C3a、C5a和MAC蛋白含量有明显升高，说明 Work EAhy926本身不会引起补体激活。

表2.正常人血浆处理后对C3a，C5a和MAC蛋白表达量的影响。

进一步地，实验组(EAhy926组和Work EAhy926组)均加入终 浓度为500μmol/L的t-BHP和10％正常人血浆，处理1h后，检测 C3a、C5a和MAC蛋白含量，空白对照为无血清培养基+10％正常人 血浆。

实验结果参照表3所示：

与空白对照组相比，EAhy926组的C3a、C5a和MAC蛋白含量 均显著升高；与空白对照组相比，Work EAhy926组的C3a、C5a和 MAC蛋白含量均无明显差异；Work EAhy926组的C3a、C5a和MAC 蛋白含量明显低于EAhy926组。

表3.500μmol/L t-BHP处理对C3a，C5a和MAC蛋白表达量的影响。

a表示：与空白对照组相比，p<0.01；

b表示：与EAhy926相比，p<0.01。

实验例4

本实验例分别采用RT-PCR以及ELISA的方法检测Work EAhy926在外源刺激下抑制炎症因子表达水平。

实验方法包括：用无血清培养基+1μg/ml LPS分别处理Work EAhy926和EAhy926，4h后收集细胞检测TNF-α和IL-6mRNA表 达量，收集培养上清ELISA法(采用美国RayBiotech公司生产的 TNF-α和IL-6含量ELISA试剂盒)检测TNF-α和IL-6分泌量。

实验结果：参照图2和图3所示，在LPS后处理后EAhy926细 胞TNF-α和IL-6表达量均明显升高，而Work EAhy926细胞则能显 著抑制TNF-α和IL-6表达，将TNF-α和IL-6表达量维持在正常水平。

实验例5

本实验例检测人血浆+50转/min培养Work EAhy926 1h对细胞形 态和细胞活性的影响。

实验方法包括：

Work EAhy926细胞用正常人血浆培养，并且在50转/min，正常 细胞培养箱的培养条件(37℃，5％CO₂)下培养1h，以模拟Work EAhy926细胞在实际使用时的培养环境，对照组为用无血清培养基正 常培养的Work EAhy926细胞。

TF表达量和TF促凝活性检测方法参照实验例1的方法；

培养上清中TNF-α和IL-6含量用ELISA法检测，ELISA试剂 盒与实验例4相同。

培养上清中游离C3a、C5a和膜表面MAC蛋白含量用ELISA法 检测，ELISA试剂盒与实验例3相同。

实验结果如下：

显微镜下的细胞形态及用CCK-8检测细胞活性的数据参照图4 所示，由图4可知Work EAhy926细胞在培养前后细胞形态和细胞活 性均无明显差异，表明实际使用时的细胞外环境不会对细胞形态和细 胞活性造成明显影响。

参照表4所示，Work EAhy926在正常人血浆+50转/min培养条 件下，以上各项指标均无明显差异，表明实际使用时的培养环境不会 引起TF介导的凝血反应，不会引起TNF-α和IL-6分泌增多，也不 会激活补体。

表4.正常人血浆+50转/min培养前后对Work EAhy926的影响。

实验例6

本实验例为SARS-CoV-2的S蛋白和内皮细胞ACE2结合介导的 膜融合对WorkEAhy926细胞的影响实验。

Work EAhy926细胞用正常人血浆培养，并且在50转/min，正常 细胞培养箱的培养条件(37℃，5％CO₂)下培养1h，处理组加10⁶PFU SARS-CoV-2的S蛋白假病毒共同孵育，以模拟Work EAhy926细胞 在实际使用时，SARS-CoV-2的S蛋白和内皮细胞ACE2结合介导的 膜融合对Work EAhy926细胞的影响。

显微镜下的细胞形态及用CCK-8检测细胞活性的数据参照图5 所示，由图5可知Work EAhy926细胞在培养前后细胞形态和细胞活 性均无明显差异，表明实际使用时的S蛋白介导的膜融合(即1h内 吸附SARS-CoV-2这个过程)不会对细胞形态和细胞活性造成明显影 响。

TF表达量和TF促凝活性检测方法与实验例2相同；

培养上清中TNF-α和IL-6含量用ELISA法检测

培养上清中游离C3a、C5a和膜表面MAC蛋白含量用ELISA法 检测。

实验结果参照表5所示：

Work EAhy926+10⁶PFU组和Work EAhy926组相比，以上各 项指标均无明显差异，表明SARS-CoV-2的S蛋白和内皮细胞ACE2 结合介导膜融合时不会影响Work EAhy926细胞活性，不会引起TF 介导的凝血反应，不会引起TNF-α和IL-6分泌增多，也不会激活补 体。

表5.10⁶PFU SARS-CoV-2的S蛋白假病毒处理前后对Work EAhy926的影响。

实验例7

本实验例的实验方法包括：

正常人血浆+50转/min的培养条件下，10⁶PFU SARS-CoV-2的S 蛋白假病毒和细胞共培养1h，1h后吸去上清，PBS洗涤后，换无血 清培养基在培养箱中静置培养48h，48h后在荧光显微镜下观察。

用荧光显微镜观察。实验结果参照图6所示：与EAhy926相比， Work EAhy926的平均荧光面积(Mean fluorescence area)显著增多， 平均荧光强度(Mean IntDen)也明显增高，表明能高效结合 SARS-CoV-2的S蛋白假病毒。

平均荧光面积和平均荧光强度统计方法为：采取双盲检测法，每 组随机选择10个视野，拍摄荧光照片，用Image J图像分析软件， 计算每组各个视野中总荧光面积和总荧光强度，再通过SPSS统计软 件做统计分析。

10⁶PFU SARS-CoV-2的S蛋白假病毒对应吉满说明书中 0.1μlSARS-CoV-2假病毒原液(参照现有的吉满生物科技 -SARS-CoV-2(2019-nCoV)S蛋白假病毒说明书)。

实验例8

为进一步明确Work EAhy926对血浆中SARS-CoV-2的S蛋白假 病毒的吸附效率进行本实验例。

正常人血浆+50转/min的培养条件下，10⁶PFU SARS-CoV-2的S 蛋白假病毒和WorkEAhy926细胞共培养1h，1h后此细胞换无血清 培养基在培养箱中静置培养48h，将上述培养1h后含剩余假病毒的 培养上清分别和Work EAhy926和EAhy926细胞再共培养1h，1h后 均换无血清培养基在培养箱中静置培养48h，48h后各组在荧光显微 镜下观察。

用荧光显微镜观察，实验结果参照图7A所示：Work EAhy926 细胞和假病毒孵育后，同图6依然观察到大面积强荧光；

而将剩余假病毒培养液再和Work EAhy926细胞共孵育后，仅能 观察到零星弱荧光；参照图7B所示，将剩余假病毒培养液再和 EAhy926细胞共孵育后，基本未观察到荧光(n.o.＝not observed未观 察到)。

以上结果进一步明确Work EAhy926细胞可以高效吸附血浆中的 假病毒，极大程度上减轻了病毒对正常血管内皮细胞(EAhy926)的 感染。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明， 对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本 发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应 包含在本发明的保护范围之内。

Claims (15)

1.一种生物吸附材料，其特征在于，所述生物吸附材料是高表达hACE2、hTMPRSS2、hCD55和hCD59蛋白的细胞株，且所述细胞株为敲除了组织凝血激酶的人血管内皮细胞，所述人血管内皮细胞为EAhy926，所述细胞株能够吸附SARS-CoV-2病毒。

2.一种如权利要求1所述的生物吸附材料的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：采用基因敲除的方法敲除人血管内皮细胞的组织凝血激酶，然后在敲除组织凝血激酶的人血管内皮细胞株中，通过慢病毒转染，获得高表达hACE2、hTMPRSS2、hCD55和hCD59蛋白的细胞株，所述人血管内皮细胞为EAhy926，所述细胞株能够吸附SARS-CoV-2病毒。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述基因敲除的方法为CRISPR-Cas9基因编辑技术，通过CRISPR-Cas9基因编辑技术敲除人血管内皮细胞的组织凝血激酶，然后通过慢病毒转染构建同时稳定高表达hACE2和hTMPRSS2的细胞株，然后以高表达hACE2和hTMPRSS2的细胞株为基础，通过慢病毒转染构建同时稳定高表达hCD55和hCD59的细胞株。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括获得将同时高表达hACE2、hTMPRSS2、hCD55和hCD59蛋白的细胞株用NF-κB信号通路抑制剂进行处理。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述NF-κB信号通路抑制剂为QNZ，QNZ的使用浓度为0.3-0.7μmol/L。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，QNZ的使用浓度为0.5μmol/L。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，在体外用QNZ处理8-12h。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，用QNZ处理8-12h后，用无血清培养基清洗细胞，消化收集细胞。

9.一种病毒吸附系统，其特征在于，其包括生物反应器，所述生物反应器中接种有权利要求1所述的生物吸附材料或权利要求2-8任一项所述的制备方法制得的生物吸附材料。

10.根据权利要求9所述的病毒吸附系统，其特征在于，所述生物反应器为生物人工肝系统中的生物反应器。

11.根据权利要求9所述的病毒吸附系统，其特征在于，所述病毒吸附系统是吸附通过ACE2感染人体的病毒的吸附系统。

12.根据权利要求11所述的病毒吸附系统，其特征在于，所述病毒吸附系统是吸附新型冠状病毒的吸附系统。

13.一种辅助透析系统，其特征在于，其包括辅助透析装置，所述辅助透析装置中连接有权利要求9-12任一项所述的病毒吸附系统。

14.根据权利要求13所述的辅助透析系统，其特征在于，所述辅助透析装置为免疫吸附机。

15.一种包被有权利要求1所述的生物吸附材料或权利要求2-8任一项所述的制备方法制得的生物吸附材料的免疫吸附器。

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