CN112375128B - 一种RNA结合蛋白OsRRM及调控水稻中糖转运的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种RNA结合蛋白OsRRM及调控水稻中糖转运的应用，所述的RNA结合蛋白OsRRM是下列核苷酸序列之一：(1)、序列表中序列1所示的DNA序列；(2)、与序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同的功能蛋白质的DNA序列。另一方面，本发明公开了RNA结合蛋白OsRRM在调控水稻中糖转运的应用。本发明的有益效果为：糖转运体编码基因受到一个新的RNA‑结合蛋白OsRRM的调控。OsRRM直接并特异结合多个糖转运体编码基因的mRNA，并可能使它们稳定性增加。鉴于糖的分配对植物的生长，发育和产量都至关重要，因此我们的研究对作物产量的提升提供了新的指导方向。

Description

一种RNA结合蛋白OsRRM及调控水稻中糖转运的应用
技术领域
本发明涉及水稻糖转运体调控领域，主要是一种RNA结合蛋白OsRRM及调控水稻中糖转运的应用。
背景技术
糖分在营养组织和生殖组织之间的分配对植物发育至关重要，而糖转运体在这一过程中起着基础性作用。尽管已经鉴定到了一些转录因子可以参与糖转运体转录水平的调控，但是它们如何在转录后水平来被调控的却仍然不清楚。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，而提供一种RNA结合蛋白OsRRM及调控水稻中糖转运的应用。
本发明的目的是通过如下技术方案来完成的。本发明公开了一种RNA结合蛋白OsRRM，是下列核苷酸序列之一：
(1)、序列表中序列1所示的DNA序列；
(2)、与序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同的功能蛋白质的DNA序列。
另一方面，本发明公开了RNA结合蛋白OsRRM在调控水稻中糖转运的应用。
本发明的有益效果为：在本发明中，发现OsRRM作为一种RNA结合蛋白，能够在源-库途径上调节组织中的糖分配。OsRRM在一定程度上与几个糖转运蛋白基因和影响糖转运蛋白基因的表达转录因子的表达模式相似。在osrrm突变体中几乎所有糖转运体编码基因的转录水平被显著下调，这些变化改变了糖代谢和糖信号，进而影响植株高度、开花时间、种子大小和淀粉合成。进一步发现OsRRM可以直接与糖转运基因编码的mRNA结合，可能会使它们的稳定性增加。因此，本发明揭示了OsRRM的生理功能，为糖代谢和糖信号传导提供了新的思路。
附图说明
图1.osrrm突变体及其互补转基因植株pOsRRM::OsRRM/osrrm的株型和种子表型鉴定。
(A)WT，osrrm，及pOsRRM::OsRRM/osrrm植株在抽穗期的株型。Bar＝10cm。(B)WT，osrrm，及pOsRRM::OsRRM/osrrm植株的抽穗期，茎长及分蘖数统计。n＝20。(C)WT，osrrm，及pOsRRM::OsRRM/osrrm植株的籽粒大小表型。Bar＝5mm。(D)粒重分析，每个株系以千粒重形式统计。(B)和(D)图中的不同字母表示T-检验的显著性差异(P＜0.05)。上述测量结果在两年不同年份重复测量2次结果类似。
图2.长日条件和短日条件下昼夜节律基因及开花控制相关基因在WT和osrrm突变体中的表达。
图3.osrrm突变体的淀粉含量及支链淀粉的精细结构检测。
(A-C)胚乳中总淀粉含量，表观直连淀粉含量及可溶性糖含量的测定。图中不同字母表示T-检验的显著性差异(P＜0.05)。(D)osrrm与WT胚乳中支链淀粉的链长分布差异。链长分布由HPAEC-PAD法来测定。上述测定结果重复3次具有相似结果。
图4.osrrm突变体的糖输出效率降低。
(A)WT和osrrm的旗叶，旗叶鞘，茎及幼穗中三种可溶性糖(蔗糖，果糖和葡萄糖)含量的检测。(B)4周龄幼苗顶端叶片的可溶性糖输出测定。误差棒表示SD，FW表示鲜重。
(C)糖转运基因在osrrm和WT茎中的表达检测。数据是以8个基因在osrrm和WT中的相对表达来表示的。三次生物学重复具有相似的结果。
图5.OsRRM在水稻中的表达模式。
(A)OsRRM在不同组织中的qRT-PCR检测(每个样本4个生物学重复)。分别从根(7天幼苗)，茎，叶片，叶鞘(抽穗前)，穗(授粉前)及7DAF未成熟种子中提取总RNA。UBQ10的表达作为内参。每个样本3个生物学重复外加3个技术重复。误差棒表示SD。(B)-(M)GUS转基因植株6种组织的GUS组织染色观察。(B)和(C)是根，(D)和(E)是茎，(F)和(G)是叶片叶鞘，(H)是授粉前幼穗，(I)是雄蕊。(J-M)分别是5/7/9/16DAF的种子。AL表示糊粉层，DVB表示背部维管束，En表示胚乳，EP表示表皮，LC表示叶枕，MP表示成熟花粉，N表示节，P表示胚芽，R表示胚根，S表示盾片，SC表示种皮，T表示绒毡层，VC表示维管柱。(B)，(D)，(F)，(G)，和(H)的标尺为5mm。(C)，(I)，和(K)的标尺为50μm。(E)的标尺为1mm。(J)的标尺为200μm。(L)和(M)的标尺为2mm。
图6.截短的OsRRM特异的结合到OsSUT2,OsTMT1,和OsTMT2的mRNA上。
(A)OsRRM及其截短蛋白的骨架示意图。(B)使用His抗体对纯化蛋白的WB检测。(C)pET32b-OsRRM(1-735)与总RNA的REMSA分析。总RNA提取自ZH11的抽穗前的茎和叶鞘并进行生物素标记。非标记的总RNA作为竞争探针(100倍)。pET-32b作为负对照。箭头指示RNA-蛋白复合物的位置。(D)体外转录的OsSUT2，OsTMT1，OsTMT2和SEBIIb的mRNA的凝胶电泳检测。(E)pET32b-OsRRM(1-735)与上述特异mRNA的REMSA分析。泳道1表示生物素标记的感兴趣RNA，泳道2表示标记的RNA与pET32b-OsRRM(1-735)蛋白孵育产物，泳道3表示加入非标记的RNA竞争物的结果。(C)和(E)的实验重复2次具有相似的结果。
图7.osrrm突变等位基因的分离。
(A)OsRRM基因结构及突变等位基因中T-DNA插入位点示意图。编号的黑色方块表示外显子，而内含子用线条表示。黏结三角形表示T-DNA在osrrm中的插入位点。箭头表示用于基因分型的引物的位置和方向。(B)通过基因分型测定OsRRM位点的合子类型。引物见(A)，+/-表示一个杂合(OsRRM/osrrm)突变株，-/-纯合(osrrm/osrrm)突变株，+/+表示野生型(OsRRM/OsRRM)植株。(C)通过Southern blotting检测osrrm突变等位基因中T-DNA拷贝数。从纯合osrrm或WT植株中提取分离的基因组DNA，用HindIII或SpeI酶切，然后琼脂糖凝胶电泳，将DNA转移到尼龙膜上，并与生物素标记的包含HPTII编码序列的DNA片段杂交。(D)利用半定量RT-PCR分析野生型和纯合osrrm突变植株节中OsRRM的表达。Actin的表达作为内参对照。实验进行了两次重复，得到了相似的结果。
图8.osrrm突变体的颖壳细胞变小。
(A)野生型和osrrm突变体中外稃细胞的扫描电镜。关注由白色虚线勾画的区域中的细胞数目。标尺100μm。(B)WT和osrrm突变体在颖片纵轴上的外稃细胞总数的统计。两次重复实验均得到相似结果，所示数据是五次重复的平均值。
图9.osrrm互补株系的分子鉴定。
(A)表达野生型OsRRM等位基因互补质粒载体的T-DNA区域图。灰色箭头，黑色、浅灰色和白色矩形分别表示启动子、基因编码区、终止子和T-DNA边界。(B)半定量RT-PCR分析WT、纯合osrrm、OsRRM补体植株(pOsRRM::OsRRM/OsRRM)节中OsRRM的表达。Actin的表达作为内参对照。
图10.WT和osrrm突变体的7DAF胚乳中8个淀粉合成酶相关蛋白的WB分析。
将从WT和osrrm籽粒未成熟胚乳中提取分离的总蛋白(20μg)在8％或10％变性聚丙烯酰胺凝胶中分离，转移到PVDF膜上，分别使用抗-AGPase、-OsGBSS1、-SSI、-SSIIa、-SBEI、-SBEIIb、-ISA1和-SP抗体进行检测。蛋白上样量用与抗Actin蛋白抗体WB(下图)来调平。实验进行了两次重复，得到了相似的结果。
图11.OsRRM在外源糖或ABA处理的ZH11植株的表达情况。
“+”和“-”表示植物有无外源处理。从H2O及糖或ABA处理过夜的5天龄幼苗中提取总RNA，进行半定量RT-PCR分析OsRRM的表达。Actin的表达作为内参对照。实验进行了两次重复，得到了相似的结果。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明做详细的介绍：
本发明公开了一种RNA结合蛋白OsRRM，是下列核苷酸序列之一：
(1)、序列表中序列1所示的DNA序列；
(2)、与序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同的功能蛋白质的DNA序列。
另一方面，本发明公开了RNA结合蛋白OsRRM在调控水稻中糖转运的应用。
糖转运体编码基因受到一个新的RNA-结合蛋白OsRRM的调控。OsRRM直接并特异结合多个糖转运体编码基因的mRNA，并可能使它们稳定性增加。鉴于糖的分配对植物的生长，发育和产量都至关重要，因此我们的研究对作物产量的提升提供了新的指导方向。
一、材料和方法：
1.植物材料和生长条件：野生型粳稻品种‘Hwayoung’和osrrm突变体(PFG_2D-01214)来自于韩国浦项科技大学(Jeong等2002)。粳稻品种‘ZH11’被用来做外源糖和ABA处理分析。用于株型，籽粒大小和粒重表型分析的水稻植株种植于自然条件的松江实验基地(31.0322°N,121.2277°E)，其他分析使用的水稻植株种植于温室条件(28℃白天/22℃晚上，光强383μmol m-2s-1)，10h光照/14h黑暗为短日照条件，14h光照/10h黑暗为长日照条件)。为了进行外源糖处理，先将种子在水中萌发5天，然后将根浸没在含有外源糖的水中，黑暗过夜培养。
2.osrrm突变体的互补：OsRRM的启动子(位于OsRRM编码基因起始密码子ATG上游2kb的序列,Os09g12730)和编码区(3018bp)分别扩增自ZH11基因组DNA和cDNA克隆J023129A05(http://cdna01.dna.affrc.go.jp/cDNA)，扩增使用基因特异的引物(见表S1)和KOD PLUS DNA高保真聚合酶。PCR扩增片段串联插入到双元载体pCAMBIA2301中并通过DNA测序来验证，使用根癌农杆菌EHA105介导互补质粒转化osrrm的未成熟幼胚，转化程序参考Liu等的文章(1998)，然后转化植株使用含有G418的培养基进行筛选。
3.Southernblot分析：从叶片中提取的总DNA使用限制性内切酶进行完全消化，然后使用0.7％的琼脂糖凝胶分离，转印到尼龙膜上(Amersham)，DNA条带的检测使用ECL核酸标记检测试剂盒(Amersham)进行。探针为通过PCR扩增并标记的潮霉素基因片段，长度约884bp，扩增引物Hyg-F和Hyg-R列于表S1中。
4.半定量RT-PCR和定量RT-PCR分析：使用植物总RNA提取试剂盒(TIANGEN)从新鲜收获的植物组织中提取总RNA，并使用无RNAase的DNAaseI消化去除残留的DNA，第一链cDNA的合成以1μg总RNA为模板，使用ImProm-IITM反转录酶(Promega)进行。
半定量-RT-PCR使用普通的Taq酶预混液(CW-BIO)来完成，水稻的Actin基因被用作内参来分析表达水平。qRT-PCR使用SYBR Green II(BioRad)来完成。水稻UBQ10作为内参控制均一化。水稻开花控制相关基因的扩增参考Liu和Cai等的文献(2013)。糖转运相关基因的扩增参考文献(Cho等2010，Hirose等2010，Zhang等2010，Eom等2011)。
5.颖壳的扫描电镜(SEM)观察：种子的预处理按Yang等的文献描述(2019)，细胞数目的统计使用ImageJ来完成。
6.Western blot(WB)分析：WB分析根据Zhang等的文献描述来完成(2006)。蛋白样品(～20μg)用8％或10％的SDS-PAGE进行分离并转印到PVDF膜上(GE Healthcare)，并使用ECL Plus Western Blotting检测试剂盒(GE Healthcare)来检测蛋白条带。抗体使用如下：AGPS2b抗体(1：1000，惠赠于Michael J.Emes,圭尔夫大学)，GBSSI抗体(1：5000，Immunogen公司定制)，SSI抗体(1：5000)，SSIIa抗体(1：1000)，SBEI抗体(1：5000)，SBEIIb抗体(1：5000)，ISA1抗体(1：1000)，SP抗体(1：5000)(后面这些抗体均由CW-BIO公司定制，兔多克隆抗体)。His鼠单克隆抗体(1：2000，购自Abmart)，HRP-偶联的羊抗兔或羊抗鼠二抗(1：10000，CW-BIO)。
7.稻米品质测定：将去壳的干燥水稻种子的胚乳研磨成细粉。表观直链淀粉含量(AAC)和总淀粉含量的测定分别使用碘染比色法如Williams等的文献所述(1970)和淀粉测定试剂盒(Megazyme)完成，总可溶性糖含量和支链淀粉的链长分布按照Wang等(2013)的文献描述的步骤来完成。
8.总可溶性糖含量测定：100mg新鲜研磨的组织样品与1ml含有0.02％叠氮化钠的双蒸水混匀，然后将溶液用0.2μm的微孔过滤柱进行过滤，过滤后的溶液使用HPLC进行测定分析。葡萄糖，果糖和蔗糖的浓度分别用它们的标准品来定量。
9.糖转运活性分析：按Eom等文章(2011)描述的方法收集韧皮部渗出液，4-周龄的水稻植株在傍晚切下最顶端叶片，然后浸入在500μL 15mM EDTA溶液(pH 7.25)并黑暗培养16h。然后将浸泡的渗出液用0.2μm的微孔过滤柱进行过滤，过滤后的溶液使用HPLC进行葡萄糖，果糖和蔗糖的测定分析。每克鲜重样品的6碳糖的浓度定义为糖转运活性。
10.pOsRRM::OsRRM gDNA-GUS质粒的构建及组织GUS活性染色：首使用OsRRMp-5'/OsRRM-3'引物对先从ZH11植株基因组DNA中扩增OsRRM全长基因，并通过同源重组酶(Clontech)将扩增片段插入到p1300GN-GUS载体的BamHI和PstI酶切位点之间，构建进行测序验证。
GUS染色按照Edwards等(1990)文献记录的方法进行并稍作如下修改。染色的组织用70％乙醇脱色处理后在体视显微镜(BX51 plus DP70；Olympus)下观察，或用FAA固定液(50％乙醇:甲醛:乙酸,90:5:5[v/v/v])过夜固定，然后通过梯度乙醇脱水处理后，二甲苯玻璃化，石蜡包埋切片。用二甲苯脱蜡，并在一系列分级乙醇中再水化。切片用立体显微镜(DP72；Olympus)拍摄。
11.重组截短的OsRRM的表达与纯化：OsRRM的CDS上从ATG至第二个RRM机序的735bp长度的片段被用KOD PLUS DNA高保真酶扩增下来，扩增片段插入到PET32b载体的SalI酶切位点处，位于T7启动子下游并与Trx-和His标签同框融合。将重组质粒与空载质粒转入大肠杆菌Rosetta(DE3)表达菌株中。重组蛋白诱导表达条件为37℃条件下在含有0.5mM IPTG的LB培养基中诱导3h。重组蛋白使用Ni-NTA柱(QIAGEN)在非变性条件下纯化。
12.RNA凝胶电泳迁移分析(REMSA)：REMSAs使用RNA并根据Ambrosone等(2015)文献描述的方法进行，并稍作如下修改。使用植物总RNA提取试剂盒(TIANGEN)从未抽穗的ZH11植株的茎和叶鞘中提取总RNA，并用RNA 3’末端生物素标记试剂盒(Thermo Fisher)进行标记。标记后的RNA与7.5μg pET32b或pET32b-OsRRM(1-735)混合孵育30min，后续检测使用RNA迁移试剂盒(Thermo Fisher)来完成。
为了进行OsRRM与特异mRNA的REMSAs,全长OsSUT2,OsTMT1,OsTMT2,和SBEIIb的mRNAs使用表S1中的引物进行扩增随后克隆到pSK载体中。体外转录按照Dong等(2005)文献描述进行，后续步骤同上面。
13.统计分析：统计分析采用Excel内建公式进行计算。p值的计算采用双尾学生的非配对t检验分析进行二进制比较，或用单因素方差分析和T的事后诚实显著性检验比较两个以上的基因型。
结果：
1.osrrm突变导致矮化，晚开花和较小的种子表型
为了鉴定OsRRM的生物学功能，我们从T-DNA插入突变体库中获得了一个T-DNA插入突变体(ID:PFG_2D-01214)。通过使用OsRRM的序列引物配合T-DNA序列引物进行PCR对插入位点进行了验证(图7A)。随后我们进一步从分离的后代中分离出纯合突变体(图7B)。Southern blot分析证实osrrm只携带一个T-DNA插入(图7C)。半定量RT-PCR分析显示，分离的纯合突变体中没有内源性OsRRM的转录本(图7D)，因此，该osrrm等位基因为功能缺失突变。
osrrm突变体表现出矮化和晚开花表型(图1A)。与野生型抽穗期(WT，65天)相比，osrrm的开花时间和抽穗期(72天)有所推迟。花期的推迟还伴随着茎长从64厘米减少到55厘米的表型，分蘖数从15个增加到19个(图1B)。
矮化和晚开花表型可能暗示了同化异常，导致种子变小(图1C)和种子重量减少(图1D)。osrrm突变体的脱壳粒重约为WT的90％(图1D)。由于谷物的内稃和外稃中的细胞数量和细胞大小决定了种子的大小(Song等2007)，因此我们使用扫描电子显微镜(SEM)检测了osrrm和WT种子。结果表明，osrrm突变体的外稃细胞比WT小。WT和osrrm突变体在一个视野内的细胞数分别为7和9(图8A)，但WT和osrrm突变体在颖壳纵轴上的细胞总数相同(图8B)。
通过导入由OsRRM自身启动子(pOsRRM)驱动的野生型OsRRM编码序列(CDS)，可以互补osrrm突变体的表型。我们得到了2个纯合的转基因株系(图9A)，其中line-1命名为pOsRRM::OsRRM/osrrm被继续用于后续如下检测(图1)，在pOsRRM::OsRRM/osrrm植株中，OsRRM的表达恢复到正常水平(图9B)。
由于osrrm植株表现出开花晚的表型，因此我们分别还分析了长日和短日条件下关键花期调控基因的表达情况(图2)。在两个光周期中，每4小时检测一次每个基因的表达情况。结果发现在短日条件下，与WT相比，osrrm突变体的抽穗期3a(Hd3a)和编码移动开花信号的水稻开花位点T1(RFT1)的转录水平显著减少(Komiya等.2008)。拟南芥花期基因CONSTANS(CO)的同源基因(Yano等2000)的抽穗期1(Hd1)表达高峰出现较早。在水稻中GIGANTEA(OsGI)控制CO的表达(Hayama等2003)，其表达水平在多个时间点略微上调。早抽穗1(Ehd1)控制Hd3a的表达(Doi等2004)，其表达水平在光照条件下下调，而在黑暗中上调。籽粒数、株高和抽穗期7(Ghd7)抑制Ehd1的表达(Xue等2008)，而它的的表达水平则在两者之间无差异。相比之下，在长日条件下，Hd3a和RFT1均显著下调。Ehd1的表达模式则是与WT中观察到的情况是相反的，Hd1，OsGI，和Ghd7的表达在osrrm突变体和WT之间没有明显差异(图2)。基于上述结果，我们推测OsRRM是以开花调控网络的调控因子的形式发挥功能的，且位于OsGI，Hd1，Ehd1的上游，并通过它们继而调节Hd3a和RFT1。相反，OsRRM不影响Ghd7的表达。
如图2所示，使用qRT-PCR对相关基因进行检测。其中水稻UBQ10基因作为内参控制基因进行均一化计算。图底部白色和黑色的横柱分别表示白天和晚上。每个样本检测3个生物学重复，每个生物学重复检测3个技术重复。误差棒表示SD，*p<0.05,**p<0.01。
2.osrrm的突变改变了淀粉含量并改变了支链淀粉的精细结构：
在谷类作物中，糖主要运输到储存器官如种子中，而淀粉是储存糖的独特储存形式。淀粉是由两种类型的α-d-葡醛基均聚物组成：线性的直链淀粉和高度分支的支链淀粉。osrrm突变体的种子比WT的种子小，这可能表明存储的产物发生了改变。为了验证这一点，我们对osrrm和WT种子淀粉的含量和中支链淀粉链长分布进行了分析。
结果发现osrrm种子的总淀粉含量显著下降(图3A)。相比之下，在表观直链淀粉含量(AAC)方面，WT和osrrm之间没有统计学差异(图3B)，但可溶性糖含量从WT的0.45％显著增加到osrrm的1.25％(图3C)。在osrrm突变体中表达野生型OsRRM等位基因可以逆转这些表型(图3A-C)。
至于支链淀粉结构，发现相比于WT，osrrm突变体中短链的比例明显减少，而长链的比率增。特别是，短链聚合(DP)6-9和12-18的比例在osrrm明显减少，而长链40个<DP<67的比例显著增加。此外，osrrm中中等长度链(20<DP<32)的比例也显著增加(图3D)。这些数据表明，在osrrm突变体中短链支链淀粉的合成率下降。这类似于amylose-extender(ae)突变体的表型，该突变体携带淀粉分支酶IIb(SBEIIb)编码基因突变(Nishi等2001)。因此，除了茎结构和花期控制外，OsRRM还可能在保持可溶性糖水平及胚乳中合成短支链支链方面发挥作用。
淀粉合成相关的蛋白质如淀粉粒结合淀粉合酶1(GBSS1)和ADP-glucose焦磷酸化酶(AGPase)控制直链淀粉合成，而AGPase，淀粉合成酶(SSs),淀粉分支酶(SBEs)和淀粉脱支酶(DEBs)如异淀粉酶1(ISA1)共同控制合成支链淀粉，淀粉磷酸化酶(SP)则同时催化生物合成和降解α1,4-linked葡聚糖链(Tetlow和Emes2017)，这些基因的突变会改变AAC和支链淀粉的结构(James等2003)。因此，我们检测了osrrm突变对7天未成熟种子胚乳中这些基因表达的影响。Western blot分析显示，除SBEIIb和ISA1蛋白在osrrm突变体略有下降外，osrrm突变体中AGPase、OsGBSS1、SSI、SSIIa、SBEI和SP蛋白的含量均与WT相似(图10)。这进一步表明，osrrm突变体中的糖的重新分配不是淀粉合成的酶基因表达水平改变或介导结果。
3.osrrm突变体中糖转运效率低下：
我们提出了两个假设来解释在osrrm突变体中观察到的淀粉变化：(1)缺乏单糖(葡萄糖、果糖)或双糖(蔗糖)，它们是淀粉合成的主要供体。或(2)从供体到最终聚糖链的转化效率降低。然而，osrrm突变体中AAC(图3B)基本上未变，可溶性糖含量有几乎三倍增加(从0.45％到1.25％)，但是总淀粉含量只下降了3％(从67.8％到64.8％)(图3C)，也就是说，可溶性糖的转化多糖只有轻微影响。为了解决假设(1)，我们测定了韧皮部筛细胞、旗叶、旗叶鞘和茎中的可溶性糖(包括葡萄糖、蔗糖和果糖)的含量，这些糖是旗叶、旗叶的鞘和茎中长距离运输的主要糖。我们的数据显示，与WT相比，osrrm叶鞘和茎中的蔗糖、葡萄糖和果糖含量均显著增加(图4A)。而在旗叶和小穗中，随着蔗糖含量的明显增加，葡萄糖和果糖的含量都急剧下降(图4A)。
植物体内糖的净积累发生在白天(光照下)，而储存的碳水化合物的净降解发生在夜间(Eom等2011)。我们预测，在osrrm突变体中，叶片中蔗糖的富集可能是由于蔗糖转移到库组织的减少所致。通过测定暗周期osrrm突变体和WT离体成熟叶片渗出液中的可溶性糖含量来确定糖输出量。由图4B可知，WT叶片出口可溶性糖为32.7mol C6 units/g鲜重(FW)，而osrrm叶片则减少了约33％(22.0mol C6 units/g FW)。
鉴于osrrm突变体中可溶性糖含量与WT是显著不同的(图3C，图4A),因此在osrrm突变体糖输出能力是受到阻碍(图4B)的，并且聚糖成分和结构也发生改变(图3A,D)。但是在osrrm和WT之间没有发现淀粉合成相关基因表达的差异(图10)，因此，淀粉含量的差异极有可能是糖转运改变引起糖分配的变化导致的。由于茎叶是蔗糖从源向库运输的重要枢纽，而糖转运蛋白正是调节糖从叶子到茎秆和茎秆到种子的运输的。因此我们进一步研究了osrrm和WT植物在抽穗开始阶段糖运输相关基因的转录水平包括OsSUT 1-4、单糖转运蛋白OsMST6/8,OsTMT1/2。我们发现OsSUT1-4、OsMST6、OsMST8、OsTMT1和OsTMT2的转录本均减少，其中OsSUT2、OsSUT4、OsTMT1和OsTMT2的转录本水平受影响最大(图4C)。因此，我们假设这些基因转录量的减少是导致osrrm突变体的表型原因，正如当这些糖转运体基因发生突变时，植物就会表现出类似osrrm突变体的表型(Wormit等2006，Wingenter等2010，Eom等，2011)。
4.OsRRM的表达模式：
OsRRM先前被描述为一个在胚乳中特异表达的基因(Chen等2007)，但这使得人们无法解释OsRRM如何控制花时间和糖运输相关基因表达的，这两个过程发生在胚乳发育之前。为了重新研究OsRRM的时空表达模式，我们进行了实时荧光定量PCR检测。并对以下组织中OsRRM转录水平进行分析：7日龄幼苗的根、抽穗前收获的茎、叶和叶鞘、授粉前收获的圆锥花序和7DAP未成熟种子(图5A)。结果我们发现OsRRM在茎和叶中表达量最高，在叶鞘和未成熟种子中的表达量高于在圆锥花序和根中的表达量。
我们还制备获得了表达pOsRRM::OsRRM gDNA-GUS的转基因植株，并进行了GUS的组织化学分析。得到的10个独立的转基因植株，除表达水平不同外，GUS表达模式无差异。根(图5B,C)、茎(图5D,E)、叶和叶鞘(图5F,G)、雄蕊(图5H,I)和未成熟种子(图5J-M)中均能检测到GUS酶活性。在根中，根伸长区表皮和维管束(图5C)以及雄蕊绒毡层和成熟花粉(图5I)中也能检测到GUS活性。最有趣的是，在种子淀粉填充早期(5-9DAP)的糊粉层和胚中发现了GUS酶的活性，而背向维管束中没有(图5J-L)，仅在成熟种子胚乳中发现了GUS酶的活性(16DAP)(图5M)。值得注意的是，尽管OsRRM表达式可以发现在几乎所有的组织，但在节间高表达，这在一定程度上类似于OsDOF11(吴等2018年)，在花粉中一定程度上类似的OsSUT1(Hirose等2010年)，在未成熟的种子中类似于糖转运蛋白基因OsSUT2(Eom等2011)和OsSWEET11(Ma等2017)。
5.OsRRM直接结合在糖转运相关基因的转录本上：
OsRRM蛋白主要定位于细胞核(Chen等2007)，这种定位模式可能赋予其与目标RNA特异性结合功能。为了验证这一假设，由于OsRRM的全长不能在大肠杆菌中表达，我们采用OsRRM的截短形式(OsRRM[1-735])和从茎或叶鞘中分离的生物素标记的总RNA进行RNA凝胶电泳迁移分析(RNA electrophoretic mobil-shift assays,REMSAs)。截短的OsRRM(1-735)由OsRRM从起始密码子到第二个RRM结构域的编码区域组成(图6A)，因此我们认为该区域具有RNA结合能力。将对照蛋白pET32b(只含有6个His标签)与pET32b-OsRRM(1-735)在大肠杆菌中表达并进一步纯化(图6B)。将生物素标记的RNA加入或不加入OsRRM(1-735)孵育，然后在非变性条件下电泳。结果发现只有当标记的RNA与OsRRM孵育(1-735)才观察到RNA条带偏移(图6C)，而与对照蛋白pET32b孵育时则没有。进一步添加未标记RNA可以消除迁移率的变化(图6C)。因此上述结果证实OsRRM是一种功能RNA结合蛋白。
鉴于osrrm突变体表现出与几个单糖和二糖转运蛋白突变体类似的表型，以及这些糖运输相关基因的转录水平在osrrm突变体中发生下调(图4C)，因此我们认为OsRRM可能直接结合到这些糖转运蛋白基因转录的pre-mRNA或成熟mRNA参与它们的转录后调控。为了对此进行研究，我们以OsRRM(1-735)和全长OsSUT2、OsTMT1、OsTMT2的mRNA进行REMSAs(图6D,E)，并以SBEIIb mRNA作为负对照。如图6E所示，OsRRM(1-735)能够结合生物素标记的OsSUT2、OsTMT1和OsTMT2，并可以与未标记的mRNA竞争结合。相比之下，OsRRM(1-735)不结合SBEIIb的mRNA(图6E)。因此，OsRRM可能在转录后水平正向调控这三个糖转运蛋白基因的转录本水平。
表S1.本发明中所使用的引物。
Figure GDA0003562325890000101
Figure GDA0003562325890000111
可以理解的是，对本领域技术人员来说，对本发明的技术方案及发明构思加以等同替换或改变都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。
序列表
<110> 扬州大学 中国科学院分子植物科学卓越创新中心
<120> 一种RNA结合蛋白OsRRM及调控水稻中糖转运的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3018
<212> DNA
<213> 水稻 (Oryza.sativa L. )
<400> 1
atggggagac ctcgaggccg cggcggagga ggaggaggag ggagggggag gttcggcggc 60
ggcggggggt cccgcttctc cgccgcccgc gatgacccgc cgccgcggcg ctcctcctcc 120
gggtgggggg tggcaccgcc gtcgcggcac ctgtgggtgg gcagcctctc cccgggcgtc 180
gccgcggccg acctctcgga gctcttcctc cggtgcggcg acgtcgaggg catctcccgt 240
gaccccggcc ggagcttcgc gttcgtgacg ttcgcgcggg aggaggacgc cgtggcggcg 300
gtgcgggagc tgcaggggat ccacctccgc ggggcgccca ttaggatcga gttttccaag 360
ggggataaag attcaagtag ctctatggat gacagatact cacaacatgc tgatcaaaga 420
cgttttactg aacgaggaag gaatcagcaa tcaagtcctg aaaaatcaac tgataaatcc 480
aaaagaagca ggccagcaga acctagtgaa gtattatgga taggttttcc tgttggtctg 540
aaggtagatg aggcaactct ctgggaagcc ttttcacctt ttggtgaggt tgtcaagata 600
actacattcc cagggcgtac ttatgcattt gtccagtaca ctactattgc agcggcatgc 660
agggcgaagg aaacactgca gggaaatatt ttcaataacc ctcgagttag catttgcttt 720
tctcggagtg acagtgtttc agcagaattt ggaaaaggtt ccttagatgc cccatattcc 780
ccccatttaa actctagtgt tagacctata ttcagggagc aagattttga agattttcct 840
agggctaggc cttttgatag tcctccaaga gatatgtaca tgccatctcc acattatggc 900
cctaagagac tttctagaga tcatgatgat gtgggtttca gcagggataa ttatttgcga 960
tatggacctg gagtagagcc tgatcctaga tctaattttg aaccttttag gatacaaggg 1020
ctcggtccag aaagaaggat gtctgaggac ccatatgaac agcataggcg tagccctgct 1080
ggtgatgcac catggcacaa cattccattc gagcgatctc agggagcctt accattagag 1140
gattctcggt atgctaggga agatccatac ccattttcaa agaagttgag gactggtgaa 1200
gcacatgact ctgaacttcc tgaataccct ttctctgaat ttgatcgagg gaaggttggc 1260
tctgcctacc caaggaggcc cttctatggt gtgccagatg atgacataca ccccagaggc 1320
tatcaacttg ctcctatgca tggtagaaat catgttgatc ctttaaggaa tccaactcca 1380
cttgtagata ggcatatacc agggcatgca caggacagct tttctaggca tgtagaagtg 1440
gaaagatcaa ctcctgaata ccatgaaccc cttctcaagg aagaatggaa atgggatggt 1500
acaatagcaa agggaggcac accaatttgc cgagcgcgat gcttccctgt tgggaaggtt 1560
cttaacttca tgctgcccga atttttggat tgcactgcta ggacaagcct ggagatgctc 1620
tctaagcact attaccaagc tgccagcagc tgggtggtgt tttttgttcc agaaaatgat 1680
gctgacatgg cagcctataa tgaattcatg aattaccttg gtgataagca gcgtgcagca 1740
gtttgtaaac ttggagaaag gagcagctta tttcttgttc caccctcaga cttctctgaa 1800
caagtactga gggttccagg taaagtcagc atatctggag tcattctgaa gtttgagcag 1860
tcagatccag aagtttcctc gccaactcgc aaaccagaaa catttgtgag tcatttgaac 1920
catgatgttc gtgctcatga ggatctagat gcattgagaa gaatcaaccc accagatatc 1980
aggccacttc ctcagggttc agattatctc gggttgtcgc ctggaagcta taatccagca 2040
agtgcacatt tggttccgcc ttacaagttt ggaaatgctc cttcatatct agaatctgaa 2100
ttagctcatc aaaagcatcc acctgactcc cacagggaga tagcacatga caagcagcag 2160
caacacccag atgtattgcc ctcaagatgg tcagataaca tttacaatcc aagtccaggt 2220
tctggaaatt tgaattattt ggctgagagt gcgatcccac atacatcaac tgataggaca 2280
ccagaggcat actcatttgc tcctcaagga gtaccaaaag tgagtacatc agggtatgca 2340
ccagttgcag atgaggcatc aaacatgtcc taccctccca tgcaacctgc atcacagcag 2400
gtagttagac ctcaacaacc tccatctctc ccattatcgc ttccaccaga gcaacttgca 2460
caattggcca ctcttcttgc acaacaaaac caaccaggaa aagagcctgt ggacagctta 2520
aacaaagaat caggattcat acggaatcca catggacatt cttcaatgat gccacacagc 2580
tcaggttcta tccctgtcca aaactcattg ccacctgctc cgccatctgc atcacagtta 2640
caggttcatg cgccaccagt tcaaggttca gtgccaccaa atccatccat tatgcataca 2700
ccgaatgctc ctatgccttc tcacaacact ttgcctttac cccctatgca tccttcggga 2760
aatccagctc attcttccat gcctttgaga tcgttcgtcc ctcctcttcc tgaaggccct 2820
ccacccctta ggcagcacac atcaagtgct ctacaagcgc aacctgcact tccctctgga 2880
ccacagacta gccagcaacc gtctgctcag gaagaccatc acggagaccc tcaaaagcgc 2940
cttcaagcaa cattgcaatt ggcagcaacc ctacttcagc agatacagca acaatctaaa 3000
cctggtggcc agaagtag 3018

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1.一种RNA结合蛋白OsRRM在调控水稻中糖转运的应用，所述RNA结合蛋白OsRRM的核苷酸序列为序列表中序列1所示的DNA序列。
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