CN112367979A - 用于局部释放抗炎药和促髓鞘药的电纺纤维 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及在定义的时间窗口内用于在中枢神经系统中局部释放抗炎剂和促髓鞘剂的电纺纤维，以限制由谷氨酸释放触发的、并由持续进行的炎症支持的继发性神经变性。组合治疗旨在在病理学的非常早期减少炎症并改善髓鞘再生，从而改善病变的慢性临床结果。特别地，本发明涉及电纺聚合纤维，其中所述纤维负载有3,3,5‑三碘代‑L‑甲状腺原氨酸(T3)和布洛芬。

Description

用于局部释放抗炎药和促髓鞘药的电纺纤维
说明
本发明涉及用于在定义的时间窗口内用于局部释放抗炎药和促髓鞘剂的电纺纤维，以限制在神经系统中由谷氨酸释放触发的、并由持续进行的炎症支持的继发性神经退行性变。组合治疗旨在在病理学的非常早期减少炎症并改善髓鞘再生，从而改善病变的慢性临床结果。特别地，本发明涉及电纺聚合纤维，其中所述纤维负载有促髓鞘剂，例如3,3,5-三碘代-L-甲状腺原氨酸(T3)，和抗炎剂，例如布洛芬。
背景技术
脊髓损伤是造成死亡和残疾的全球性原因。文献报道的发病率在每百万例15例到45例不等。结果受在急性期过程中手术和药物治疗、提供医疗服务的地点、住院时间的长短和所涉及服务的可用性的影响。成本分析显示，与健康水平并与根据ASIA量表(美国脊髓损伤协会)测量的病变的恢复程度(completeness)高度相关。在目前的状态下，尽管很大程度上已经放弃了在脊髓损伤患者中常规使用类固醇，并被认为是一种“有害的护理标准”，药理干预仍然是有限的，且常规方案旨在减少水肿。一些已获批准用于其它神经源性疾病的药物目前正在测试中(例如利鲁唑(Riluzole)、促红细胞生成素、靶向轴索过度生长抑制因子-A(Nogo-A)、Rho抑制剂Cethrin和米诺环素(minocycline))。然而，目前还没有人展示出“在恢复感觉运动功能方面的良好功效”的证据。因此，针对脊髓损伤(SCI)的早期事件，与特定的生物学靶点关联以制定治疗策略，是神经生物学向临床SCI实验迈进的一大步。
目前的药理失败可能至少有两个原因：(i)药物用于单一治疗，而这本身不足以打破炎症增加和病变后髓鞘再生减少之间的恶性循环。越来越多的证据表明SCI的多重抑制特性需要多靶点(组合)治疗方法。(ii)包括非甾体抗炎药(NSAID)和可的松(cortisones)在内的现有可用药物存在严重的全身性副作用，特别是在适合于适当地靶向脊髓的剂量和治疗持续时间方面。
最近的一项研究致力于开发一种新型的基于水凝胶的药物递送系统，用于将T3局部递送至脊髓损伤部位(Shultz等人,2017)。作者证明，通过精确地调节初始药物载量和凝胶体积，可以以与安全的人类剂量相当的剂量递送T3。然而，体外测试表明，初始的T3爆发释放远远高于安全剂量，这是不可避免的，建议在体外进行植入前治疗来消除体内爆发。爆发释放是药物传递系统中常见的现象，当使用像水凝胶这样的高亲水性基质时，这种现象会进一步加剧。
专利US9498536公开了用于在患有癌症的受试者中治疗炎性病症的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒由与三碘甲状腺乙酸或四碘甲状腺乙酸以及其它甲状腺部分激动剂或拮抗剂共价连接的生物聚合物组成，单独或与第二药剂(例如非甾体抗炎药)组合使用。
本发明旨在提供新的和更有效的支架，用于在SCI病变的非常早期阶段靶向炎症和髓鞘脱失，例如预防/限制继发性阶段，该阶段发生在手术脊柱稳定的时间窗口内(需要时)，这是神经病理学的治疗孤儿阶段。
发明内容
发明人生产了在定义的时间窗口内用于局部释放抗炎药和促髓鞘剂的电纺纤维，以限制由谷氨酸释放触发的、并由持续进行的炎症支持的继发性神经退行性变。组合治疗旨在在病理学的非常早期减少炎症并改善髓鞘再生，从而改善病变的慢性临床结果。
本发明提供了多药物局部递送系统，其允许在估计的8至14天的时间内同时施用NSAID(布洛芬)和髓鞘再生剂(T3，天然激素)在例如创伤性脊髓损伤后24小时内被直接植入病变的上方。实施例中详细报告的实验数据表明了发明人生产的功能化电纺纤维的有效性及其优点。
此外，将药物装载入电纺纤维是保护药物免受外界环境影响并更好地控制释放动力学的有效方法。可以通过直接共混方法将药物分散在聚合基质中，或通过将药物装载入芯/壳纤维结构中，以将药物装载入纤维中。
因此，本发明的第一目的是电纺聚合纤维，其中所述纤维的部分或全部负载有促髓鞘剂，特别是激素T3，并且所述纤维的另一部分或全部负载有抗炎剂，特别是布洛芬。
本发明的另一目的是用于在脊髓损伤的治疗中，特别是在患有脊髓损伤的受试者中预防和/或治疗继发性神经退行性变中使用的电纺聚合纤维。
本发明的另一目的是包含所述电纺纤维或由所述电纺纤维组成的可植入支架。
本发明的另一目的是用于制造所述电纺纤维的方法，所述方法包括电纺聚合溶液的步骤，所述聚合溶液包含促髓鞘剂，特别是激素T3，和抗炎剂，特别是布洛芬。
本发明的另一目的是包含聚合纤维和/或赋形剂和/或载体的混合物的组合物，其中所述纤维的部分或全部负载有促髓鞘剂，特别是激素T3，并且所述纤维的另一部分或全部负载有抗炎剂，特别是布洛芬和稀释剂。
附图说明
图1示出了根据本发明的一个实施方案，用于制造电纺聚合纤维的方法的示意图。
图2示出了根据本发明的一个实施方案，电纺聚合纤维的扫描电子显微镜(SEM)图像。
图3示出了根据本发明的一个实施方案，电纺纤维的纤维直径分布。
图4示出了根据一个实施方案，在预期的递送时间(15天)内获得的布洛芬的累积释放。
图5示出了根据一个实施方案，在预期的递送时间(15天)内获得的T3的累积释放。
图6示出了根据一个实施方案，在以模拟累积的T3和IBU释放为条件的培养基的存在下，对LPS刺激的RAW细胞的体外功效测试，证明了条件培养基逆转了LPS触发的分子效应。
图7示出了根据一个实施方案，在挫伤性脊髓损伤的大鼠模型中用于体内功效测试的功能参数。
图8示出了根据一个实施方案，在挫伤性脊髓损伤的大鼠模型中用于体内功效测试的步态参数。
图9示出了根据本发明的一个实施方案，全身性施用所使用的药物组合的效果。
图10示出了与单独的聚合物相比，由植入本发明的大鼠的脊髓获得的突触体释放的谷氨酸的抑制，证明了在阻断触发继发性神经退行性变的初级事件的功效。
图11示出了与单独的聚合物相比，由植入本发明的大鼠的脊髓获得的突触体释放的GABA的抑制，证明了对谷氨酸释放的特异性。
图12示出了与单独的聚合物相比，植入本发明的大鼠脊髓内的细胞浸润的细胞组成，证明了fagocytes(CD11+)和促髓鞘细胞(MBP+)的增加。
图13示出了在病变和经植入的大鼠的脊髓中与炎症和髓鞘再生有关的分子的mRNA表达水平，证明了本发明抵消了病变诱导的变化，减少了炎症和抗髓鞘再生的标志物。
图14示出了本发明目的所需的药物释放曲线的最佳聚合物化学。
图15示出了用于聚合物制造以获得本发明目的所需的药物释放曲线的最佳药物浓度。
图16示出了用于聚合物制造以获得本发明目的所需的药物释放曲线的最佳纤维直径。
发明详述
如前所述，本发明涉及电纺聚合纤维，其中所述纤维负载有促髓鞘剂和抗炎剂。特别地，本发明涉及电纺聚合纤维，其中所述纤维的部分或全部负载有促髓鞘剂，并且所述纤维的另一部分或全部负载有抗炎剂。
在本说明书中，表述“促髓鞘剂”是指任何促进髓鞘细胞(例如少突胶质细胞前体细胞)分化为髓鞘细胞(例如成熟的髓鞘少突胶质细胞)药剂。
在本说明书中，表述“负载有促髓鞘剂或抗炎剂”是指将药剂/药物/活性成分与聚合溶液混合，然后将得到的混合物进行电纺。以这种方式，药剂/药物/活性成分以非共价方式被包封在电纺纤维内。
根据一个实施方案，所述促髓鞘剂选自甲状腺激素受体激动剂，优选地选自3,3,5-三碘代-L-甲状腺原氨酸(T3)、L-甲状腺素(T4)、DITPA(3,5-二碘甲状腺丙酸)、DIMIT(3,5-二甲基-3-异丙基-L-甲状腺原氨酸)、DIBIT(3,5-二溴-3'-异丙基-L-甲状腺原氨酸)、MIBRT(3,5-二溴-4-(3'异丙基-4'-羟基苯氧基)苯甲酸)、伊罗替罗(Eprotirome)、Sobetirome、MGL-3196(2-[3,5-二氯-4-[(6-氧代-5-丙烷-2-基-1H-哒嗪-3-基)氧基]苯基]-3,5-二氧代-1,2,4-三嗪-6-甲腈)。
根据一个实施方案，所述抗炎剂选自非甾体抗炎药(NSAID)、水杨酸盐、抗炎糖皮质激素和吡非尼酮。
根据一个实施方案，所述抗炎剂是非甾体抗炎药(NSAID)，其选自布洛芬、氟比洛芬(flurbiprofen)、双氯芬酸(diclofenac)和双氯芬酸与米索前列醇(misoprostol)、吲哚美辛(indomethacin)、酮洛芬(ketoprofen)、芬布芬(fenbrufen)、萘普生(naproxen)、舒林酸(sulindac)、塞来昔布(celecoxib)、萘丁美酮(nabumetone)、甲芬那酸(mefenamicacid)、羟基保泰松(oxyphenbutazone)、二氟尼柳(diflunisal)、依托度酸(etodolac)、非诺洛芬(fenoprofen)、氟比洛芬(flurbiprofen)、甲氯芬那酸(meclofenamate)、美洛昔康(meloxicam)、萘丁美酮(nabumetone)、奥沙普嗪(oxaprozin)、吡罗昔康(piroxicam)、托美汀(tolmetin)、伐地昔布(valdecoxib)和丙酸衍生物或它们的混合物。
根据一个实施方案，所述抗炎剂、所述促髓鞘剂是3,3,5-三碘代-L-甲状腺原氨酸(T3)，并且所述抗炎剂是布洛芬。
根据一个实施方案，所述聚合纤维是生物相容性聚合纤维，优选地选自合成聚酯(例如聚乳酸(PLLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚己内酯(PCL)和/或它们的共聚物，例如聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)，和/或它们的混合物)、聚氨酯、聚酰胺、氟化聚合物，或它们的共聚物和/或混合物，或天然聚合物，天然聚合物优选地选自蛋白质、多糖、聚酯、多肽及其共聚物和/或它们的混合物。
根据一个实施方案，所述纤维的10％至90％、优选20％至50％负载有促髓鞘剂，和/或所述纤维的10％至90％、优选20％至50％负载有抗炎剂。
根据一个实施方案，所有所述电纺纤维均负载有两种活性剂，即促髓鞘剂和抗炎剂。
根据一个实施方案，所述纤维的直径在50至5000nm之间。
根据一个实施方案，所述纤维中抗炎剂的量为20％w/v的PLLA溶于DCM:DMF 70:30(v/v)，并加入5％w/w或10％w/w的IBU，而所述促髓鞘剂的量为20％w/v的PLLA溶于DCM:MetOH 70:30(v/v)，并加入0.6％w/w的T3。
本文公开的电纺纤维可以在患有脊髓损伤的受试者的手术方法中用作或用于可植入支架中。
本发明的另一目的是根据本文公开的任何一个实施方案制造电纺纤维的方法，所述方法包括电纺包含促髓鞘剂和抗炎剂的聚合溶液的步骤。
根据一个实施方案，所述方法包括以下步骤：
a)制备包含促髓鞘剂的聚合溶液：
b)制备包含抗炎剂的聚合溶液：
c)电纺步骤a)和/或b)中制备的溶液。
根据一个实施方案，在所述方法的电纺步骤中使用的电压为15至20kV和/或流速为0.5至2.5ml/h。
根据所述方法的一个实施方案，共混溶液包含浓度为0.1至2％重量/重量(w/w)的促髓鞘剂和/或浓度为1至10％w/的抗炎剂。
根据一个实施方案，在共混过程中，将促髓鞘剂和/或抗炎剂和生物聚合物与有机溶剂混合，生物聚合物优选地选自合成聚酯(例如聚乳酸(PLLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚己内酯(PCL)和/或它们的共聚物，例如聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)，和/或它们的混合物)、聚氨酯、聚酰胺、氟化聚合物或它们的共聚物和/或混合物，或天然聚合物，该天然聚合物优选地选自蛋白质、多糖、聚酯、多肽及它们的共聚物和/或它们的混合物，有机溶剂选自二甲基甲酰胺(DMF)、碳酸二甲酯(DMC)、甲醇(MetOH)或它们的混合物。然后将制备的共混物进行电纺，优选地，分别制备出具有抗炎剂的共混物和具有促髓鞘剂的共混物并进行电纺(例如图1)。
以下报道了旨在说明本发明的一些实施方案的实施例。决不将这样的实施例解释为对本说明书和所附权利要求的限制。
实施例和实验数据
实施例1(材料制造)
PLGA 50:50(
Figure BDA0002830494340000051
RG 504H,特性粘度＝0.45-0.60dL/g)、PLGA 75:25(
Figure BDA0002830494340000061
RG 756S,特性粘度＝0.71-1.0dL/g)、PLGA 85:15(
Figure BDA0002830494340000064
RG 858S,特性粘度＝1.3-1.7dL/g)、PLLA(
Figure BDA0002830494340000062
L 206S,特性粘度＝0.8-1.2dL/g)购自赢创工业(Evonik Industries)。
N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷(DCM)、甲醇(MeOH)购自Sigma Aldrich。
3,3,5-三碘代-L-甲状腺原氨酸钠盐(T3)≥95％(HPLC)购自Sigma Aldrich。布洛芬购自Sigma Aldrich。
为了制备负载有药物的纤维使用了以下聚合溶液：
-PLGA 50:50，15％w/v溶于DCM:DMF 70:30(v/v)，加入5％w/w的IBU；
-PLGA 75:25，20％w/v溶于DCM:DMF 70:30(v/v)，加入5％w/w的IBU；
-PLGA 85:15，8％w/v溶于DCM:DMF 70:30(v/v)，加入5％w/w的IBU；
-PLLA，20％w/v溶于DCM:DMF 70:30(v/v)，加入5％w/w或10％w/w的IBU。
-PLLA，20％w/v溶于DCM:MetOH 70:30(v/v)，加入0.6％w/w的T3。
制备了不含药物的类似聚合溶液作为参照。
一种电纺设备(Spinbow srl，意大利)，包括高压电源、注射泵、与电源电极连接的不锈钢钝针(内径0.84mm)和以75rpm旋转的接地的铝制鼓式收集器(直径5cm)(图1)。聚合物溶液通过PTFE管分配至针头，所述针头垂直放置在距收集鼓20cm处。通过将聚合溶液电纺持续2h的时间段来生产所有支架，以获得厚度在150至170μm范围内的样品。在室温(RT)和30％的相对湿度下生产电纺支架。下表报告了用于生产载药支架的电纺参数。使用相同的实验条件生产普通纤维。
Figure BDA0002830494340000063
实施例2(分析程序：布洛芬)
旨在开发一种简单、快速的HPLC-UV方法，用于量化不同基质(电纺纤维和释放介质)中的布洛芬(IBU)。文献综述显示，已开发出许多用于测定IBU的HPLC方法(Colloidsand Surfaces B:Biointerfaces 86(2011)275–284；International Journal ofPharmaceutics 279(2004)33-41；International Journal of Nanomedicin 2016:111201-1212；Arch Pharm Res第35卷，第4期，683-689，2012)。因此，通过方便地使这些HPLC方法适应我们的条件，开发了HPLC-UV方法。
体外药物释放研究旨在将电纺纤维的物理化学特性与其性能相关联，以便：
(i)通过改变聚合物的特性(交酯/乙交酯的比率)、药物用量和药物掺入方法(物理掺入或聚合物-药物缀合)来优化药物递送系统的设计。
(ii)选择用于体内测试的系统。
材料
从Millipore Elix 10净水系统获得的高纯去离子水用于制备所有水溶液。布洛芬(IBU)购自Sigma Aldrich；NH4H2PO4、CH3CN(ACN)和(CH3)2SO(DMSO)购自Sigma-Aldrich。所有HPLC溶剂均为分析级。
HPLC-UV方法优化
布洛芬通过HPLC系统分析，该系统由两个流动相递送泵(LC-10ADvp，岛津，日本)和紫外可见检测器(SPD-10Avp，岛津，日本)组成。使用自动进样器(SIL-20A，岛津，日本)将样品(20μl)注入到Kinetex C18(150mm×4.60mm×5μm)柱(Phenomenex，博洛尼亚，意大利)上。流动相由NH4H2PO4(0.02M，pH值使用正磷酸调节至3.0)和CH3CN(43:57，V/V)组成。使用前，将流动相通过0.22μm的Sartorius过滤器过滤。流速为1ml/min，检测波长设定为220nm。IBU的保留时间为5.2分钟。
解决了以下方法特征：线性、范围、检测限(LOD)和定量限(LOQ)。
标准溶液的制备
制备了10mg/mL IBU在ACN中的储备溶液，然后通过稀释在流动相(ACN:NH4H2PO4v/v)中获得了一系列浓度在0.05至20μg/ml之间的溶液。
线性和范围
通过分析在标称标准浓度0.05-20μg/ml之内的7个不同浓度的IBU来评估线性。通过使用校准曲线计算相关系数、斜率和截距值来评估所提出方法的线性。
检测限(LOD)和定量限(LOQ)
LOD是样品中能够被检测到但不一定要定量的分析物的最低量。LOQ是样品中可以以可接受的准确度和精密度确定的分析物的最低量。
对应于LOD和LOQ的值被估计为IBU浓度，这些浓度会产生峰值，这些峰值的高度对应于背景噪音的3倍和10倍。
实施例3(分析程序：T3)
试剂和化学药品
标准三碘甲状腺原氨酸(3,3,5-三碘代-L-甲状腺原氨酸钠盐(T3)≥95％(HPLC)购自Sigma Aldrich)。
甲醇、乙腈和甲酸为LC-MS级，购自Sigma Aldrich(圣路易斯，密苏里州，美国)。超纯水使用Human Power I系统(首尔，韩国)在内部生产。
Figure BDA0002830494340000081
HLB 200mg SPE柱购自Waters(米尔福德，马萨诸塞州，美国)。
样品制备
通过改良先前描述的程序(J.A.L.Kiebooms,J.Wauters,J.Vanden Bussche,L.Vanhaecke.Journal of Chromatography A,1345(2014)164–173)进行样品净化。
简而言之，在用2mL甲醇和2mL水调节
Figure BDA0002830494340000082
HLB柱后，始终避免固相变干，加载1mL样品。一旦所有溶液都通过色谱柱，则用3mL水/甲醇(80/20，v/v)混合物进行洗涤，然后施加真空5min以除去最终的残留液滴。在UPLC-MS/MS中进行分析之前，用1mL含0.1％甲酸的甲醇洗脱小瓶中的分析物。
UPLC–MS/MS分析
在UPLC-MS/MS系统上进行分析，该系统包括配备了内置真空脱气机、恒温自动进样器和柱加热器的Waters Acquity
Figure BDA0002830494340000083
二元泵。色谱分离是通过使用适配有相同包装的Waters VanGuard保护柱(沃特世公司，米尔福德，马萨诸塞州，美国)的Waters Acquity
Figure BDA0002830494340000084
BEH C18反相色谱柱(50×2.1mm,1.7μm)实现的。
流动相由含有0.1％甲酸的水/甲醇(90/10，v/v)(溶剂A)和含有0.1％甲酸的甲醇(溶剂B)的混合物组成。梯度(0.3mL/min的恒定流速)从70％A和30％B开始，然后是溶剂B的梯度(最低2-75％、最低2.5-85％、最低2.6-95％、最低2.8-10％、最低3.5-75％、最低4-60％、最低5-30％)。使用含有0.1％甲酸的水/甲醇(70/30，v/v)(弱洗)和含有0.2％甲酸的甲醇/水/乙腈(40/30/30，v/v)(强洗)来洗涤针头的混合物。
样品在自动进样器中保持在室温，以“针头过量填充的部分定量环”模式注入10μL；将该柱保持在40℃。
色谱仪与配备了ESCi多模式电离源(沃特世公司，米尔福德，马萨诸塞州，美国)的Waters Quattro Premier XE串联质谱仪连接，并在负电喷雾电离(ESI+)模式下运行。在MRM(多重反应监测)模式下进行分析，然后进行对T3的两个转变(括号中为锥孔电压和碰撞能量的相对优化值)：651.45>605.4(33v,35eV)和651.45>478.7(35V,30eV)。
调优页面中应用了以下参数：毛细管电压设置为3.00kV，锥孔电压设置为30V，而源温度和去溶剂化温度分别为130℃和450℃。氮气流量在锥孔上设置为50L/h，在去溶剂化时设置为500L/h；氩气以0.35mL/min用作碰撞气体。使用MassLynx 4.1软件(沃特世公司，米尔福德，马萨诸塞州，美国)进行数据采集和处理。
校准
使用5个不同浓度(0、10、50、100、200ng/mL)的T3加标的(spiked)DMEM细胞培养基制备基质匹配的校准曲线。
实施例4(体外测试)
细胞培养
鼠巨噬细胞细胞系RAW 264.7购自美国典型培养物保藏中心(
Figure BDA0002830494340000091
TIB-71TM)。细胞在5％CO2的加湿培养箱中，在37℃的补充有10％热灭活的胎牛血清(FBS，ThermoFisher Scientific)、1％青霉素/链霉素DMEM(100U ml-1/100μg ml-1)(Thermo FisherScientific)的高葡萄糖培养基(Thermo Fisher Scientific)中生长。当达到70-80％融合时，用刮板将细胞机械分离，并在75cm2烧瓶中继代培养。
处理
为了评估从电纺PLLA纤维中释放的布洛芬和T3的生物活性，下文描述了制备条件培养基的方法。将与布洛芬缀合的支架(ibsc)、与T3缀合的支架(T3sc)、与布洛芬和T3缀合的支架(ibT3sc)和空白支架(sc)的各无菌样品(1.5cm x 0.5cm)浸入1ml完全生长培养基，在37℃下震荡(50rpm)3天。将终浓度为200μM的布洛芬和250nM的T3的培养基与空白PLLA电纺支架在相同条件下孵育，并用作对照。孵育结束时，将细胞以12000个细胞/孔的密度接种在24孔板上。3天后，将融合细胞用条件培养基和终浓度为500ng/ml的脂多糖(LPS)处理24小时以刺激炎症。表1描述了该组的详细信息。每组分析三个样品。
RNA分离和半定量实时聚合酶链反应(qPCR)
在处理结束时，按照厂商说明书，使用RNeasy Micro试剂盒(Qiagen)进行总RNA分离。将总RNA洗脱在无RNase的水中，并通过260、280和320nm的吸光度值(Nanodrop 2000分光光度计，Thermo Scientific)估算浓度。使用iScript cDNA合成试剂盒(Bio-Rad)在42℃孵育30min以获得第一链cDNA。将反应混合物中没有逆转录酶的RNA样品作为无逆转录对照样品进行处理。
使用CFX96实时PCR系统(Bio-Rad)进行半定量实时PCR。反应的最终体积为20μl，由1×SYBR Green qPCR预混液(Bio-Rad)和0.4μM正向和反向引物组成。为了避免分离的RNA中可能的基因组DNA的污染，将不含逆转录酶的样品与其它样品平行处理，并通过实时PCR对使用的每对引物进行测试。使用的所有引物均使用Primer Blast软件(NCBI)设计，并由IDT(Coralville)合成。使用的引物序列报道在表2中。GAPDH用作管家基因以标准化用于PCR的逆转录RNA的量。PCR反应的热曲线首先包括变性步骤(95℃，2min)和40个扩增循环(95℃持续15s和60℃持续60s)。在扩增循环结束时，扩增产物的熔解曲线根据以下温度/时间方案进行：从55℃加热到95℃，温度每秒升高0.5℃。所有引物的引物效率值为95-102％。使用比较阈值法2(-ΔΔCT)计算目标基因表达的相对定量。使用的引物也公开在Giardino L.等人，Glia 2006年9月；(64(9):1573-89.doi:10.1002/glia.23025。
统计分析
结果表示为平均值±标准误差(SEM)，并绘制在图表上。使用Prism软件(GraphPad)用学生t检验和单因素方差分析(One-way ANOVA)进行统计分析，然后进行Sidak多重比较检验。当仅由于偶然性导致其结果出现的概率小于5％时(P<0.05)，结果被认为是显著的。
实施例5(体内测试)
动物
使用CD-Sprague Dawley(Charles River)200-250gr的雌性大鼠进行这项研究。将所有动物用标准的食宿成对饲养。手术前一周对所有动物进行操纵并使其习惯于膀胱操控。
手术和动物护理
动物(n＝)在胸椎位置(T9)经历了挫伤性脊髓病变。简而言之，将大鼠用O2中的异氟烷(1至3％)麻醉，并在手术前用恩诺沙星和曲马多(4mg/kg，皮下)处理。在无菌条件下，在T8-T10椎骨位置处进行椎板切除术。小心打开硬脑膜并暴露脊髓。以Impact One冲击器(Leica BioSystems)使用不同直径(1.5或2mm)的尖端、1N(0.75m/s)的力和0s的静止时间来获得脊髓的挫伤性病变，冲击深度为2mm以达到灰质前角。进脊髓损伤后，局部施用利多卡因。缝合背部肌肉，并用伤口夹闭合皮肤切口。手术完成后，动物接受7天镇痛剂曲马多(4mg/kg，皮下)和恩诺沙星(4mg/kg，皮下)以预防感染。每天两次手动按压膀胱，直到排尿反射恢复(8至10天)。手术后第一周将动物关在单个笼子里。
使用Ramsey等人(2010年)描述的临床评分进行大鼠的健康评估，特别是动物的体重是脊髓病变后监测的第一个参数。在前两周每天评估临床评分，然后每周一次直到处死之日。每天用恩诺沙星(4mg/kg，皮下)对动物进行两次处理，持续三天，以防下尿路感染。
处死时，收集脑脊液和血液。然后将脊髓的病变组织、病变上部位和病变下部位(SC-L、SC-UL、SC-DL)、运动皮层(CTX-M)、基底神经节(BG)进行解剖、称重，并立即快速冷冻并保存于-80℃直至使用。专用于IHC的SC-L如下所述被固定。解剖用于细胞荧光测定术和突触体分析的SC-L，并立即用于分析。将血液收集在EDTA-K2真空管中，并在4℃下以3000×g离心10min，移除血浆，等分在聚丙烯管中并保存在-80℃直至使用。将CSF也收集在聚丙烯管中，并立即保存在-80℃下直至使用。
处理和电纺生物材料植入
脊髓病变后两小时开始，每天通过皮下注射以施用全身性处理，连续10天。用60mg/kg布洛芬(每天一次)和10ug/kg T3(每天两次)处理动物(Fernandez等人，2004；D’intino等人，2011；Dell’Acqua等人，2012)。
脊髓病变后进行布洛芬和T3缀合支架的植入。将电纺物放置在脊髓上，在其上弯曲，然后用BioGlue(CryoLife)固定于相邻椎骨的脊突处。
功能运动和步态分析
在病变后3天，以BBB评分(Basso等人)进行后肢功能运动丧失的评估，并从分析中剔除病变动物得分大于1的动物(病变8天组中4只动物、病变45天组中1只动物被剔除分析)。术后，病变动物组和假手术动物组每周重复一次BBB评分，以评估自发运动的恢复。
使用CatWalk(Noldus)自动化系统进行步态分析。在手术前对动物进行训练，使其沿平台反复行走，然后在脊髓病变的前两天和病变后每周一次进行测试。在每个时间点，所有动物都要进行由仪器参数定义的5次符合标准的奔走(奔走持续时间从0.5s到7s)，所有参数的均值由CatWalk软件计算。对11种不同的参数进行了步态分析，分为4类：空间参数(脚印面积、最大接触面积、脚间距离(base of support))；动力学参数(站立时间(standtime)、摇摆时间、摇摆速度、单脚支撑(single stance))；比较参数(步周长(stridelength)、步循环)；协调参数(支撑时相比(duty cicle)、步序规律性指数(step sequenceregularity idex))。分析了后爪和前爪的所有参数(表示为右爪和左爪的平均值)。
组织化学
处死当天，向大鼠灌注4％多聚甲醛和在0.1M pH＝7的
Figure BDA0002830494340000111
缓冲液中的苦味酸饱和水溶液，然后解剖脊髓组织并固定24小时，然后用5％O/N蔗糖洗涤。然后制备14μm厚的矢状和冠状切片(Leica CM1950)，并进行组织化学染色。用甲苯胺蓝和苏木精/曙红评估病变面积和炎性浸润。为了确定病变面积，使用配备了CCD相机Nikon DXM1200F(Nikon)的Nikon Microphot-FXA捕获切片，然后使用Photoshop(Adobe)测量，所有图像均以物镜的4倍放大率捕获，并使用Photoshop的photomerge功能进行重建。然后使用ImageJ软件(NIH)将每个重建切片的病变面积确定为占据病变部位的像素数，并获得病变组织与健康组织之间的比率，然后测量每个切片的总切片面积。将同一脊髓的不同位置对齐以获得3D重建(采样步长为210μm)。
总RNA分离、反转录和PCR阵列。
将CTX-M、SC-DL、SC-UL和BG彻底均质化，并使用RNeasy Microarray组织迷你试剂盒(Qiagen)进行总RNA分离。在无RNA酶的水中洗脱总RNA，并使用分光光度计(Nanodrop2000，Thermo Scientific)，测量吸光度值并评估纯度(A260/A280)。将每组的RNA混池，得到的总量为0.5μg的RNA。使用GE Buffer(Qiagen)将基因组DNA在42℃消化5分钟，然后使用RT2 First Strand试剂盒(Qiagen)和热循环仪在42℃持续15分钟、随后在92℃持续5分钟以抑制酶来进行逆转录。使用大鼠突触可塑性PCR阵列(PARN-126ZD-Qiagen)进行突触可塑性分析，大鼠突触可塑性涉及特异性的一组84个基因(表1)。cDNA混池物的实时扩增通过CFX96实时PCR系统(Biorad)实现。为了检查可能的基因组DNA污染，阵列包含内部对照。PCR反应的热曲线如下：Taq聚合酶的激活步骤(95℃，10min)和40个循环的变性(95℃，15s)和退火/延伸(60℃持续1min 30s)。在扩增循环结束时，按照由以下组成的程序获得解离曲线：首先将样品在95℃下孵育1min以使PCR扩增产物变性，然后将温度逐渐降低至65℃，最后将温度以0.5℃/s的速率从65℃升至95℃，在温度逐渐变化过程中连续收集荧光强度。使用RT2 Profiler PCR Array Data Analysis 3.5版本(SABiosciences)对阵列的基因表达进行分析，预先设置了表达阈值以便仅分析线性表达，并且最大Ct值设置为35。基于软件提示的自动检测到的参照基因，进行基因表达标准化。
细胞荧光分析
收集SC-L后，使用GentleMACS Dissociators(Miltenyi Biotech)，用MultiTissue Dissociation试剂盒1(Miltenyi Biotech)将组织解离至单细胞，持续45分钟。使用碎片去除溶液(Miltenyi Biotech)去除组织碎片，以消除髓磷脂和细胞碎片。用一组抗体标记细胞(表…)，以评估炎症、少突胶质细胞群和细胞活力。
MACSQuant流式细胞仪(Miltenyi Biotech)用于分离和计数标记有特异性抗体的细胞群。为了防止样品读取过程中出现激光覆盖，在样品分析之前对仪器通道进行了补偿。
突触体中的谷氨酸释放
从脊髓制备粗突触体(P2)部分。简而言之，在实验当天，通过断头处死轻度麻醉的动物，并从大脑中解剖出小脑。然后将组织在冰冷的缓冲(pH 7.4)蔗糖溶液(0.32M)中均质化。匀浆离心(10min；2500g，4℃)后，收集上清液，通过离心分离突触体(20min；9500g，4℃)。将P2沉淀物部分重悬于5ml Krebs溶液(mm：NaCl 118.5，KCl 4.7，CaCl2 1.2，KH2PO41.2，MgSO4 1.2，NaHCO3 25，葡萄糖10；充入95％O2/5％CO2)(Chiodi等人，2012年)。
在其制备后，将突触体保持在温暖的条件下(37℃)持续20min。此后，将相同等分试样(0.5ml)的突触体混悬液分布在微孔过滤器上，置于一组平行的超融合室的底部，保持在37℃并用充气的(95％O2/5％CO2)Krebs溶液连续灌注(0.3ml/min)。经过30min的冲洗期后，收集了连续9次的5-min的部分。具体地，在收集了三个基础样品之后，将突触体用15mmK+去极化90秒钟。
在每个样品中，通过连接有荧光检测的HPLC同时测量GABA和谷氨酸水平。将每个样品的30微升转移到各个玻璃小瓶中，并置于温度受控(4℃)的Triathlon自动进样器(Spark Holland，埃曼，荷兰)中。注射前，系统向每个样品中加入30μl邻苯二甲醛/巯基乙醇试剂，反应60秒后，将40μl的混合物注入Chromsep分析柱(内径3mm，长度10cm；Chrompack，米德尔堡，荷兰)。用含有0.1M乙酸钠、10％甲醇和2.2％四氢呋喃(pH6.5)的流动相，以0.52ml/min的流速(Beckman 125泵；Beckman Instruments Indianapolis，印第安纳州，美国)洗脱该柱。通过Jasco荧光分光光度计FP-2020Plus(Jasco，东京，日本)检测谷氨酸和GABA。谷氨酸和GABA的保留时间分别为约3.5min和约15.0min。
GABA和谷氨酸外排表示为蛋白的pmol/min/g，而K+诱发的GABA和谷氨酸外排表示为相对于各自自发外排(由去极化刺激之前收集的两个部分的平均值计算)的增加百分比。根据Bradford(1976)测定蛋白质。
结果
1.材料设计与制造
PLLA电纺纤维中的T3含量的测定
用4mL甲醇提取约10mg精确称量的纤维，并放置在超声浴中持续15min。然后将混合物以7250rpm离心5分钟。收集上清液，并用相同的程序将纤维再提取两次。收集三次提取物，并以5mL浓缩在量瓶中。将10μL用990μL含0.1％甲酸的甲醇稀释，然后注入LC-MS/MS系统。
用在每次分析当日新鲜制备的6种不同浓度(0、100、200、300、400、500ng/mL)的T3加标的甲醇的校准曲线进行定量。
PLGA和PLLA电纺纤维中的IBU含量的测定
PLGA：将精确称量的一部分纤维溶解在2mL的ACN中，搅拌以促进活性成分的溶解，然后离心10分钟以将药物与聚合物分离。然后用PBS:ACN(1:1)溶液将溶液稀释1∶10。如果需要，可以进行稀释以达到0.05-20μg/ml的浓度。然后，如先前部分所述，通过HPLC检测溶液中的药物含量。
PLLA：将精确称量的一部分纤维溶于2mL ACN:DMSO(3:1v/v)中，加温并超声处理15分钟，最后将溶液离心10分钟；如果需要，可以进行稀释以达到0.05-20μg/ml的浓度。然后，如先前部分所述，通过HPLC检测溶液的IBU含量。
最后，PLGA和PLLA纤维的包封效率(EE)计算如下：
EE(％)＝(Wa/Wt)×100
其中Wa是实际药物浓度，Wt是理论药物浓度。
体外药物释放
将精确称量的一部分(portion或part)纤维倒入装有10mL pH 7.4PBS的管中。在37℃的温度下水平震荡试管。以预定的时间间隔(从1小时到21天)抽出释放介质，并用10mL新鲜缓冲溶液完全替换。
对于IBU测定，继而将抽出的液体样品用浓HCl酸化、过滤(0.4um NY过滤器)，需要时稀释，然后如上所述通过HPLC分析药物含量。释放测试至少进行三次重复，并报告平均值±SD。
对于T3测定，样品经过了提取方案和纯化，以通过LC-MS/MS进行分析(请参见上文)。
分析程序的验证：布洛芬
为了优化HPLC方法，测试了不同的流动相比率和不同的pH条件，以获得尖锐且对称的峰和较短的保留时间。特别地，在等度洗脱中评估了以下体积比CH3CN:NH4H2PO4(50:50、55:45和57:43v/v)。为此目的，制备了布洛芬的标准溶液，并用于分析。
以不同的流动相比率注入标准溶液(10μg/mL)。增加有机相的百分比，保留时间从7.1分钟变为5.2分钟；在所有情况下，IBU峰均被基线解析并显示出良好的对称性，使用57:43v/v的比率获得了最佳条件。
此外，还研究了四个不同的pH值(2.5、3.0、3.5和7.4)。在这些条件下，峰的形状及其保留时间没有显著差异。因此，使用CH3CN:NH4H2PO4比率(57:43v/v)pH为3(使用正磷酸调节)来分析所有样品。
为了获得校准曲线，使用了在0.05-20μg/ml范围内的IBU标准溶液。每次测量重复三次。通过峰面积积分并将这些值拟合到校准曲线中来进行定量评估：获得了平均线性回归方程y＝47936x+860.4和相关系数r2＝0.999。该相关系数值表明校准曲线1、2具有良好的线性(1.国际协调会议(ICH)，2005.协调三方指南：分析程序的验证：方法论(Q2B)，2005。2.《美国药典》(USP)34(NF 29)，第621章，2011年版)。
以LOD＝3σ/s计算的检测限为6.2ng/mL，以LOQ＝10σ/s计算的定量限为20.8ng/mL。
还评估了在T3(甲状腺激素)存在下和由包含10％FBS的完全细胞培养基(DMEM)(Dulbecco改良的Eagle培养基+10％胎牛血清DMEM-FBS)组成的样品中测定IBU的方法。为此目的，分析了包含IBU(10μg/mL)和T3(20μg/mL)混合的标准溶液(PBS pH7.4)。所获得的色谱图在IBU保留时间未出现其它峰。此外，为了测试分析方法也可用于测定培养基中的IBU，首先分析了包含完全DMEM(DMEM+10％FBS)的不同样品和DMEM(不含FBS)的样品。在两种情况下，色谱图均未显示在IBU保留时间存在其它峰。随后，制备含有已知浓度的IBU(1和10μg/mL)的完全DMEM溶液。结果表明两种浓度的恢复均超过96％。
分析程序的验证：T3
测试了不同的色谱条件，以在合理的分析时间内获得最佳的保留，并使分析物与基质干扰化合物良好的分离。所选的色谱梯度可在1.9min内良好洗脱T3，并具有更好形状且更对称的峰。
直接注入调优标准溶液后，获得了T3的质谱图。使用在正电离下运行的ESI获得了更高的响应。
根据保留时间、两个特定质量转变的存在以及这些产物离子的离子比率确定T3。
通过检查10种空白培养基样品的离子色谱图来评估特异性，用上述提到的方法提取并分析潜在共洗脱干扰化合物，这可能会损害在特定保留时间对分析物的解释。
该方法的线性通过在每次分析当日新鲜制备的与基质匹配的校准曲线进行评估。获得的回归线均符合要求，测定系数(r2)始终高于0.98，范围为0至200ng/mL。
通过制备和分析两次(在每批分析的开始和结束时)细胞培养基中的校准曲线，可以确保测定的准确性。
体外测试：药物含量和释放特性
电纺物中PLLA纤维中的T3含量
在5个样品中测定负载有两种药物(IBU和T3)的PLLA纤维中的T3含量。T3的平均含量为1.73±0.41μg/mg纤维。
电纺纤维中的IBU含量和释放
大多数仅含IBU的纤维的实际药物含量非常接近理论值，因此几乎所有样品的EE％约为100％。此外，药物在纤维中的分布是均质化的。这些结果表明，用于生产负载有IBU的纤维而采用的最终操作参数是正确的。
相反，在负载有两种药物(IBU和T3)的纤维中实际的IBU含量低于理论值(3.4％vs5.0％)。此外，药物在纤维中的分布是非均质化的。考虑到双注射工艺(图1)由于过程中的电荷排斥而具有更高的可变性，可以解释该结果。
使用50:50-IBU缀合的PLGA获得的纤维的药物含量为2％。
从可植入的基于聚合物的支架(例如电纺纤维)的药物释放受支架属性的强烈影响(图2和3)。
在此项研究中，效果如下：
(i)聚合物组成(交酯/乙交酯的比率)；
(ii)IBU装载量和药物掺入方法(物理掺入或聚合物-药物缀合)；
(iii)形态(纤维的纳米或微米直径)。
(iv)已经评估了聚合物组成(交酯/乙交酯比率)对IBU释放曲线的影响(图14)。
IBU释放结果表明，聚合物组成(交酯/乙交酯的比率)对IBU从纤维中的释放具有显著影响。因此，通过选择聚合物，可以调节药物释放速率。增加的药物释放速率，增加了PGA(更亲水)相对于PLA的比率。在任何情况下，PLGA 50:50、PLGA 75:25和PLGA 85:15纤维均显示出显著的爆发效应，在24h内释放了约80％的药物。PLLA系统表现出更好的性能；特别是负载有5％IBU的PLLA纤维在24h内仅释放了20％的药物，随后是受控的IBU释放阶段。因此，选择了基于PLLA且包含5％IBU的系统用于下一步。
(ii)IBU装载量和药物掺入方法(物理掺入或聚合物-药物缀合)(图15)。
对于使用PLGA和PLLA聚合物生产的共混纤维，研究了IBU装载量(5％和10％)对释放曲线的影响。结果表明，通过增加药物量，IBU的爆发释放增加。这一效应在PLLA系统中相对于PLGA系统更明显。使用50:50-IBU缀合的PLGA生产的纤维在21天内仅释放约2％的IBU。
(iii)形态(纤维的纳米或微米直径)
为了研究纤维尺寸对药物释放的影响，生产了微米级和纳米级的纤维(基于PLLA并且含5％IBU)。两种材料(微米级和纳米级)均显示出相似的释放曲线，但是纤维大小的差异影响了药物的释放量。如所预期的，从纳米纤维释放的药物的百分比高于从微米纤维释放的药物的百分比(14天后分别为42％和28％)(图16)。
根据体外IBU释放结果，选择了基于负载有5％IBU的PLLA的系统，以生产同时包含IBU和T3的电纺纤维。最终系统显示了所需的受控药物释放曲线，可在预定时间内递送目标量的IBU。
电纺纤维中的T3和IBU释放
T3和IBU在14天(350小时)内的累积释放如图4和5所示。体外释放研究证实，PLLA支架确保了在药物浓度和递送时间上预期的药物递送。
以PLLA聚合物为条件的DMEM细胞培养基中的T3的定量
将针对体外测试调整的细胞培养基样品进行提取方案和纯化，用于通过LC-MS/MS分析测定T3。测量的平均浓度(n＝3)为119.0±48.7ng/mL。
体外测试：功效
测试了下列条件：
Figure BDA0002830494340000171
为了获得体外生物材料的功效，进行了基因表达分析以评估药物是否从支架释放以及可溶药物是否能够改变LPS刺激后某些特定通路相关基因的mRNA谱。使用了编码促炎(TNFα)细胞因子和抗炎(IL-10)细胞因子的基因，以及编码甲状腺激素通路去碘酶2(D2)的标志物的基因。施用500ng/ml LPS持续24h会导致TNFα、D2和IL-10分别比基础水平增加约7倍、8倍和2倍(图6A)。实际上，未受到刺激的巨噬细胞表达这些基因的水平可忽略不计(数据未显示)。
用从PLLA支架释放的含布洛芬和T3的培养基进行细胞处理后，相对于LPS刺激的对照(sc LPS)，观察到所有支架组的TNFα和D2下调(图6B，C)。与sc LPS(p＝0.0006)相比，布洛芬缀合的支架(ibsc)的TNFα的mRNA水平最大程度地降低(64％)(p＝0.0006)，这与作为溶液加入布洛芬的对照(SC+IBU)相当(p＝0.0011，图6B)。此效果表明，ibsc在细胞培养基中孵育3天可提供一定量的布洛芬(约32μg)，这可有效地显著抑制炎症。
在这项研究中研究的另一个重要的炎症标志物是脱碘酶2，与未受刺激的对照相比，LPS活化的巨噬细胞中的碘化酶2大幅上调(p＝0.0006，图6A)。另外，在用富含从支架释放的布洛芬和T3的培养基处理后，脱碘酶2显著下调，其中相对于sc LPS，T3sc组和ibT3sc组在统计学上存在显著差异(分别为p＝0.013和p＝0.001，图6C)。ibT3sc的D2下调了83％，相比于T3sc的D2下调了73％、ibsc的D2下调了50％，这表明了当两种分子都存在时的协同的抗炎作用(图6C)。
最后分析的细胞因子是抗炎IL-10，仅在施用LPS后表现出较低的mRNA水平，并且在所有三个支架组中其表达均显著增加，从而确认了从支架释放的布洛芬和T3对LPS活化的巨噬细胞的抗炎作用(图6D)。
体内测试
创伤性脊髓损伤模型
大鼠挫伤模型已得到广泛表征，功效研究的最重要参数如图7所示。
实验动物手术后体重增加，用％表示相对于术前体重(bw)的变化：病变动物在挫伤后体重显著地降低，并随时间部分地恢复。评估行为、伤口闭合、感染和质量指数为每日临床评分：病变动物在术后前两周表现出较高的临床评分。膀胱功能恢复，显示此功能在6天(从4到19天)的时间跨度内恢复。Basso-Beattie-Bresnahan 21分，用于评估脊髓损伤后的运动恢复：病变组动物显示脊髓损伤后运动明显降低，并随时间部分地恢复。图13显示了由CatWalk设备进行的步态分析的选定参数。特别的，描述动物协调运动能力的协调参数(支撑时相比，步序规律性指数)表明，与假手术组动物相比，损伤动物在所分析的所有参数中均表现出差异。值得注意的是，支撑时相比得以恢复。还估计了病变体积，结果如图17所示。
对照处理：全身性施用
为了证明局部递送系统比全身性施用更有效，我们在全身性施用IBU(60mg/kg/day，10天)和T3(10g/kg，每天两次，10天)后进行了功效研究。我们观察到，大体情况(临床评分)略有改善，但对运动恢复没有影响(图9)。
探索性终点：Step1对运动的影响
谷氨酸释放
触发继发性退行性变的第一个事件是谷氨酸的释放。我们继而测量了从植入了Step1和空白支架的动物中获得的病变脊髓的突触体制备物中谷氨酸释放。结果示于图10-11。Step1显著降低了病变和植入后24小时和8天的自发和K+诱发的谷氨酸的释放，而对GABA的释放没有影响。
炎症和髓鞘再生
为了研究具有IBU和T3的支架是否影响炎症和髓鞘再生，我们分析了从植入了具有IBU和T3的支架以及空白支架的动物获得的病变脊髓的细胞组成。结果示于图12。我们展示了在植入了Step1的动物的脊髓中，负责髓磷脂碎片清除的细胞(CD11b和CD11b/MBP阳性细胞)的数量增加，例如髓鞘再生细胞(O4和MBP阳性)。此外，我们研究了编码炎症细胞因子的基因的表达调控(图13)，表明Step1降低了炎症级联关键基因(IL-1b和TNFa)的表达，也降低了T3灭活酶D3的表达水平。

Claims (27)

1.电纺聚合纤维，其中所述纤维的部分或全部负载有促髓鞘剂，并且所述纤维的另一部分或全部负载有抗炎剂。
2.根据权利要求1所述的电纺纤维，其中所述促髓鞘剂是甲状腺激素、狐衣酸、洛伐他汀、甲氧基异黄酮、依达拉奉、醋酸氯地孕酮、氯沙坦、非那米柳。
3.根据权利要求1所述的电纺纤维，其中所述促髓鞘剂是甲状腺激素受体激动剂，所述甲状腺激素受体激动剂选自3,3,5-三碘代-L-甲状腺原氨酸(T3)、L-甲状腺素(T4)、DITPA(3,5-二碘甲状腺丙酸)、DIMIT(3,5-二甲基-3-异丙基-L-甲状腺原氨酸)、DIBIT(3,5-二溴-3'-异丙基-L-甲状腺原氨酸)、MIBRT(3,5-二溴-4-(3'异丙基-4'-羟基苯氧基)苯甲酸)、伊罗替罗、Sobetirome、MGL-3196(2-[3,5-二氯-4-[(6-氧代-5-丙烷-2-基-1H-哒嗪-3-基)氧基]苯基]-3,5-二氧代-1,2,4-三嗪-6-甲腈)。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的电纺纤维，其中所述抗炎剂选自非甾体抗炎药(NSAID)、水杨酸盐、抗炎糖皮质激素和吡非尼酮。
5.根据权利要求4所述的电纺纤维，其中所述抗炎剂是非甾体抗炎药(NSAID)，所述非甾体抗炎药(NSAID)选自布洛芬、氟比洛芬、双氯芬酸和双氯芬酸与米索前列醇、吲哚美辛、酮洛芬、芬布芬、萘普生、舒林酸、塞来昔布、萘丁美酮、甲芬那酸、羟基保泰松、二氟尼柳、依托度酸、非诺洛芬、氟比洛芬、甲氯芬那酸、美洛昔康、萘丁美酮、奥沙普嗪、吡罗昔康、托美汀、伐地昔布和丙酸衍生物或它们的混合物。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的电纺纤维，其中所述促髓鞘剂是T3并且所述抗炎剂是布洛芬。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的电纺纤维，其中所述聚合纤维是生物聚合纤维。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的电纺纤维，其中所述聚合物选自合成聚酯、聚乳酸(PLLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚己内酯(PCL)和/或它们的共聚物，例如聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)和/或它们的混合物、聚氨酯、聚酰胺、氟化聚合物，或它们的共聚物和/或混合物，或天然聚合物，所述天然聚合物选自蛋白质、多糖、聚酯、多肽和它们的共聚物和/或它们的混合物。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的电纺纤维，其中所述聚合纤维是生物相容性纤维。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的电纺纤维，其中所述纤维的10％至90％、优选20％至50％负载有所述促髓鞘剂。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的电纺纤维，其中所述纤维的10％至90％、优选20％至50％负载有所述抗炎剂。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的电纺纤维，其中全部的所述纤维负载有所述促髓鞘剂和所述抗炎剂。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的电纺纤维，其中所述促髓鞘剂和/或所述抗炎剂通过非共价结合被包封在所述纤维内。
14.根据权利要求1至12中任一项所述的电纺纤维，用于在治疗脊髓损伤的方法中使用。
15.根据权利要求1至12中任一项所述的电纺纤维，用于在患有脊髓损伤的受试者中预防和/或治疗继发性神经退行性变中使用。
16.可植入支架，包含根据权利要求1至15中任一项所述的电纺纤维或由根据权利要求1至15中任一项所述的电纺纤维组成。
17.组合物，包含聚合纤维和稀释剂和/或赋形剂和/或载体的混合物，其中所述纤维的部分或全部负载有促髓鞘剂，并且所述纤维的另一部分或全部负载有抗炎剂，用于在治疗脊髓损伤的方法中使用。
18.根据权利要求17所述的组合物，其中所述促髓鞘剂是3,3,5-三碘代-L-甲状腺原氨酸(T3)并且所述抗炎剂是布洛芬。
19.用于制造根据权利要求1至12中任一项所述的电纺纤维的方法，所述方法包括电纺包含促髓鞘剂和抗炎剂的聚合溶液的步骤。
20.用于制造根据权利要求1至12中任一项所述的电纺纤维的方法，所述方法包括以下步骤：
a)制备包含促髓鞘剂的聚合溶液：
b)制备包含抗炎剂的聚合溶液：
c)电纺步骤a)和/或b)中制备的溶液。
21.根据权利要求19或21所述的方法，其中在所述电纺中使用的电压为15至20kV和/或流速为0.5至2.5ml/h。
22.根据权利要求19至21中任一项所述的方法，其中所述聚合溶液中的所述促髓鞘剂为0.1至2％w/w和/或所述聚合溶液中的所述抗炎剂为1至10％w/w。
23.根据权利要求19至22中任一项所述的方法，其中所述促髓鞘剂是甲状腺激素，所述甲状腺激素选自3,3,5-三碘代-L-甲状腺原氨酸(T3)、L-甲状腺素(T4)、DITPA(3,5-二碘甲状腺丙酸)、DIMIT(3,5-二甲基-3-异丙基-L-甲状腺原氨酸)、DIBIT(3,5-二溴-3'-异丙基-L-甲状腺原氨酸)、MIBRT(3,5-二溴-4-(3'异丙基-4'-羟基苯氧基)苯甲酸)、伊罗替罗、Sobetirome、MGL-3196(2-[3,5-二氯-4-[(6-氧代-5-丙烷-2-基-1H-哒嗪-3-基)氧基]苯基]-3,5-二氧代-1,2,4-三嗪-6-甲腈)。
24.根据权利要求19至23中任一项所述的方法，其中所述抗炎剂选自非甾体抗炎药(NSAID)、水杨酸盐、抗炎糖皮质激素和吡非尼酮。
25.根据权利要求19至24中任一项所述的方法，其中所述抗炎剂是非甾体抗炎药(NSAID)，所述非甾体抗炎药(NSAID)选自布洛芬、双氯芬酸和双氯芬酸与米索前列醇、吲哚美辛、酮洛芬、芬布芬、萘普生、舒林酸、塞来昔布、萘丁美酮、甲芬那酸、羟基保泰松、二氟尼柳、依托度酸、非诺洛芬、氟比洛芬、甲氯芬那酸、美洛昔康、萘丁美酮、奥沙普嗪、吡罗昔康、托美汀、伐地昔布和丙酸衍生物或它们的混合物。
26.根据权利要求19至25中任一项所述的方法，其中所述促髓鞘剂是T3并且所述抗炎剂是布洛芬。
27.根据权利要求19至27中任一项所述的方法，其中所述聚合物选自合成聚酯、聚乳酸(PLLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚己内酯(PCL)和/或它们的共聚物，例如聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)和/或它们的混合物、聚氨酯、聚酰胺、氟化聚合物，或它们的共聚物和/或混合物，或天然聚合物，所述天然聚合物选自蛋白质、多糖、聚酯、多肽和它们的共聚物和/或它们的混合物。
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