CN112345323A - 稻米直链淀粉含量标准品的研制方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于稻米品质检测技术领域，尤其涉及一种稻米直链淀粉含量标准实物样品的制备方法。本发明包括利用稻谷样品进行米粉样品的制备，并进行了水分含量的检测、稻米直链淀粉含量检测、均匀性检验、长期稳定性和短期稳定性检验、定值检验。通过本发明提供的方法可以制备出不同直链淀粉含量的稻米标准实物样品，并可作为标准样品用于稻米直链淀粉含量的检测与分析，也可用于测量仪器核查、分析方法确认与评价、测量过程质量控制等。

Description

稻米直链淀粉含量标准品的研制方法
技术领域
本发明属于稻米品质检测技术领域，尤其涉及一种稻米直链淀粉含量标准实物样品的制备方法。
背景技术
在过去相当长的一段时间里，为了解决粮食不足，我国水稻生产偏重提高产量而忽视品质的现象较为突出，有关稻米品质研究与优质稻品种选育比美国、日本、澳大利亚、印度等国都要晚。过去对稻米品质的要求也一直局限于收购指标，如杂质，碎米等。正是由于提高水稻产量一直是水稻产业的发展目标，忽视了“质”的需求，我国对稻米品质的研究起步较迟。直到1986年和1988年颁布了农业行业标准《优质食用稻米》和《米质测定方法》，使我国的稻米品质鉴定有了初步的发展。
为了加强农业质量标准体系建设，促进稻米质量的升级和满足国际贸易的需求，国家技术监督局于1999年11月发布了《稻谷》和《优质稻谷》两个国家标准，农业部也正在积极制定《食用籼米》、《食用粳米》和《香稻米》等一系列与稻米相关的行业产品技术标准，并以此来规范，指导稻米的生产和消费，保障稻米进出口和引导优新产品的研究与开发。这些新标准的颁布和实施，改变了以往只注重稻米的收购指标(如杂质、碎米等)，而增加了稻米的营养品质、食味品质等相关理化指标。
稻米直链淀粉含量是稻米蒸煮及食用品质的重要体现，生产实践表明，稻米直链淀粉含量对米饭的质地及大米的生产加工与应用有显著影响，受到企业和育种家的高度重视。目前，我国关于稻米直链淀粉含量标准物质的研究显得相当薄弱，还没有一套完整的、确切的稻米直链淀粉含量测定的标准物质，造成了相关检测时间的浪费。而目前稻米的标准物质也仅有从环境保护和营养成分为出发点的GBW 08502(米粉成份分析标准物质)和GBW(E)100009 (水稻粉营养成份分析标准物质)。它们被用于环境化学分析和食品成份分析，且成份也不够全面，也未包括直链淀粉这一项国际通用的关键性稻米品质的重要指标。由于缺乏有效的质控样品，其含量的测定依赖于马铃薯直链淀粉和糯米支链淀粉的合适配比，并根据相关马铃薯直链淀粉含量加以标定。目前的稻米品质和成分分析标准样品的现状已严重滞后于实际需要。因此，稻米直链淀含量标准样品的研制会填补相关标准样品的空白，为质检和科研降低成本、提供便利。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供一种稻米直链淀粉含量标准品的制备方法。
通过本发明提供的方法可以制备出不同直链淀粉含量的稻米标准实物样品，并可作为标准样品用于稻米直链淀粉含量的检测与分析，也可用于测量仪器核查、分析方法确认与评价、测量过程质量控制等。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种稻米直链淀粉含量标准品的研制方法，依次进行以下步骤：
1)、稻谷样品的采集：
筛选获得四种稻谷样品，所述四种稻谷样品的稻米直链淀粉含量分别为0-2％、9-12％、 14-18％和24-27％；
将上述四种稻谷样品分别各自进行如下步骤：
2)、稻谷样品的出糙后磨精：
先将稻谷样品脱壳，得糙米；糙米磨成精米，控制去皮率为9.5～10％，得精米样品；
3)、精米样品的研磨和过筛：
将精米样品研磨成粉后，过筛(0.150mm)；
4)、米粉样品的混匀：
将步骤3)得到的米粉样品均匀搅拌，得混匀后米粉样品；
说明：为了避免由于研磨、过筛过程中样品的吸水程度不同等原因带来的样品不均匀性，故而对样品进行进一步混匀处理；
5)、米粉样品水分的测定和分装：
测定混匀后米粉样品的水分含量，并进行分装；每套标准品中，对应的含有上述4个米粉样品；
6)、设定稻米直链淀粉含量检测方法；从而获得米粉样品的直链淀粉含量(干基)；
7)、进行均匀性检验；
8)、进行长期稳定性和短期稳定性检验；
9)、进行定值检验：
上述均匀性、长期稳定性和短期稳定性、定值的检验均需符合要求；
10)、包装、标志和标签。
作为本发明的稻米直链淀粉含量标准品的研制方法的改进：所述步骤6)包括以下内容：
米粉样品脱脂后制备成样品溶液，并制备相应的空白溶液；
利用马铃薯直链淀粉标准溶液(1mg/mL)、大米支链淀粉标准溶液(1mg/mL)、氢氧化钠溶液(0.09mg/mL)配制系列标准溶液(系列校正标准溶液)；
测定系列标准溶液的吸光度，以吸光度为纵坐标，系列标准溶液的直链淀粉含量为横坐标，绘制校正曲线；
测定样品溶液的吸光度，代入校正曲线中，获得米粉样品的直链淀粉含量(干基)。
作为本发明的稻米直链淀粉含量标准品的研制方法的进一步改进，步骤6)的吸光度确定方法为：
移取2.5mL系列标准溶液或样品溶液至预先加入20～30水的容量瓶中，加1mol/L的乙酸溶液0.5mL，摇匀，再加入1.0mL碘试剂，加水定容至50mL，摇匀，静置10min；
于720nm处测定系列标准溶液或样品溶液的吸光度(分光光度计用空白溶液凋零)。
作为本发明的稻米直链淀粉含量标准品的研制方法的进一步改进，所述步骤6)中，样品溶液的制备方法为：
将步骤5)所得的部分米粉样品利用甲醇进行脱脂，得脱脂后米粉样品；
在50mg±0.2mg脱脂米粉样品中加入0.5mL 95％乙醇，使样品湿润分散，再加入(沿壁加入)4.5mL 1mol/L的氢氧化钠溶液，然后于沸水浴中加热10min以溶解淀粉；再加蒸馏定容至50mL，摇匀；得样品溶液。
作为本发明的稻米直链淀粉含量标准品的研制方法的进一步改进，所述步骤6)中，对稻米直链淀粉含量检测后，还进行针对重复性、再现性的检测，要求满足以下要求：
大于重复性限r的情况不超过5％；大于再现性限R的情况不超过5％；
对满足要求的样品进行下述的步骤7)。
作为本发明的稻米直链淀粉含量标准品的研制方法的进一步改进，步骤7)中：
当分装的总体单元数少于1000时，抽取15～20套(个)；大于或等于1000时，抽取数为 2*N1/3个进行均匀性检验；
对测量的数据进行方差分析，通过瓶间方差和瓶内方差的比较来判断不同瓶中直链淀粉含量测量值之间有无系统性差异；
采用随机顺序重复测量的方法，从分装后的样品中随机抽取若干瓶样品；通过计算组内方差(MSwithin)和组间方差(MSamong)，并确定F值，并将该计算得到的F值与查表所得的F值进行比较；若F<F0.05(dfamong，dfwithin)，则样本被视为均匀的；若不满足，则样本被视为不均匀；F值计算方法如下：
Figure BDA0002754869810000041
Figure BDA0002754869810000042
Figure BDA0002754869810000043
其中，k为分组的组数，nj为第j组的单元数；
Figure BDA0002754869810000044
代表第j组数据的算术平均值，
Figure DEST_PATH_FDA0002754869800000032
代表总体的算术平均值，
若样本为均匀的，则通过下式计算样本的均匀性不确定度：
Figure BDA0002754869810000046
被视为均匀的样本进行下述的步骤8)。
作为本发明的稻米直链淀粉含量标准品的研制方法的进一步改进，所述步骤)8)的长期稳定性和短期稳定性检验中，
采用直线作为经验模型，对于大米直链淀粉进行长期和短期稳定性的研究；随机抽取3 个包装，每个包装做3个平行，做标准样品的长期稳定性统计检验；长期稳定性分别在第0、 3、6、9、12、18个月进行检测；
短期稳定性的检测，将样品置于0-4℃、20℃和40℃的恒温箱中保存，分别在第0、3、 7、14天进行稳定性监测；用t检验对数据进行统计分析，斜率b1为
Figure BDA0002754869810000047
截距b0为
Figure BDA0002754869810000048
S是直线上每点的标准偏差：
Figure BDA0002754869810000049
与斜率相关的不确定度s(b1)
Figure BDA00027548698100000410
在自由度n-2，置信水平p＝0.95(95％显著水平)下，通过查询t检验临界值表得到T(0.95，n-2)；若|b1|<T(0.95，n-2)×s(b1)，故斜率并不显著，因此标准样品在检测时间内未观测到明显的不稳定性；反之，则不稳定；
若样本为稳定的，则通过下式计算样本的长期和短期稳定性不确定度：
ults＝T×s(b1)，T代表长期稳定性考察的总时长(月)
usts＝t×s(b1)，t代表短期稳定性考察的总时长(日)；
长期和短期稳定性均被视为稳定的样本进行下述的步骤9)。
作为本发明的稻米直链淀粉含量标准品的研制方法的进一步改进，步骤9)中，对所采集的测定结果进行正态性分布检验；当K-S检验和S-W检验同时满足P值大于0.05时，判定成满足符合正态性分布。
作为本发明的稻米直链淀粉含量标准品的研制方法的进一步改进，所述5)中，混匀后米粉样品的水分含量测定时，随机抽检5次，要求标准偏差≤0.06％。
作为本发明的稻米直链淀粉含量标准品的研制方法的进一步改进，四种稻谷样品分别为：长粒糯米、嘉引2号、武粳31和中早39，相应的去皮率分别为9.5％、9.8％、9.6％和10.0％。
在本发明中：
步骤10)的包装、标志和标签为：
包装：净重4g一种规格，包装为白色具盖塑料管子。
标志：0-4℃保存；有“温度极限”、“怕雨怕潮”、“怕辐射”的特殊标志；有“本品为化学品，非食用品，不得入口……”安全警示。无指示性标志。无警告性标志(即危险品标志)。
标签内容：名称、批号、重量、有效期、贮存条件、生产单位名称等。
后续的贮存运输为：贮存：0-4℃保存。运输时避免暴晒，注意防潮，远离热源，防止撞击。
在本发明的步骤6)中：
设定了马铃薯直链淀粉标准品的确认：碘结合力x、碘-淀粉结合体的最大吸光度、淀粉含量均满足国标要求。还设定了大米支链淀粉标准品的确认：大米支链淀粉的碘结合力满足国标要求。
在本发明中，标准样品一定要满足长期稳定性和短期稳定性稳定，尤其是长期稳定性，这个直接关系到标准样品的保质期限。
步骤6)中的系列校正标准溶液为如下：
Figure BDA0002754869810000061
本发明步骤9)的定值程序：
采用多个实验室(8-10家)协作试验定值方法，对大米直链淀粉含量标准实物样品进行定值。每个定值实验室各送3套，每管平行测定3次。对定值测量的要求为：在同一实验室，由同一操作者使用相同设备，按照相同的测试方法，并在短时间内，对同一被试对象，独立进行测试。
对所采集的测定结果进行正态性分布检验；当K-S检验和S-W检验同时满足P值大于0.05 时，判定成满足符合正态性分布；
若符合正态性分布，则根据国家标准《数据的统计处理和解释正态样本离群值的判断和处理(GB/T 4883-2008)》，采用科克伦(Cochran)准则、格拉布斯(Grubbs)和迪克逊(Dixon) 准则对数据的有效性进行检验。
具体的定值为所有实验室测定结果的平均值，计算公式如下：
Figure BDA0002754869810000062
其中，x1、x2、x3……、xn等表示8-10家实验室报出的直链淀粉含量值，n表示实验室个数。定值不确定度计算如下：
Figure BDA0002754869810000063
另外，本标准样品溯源到马铃薯直链淀粉，其纯度不能达到100％，因此需要根据均匀分布评定，计算其B类不确定度，计算公式如下：
Figure BDA0002754869810000064
最后，稻米直链淀粉含量标准样品的扩展不确定度是通过合成定值、均匀性、稳定性和标准品B类不确定度对特性值总不确定度的贡献来计算的(包含因子k＝2)，具体计算公式如下：
Figure BDA0002754869810000071
四个稻米直链淀粉含量标准样品的定值需分别落在0-2％、9-12％、14-18％和24-27％范围内，且其扩展不确定度均需小于5％，才能进行下述步骤。
本发明在发明过程中，主要考虑了以下内容：
1)去皮率的确定
不同去皮率对稻米直链淀粉含量有很大的影响。长粒糯米、嘉引2号、武粳31和中早 39这种样品；若不去皮，直接用糙米进行含量的测定，则直链淀粉含量分别为1.20％、9.56％、 15.35％和21.97％；若去皮不够充分(5％左右)，其直链淀粉含量分别为1.33％、9.85％、15.84％和22.84％；若去皮度稳定在10％左右，则其直链淀粉含量分别稳定在1.45％、10.45％、16.80％和24.30％。
2)马铃薯直链淀粉标准品的确认
由于市售的马铃薯直链淀粉纯度不能达到100％，因此其纯度应该得到验证，且其碘结合力要通过电位滴定方法进行确认。
3)均匀性测定的取样问题
在均匀性检测中，采用随机顺序重复测定法进行取样，并计算相应的不确定度，如“具体实施方式”第7)点内容。
4)稳定性问题
在稳定性检验中，分别考察长期和短期稳定性及其对应的不确定度。长期稳定性主要考虑了本套标准样品的保质期限问题，短期稳定性主要考虑了本套标准品在不同运输条件下(包括极端运输条件)的稳定性问题，并分别考察了长期和短期稳定性的不确定度。
5)定值问题
在本套标准样品的定值方面，考虑了马铃薯直链淀粉的B类不确定度问题。同时，还考虑了由于标准样品本身的均匀性、保质期限和不同实验室间的测量误差等方面带来的不确定性问题，并合成了5类不确定度，对每个标准样品的扩展不确定度进行合理的分析与计算。
本发明具有如下的技术优势：
1、标准样品的筛选。筛选到的四个稻米标准样品的直链淀粉含量的值分别为0-2％、 9-12％、14-18％和24-27％，其值基本涵盖了我国稻米直链淀粉含量的总体。
2、溯源性问题和B类不确定度的引入。本发明关于直链淀粉含量的测定直接溯源到马铃薯直链淀粉，而不是传统地溯源到标准测量器具。同时，在稻米直链淀粉含量标准实物样品的扩展不确定度合成过程中，引入了B类不确定度，以进一步保证相关检测和分析的可靠性、科学性和有效性。
3、标准样品的定值和使用。对标准样品进行定值时，脱脂后测定其含量的，以减除脂肪含量对结果的影响。当标准样品直链淀粉含量确定后，使用未脱脂的标准米粉样品直接用作标样对未脱脂的待测样品的直链淀粉含量进行测定。这可以大大节约时间和成本，同时减少脱脂过程中有机试剂的使用，对环境友好。
4、应用情况。通过本发明研制的稻米直链淀粉含量标准样品具有广泛的应用基础，受到行业内的公认。同时，本发明研制的标准样品为稻米直链淀粉含量的检测降低成本，提供便利。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1碘-淀粉结合体最大吸光度；
图2稻米直链淀粉含量的校正曲线；
图3稻米直链淀粉含量均匀性趋势图；
图4稻米直链淀粉标准样品的包装、标识和标签；
图5稻米直链淀粉含量标准样品验证。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：一种稻米直链淀粉含量标准品的研制方法，依次进行以下步骤：
1)、稻谷样品的采集
筛选了大量水稻样品后，筛选出4个水稻品种----长粒糯米、嘉引2号、武粳31和中早 39，其水分含量为14％左右，根据国标《稻米直链淀粉含量的测定(GB/T 15683-2008)》对稻米直链淀粉的进行检测，其含量分别在如下范围：0-2％、9-12％、14-18％和24-27％。
每个水稻品种选择的样本量为10kg，备用。
将上述4个稻谷样品先分别各自进行如下的步骤2)～4)。
2)、稻谷样品的出糙和磨精
先将稻谷样品置于砻谷机中脱壳，得糙米；糙米置于精米机中磨成精米，同时产生糠粉；
长粒糯米、嘉引2号、武粳31和中早39的去皮率分别为9.5％、9.8％、9.6％和10.0％。去皮率的计算公式如下：
Figure BDA0002754869810000091
3)、稻米样品的研磨和过筛
将精米样品通过旋风磨粉机磨成粉末后，并用0.150mm(100目)的筛子过筛。
4)、米粉样品的混匀
将步骤3)得到的米粉样品均倒入V型混合机中均匀搅拌2小时后，倒入自封袋中。这样，能避免由于研磨、过筛过程中样品的吸水程度不同等原因带来的样品不均匀性，故而对样品进行了进一步混匀处理。
因此，共得到4个米粉样品(每个稻谷样品对应一种米粉样品)。
5)、米粉样品水分的测定和分装
将预先购置的带有密封内盖的5mL白色塑料管进行自来水清洗和超纯水冲洗，并在65℃下烘干、冷却到常温后，置于相对独立和洁净空间内。按每瓶4g分装，用千分之一天平称量。共分装稻米直链淀粉含量标准实物样品1000套，4管/套，即，每套的4管为对应上述4 种稻谷的4个米粉样品，每管的量为4g。分装好的样品瓶放在自封袋中0-4℃保存。
随机选取了5套共20个单元，每个单元称取1g进行水分测定，水分测定方法参考国家标准《食品安全国家标准食品中水分的测定(GB 5009.3-2016)》，测定结果如表1所示，标准样品1的含水量为10.49％，标准样品2的含水量为11.35％，标准样品3的含水量为10.89％，标准样品4的含水量为9.78％。
标准样品1为长粒糯米，标准样品2为嘉引2号，标准样品3为武粳31，标准样品4为中早39。
表1米粉样品水分测定结果
Figure BDA0002754869810000092
Figure BDA0002754869810000101
样本标准偏差的计算公式如下：
Figure BDA0002754869810000102
其中，xi代表第i次重复数据，
Figure BDA0002754869810000103
代表采用样本的平均值，N代表重复次数。
6)、稻米直链淀粉含量检测方法研究
①原理
将大米粉碎至细粉，以破坏淀粉的胚乳结构，使其易于完全分散及糊化，并对粉碎试样脱脂，脱脂后的试样分散在氢氧化钠溶液中，向一定量的试样分散液中加入碘试剂，然后使用分光光度计于720nm处测定显色复合物的吸光度。
考虑到支链淀粉对试样中碘-直链淀粉复合物的影响，利用马铃薯直链淀粉和支链淀粉的混合标样制作校正曲线，从校正曲线中读出样品的直链淀粉含量。
②试剂
除非另有说明，仅使用确认为分析纯的试剂，所用的水为蒸馏水或除去矿物质的水或同等纯度的水。
95％乙醇溶液、1.0mol/L和0.09mol/L氢氧化钠溶液、1mol/L乙酸溶液等。
碘试剂：用具盖称量瓶称取2.000g±0.005g碘化钾，加适量的水以形成饱和溶液，加入 0.200g±0.001g碘，碘全部溶解后将溶液定量移至100mL容量瓶中，加蒸馏水至100mL刻度，摇匀。现配现用，避光保存。
一、马铃薯直链淀粉标准品的确认：
1)、称0.0500g马铃薯直链淀粉(通过购买方式获得的脱脂后马铃薯直链淀粉)加入到 50mL烧杯中，加0.5mL 95％乙醇溶液浸润样品。然后加4.5mL1.0 mol/L氢氧化钠溶液，样品用水浴锅在100℃水浴加热，直到其完全分散；冷却并用水稀释定容至50mL(于容量瓶) 中，剧烈振摇混匀，作为马铃薯直链淀粉溶液，其浓度为1mg/mL。
2)、移取5.0mL浓度为1mg/mL的马铃薯直链淀粉溶液到200mL烧杯中，加85mL水，5.0mL 1mol/L乙酸溶液和5.0mL 0.1mol/L碘化钾溶液。然后用微量滴管向烧杯中滴加标准碘酸钾溶液，每滴0.05mL，每加一滴1min后用电位滴定法测定，结果以mV计。终点可由滴定曲线二阶导数图计算。碘结合力以质量分数表示，并按照下式进行计算：
x＝0.7610×V×100/[m×(1-ωm)]
其中，x为碘结合力，％；0.7610为每毫升标准碘酸钾溶液相当于碘的质量，单位为毫克 (mg)；V为滴定耗用的标准碘酸钾溶液的体积，单位为毫升(mL)；m为直链淀粉总量，单位为毫克(mg)；ωm为按照ISO 712测定的直链淀粉的水分含量，％。
经测定，滴定耗用的标准碘酸钾溶液的体积V为1.139mL，滴定用的直链淀粉总量m为 5mg，含水量ωm为10.18％。因此，碘结合力x＝0.7610×1.139×100/[5×(1-0.1018)]＝19.3％。
3)、移取1.0mL浓度为1mg/mL的马铃薯直链淀粉溶液到50mL容量瓶中，加入1.5mL0.09mol/L氢氧化钠溶液、25mL水、0.5mL 1mol/L乙酸溶液和0.5mL碘试剂，用水稀释并定容到50mL，静置10min，用分光光度计测定在波长500nm～800nm范围吸光度。如图1 所示，碘-淀粉结合体的最大吸光度为642nm。
4)、根据ISO 15914:2004，马铃薯直链淀粉用40％乙醇除去其中的可溶性糖。用90％DMSO 溶液在100℃条件下裂解样品并溶解淀粉，随后在60℃下加入浓盐酸水解。最后，该溶液用淀粉转葡糖苷酶将可溶性淀粉转化成葡萄糖。葡糖糖的定量采用己糖激酶法进行，淀粉含量通过乘以葡萄糖换成淀粉的换算系数(0.9)得到。通过计算，得出马铃薯直链淀粉中淀粉含量为97.04％(以干基计)。
上述2)～4)所得的碘结合力x、碘-淀粉结合体的最大吸光度、淀粉含量均满足国标要求。因此，本发明所选用的马铃薯直链淀粉能作为马铃薯直链淀粉标准品。以此马铃薯直链淀粉进行下述马铃薯直链淀粉标准溶液的制备。
二、大米支链淀粉标准品的确认：
以大米支链淀粉(经脱脂的大米支链淀粉)代替马铃薯直链淀粉，按照上述方法进行检测，所得结果为：大米支链淀粉的碘结合力为0.17％。满足国标要求。因此，本发明所选用的大米支链淀粉能作为大米支链淀粉标准品。以此大米支链淀粉进行下述支链淀粉标准溶液的制备。
马铃薯直链淀粉标准溶液(1mg/mL)的制备：
称取50mg±0.2mg的马铃薯直链淀粉于100mL锥形瓶中，小心加入0.5mL 95％乙醇，将粘在瓶壁上的直链淀粉冲下，加入4.5mL 1mol/L的氢氧化钠溶液，轻摇使直链淀粉完全分散开。随后将混合物在沸水浴中加热10min以分散马铃薯直链淀粉。分散后取出冷却到室温，转移至50mL容量瓶中。加水至刻度(50mL)，剧烈摇匀。因此，1mL此标准分散液含1mg直链淀粉。
大米支链淀粉标准溶液(1mg/mL)的制备：
称取50mg±0.2mg的大米支链淀粉于100mL锥形瓶中，小心加入0.5mL 95％乙醇，将粘在瓶壁上的支链淀粉冲下，加入4.5mL 1mol/L的氢氧化钠溶液，轻摇使支链淀粉完全分散开。随后将混合物在沸水浴中加热10min以分散支链淀粉。分散后取出冷却到室温，转移至50mL容量瓶中。加水至刻度(50mL)，剧烈摇匀。因此，1mL此标准分散液含1mg支链淀粉。
③仪器
砻谷机、磨精机、旋风磨粉机、0.150mm筛子(100目)、分光光度计、抽提机(能采用甲醇回流抽提样品)、50mL容量瓶、水浴锅、50mL锥形瓶、分析天平(分度值0.0001g)。
④样品溶液的制备
先在4g米粉样品(即步骤5)分装所得的米粉样品)中加入60ml甲醇进行脱脂，以5滴/秒-6滴/秒的速度索氏回流抽提4小时-6小时；然后放在盘子或表面皿上铺成一薄层，放置2天，以挥发残余甲醇，并平衡水分；得脱脂米粉样品；
称取50mg±0.2mg脱脂米粉样品于50mL锥形瓶中，小心加入0.5mL 95％乙醇，将粘在瓶壁上的米粉冲下，移取4.5mL 1mol/L的氢氧化钠溶液到锥形瓶中，轻轻摇匀，随后将混合物在沸水浴(约100℃)中加热10min以分散淀粉。取出冷却到室温，得样品溶液。
⑤空白溶液的制备
采用与测定样品时相同的操作步骤及试剂，但使用5.0mL 0.09mol/L氢氧化钠溶液替代步骤④的混合物制备空白溶液。即，5.0mL 0.09mol/L氢氧化钠溶液在沸水浴中加热10min，取出冷却到室温，转移至50mL容量瓶中；加蒸馏定容至50mL，并摇匀。
⑥系列校正标准溶液的配制
按表2混合配制直链淀粉和支链淀粉标准分散液及0.09mol/L氢氧化钠溶液的混合液。
表2、系列校正标准溶液
Figure BDA0002754869810000121
Figure BDA0002754869810000131
⑦显色和吸光度确定
准确移取2.5mL系列校正标准溶液或样品溶液(上述步骤④所得)到预先加入大约25mL 水的50mL容量瓶中，加0.5mL乙酸溶液(1mol/L)，摇匀，再加入1.0mL碘试剂，加水至刻度(50mL)，摇匀，静置10min。
分光光度计用空白溶液凋零，在720nm处测定系列标准溶液或样品溶液的吸光度。
⑧校正曲线的绘制
针对系列校正标准溶液，以吸光度为纵坐标，直链淀粉含量为横坐标，绘制校正曲线。直链淀粉含量以大米干基质量分数表示。
根据以上操作规程，可得系列校正标准溶液的吸光值和校正曲线分别如表3和图2所示。其相关系数r为0.9999。
表3系列校正标准溶液的直链淀粉含量和相应的吸光值(A720nm)
Figure BDA0002754869810000132
⑨结果表示
参照以上校正曲线的吸光值得到测试结果。直链淀粉含量表示为干基质量分数。以两次测定结果的算术平均值为测定结果。
即，将步骤⑦所得的样品溶液的吸光度代入步骤⑧所得的校正曲线方程中，获得米粉样品的直链淀粉含量(干基)。
⑩精确度
重复性：在同一实验室，由同一操作者使用相同设备，按相同的测试方法，并在短时间内，对同一被试对象，独立进行测试获得的两次独立测试结果差的绝对值，大于重复性限r 的情况不超过5％。其中r＝0.6972×ω0.20(ω为两次直链淀粉样品测试结果的平均值，单位为％)。
再现性：在不同实验室，由不同操作者使用不同设备，按相同的测试方法，对同一被试对象相互独立进行测试获得的两次独立测试结果差的绝对值，大于再现性限R的情况不超过 5％。其中R＝1.899×ω0.38(ω为两次直链淀粉样品测试结果的平均值，单位为％)。
实验研究表明，该检测方法有效，并用于均匀性和稳定性的研究。
7)、均匀性检验
由于制作了1000套，因此抽取数应为2*N1/3＝20套进行均匀性检验，并按三种程序分别从每瓶中称取50mg样品3份：
第一次：1-3-5-7-9-11-13-15-17-19-2-4-6-8-10-12-14-16-18-20
第二次：20-19-18-17-16-15-14-13-12-11-10-9-8-7-6-5-4-3-2-1
第三次：2-4-6-8-10-12-14-16-18-20-1-3-5-7-9-11-13-15-17-19
具体检测方法为：
按照上述“④样品溶液的制备”所述方法，使用分光光度计于720nm处测定显色复合物的吸光度。所得的样品溶液的吸光度代入步骤⑧所得的校正曲线方程中，获得米粉标准样品的直链淀粉含量(干基)。
每瓶的平均值和方差如表4所示。其均匀性良好，趋势性如图3所示。具体的方法差分析如表5所示。
表4、每瓶的平均值、方差和测量次数
Figure BDA0002754869810000141
Figure BDA0002754869810000151
Figure BDA0002754869810000161
表5、稻米直链淀粉含量的瓶间均匀性研究的方差分析表
Figure BDA0002754869810000162
Figure BDA0002754869810000163
MSamong和MSwithin的计算公式为：
Figure BDA0002754869810000164
从上表可知，以dfamong＝19，dfwithin＝40，查F检验临界值表(α＝0.05)，F0.05(19,40)>1.84.
①对于标准样品1：由于F＝MSamong/MSwithin＝1.38<F0.05(19,40)，所以本样品是均匀的，可以进行下述步骤8。不确定度
Figure BDA0002754869810000166
②对于标准样品2：由于F＝MSamong/MSwithin＝1.38<F0.05(19,40)，所以本样品是均匀的，可以进行下述步骤8。不确定度
Figure BDA0002754869810000171
③对于标准样品3：由于F＝MSamong/MSwithin＝1.51<F0.05(19,40)，所以本样品是均匀的，可以进行下述步骤8。不确定度
Figure BDA0002754869810000172
④对于标准样品4：由于F＝MSamong/MSwithin＝1.42<F0.05(19,40)，所以本样品是均匀的，可以进行下述步骤8。不确定度
Figure BDA0002754869810000173
说明：计算均匀性不确定度的目的是为了在下述步骤9)中用于计算样品的扩展不确定度。 8)、长期稳定性和短期稳定性检验
从2018年1月开始到2019年6月，本标准样品(储存于0-4℃)已经进行了18个月的稳定性考察。随机抽取3个包装，每个包装做3个平行，做标准样品的长期稳定性统计检验。长期稳定性考察按先密后疏的原则。分别在第0、3、6、9、12、18个月进行检测。
将样品置于0-4℃、20℃左右和40℃左右的恒温箱中(模拟极端运输条件)保存，分别在第0、3、7、14天进行稳定性监测，测定方法和长期稳定性监测相同。
用t检验对数据进行统计分析，得到的长期稳定性结果如表6所示。
表6、稻米直链淀粉含量的长期稳定性(4℃，干基质量分数表示)
Figure BDA0002754869810000174
Figure BDA0002754869810000181
说明：上表6中的ults为长期稳定性的不确定度，目的是为了在下述步骤9)中用于计算样品的扩展不确定度；
Figure BDA0002754869810000182
为标准品在0-18个月间检测的直链淀粉含量的平均值；
Figure BDA0002754869810000183
为标准品在0-18 月间的时间平均值；b1为斜率，计算公式为：
Figure BDA0002754869810000184
Xi代表第i个时间点的时间，Yi代表第i个时间点的直链淀粉含量，n代表总的时间点个数 (n＝6)；
b0为截距，计算公式为：
Figure BDA0002754869810000185
S是直线上每点的标准偏差，计算公式为：
Figure BDA0002754869810000186
s(b1)是与斜率相关的不确定度，计算公式为：
Figure BDA0002754869810000187
ults是长期稳定性的不确定度，计算公式为：
ults＝T×s(b1).
查T分布表(双尾)得，在自由度n-2，置信水平p＝0.95(95％显著水平)下，t检验的临界值为：
t＝(0.95，n-2)＝t(0.95，4)＝2.776
因为|b1|<t(0.95,n-2)×s(b1)，故斜率并不显著，因此标准样品在检测时间内未观测到明显的不稳定性。
由表6可知，有效期t＝18个月的长期稳定性的不确定度贡献ults＝18×s(b1)，标准样品1 为0.053，标准样品2为0.166，标准样品3为0.220，标准样品4为0.040。
由表7可知，标准样品1-4在4℃、20℃和40℃条件下放置14天，均呈稳定状态。短期稳定性的不确定度的贡献usts＝14×s(b1)，标准样品1为0.248，标准样品2为0.221，标准样品3为0.289，标准样品4为0.216。
表7、稻米直链淀粉含量的短期稳定性(干基质量分数表示)
Figure BDA0002754869810000191
Figure BDA0002754869810000201
9)、定值程序
邀请了10家实验室进行协作试验定值。每个定值实验室各送3套，每管平行测定3次。统计结果如表8所示。
对所采集的测定结果进行正态性分布检验，结果表明所有数据均符合正态分布(KS检验和SW检验的P值均大于0.05)(表9)。如表10和表11所示，根据国家标准《数据的统计处理和解释正态样本离群值的判断和处理(GB/T 4883-2008)》，采用科克伦(Cochran)准则、格拉布斯(Grubbs)和迪克逊(Dixon)准则对数据的有效性进行检验。由表10可知，科克伦的检验统计量均小于科克伦检验临界值(查询科克伦检验临界值表)。由表11可知，格拉布斯检验的低值和高值均小于格拉布斯检验临界值(查询格拉布斯检验临界值表)，迪克逊检验的低值和高值均小于迪克逊检验临界值(查询迪克逊检验临界值表)。因此，所有数据判定均为有效。因此，根据10家单位的定值结果，计算标准样品的标准值和协作测定的不确定度 uchar。
表8、稻米直链淀粉含量的实验室间研究的测定数据分析表
Figure BDA0002754869810000211
Figure BDA0002754869810000221
Figure BDA0002754869810000231
表9、稻米直链淀粉含量的正态性检验
Figure BDA0002754869810000232
表10、稻米直链淀粉科克伦检验
Figure BDA0002754869810000233
表11、稻米直链淀粉格拉布斯检验和迪克逊检验
Figure BDA0002754869810000234
由上表可知，标准样品1联合定值结果为M1＝1.46％，10家联合定值的总标准偏差为S1＝ 0.20，10家单位定值结果的合成不确定度
Figure BDA0002754869810000235
标准样品2联合定值结果为M2＝10.44％，10家联合定值的总标准偏差为S2＝0.22，10 家单位定值结果的合成不确定度
Figure BDA0002754869810000236
标准样品3联合定值结果为M3＝16.83％，10家联合定值的总标准偏差为S3＝0.40，10 家单位定值结果的合成不确定度
Figure BDA0002754869810000241
标准样品4联合定值结果为M4＝24.33％，10家联合定值的总标准偏差为S4＝0.46，10 家单位定值结果的合成不确定度
Figure BDA0002754869810000242
综上所述，稻米直链淀粉标准样品的定值和不确定度结果统计如表12。
表12、稻米直链淀粉标准样品的定值和不确定度结果统计表
标准样品编号 定值(干基质量分数,％) 不确定度(％)
标准样品1 1.46 0.064
标准样品2 10.44 0.068
标准样品3 16.83 0.126
标准样品4 24.33 0.145
购买的马铃薯直链淀粉标准样品的纯度为97.1％，根据发明人实验室的验证得到的纯度为 97.04％。因此，采用的马铃薯直链淀粉纯度为(97.1％+97.04％)/2＝97.07％，标准偏差为0.042％。由于该纯品没有证书，没有误差范围，仅给出纯度，根据均匀分布评定，马铃薯直链淀粉的B类不确定度为：
Figure BDA0002754869810000243
稻米直链淀粉含量标准样品的扩展不确定度是通过合成测定、均匀性、稳定性和马铃薯直链淀粉的B类不确定度对特性值总不确定度的贡献来计算的：
Figure BDA0002754869810000244
包含因子k＝2；
其中，uchar是定值过程中产生的不确定度，如表13所示，标准样品1-4的值分别为0.064％、 0.068％、0.126％和0.145％；
ub是马铃薯直链淀粉纯品的B类不确定度，如表13下方文字所示，值为0.024％；
ubb是均一性带来的不确定度，如7)均匀性检验所示，标准样品1-4的值分别为0.026％、 0.065％、0.064％和0.061％；
ults是长期稳定性不确定度，如上表所示，标准样品1-4的值分别为0.053％、0.166％、0.220％和0.040％；
usts是短期稳定不确定度，如上表8所示。
由于可以保证运输条件，所以短期稳定性usts＝0.因此，标准样品1、标准样品2、标准样品3和标准样品4的扩展不确定度(k＝2)分别为：
Figure BDA0002754869810000251
Figure BDA0002754869810000252
Figure BDA0002754869810000253
Figure BDA0002754869810000254
结论
稻米直链淀粉含量及其相对扩展不确定度如表13所示。
表13、稻米直链淀粉含量及其扩展不确定度
标准样品编号 定值(干基质量分数表示) 扩展不确定度(k＝2)(％)
标准样品1 1.46 0.18
标准样品2 10.44 0.39
标准样品3 16.83 0.53
标准样品4 24.33 0.33
10)、包装、标志和标签
包装、标识和标签如图4所示：
11)、贮存运输
贮存：0-4℃保存。运输时避免暴晒，注意防潮，远离热源，防止撞击。
12)应用情况
①从稻米品质分析检测以来，该套样品多次作为全国粮食部门评比考核用的参比样品。
②该套样品一直作为质控样品，用于水稻品种审定、区试试验、委托等水稻样品的直链淀粉含量测定。
③邀请了3家单位对该套标准样品进行验证，得到的标准曲线均表现出良好的现行和相关性，具体如图5所示。
实验1、应用实验：作为标准样品用于稻米直链淀粉含量的检测与分析。
利用本标准样品对待测样品1-10进行检测，同时按照本行业公认的检测精度最高的方法《大米直链淀粉含量的测定(GB/T 15683-2008)》进行比对，相关检测结果如表14所示。两种方法测得的结果无显著差异性性，其变异系数均在1％以内，本发明检测正确性高。
表14.本标准样品与公认方法检测结果的比对分析
样品编号 本标准样品检测结果<sup>a</sup> GB 15683-2008检测结果<sup>b</sup> 变异系数(％)
待测样品1 8.5 8.4 0.84
待测样品2 10.2 10.2 0.00
待测样品3 12.9 12.8 0.55
待测样品4 15.1 15.3 0.93
待测样品5 16.7 16.8 0.42
待测样品6 17.3 17.3 0.00
待测样品7 20.6 20.5 0.34
待测样品8 21.4 21.2 0.66
待测样品9 22.7 23 0.93
待测样品10 24.1 24.3 0.58
a待测样品1-10均未脱脂，本标准样品也未脱脂；b待测样品1-10均脱脂。
具体方法为：1、将所得的4种稻米直链淀粉含量标准品，进行如下操作：
1.1)、在50mg±0.2mg米粉样品中加入0.5mL 95％乙醇和4.5mL 1mol/L的氢氧化钠溶液，然后于沸水浴中加热10min以分散淀粉；再加蒸馏定容至50mL，摇匀；得样品溶液；
准确移取2.5mL样品溶液至预先加入大约25mL水的50mL容量瓶中，加0.5mL乙酸溶液(1mol/L)，摇匀，再加入1.0mL碘试剂，加水至刻度(50mL)，摇匀，静置10min。
分光光度计用空白溶液凋零，在720nm处测定吸光度；
1.2)、以吸光度为纵坐标，直链淀粉含量为横坐标，绘制校正曲线。
2、将待测样品实施例1进行出糙后磨精(控制去皮率为9.5～10％)，再研磨和过筛(0.150 mm)，然后按照1.1)进行操作，从而获得样品的吸光度，再带入1.2)所得的校正曲线中，从而获得检测结果。
说明：对标准样品进行定值的时候，是需要脱脂测定其含量的。当其具体含量确定后，其未脱脂的米粉就直接用作标样测定待测样品，即，标准样品和待测样品均不需要进行脱脂，可以大大节约时间和成本，同时对环境也友好。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (10)

1.稻米直链淀粉含量标准品的研制方法，其特征是依次进行以下步骤：
1)、稻谷样品的采集：
筛选获得四种稻谷样品，所述四种稻谷样品的稻米直链淀粉含量分别为0-2％、9-12％、14-18％和24-27％；
将上述四种稻谷样品分别各自进行如下步骤：
2)、稻谷样品的出糙后磨精：
先将稻谷样品脱壳，得糙米；糙米磨成精米，控制去皮率为9.5～10％，得精米样品；
3)、精米样品的研磨和过筛：
将精米样品研磨成粉后，过筛；
4)、米粉样品的混匀：
将步骤3)得到的米粉样品均匀搅拌，得混匀后米粉样品；
5)、米粉样品水分的测定和分装：
测定混匀后米粉样品的水分含量，并进行分装；每套标准品中，对应的含有上述4个米粉样品；
6)、设定稻米直链淀粉含量检测方法；从而获得米粉样品的直链淀粉含量；
7)、进行均匀性检验；
8)、进行长期稳定性和短期稳定性检验；
9)、进行定值检验：
10)、包装、标志和标签。
2.根据权利要求1所述的稻米直链淀粉含量标准品的研制方法，其特征是：所述步骤6)包括以下内容：
米粉样品脱脂后制备成样品溶液，并制备相应的空白溶液；
利用马铃薯直链淀粉标准溶液、大米支链淀粉标准溶液、氢氧化钠溶液配制系列标准溶液；
测定系列标准溶液的吸光度，以吸光度为纵坐标，系列标准溶液的直链淀粉含量为横坐标，绘制校正曲线；
测定样品溶液的吸光度，代入校正曲线中，获得米粉样品的直链淀粉含量。
3.根据权利要求2所述的稻米直链淀粉含量标准品的研制方法，其特征是：所述步骤6)的吸光度确定方法为：
移取2.5mL系列标准溶液或样品溶液至预先加入20～30水的容量瓶中，加1mol/L的乙酸溶液0.5mL，摇匀，再加入1.0mL碘试剂，加水定容至50mL，摇匀，静置10min；
于720nm处测定系列标准溶液或样品溶液的吸光度。
4.根据权利要求3所述的稻米直链淀粉含量标准品的研制方法，其特征是：所述步骤6)中，样品溶液的制备方法为：
将步骤5)所得的部分米粉样品利用甲醇进行脱脂，得脱脂后米粉样品；
在50mg±0.2mg脱脂米粉样品中加入0.5mL 95％乙醇，使样品湿润分散，再加入4.5mL1mol/L的氢氧化钠溶液，然后于沸水浴中加热10min以溶解淀粉；再加蒸馏定容至50mL，摇匀；得样品溶液。
5.根据权利要求2～4任一所述的稻米直链淀粉含量标准品的研制方法，其特征是：所述步骤6)中，对稻米直链淀粉含量检测后，还进行针对重复性、再现性的检测，要求满足以下要求：
大于重复性限r的情况不超过5％；大于再现性限R的情况不超过5％；
对满足要求的样品进行下述的步骤7)。
6.根据权利要求5所述的稻米直链淀粉含量标准品的研制方法，其特征是所述步骤7)中：
当分装的总体单元数少于1000时，抽取15～20套；大于或等于1000时，抽取数为2*N1/3个进行均匀性检验；
对测量的数据进行方差分析，通过瓶间方差和瓶内方差的比较来判断不同瓶中直链淀粉含量测量值之间有无系统性差异；
采用随机顺序重复测量的方法，从分装后的样品中随机抽取若干瓶样品；通过计算组内方差(MSwithin)和组间方差(MSamong)，并确定F值，并将该计算得到的F值与查表所得的F值进行比较；若F<F0.05(dfamong，dfwithin)，则样本被视为均匀的；若不满足，则样本被视为不均匀；F值计算方法如下：
Figure FDA0002754869800000021
Figure FDA0002754869800000022
Figure FDA0002754869800000023
其中，k为分组的组数，nj为第j组的单元数；
Figure FDA0002754869800000031
代表第j组数据的算术平均值，
Figure FDA0002754869800000032
代表总体的算术平均值，
若样本为均匀的，则通过下式计算样本的均匀性不确定度：
Figure FDA0002754869800000033
被视为均匀的样本进行下述的步骤8)。
7.根据权利要求6所述的稻米直链淀粉含量标准品的研制方法，其特征是：
所述步骤)8)的长期稳定性和短期稳定性检验中，
采用直线作为经验模型，对于大米直链淀粉进行长期和短期稳定性的研究；随机抽取3个包装，每个包装做3个平行，做标准样品的长期稳定性统计检验；长期稳定性分别在第0、3、6、9、12、18个月进行检测；
短期稳定性的检测，将样品置于0-4℃、20℃和40℃的恒温箱中保存，分别在第0、3、7、14天进行稳定性监测；用t检验对数据进行统计分析，斜率b1为
Figure FDA0002754869800000034
截距b0为
Figure FDA0002754869800000035
S是直线上每点的标准偏差：
Figure FDA0002754869800000036
与斜率相关的不确定度s(b1)
Figure FDA0002754869800000037
在自由度n-2，置信水平p＝0.95下，通过查询t检验临界值表得到T(0.95，n-2)；若|b1|<T(0.95，n-2)×s(b1)，故斜率并不显著，因此标准样品在检测时间内未观测到明显的不稳定性；反之，则不稳定；
若样本为稳定的，则通过下式计算样本的长期和短期稳定性不确定度：
ults＝T×s(b1)，T代表长期稳定性考察的总时长(月)
usts＝t×s(b1)，t代表短期稳定性考察的总时长(日)；
长期和短期稳定性均被视为稳定的样本进行下述的步骤9)。
8.根据权利要求7所述的稻米直链淀粉含量标准品的研制方法，其特征是：步骤9)中，对所采集的测定结果进行正态性分布检验；当K-S检验和S-W检验同时满足P值大于0.05时，判定成满足符合正态性分布。
9.根据权利要求1～8任一所述的稻米直链淀粉含量标准品的研制方法，其特征是：
所述5)中，混匀后米粉样品的水分含量测定时，随机抽检5次，要求标准偏差≤0.06％。
10.根据权利要求1～8任一所述的稻米直链淀粉含量标准品的研制方法，其特征是：四种稻谷样品分别为：长粒糯米、嘉引2号、武粳31和中早39，相应的去皮率分别为9.5％、9.8％、9.6％和10.0％。
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