CN112342309A - 棉花花基斑性状相关snp分子标记及其应用 - Google Patents

棉花花基斑性状相关snp分子标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种棉花花基斑性状相关SNP分子标记及其应用，该SNP分子标记具有棉花第7号染色体上第10763953位碱基及其上下游碱基组成的核苷酸序列，多态性为C或A。该SNP分子标记直接以DNA的形式表现，可在棉花的各个发育阶段以及不同的组织器官中检测，且不受环境和季节的限制，不存在表达与否等问题影响。通过提取棉花组织DNA，使用本发明中的特异性引物进行PCR扩增，基因型为A的为有花基斑的材料，基因型为C的则为无花基斑的材料，从而达到对待测样本的快速、规模化、自动化检测。

Description

棉花花基斑性状相关SNP分子标记及其应用
技术领域
本发明属于植物分子生物学技术领域，具体涉及棉花花基斑性状的分子检测技术领域，尤其涉及一种棉花花基斑性状相关SNP分子标记及其应用。
背景技术
棉花是我国重要的经济作物，作为纺织工业的主要原材料，其产量、品质等性状都备受育种者们关注，现如今随着测序技术的不断进步，分子标记辅助选择育种的方式为棉花新品种的选育提供了越来越多的便利，分子标记辅助选择育种越来越受到大家的欢迎，如何找到一个方便、快捷且不受环境影响的分子标记位点成了标记辅助选择育种首要解决问题。
棉花花基斑是棉花花瓣基部的一个含有紫红色的花青素沉着的一个区域，在早期的野生棉种和海岛棉花瓣中均有表现，但在栽培型陆地棉中却很少存在。花基斑不仅具有观赏价值还是物种分类的重要依据。花基斑可以吸引昆虫传粉，对棉花杂交选育新品种、及杂交种制种具有重要价值。
SNP是single nucleotide polymorphism的缩写，指在基因组上单个核苷酸的变异,包括转换和颠换。SNP在基因组中分布相当广泛，大量存在的SNP位点，使人们有机会发现控制各种性状的位点。SNP一般只有两种碱基组成，所以它是一种二态的标记，即二等位基因(biallelic)。由于SNP的二态性，非此即彼，在基因组筛选中SNPs往往只需+/-的分析，而不用分析片段的长度，这就利于发展自动化技术筛选或检测SNPs。目前关于棉花花基斑相关的分子标记尚未被报道，本发明的目的旨在发现一种新的与棉花花基斑性状紧密连锁或共分离的SNP分子标记，为花基斑性状的分子检测提供便利，同时有助于具有花基斑性状的棉花品种选育。
发明内容
本发明的目的就在于提供一种棉花花基斑性状相关SNP分子标记及其应用，以提供一种新的与棉花花基斑性状紧密连锁或共分离的SNP分子标记，为花基斑性状的分子检测和分子辅助育种提供一种新的方法。
本发明通过以下技术方案来实现上述目的：
本发明提供了一种棉花花基斑性状相关SNP分子标记，该SNP分子标记为棉花第7号染色体上第10763953位碱基及其上下游碱基组成的核苷酸序列，其中棉花第7号染色体上第10763953位碱基的基因型为C或A。
本发明还提供了上述棉花花基斑性状相关SNP分子标记在检测棉花花基斑性状中的应用，当基因型为AA或AC时为有花基斑棉花品种，当基因型为CC时为无花基斑棉花品种，如下表所示：
Figure BDA0002794995280000021
本发明还提供了一种用于检测棉花花基斑性状的试剂盒，该试剂盒包含上述特异性引物。
本发明还提供了一种利用上述棉花花基斑性状相关SNP分子标记检测棉花花基斑的方法，步骤包括：提取待检测棉花组织DNA，利用MASSARRAY技术，根据所述SNP分子标记设计特异性引物，以棉花组织DNA为模板，利用设计的特异性引物进行PCR扩增、SAP消化和延伸，检测SNP分子标记位点的基因型，若基因型为AA或AC时，该棉花为有花基斑材料，若基因型为CC时，该棉花为无花基斑材料。
本发明的有益效果在于：
本发明提供的与棉花花基斑性状关联的SNP分子标记，直接以DNA的形式表现，可在棉花的各个发育阶段以及不同的组织器官中检测，且不受环境和季节的限制，不存在表达与否等问题影响。通过提取棉花组织DNA，使用本发明中的特异性引物进行PCR扩增，基因型为AA或AC的为有花基斑的材料，基因型为CC的则为无花基斑的材料，从而达到对待测样本的快速、规模化、自动化检测。
本发明的棉花花基斑性状的SNP分子标记与棉花花基斑性状紧密连锁，能够有效地检测棉花中花基斑性状的有无，对于解析棉花驯化过程中花基斑的演化和花基斑形成的分子机理具有重要的意义。
本发明中的SNP分子标记可用于棉花花基斑性状的检测，还可用于棉花遗传背景分析和筛选，以及棉花花基斑位点分子标记辅助选择育种，具有广阔的应用前景。
具体实施方式
下面对本申请作进一步详细描述，有必要在此指出的是，以下具体实施方式只用于对本申请进行进一步的说明，不能理解为对本申请保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述申请内容对本申请作出一些非本质的改进和调整。
实施例1
1.实验材料及群体构建
棉花有花基斑材料，与常规无花基斑栽培品种进行杂交获得F1，F1自交获得F2，作为遗传群体进行研究。为控制田间试验的系统误差，所有材料均种植在同一地块，以保证环境条件一致。
2.棉花花基斑性状调查
对F2群体中的每个单株进行花基斑性状的调查，调查结果符合孟德尔分离定律，有花基斑和无花基斑的分离比为3:1，说明花基斑性状是由一对显性基因控制的。
3.BSR高通量测序
基于以上遗传分析结果，对F2群体中的有花基斑单株和无花基斑单株分别取样，构建有无花基斑性状的子代混池，进行BSR高通量测序，两个子代中得到21854个多态性标记位点。计算两个子代SNP-index作差：△(SNP-index)＝SNPindex(极端性状B)-SNPindex(极端性状A)。选择95％置信水平下，大于阈值的窗口作为候选区间，在候选基因组范围内挑选两个子代在SNP-index差异显著的SNP位点，即挑选子代2(极端性状B)SNP-index接近1，且子代1(极端性状A)SNP-index接近0的位点，得到候选的38个多态性标记位点。进一步的提取SNP位点ANNOVAR注释结果，挑选引起stop loss或者stop gain或者非同义突变或可变剪接的位点，共计19个SNP位点，作为候选基因的潜在SNP突变位点。
4.SNP检测
利用MASSARRAY技术，在F2群体的单株中验证上述SNP结果的准确性，结合F2群体单株表型，发现1个位于棉花第A07号染色体上的第10763953位碱基SNP[C/A]，即SNPIDNo.1与花基斑性状紧密连锁或共分离。
步骤如下：
先根据SNP位点设计特异延伸引物，如下所示：
Figure BDA0002794995280000041
然后通过PCR扩增目标序列，在SNP位点上延伸1个碱基，然后将制备的样品分析物与芯片基质共结晶后，进行质谱检测得出SNP位点信息。
具体反应体系和程序如下：
PCR反应过程为：
取1μL浓度为10ng/μL的DNA溶液，进行PCR扩增，PCR反应液应包含Water，HPLCgrade 927.5μL，10x的PCR Buffer with15 mM MgCl2 331.25μL，25mM的MgCl2 172.25μL，25mM的dNTP Mix 53μL，0.5μM的Primer Mix 530μL，5U/μl的HotStar Taq 106μL。在以下条件下进行扩增，94℃预变性2min，94℃变性20s，56℃退火30s，72℃延伸60s，以上3步循环45个，72℃延伸3min。
SAP消化反应过程为：
反应液中加入Water 810.9μL，10x的SAP Buffer 90.1μL，1.7U/μL的SAP 159.0μL。在以下条件下进行反应，37℃持续40s，85℃持续5s。
延伸反应的过程为：
反应液中加入Water 400.2μL，10x的iPLEX buffer plus 106μL，iPLEXterminator 106μL，0.6-1.3μM的MPrimer Mix 426.1μL，iPlex enzyme 21.7μL。在以下条件下进行延伸反应，94℃持续30s，94℃持续5s，52℃持续5s，80℃持续5s，以上3个反应循环40个；最后72℃持续180s后完成。
结果显示，在待检测的76株有花基斑单株中，SNPA0701位点为“AA”显性纯合基因型的有63株，及“AC”杂合基因型的有13株；无花基斑的213个单株在SNPA0701位点全为“CC”隐性纯合基因型，表型与基因型完全一致。以上结果表明SNP位点SNPA0701是与棉花花基斑性状紧密连锁或共分离的。SNPA0701可作为分子标记用于棉花花基斑性状的分子检测，还可用于棉花遗传背景分析和筛选，以及棉花花基斑性状分子标记辅助选择育种，具有广阔的应用前景。
实施例2
本实施例提供了一种利用棉花花基斑性状相关SNP分子标记检测棉花花基斑的方法，包括以下步骤：
(1)利用常规植物组织DNA提取方法，提取待检测棉花组织DNA；
(2)利用MASSARRAY技术，根据所述SNP分子标记设计特异性引物，序列如下：
上游引物：ACGTTGGATGTGAGCCTTCCATATAGAAGC
下游引物：ACGTTGGATGAAACGGAGTTTGGCCAACAC
延伸引物：TGACATTTTATAAACACACCTA
(3)以棉花组织DNA为模板，利用设计的特异性引物进行PCR扩增
取1μL浓度为10ng/μL的DNA溶液，进行PCR扩增，PCR反应液应包含Water，HPLCgrade 927.5μL，10x的PCR Buffer with 15mM MgCl2 331.25μL，25mM的MgCl2 172.25μL，25mM的dNTP Mix 53μL，0.5μM的Primer Mix 530μL，5U/μl的HotStar Taq 106μL。在以下条件下进行扩增，94℃预变性2min，94℃变性20s，56℃退火30s，72℃延伸60s，以上3步循环45个，72℃延伸3min，获得PCR反应液。
(4)SAP消化
PCR反应液中加入Water 810.9μL，10x的SAP Buffer 90.1μL，1.7U/μL的SAP159.0μL。在以下条件下进行反应，37℃持续40s，85℃持续5s，获得SAP反应液。
(5)延伸
SAP反应液中加入Water 400.2μL，10x的iPLEX buffer plus 106μL，iPLEXterminator 106μL，0.6-1.3μM的MPrimer Mix 426.1μL，iPlex enzyme 21.7μL。在以下条件下进行延伸反应，94℃持续30s，94℃持续5s，52℃持续5s，80℃持续5s，以上3个反应循环40个；最后72℃持续180s后完成。
(6)检测
利用MASSARRAY核酸质谱分析系统进行分析，判断目标位点的碱基类型，若为AA或AC基因型，则待检测棉花为有花基斑材料，若为CC基因型，则为无花基斑材料。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种棉花花基斑性状相关SNP分子标记，其特征在于，该SNP分子标记为棉花第7号染色体上第10763953位碱基及其上下游碱基组成的核苷酸序列，其中棉花第7号染色体上第10763953位碱基的基因型为C或A。
2.一种如权利要求1所述的棉花花基斑性状相关SNP分子标记在检测棉花花基斑性状中的应用，其特征在于，当基因型为AA或AC时为有花基斑棉花品种，当基因型为CC时为为无花基斑棉花品种。
3.一种用于检测如权利要求1所述的棉花花基斑性状相关SNP分子标记的特异性引物，其特征在于，所述特异性引物的序列为：
上游引物：ACGTTGGATGTGAGCCTTCCATATAGAAGC
下游引物：ACGTTGGATGAAACGGAGTTTGGCCAACAC
延伸引物：TGACATTTTATAAACACACCTA 。
4.一种用于检测棉花花基斑性状的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含如权利要求3所述特异性引物。
5.一种利用如权利要求1所述的棉花花基斑性状相关SNP分子标记检测棉花花基斑的方法，其特征在于，步骤包括：提取待检测棉花组织DNA，利用MASSARRAY技术，根据所述SNP分子标记设计特异性引物，以棉花组织DNA为模板，利用设计的特异性引物进行PCR扩增、SAP消化和延伸，检测SNP分子标记位点的基因型，若基因型为AA或AC，该棉花为有花基斑材料，若基因型为CC，该棉花为无花基斑材料。
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