CN112341390B

CN112341390B - 用于制备靶向组蛋白甲基转移酶ezh2共价抑制剂的化合物及其制备方法和用途

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Publication number: CN112341390B
Application number: CN201910726218.8A
Authority: CN
Inventors: 余洛汀; 张强胜
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2019-08-07
Filing date: 2019-08-07
Publication date: 2022-08-23
Anticipated expiration: 2039-08-07
Also published as: CN112341390A

Abstract

本发明公开了一种用于制备靶向组蛋白甲基转移酶EZH2共价抑制剂的化合物及其制备方法和用途，属于化学医药领域。本发明的目的在于提供用于制备靶向组蛋白甲基转移酶EZH2共价抑制剂的化合物及其制备方法和用途，其技术方案是提供了式I所示的化合物或其药学上可接受的盐及药物组合物。体外实验证明本发明化合物可与EZH2发生共价结合，抑制活性优异，随孵育时间延长，抑制作用增强，而其非共价对照化合物活性大大降低；本发明化合物在细胞水平可明显抑制EZH2的功能，其共价作用可延长化合物对EZH2功能的抑制，为抗肿瘤药物开发和应用提供了新的选择。

Description

用于制备靶向组蛋白甲基转移酶EZH2共价抑制剂的化合物及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于化学医药领域，具体涉及用于制备靶向组蛋白甲基转移酶EZH2共价抑制剂的化合物及其制备方法和用途。

背景技术

表观遗传学的主要调节机制包括DNA甲基化、组蛋白修饰及非编码RNA调控等。近年来，随着研究的不断深入，研究者发现表观遗传学事件是肿瘤发展的关键驱动力，对肿瘤的发生、迁移和侵袭具有非常重要的作用。组蛋白赖氨酸甲基转移酶EZH2是多梳家族蛋白PRC2复合物的催化组分，可通过催化组蛋白H3第27位赖氨酸(H3K27)发生三甲基化而抑制靶基因的表达。EZH2的过表达与肿瘤的发生密切相关，并与许多肿瘤的不良预后有关联。在实体瘤中，包括胰腺癌、乳腺癌、肾癌和肺癌等，EZH2水平的提高与EZH2靶基因的沉默相关；EZH2催化的H3K27me3的水平持续激活驱动滤泡性淋巴瘤和GCB弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)的发生发展。综上所述，EZH2目前已成为癌症药物的热门靶点。

目前，已经有多个靶向EZH2的小分子化合物进入临床。但这些EZH2小分子抑制剂均存在半衰期短、给药剂量大、易产生耐药等缺陷，所以急需开发具有新型作用模式的EZH2小分子抑制剂，如共价抑制剂。EZH2共价抑制剂相对于目前在研的EZH2可逆抑制剂具有较大优势，具体表现在以下几点：

(1)目前在研的EZH2小分子可逆抑制剂大多存在给药剂量大等缺点，共价抑制剂由于与EZH2蛋白形成共价键而作用较强且持久，可以减少给药剂量及给药频率。

(2)由于共价药物对EZH2靶蛋白能够产生持续抑制作用，因此，它能够预防耐药性的产生。同时，已有多篇报道表明EZH2蛋白发生突变，包括：Y641(Y641F，Y641N，Y641S，Y641C和Y641H)、A677G、A687等。

(3)EZH2蛋白663位的半胱氨酸残基为非保守的、特定罕见的，以此位点设计共价抑制剂，抑制剂将达到较高的选择性。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种用于制备靶向组蛋白甲基转移酶EZH2共价抑制剂的化合物，采用的技术方案是提供了式I所示的化合物或其药学上可接受的盐：

其中，R₁、R₂、R₃独立地选自H或C1～C6烷基，或者，R₂与R₃相连形成烷基环；

R₄选自

其中，R₅选自卤素、取代或未取代的5～10元芳基、取代或未取代的5～10元杂芳基，所述杂原子为N；R₆选自H或C1～C6烷基；R₇选自

R₈选自

R₉选自H或C1～C6烷基；R₁₀选自H或C1～C6烷基；R₁₁选自取代或未取代的5～10元芳基。

其中，上述式Ⅰ化合物中，当R₂与R₃不成环时，R₁、R₃独立地选自C1～C6烷基，R₂选自H、甲基或乙基；当R₂与R₃成环时，R₁选自C1～C6烷基，R₂与R₃相连形成5～8元烷基环。

优选的，上述式Ⅰ化合物中，当R₂与R₃不成环时，R₁、R₃独立地选自甲基或乙基，R₂选自H；当R₂与R₃成环时，R₁选自甲基或乙基，R₂与R₃相连形成6元烷基环。

其中，上述式Ⅰ化合物中，R₅选自卤素、取代或未取代的苯基、取代或未取代的吡啶基。

优选的，上述式Ⅰ化合物中，R₅选自卤素、

其中，R₁₂～R₁₆独立地选自H、卤素、C1～C6烷氧基、卤素取代的C1～C6烷氧基、C1～C6烷基、5～8元饱和杂环取代的C1～C6烷基、5～8元饱和杂环基；所述5～8元饱和杂环的杂原子选自N或O。

进一步优选的，上述式Ⅰ化合物中，R₅选自溴、

其中，R₁₂～R₁₆独立地选自H、氟取代的C1～C3烷氧基、5～6元饱和杂环取代的C1～C3烷基、5～6元饱和杂环基；所述5～6元饱和杂环的杂原子选自N或O。

再进一步优选的，上述式Ⅰ化合物中，R₁₂～R₁₆独立地选自H、三氟甲氧基、

其中，Y选自O或NR₁₇，R₁₇选自H、C1～C3烷基、叔丁氧羰基、金刚烷甲酰基或环己基甲酰基。

最优选的，上述式Ⅰ化合物中，R₁₂～R₁₆中仅有一个为三氟甲氧基、

其余为H；其中，Y选自O或NR₁₇，R₁₇选自H、C1～C3烷基、叔丁氧羰基、金刚烷甲酰基或环己基甲酰基。

其中，上述式Ⅰ化合物中，R₆选自H或C1～C3烷基。

优选的，上述式Ⅰ化合物中，R₆选自H或甲基。

更优选的，上述式Ⅰ化合物中，R₆选自甲基。

其中，上述式Ⅰ化合物中，R₉、R₁₀独立地选自H或C1～C3烷基。

优选的，上述式Ⅰ化合物中，R₉、R₁₀独立地选自H或甲基。

其中，上述式Ⅰ化合物中，R₇选自

其中，上述式Ⅰ化合物中，R₈选自

其中，上述式Ⅰ化合物中，R₁₁选自

其中，R₁₉～R₂₃独立地选自H、C1～C6烷基、硝基或苯基。

优选的，上述式Ⅰ化合物中，R₁₁选自

其中，R₁₉、R₂₀、R₂₁、R₂₃独立地选自H或C1～C3烷基，R₂₂选自H、C1～C3烷基、硝基、氨基或苯环。

更优选的，上述式Ⅰ化合物中，R₁₁选自

其中，R₁₉、R₂₀、R₂₁、R₂₃选自H，R₂₂选自H、硝基、氨基或苯环。

其中，上述式Ⅰ化合物中，当R₄选自

时，所述化合物选自：

当R₄选自

时，所述化合物选自：

本发明还提供了上述式Ⅰ化合物的制备方法，当R₄选自

时，合成路线如下：

步骤1：将化合物A在碱的醇水溶液中水解得到中间体B；

步骤2：中间体B和丙烯酰氯或乙烯基磺酰氯或反式-4-二甲基胺基巴豆酰氯盐酸盐在碱性条件下反应得到中间体C；

步骤3：中间体C与化合物D脱水反应得化合物E；

步骤4：在钯催化剂和无机碱的作用下，化合物E与硼酸或者硼酸酯发生偶联反应，得化合物F(化合物F中R₅若含有NH，可进一步修饰)；

当R₄选自

时，合成路线如下：

步骤1：化合物I与化合物J在碱性条件下发生反应得到中间体K；

步骤2：将中间体K在碱的醇水溶液中水解得到中间体L；

步骤3：中间体L和丙烯酰氯或乙烯基磺酰氯或反式-4-二甲基胺基巴豆酰氯盐酸盐在碱性条件下反应得到中间体M；

步骤4：利用偶联剂将化合物D偶联至中间体M上，制备得到化合物O。

其中，上述式Ⅰ化合物的制备方法，当R₄选自

时，步骤1中，所述碱为碳酸钠、氢氧化钠或氢氧化钾；水解温度为15～60℃；所述醇为甲醇、乙醇、丙醇或异丙醇中的至少一种。

其中，上述式Ⅰ化合物的制备方法，当R₄选自

时，步骤2中，所述碱为碳酸钾、三乙胺或N,N-二异丙基乙胺；反应溶剂为四氢呋喃、二氯甲烷或氯仿中的至少一种；反应温度为0～30℃。

其中，上述式Ⅰ化合物的制备方法，当R₄选自

时，步骤3中，脱水反应所用偶联剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、N-羟基-7-氮杂苯并三氮唑或1-羟基苯并三唑；反应溶剂为二甲亚砜、N，N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃或二氯甲烷；反应温度为15～30℃。

其中，上述式Ⅰ化合物的制备方法，当R₄选自

时，步骤4中，所述钯催化剂选自[1,1'-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯二氯甲烷络合物、醋酸钯、四(三苯基膦)钯中的至少一种；所述无机碱选自碳酸钠、碳酸钾、碳酸铯中的至少一种；所述化合物E：硼酸或硼酸酯：钯催化剂：碱的摩尔比为1：1～2：0.05～0.15：1～5；反应溶剂为二氧六环和水的混合物，其中，二氧六环：水的体积比为5～1：1；反应温度为90～110℃。

其中，上述式Ⅰ化合物的制备方法，当R₄选自

时，步骤1中，所述碱为碳酸铯、碳酸钾或氢化钠；反应温度为20～40℃；反应溶剂选自二甲亚砜、N，N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃或二氯甲烷。

其中，上述式Ⅰ化合物的制备方法，当R₄选自

时，步骤2中，所述碱为碳酸钠、氢氧化钠或氢氧化钾；水解温度为15～60℃；反应溶剂选自甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇中的至少一种。

其中，上述式Ⅰ化合物的制备方法，当R₄选自

时，步骤3中，所述碱为碳酸钾、三乙胺或N,N-二异丙基乙胺；溶剂为四氢呋喃、二氯甲烷或氯仿中的至少一种；反应温度为0～30℃。

其中，上述式Ⅰ化合物的制备方法，当R₄选自

时，步骤4中，所述偶联剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、N-羟基-7-氮杂苯并三氮唑或1-羟基苯并三唑；溶剂为二甲亚砜、N，N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃或二氯甲烷；温度为15～30℃。

本发明还提供了一种药物组合物，它是以上述所述式Ⅰ化合物或其药学上可接受的盐为活性成分，加入药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。

本发明进一步提供了上述所述式Ⅰ化合物或其药学上可接受的盐、上述所述药物组合物在制备抗肿瘤药物或自身免疫疾病药物中的用途。

更具体的，上述所述式Ⅰ化合物或其药学上可接受的盐、上述所述药物组合物在制备抗肿瘤药物或自身免疫疾病药物中的用途中，所述肿瘤为脑癌、成胶质细胞瘤、白血病、淋巴瘤、Bannayan-Zonana综合征、考登病、Lhermitte-Duclos病、乳腺癌、炎性乳腺癌、维尔姆斯瘤、尤因肉瘤、横纹肌肉瘤、室管膜瘤、成神经管细胞瘤、结肠癌、胃癌、膀肤癌、头颈癌、肾癌、肺癌、肝癌、黑素瘤、肾脏癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肉瘤、骨肉瘤、骨巨细胞瘤或甲状腺癌；所述自身免疫性疾病为银屑病或红斑狼疮。

术语定义：

本发明提供的化合物和衍生物可以根据IUPAC(国际纯粹与应用化学联合会)或CAS(化学文摘服务社，Columbus，OH)命名系统命名。

术语“烷基”是直链或支链的饱和烃基的基团。C₁～C₆烷基的实例包括但不限于甲基(C₁)、乙基(C₂)、正丙基(C₃)、异丙基(C₃)、正丁基(C₄)、叔丁基(C₄)、仲丁基(C₄)、异丁基(C₄)、正戊基(C₅)、3-戊基(C₅)、戊基(C₅)、新戊基(C₅)、3-甲基-2-丁基(C₅)、叔戊基(C₅)和正己基(C₆)。

术语“烷氧基”是指基团-OR，其中R是上文所定义的烷基。C₁～C₆烷氧基的实例包括但不限于甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、叔丁氧基、仲丁氧基、正戊氧基、正己氧基和1,2-二甲基丁氧基。

术语“芳基”是指在芳族环系中包含或不包含杂原子的4n+2芳族环系的基团，其中，杂原子选自氮、氧和/或硫。

术语“环烷基”是指包含或不包含杂原子的饱和的环状烃基，其可以是单环结构，也可以是两个以上的环，其中，杂原子选自硫、氧、磷和/或氮。

术语“烷氧羰基”是指基团R-O-C(O)-，其中R是上文所定义的烷基，优选R是C₁～C₆烷基(即本发明所述C1～C6烷氧羰基)。其例子包括但不限于甲氧羰基、乙氧羰基、丙氧羰基、异丙氧羰基、丁氧羰基、异丁氧羰基、叔丁氧羰基。

术语“脂环”是指饱和或部分不饱和的环状烃基。

术语“药学上可接受的”是指某载体、运载物、稀释剂、辅料，和/或所形成的盐通常在化学上或物理上与构成某药物剂型的其它成分相兼容，并在生理上与受体相兼容。

术语“药学上可接受的盐”是指本发明化合物与无机和/或有机酸和碱形成的酸式和/或碱式盐，也包括两性离子盐(内盐)，还包括季铵盐，例如烷基铵盐。这些盐可以是在化合物的最后分离和纯化中直接得到。也可以是通过将上述化合物与一定数量的酸或碱适当(例如等当量)进行混合而得到。这些盐可能在溶液中形成沉淀而以过滤方法收集，或在溶剂蒸发后回收而得到，或在水介质中反应后冷冻干燥制得。本发明中所述盐可以是化合物的盐酸盐、硫酸盐、枸橼酸盐、苯磺酸盐、氢溴酸盐、氢氟酸盐、磷酸盐、乙酸盐、丙酸盐、丁二酸盐、草酸盐、苹果酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、马来酸盐、酒石酸盐或三氟乙酸盐。

本发明的某些实施方式中，包括了同位素标记的化合物，所述同位素标记化合物是指与本文中所列化合物相同，但是其中的一个或多个原子被另一个原子取代，该原子的原子质量或质量数不同于自然界中常见的原子质量或质量数。可以引入本发明化合物中的同位素包括氢、碳、氮、氧、硫，即²H,³H、¹³C、¹⁴C、¹⁵N、¹⁷O、¹⁸O、³⁵S。含有上述同位素和/或其它原子同位素的本发明化合物以及该化合物的可药用的盐均应包含在本发明范围之内。

本发明化合物或药物组合物的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)、和局部给药。

用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增溶剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。

固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性化合物或化合物的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。必要时，活性化合物也可与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。

用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性化合物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。

除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料。

除了活性化合物外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。

用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。

用于局部给药的本发明化合物的剂型包括软膏剂、散剂、贴剂、喷射剂和吸入剂。活性成分在无菌条件下与生理上可接受的载体及任何防腐剂、缓冲剂，或必要时可能需要的推进剂一起混合。

本发明所述药学上可接受的辅料，是指除活性成分以外包含在剂型中的物质。

本发明所述药学上可接受的辅助性成分，它具有一定生理活性，但该成分的加入不会改变上述药物组合物在疾病治疗过程中的主导地位，而仅仅发挥辅助功效，这些辅助功效仅仅是对该成分已知活性的利用，是医药领域惯用的辅助治疗方式。若将上述辅助性成分与本发明药物组合物配合使用，仍然应属于本发明保护的范围。

本发明的有益效果：

本发明提供了一类结构新颖的化合物用于制备靶向组蛋白甲基转移酶EZH2的共价抑制剂。体外实验证明本发明化合物可与EZH2发生共价结合，抑制活性优异，随孵育时间延长，抑制作用增强，而其非共价对照化合物活性大大降低；本发明化合物在细胞水平可明显抑制EZH2的功能，其共价作用可延长化合物对EZH2功能的抑制。此外，本发明EZH2共价抑制衍生物的合成原料易得，合成方法容易实现，为抗肿瘤药物开发和应用提供了新的选择。

附图说明

图1为试验例2中本发明化合物及其可逆类似物对EZH2^WT体外酶活性抑制作用图。

图2为试验例3中延长EZH2蛋白与本发明化合物的作用时间，化合物对EZH2^WT酶活性抑制作用图。

图3为试验例4中底物(SAM)竞争性实验结果图。

图4为试验例5中本发明化合物对细胞内组蛋白27位赖氨酸3甲基化水平影响图。

图5为试验例6中本发明化合物在药物被洗脱后对细胞内组蛋白27位赖氨酸3甲基化水平影响图。

具体实施方式

以下通过实例形式对本发明用于制备靶向组蛋白甲基转移酶EZH2共价抑制剂的化合物及其制备方法和效果做进一步说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下实例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

实施例1 3-丙烯酰胺基-5-溴-2-甲基-N-((1-甲基-3-氧代-2,3,5,6,7,8-六氢异喹啉-4-基)甲基)苯甲酰胺(化合物A-1)的制备

步骤1 3-氨基-5-溴-2-甲基苯甲酸

将3-氨基-5-溴-2-甲基苯甲酸甲酯(1.0g，4.13mmol)、氢氧化钠(0.49g，12.39mmol)加入到甲醇/水混合溶液中(20ml/20ml)中，反应液在80℃下反应3h。TCL监测反应完全后，真空条件下浓缩反应液。加入水和乙酸乙酯萃取，调节pH至3～4，收集有机相。浓缩，真空干燥得目标化合物3-氨基-5-溴-2-甲基苯甲酸。黄褐色固体0.94g，产率：99.02％。

步骤2 3-(((2-氯-9-异丙基-9H-嘌呤-6-基)氨基)甲基)-4,6-二甲基吡啶-2(1H)-酮

将3-氨基-5-溴-2-甲基苯甲酸(580mg，2.52mmol)、碳酸钾(1042.8mg，11.6mmol)加入到四氢呋喃中，0℃条件下滴加丙烯酰氯(407μL，5.03mmol)。反应液在室温条件下反应4h。TCL监测反应完全后，真空条件下浓缩反应液。加入水和乙酸乙酯萃取，调节pH至3～4，收集有机相。柱层析得目标化合物3-(((2-氯-9-异丙基-9H-嘌呤-6-基)氨基)甲基)-4,6-二甲基吡啶-2(1H)-酮。白色固体0.646g，产率：90.34％。

步骤3 3-丙烯酰胺基-5-溴-2-甲基-N-((1-甲基-3-氧代-2,3,5,6,7,8-六氢异喹啉-4-基)甲基)苯甲酰胺(化合物A-1)

将3-(((2-氯-9-异丙基-9H-嘌呤-6-基)氨基)甲基)-4,6-二甲基吡啶-2(1H)-酮(800mg，2.82mmol)、4-(氨基甲基)-1-甲基-5,6,7,8-四氢异喹啉-3(2H)-酮(807.5mg，4.2mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)(971.7mg，5.0mmol)、1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑(HOAT)(690mg，5.0mmol)、N-甲基吗啉(1.55mL，14.0mmol)加入20ml二甲基亚砜(DMSO)中，室温反应过夜。反应完毕后，将反应液倒入30ml冰水中，有白色固体析出，过滤干燥得到目标化合物。白色固体760mg，产率：58.8％。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ11.49(s,1H),9.61(s,1H),8.31(t,J＝4.7Hz,1H),7.75(d,J＝2.0Hz,1H),7.19(d,J＝2.2Hz,1H),6.54(dd,J＝17.1,10.3Hz,1H),6.26(dd,J＝17.0,2.0Hz,1H),5.78(dd,J＝10.2,2.0Hz,1H),4.28(d,J＝4.8Hz,2H),2.71(s,2H),2.38(s,2H),2.12(s,3H),2.10(s,3H),1.68-1.60(m,4H).ESI-MS m/z 458.07(M+H)⁺，计算值：458.10。

实施例2 4-(5-(3-丙烯酰氨基-4-甲基-5-(((1-甲基-3-氧代-2,3,5,6,7,8-六氢异喹啉-4-基)甲基)叔丁基)氨基甲酰基)苯基)吡啶-2-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(化合物A-2)的制备

将化合物A-1(80mg，0.175mmol)，6-(4-Boc-1-哌嗪并)吡啶-3-硼酸频哪醇酯(103mg，0.263mmol)，碳酸钠(74.2mg，0.70mmol)加入到二氧六环/水＝4：1的混合溶液中，氮气置换五次。随后加入[1,1'-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯二氯甲烷络合物(13.2mg，0.018mmol)，氮气置换五次。100℃加热4小时，真空条件下减压浓缩，乙酸乙酯萃取，有机层合并后采用流动相为二氯甲烷：甲醇＝20：1的柱层析条件提纯得到产物，灰白色固体100mg，产率：89.3％。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ11.49(s,1H),9.63(s,1H),8.41(d,J＝2.5Hz,1H),8.25(t,J＝4.9Hz,1H),7.84(dd,J＝8.9,2.6Hz,1H),7.68(s,1H),7.31(s,1H),6.92(d,J＝8.9Hz,1H),6.55(dd,J＝17.1,10.2Hz,1H),6.25(dd,J＝17.1,2.0Hz,1H),5.76(dd,1H),4.32(d,J＝4.8Hz,2H),3.56-3.50(m,4H),3.46-3.40(m,4H),2.73(s,2H),2.38(s,2H),2.17(s,3H),2.10(s,3H),1.64(s,4H),1.43(s,9H).ESI-MS m/z 641.10(M+H)⁺，计算值：641.38。

实施例3 3-丙烯酰胺基-2-甲基-N-((1-甲基-3-氧代-2,3,5,6,7,8-六氢异喹啉-4-基)甲基)-5-(6-(哌嗪-1-基)吡啶-3-基)苯甲酰胺(化合物A-3)的制备

将化合物A-2(50mg，0.078mmol)加入到二氯甲烷中，加入50μL三氟醋酸，室温条件下反应8h。TCL检测反应完毕后，减压浓缩反应液。搅拌条件下，向浓缩液中加入饱和NaHCO₃溶液，调pH至8～9，有褐色固体析出。过滤、真空干燥得到目标化合物A-3。白色固体34mg，产率：80.6％。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ11.48(s,1H),9.63(s,1H),8.44(d,J＝2.5Hz,1H),8.24(t,J＝5.0Hz,1H),7.91–7.87(m,1H),7.71(s,1H),7.32(s,1H),7.00(d,J＝8.8Hz,1H),6.61–6.50(m,1H),6.25(dd,J＝17.0,2.0Hz,1H),5.77(dd,J＝10.3,2.0Hz,1H),4.33(d,J＝4.8Hz,2H),3.73(t,J＝5.0Hz 4H),3.17(t,J＝5.4Hz,4H),2.74(s,2H),2.38(s,2H),2.18(s,3H),2.10(s,3H),1.24(s,4H).ESI-MS m/z 541.10(M+H)⁺，计算值：541.28

实施例4 3-丙烯酰氨基5-(6-(4-((1R，3R，5R，7R)-金刚烷-2-羰基)哌嗪-1-基)吡啶-3-基)-2-甲基-N-((1-甲基-3-氧代-2,3,5,6,7,8-六氢异喹啉-4-基)甲基)苯甲酰胺(化合物A-4)的制备

化合物A-3(150mg，0.277mmol)、金刚烷乙酸(69.96mg，0.36mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)(79.65mg，0.42mmol)、1-羟基苯并三唑(HOBT)(56.14mg，0.42mmol)、三乙胺(192.5μL，1.385mmol)加入8ml二甲基亚砜(DMSO)中，室温反应过夜。反应完毕后，将反应液倒入10ml冰水中，有白色固体析出，过滤干燥得到目标化合物。灰白色固体87.3mg，产率：44.8％。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ11.50(s,1H),9.63(s,1H),8.42(d,J＝2.6Hz,1H),8.24(t,J＝4.9Hz,1H),7.84(dd,J＝8.8,2.6Hz,1H),7.69(s,1H),7.31(d,J＝2.0Hz,1H),6.92(d,J＝8.9Hz,1H),6.55(dd,J＝17.0,10.2Hz,1H),6.26(dd,J＝17.1,2.0Hz,1H),5.77(dd,J＝9.9,1.8Hz,1H),4.33(d,J＝4.9Hz,2H),3.66–3.48(m,8H),2.73(s,2H),2.38(s,2H),2.18(s,3H),2.15(s,2H),2.10(s,3H),1.91(d,J＝5.0Hz,2H),1.63(p,J＝5.2,4.3Hz,14H).ESI-MS m/z 741.4016(M+K)⁺，计算值：741.4877。

实施例5 3-丙烯酰氨基-5-(6-(4-(环己烷羰基)哌嗪-1-基)吡啶-3-基)-2-甲基-N-((1-甲基-3-氧代-2,3,5,6,7,8-六氢异喹啉-4-基)甲基)苯甲酰胺(化合物A-5)的制备

以化合物A-3、环己甲酸为原料，经过与合成化合物A-4类似的反应，得到目标化合物灰白色固体71mg，产率49.1％。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ11.50(s,1H),9.65(s,1H),8.41(d,J＝2.6Hz,1H),8.25(t,J＝4.9Hz,1H),7.85(dd,J＝8.9,2.6Hz,1H),7.69(d,J＝2.0Hz,1H),7.31(d,J＝2.1Hz,1H),6.94(d,J＝8.9Hz,1H),6.56(dd,J＝17.0,10.2Hz,1H),6.26(dd,J＝17.0,2.0Hz,1H),5.77(dd,J＝10.2,2.0Hz,1H),4.33(d,J＝4.8Hz,2H),3.62–3.55(m,4H),2.74(s,2H),2.38(s,2H),2.18(s,3H),2.11(s,3H),1.73–1.62(m,10H),1.37–1.28(m,4H).ESI-MS m/z673.3480(M+Na)⁺，计算值：673.3479。

实施例6 5-丙烯酰氨基-4-甲基-N-((1-甲基-3-氧代-2,3,5,6,7,8-六氢异喹啉-4-基)甲基)-4'-吗啉代-[1,11,1'-联苯基]-3-甲酰胺(化合物A-6)的制备

以化合物A-1、4-吗啉基苯硼酸频哪醇酯为原料，经过与合成化合物A-2类似的反应，得到目标化合物褐色固体43mg，产率68.06％。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ11.49(s,1H),9.60(s,1H),8.25(t,J＝5.0Hz,1H),7.69(s,1H),7.51(d,J＝8.6Hz,2H),7.29(d,J＝1.8Hz,1H),7.02(d,J＝8.6Hz,2H),6.55(dd,J＝16.9,10.1Hz,1H),6.26(dd,J＝17.2,2.0Hz,1H),5.76(dd,J＝10.3,2.0Hz,1H),4.32(d,J＝4.8Hz,2H),3.75(t,J＝4.8Hz,4H),3.15(t,J＝4.9Hz,4H),2.73(s,2H),2.38(s,2H),2.17(s,3H),2.10(s,3H),1.33–1.18(m,4H).ESI-MS m/z 541.00(M+H)⁺，计算值：541.27。

实施例7 5-丙烯酰氨基-4-甲基-N-((1-甲基-3-氧代-2,3,5,6,7,8-六氢异喹啉-4-基)甲基)-3'-吗啉代[1,11,1'-联苯基]-3-甲酰胺(化合物A-7)的制备

以化合物A-1、3-(4-吗啉基)苯基硼酸频哪酯为原料，经过与合成化合物A-2类似的反应，得到目标化合物灰白色固体67mg，产率57.59％。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ11.48(s,1H),9.64(s,1H),8.26(t,J＝4.8Hz,1H),7.72(s,1H),7.33(d,J＝2.2Hz,1H),7.13(s,1H),7.05(d,J＝7.7Hz,1H),6.95(dd,J＝8.1Hz,1H),6.75(d,J＝8.1Hz,1H),6.55(dd,J＝16.9,10.2Hz,1H),6.26(dd,J＝17.0,2.0Hz,1H),5.80–5.77(m,1H),4.33(d,J＝4.8Hz,2H),3.75(t,J＝4.8Hz,4H),3.16(t,J＝4.8Hz,4H),2.73(s,2H),2.38(s,2H),2.19(s,3H),2.10(s,3H),1.28–1.14(m,4H).ESI-MS m/z 541.10(M+H)⁺，计算值：541.27。

实施例8 5-丙烯酰氨基-4-甲基-N-((1-甲基-3-氧代-2,3,5,6,7,8-六氢异喹啉-4-基)甲基)-4'-(吗啉代甲基)-[11,1'-联苯]-3-甲酰胺(化合物A-8)的制备

以化合物A-1、4-(4-吗啉甲基)苯硼酸频哪酯为原料，经过与合成化合物A-2类似的反应，得到目标化合物淡黄色固体61mg，产率43.78％。

¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ12.44(s,1H),8.06(s,1H),7.58(t,J＝5.7Hz,1H),7.44(d,J＝7.8Hz,2H),7.37(s,1H),7.27(d,J＝6.8Hz,3H),6.44(dd,J＝16.9,1.7Hz,1H),6.36(dd,J＝15.3,11.9Hz,1H),5.78(dd,J＝10.0,2.0Hz,1H),4.55(d,J＝5.7Hz,2H),3.69(t,J＝4.7Hz,4H),3.47(s,2H),2.92(t,J＝6.2Hz,2H),2.43(t,J＝4.6Hz,4H),2.34(t,J＝6.2Hz,2H),2.26(s,3H),2.05(s,3H),1.36–1.19(m,4H).ESI-MS m/z 554.29(M+H)⁺，计算值：555.16。

实施例9 5-丙烯酰氨基-4-甲基-N-((1-甲基-3-氧代-2,3,5,6,7,8-六氢异喹啉-4-基)甲基)-4'-(4-甲基哌嗪-1-基)-[1,1'-联苯]-3-甲酰胺(化合物A-9)的制备

以化合物A-1、2-(4-甲基哌嗪-1-基)吡啶-5-硼酸频哪醇酯为原料，经过与合成化合物A-2类似的反应，得到目标化合物白色固体67mg，产率59.69％。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ11.47(s,1H),9.60(s,1H),8.24(t,J＝4.8Hz,1H),7.68(s,1H),7.49(d,J＝8.6Hz,2H),7.28(d,J＝1.9Hz,1H),7.00(d,J＝8.7Hz,2H),6.55(dd,J＝16.9,10.2Hz,1H),6.25(dd,J＝17.0,2.0Hz,1H),5.78–5.74(m,1H),4.32(d,J＝4.8Hz,2H),3.18(t,J＝5.1Hz,4H),2.73(s,2H),2.45(t,J＝5.0Hz,4H),2.38(s,2H),2.22(s,3H),2.17(s,3H),2.10(s,3H),1.32–1.21(m,4H).ESI-MS m/z 554.00(M+H)⁺，计算值：554.30。

实施例10 3-丙烯酰胺基-2-甲基-N-((1-甲基-3-氧代-2,3,5,6,7,8-六氢异喹啉-4-基)甲基)-5-(6-(4-甲基哌-1-基)吡啶-3-基)苯甲酰胺(化合物A-10)的制备

以化合物A-1、2-(4-甲基哌嗪-1-基)吡啶-5-硼酸频哪醇酯为原料，经过与合成化合物A-2类似的反应，得到目标化合物褐色固体62mg，产率56.85％。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ11.48(s,1H),9.63(s,1H),8.39(t,J＝4.9Hz,1H),8.24(s,1H),7.80(d,J＝8.9Hz,1H),7.68(s,1H),7.30(s,1H),6.90(d,J＝8.9Hz,1H),6.53(d,J＝14.5Hz,1H),6.26(d,J＝16.9Hz,1H),5.76(d,J＝10.3Hz,1H),4.33(d,J＝4.8Hz,2H),3.52(t,4H),2.74(s,2H),2.39(s,4H),2.22(s,2H),2.18(s,3H),2.10(s,3H),1.64(s,3H),1.24(s,4H).ESI-MS m/z 577.2901(M+Na)⁺，计算值：577.2903。

实施例11 5-丙烯酰氨基-4-甲基-N-((1-甲基-3-氧代-2,3,5,6,7,8-六氢异喹啉-4-基)甲基)-4'-(三氟甲氧基)-[1-1,1'-联苯]-3-甲酰胺(化合物A-11)的制备

以化合物A-1、4-(三氟甲氧基)苯基硼酸频哪醇酯为原料，经过与合成化合物A-2类似的反应，得到目标化合物白色固体52mg，产率53.40％。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ11.48(s,1H),9.66(s,1H),8.28(t,J＝4.9Hz,1H),7.79(s,1H),7.76(d,J＝8.7Hz,2H),7.45(d,J＝8.4Hz,2H),7.37(d,J＝2.0Hz,1H),6.57(dd,J＝17.0,10.3Hz,1H),6.26(dd,J＝17.0,2.0Hz,1H),5.78(dd,J＝10.3,2.0Hz,1H),4.33(d,J＝4.8Hz,2H),2.73(s,2H),2.38(s,2H),2.21(s,3H),2.10(s,3H),1.24(m,4H).ESI-MS m/z 562.1931(M+Na)⁺，计算值：562.1930。

实施例12 4-(5-(3-丙烯酰胺基-5-(((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)氨基甲酰基)-4-甲基苯基)吡啶-2叔丁酯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(化合物B-1)的制备

步骤1 3-丙烯酰氨基5-溴-N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-2-甲基苯甲酰胺

将3-(((2-氯-9-异丙基-9H-嘌呤-6-基)氨基)甲基)-4,6-二甲基吡啶-2(1H)-酮(500mg，1.76mmol)、3-(氨基甲基)-4,6-二甲基吡啶-2(1H)-酮(348.3mg，2.29mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)(607.3mg，3.17mmol)、1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑(HOAT)(431.2mg，3.17mmol)、N-甲基吗啉(0.97mL，8.8mmol)加入15ml二甲基亚砜(DMSO)中，室温反应过夜。反应完毕后，将反应液倒入20ml冰水中，有白色固体析出，过滤干燥得到目标化合物。白色固体660mg，产率：89.6％。

步骤2 4-(5-(3-丙烯酰胺基-5-(((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)氨基甲酰基)-4-甲基苯基)吡啶-2叔丁酯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(化合物B-1)

将化合物3-丙烯酰氨基5-溴-N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-2-甲基苯甲酰胺(300mg，0.72mmol)，6-(4-Boc-1-哌嗪并)吡啶-3-硼酸频哪醇酯(418.8mg，1.08mmol)，碳酸钠(304.1mg，2.88mmol)加入到二氧六环/水＝4:1的混合溶液中，氮气置换五次。随后加入[1,1'-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯二氯甲烷络合物(52.42mg，0.07mmol)，氮气置换五次。100℃加热4小时，真空条件下减压浓缩，乙酸乙酯萃取，有机层合并后采用流动相为二氯甲烷︰甲醇＝20︰1的柱层析条件提纯得到产物，灰白色固体308mg，产率:71.2％。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ11.47(s,1H),9.62(s,1H),8.41(d,J＝2.6Hz,1H),8.27(t,J＝5.0Hz,1H),7.84(dd,J＝8.9,2.6Hz,1H),7.69(s,1H),7.31(d,J＝2.0Hz,1H),6.92(d,J＝8.9Hz,1H),6.55(dd,J＝17.1,10.2Hz,1H),6.25(dd,J＝17.0,2.0Hz,1H),5.86(s,1H),5.76(dd,J＝10.2,2.1Hz,1H),4.30(d,J＝4.9Hz,2H),3.53(t,J＝3.2Hz,4H),3.43(t,J＝2.9Hz,4H),2.21(s,3H),2.17(s,3H),2.11(s,3H),1.43(s,9H).ESI-MS m/z 623.2955(M+Na)⁺，计算值：623.2958。

实施例13 3-丙烯酰胺-N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-2-甲基-5-(6-(哌嗪-1-基)吡啶-3-基)苯甲酰胺(化合物B-2)的制备

将化合物B-1(100mg，0.17mmol)加入到二氯甲烷中，加入100μl三氟醋酸，室温条件下反应10h。TCL检测反应完毕后，减压浓缩反应液。搅拌条件下，向浓缩液中加入饱和NaHCO₃溶液，调pH至8～9，有褐色固体析出。过滤、真空干燥得到目标化合物B-2。64mg淡黄色固体，产率：77.0％。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ11.47(s,1H),9.64(s,1H),8.39(d,J＝2.5Hz,1H),8.28(t,J＝3.6Hz,1H),7.79(d,J＝11.5Hz,1H),7.70(d,J＝16.6Hz,1H),7.30(d,J＝2.0Hz,1H),6.86(d,J＝8.9Hz,1H),6.55(dd,J＝17.0,10.2Hz,1H),6.25(dd,J＝17.1,2.0Hz,1H),5.86(s,1H),5.76(dd,J＝10.2,2.0Hz,1H),4.30(d,J＝5.0Hz,2H),3.58–3.40(m,4H),2.80–2.53(m,4H),2.21(s,3H),2.17(s,3H),2.11(s,3H).ESI-MS m/z 523.2327(M+Na)⁺，计算值：523.2434。

实施例14 5-丙烯酰胺基N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-4-甲基-4'-吗啉代-[1,1'-联苯]-3-甲酰胺(化合物B-3)的制备

以4-(4-吗啉基)苯基硼酸频哪酯为原料，经过与合成化合物B-1类似的反应，得到目标化合物，产率77.4％。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ11.46(s,1H),9.59(s,1H),8.28(t,J＝5.0Hz,1H),7.69(s,1H),7.51(d,J＝8.7Hz,2H),7.29(d,J＝2.0Hz,1H),7.02(d,J＝8.7Hz,2H),6.55(dd,J＝17.0,10.2Hz,1H),6.25(dd,J＝17.1,2.1Hz,1H),5.86(s,1H),5.76(dd,J＝10.1,2.1Hz,1H),4.30(d,J＝4.9Hz,2H),3.75(t,J＝4.8Hz,4H),3.15(t,J＝4.9Hz,4H),2.20(s,3H),2.17(s,3H),2.11(s,3H).ESI-MS m/z 523.2318(M+Na)⁺，计算值：523.2322。

实施例15 5-丙烯酰胺基N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-4-甲基-3'-吗啉代-[1,1'-联苯]-3-甲酰胺(化合物B-4)的制备

以3-(4-吗啉基)苯基硼酸频哪酯为原料，经过与合成化合物B-1类似的反应，得到目标化合物，产率71.9％。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ11.44(s,1H),9.63(s,1H),8.29(t,J＝5.0Hz,1H),7.72(s,1H),7.34(d,J＝1.9Hz,1H),7.30(d,J＝7.9Hz,1H),7.12(d,J＝2.3Hz,1H),7.05(d,J＝7.5Hz,1H),6.95(dd,J＝8.2,2.4Hz,1H),6.55(dd,J＝17.0,10.1Hz,1H),6.25(dd,J＝17.1,2.0Hz,1H),5.86(s,1H),5.76(dd,J＝10.2,2.1Hz,1H),4.30(d,J＝4.9Hz,2H),3.76(t,J＝4.8Hz,4H),3.17(t,J＝4.8Hz,4H),2.20(s,3H),2.18(s,3H),2.11(s,3H).ESI-MSm/z 523.2326(M+Na)⁺，计算值：523.2322。

实施例16 5-丙烯酰胺基N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-4-甲基-4'-(吗啉代甲基)-[1,1'-联苯]-3-甲酰胺(化合物B-5)的制备

以4-(4-吗啉甲基)苯硼酸频哪酯为原料，经过与合成化合物B-1类似的反应，得到目标化合物，灰色固体，产率45.7％。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ11.46(s,1H),9.63(s,1H),8.31(t,J＝5.0Hz,1H),7.76(s,1H),7.59(d,J＝8.2Hz,2H),7.39(d,J＝8.0Hz,2H),7.34(d,J＝2.0Hz,1H),6.56(dd,J＝17.0,10.3Hz,1H),6.26(dd,J＝17.0,2.0Hz,1H),5.86(s,1H),5.77(dd,J＝10.2,2.1Hz,1H),4.30(d,J＝4.9Hz,2H),3.58(t,J＝4.6Hz,4H),3.49(s,2H),2.37(t,J＝4.5Hz,4H),2.20(s,3H),2.19(s,3H),2.11(s,3H).ESI-MS m/z 537.2479(M+Na)⁺，计算值：537.2478。

实施例17 5-丙烯酰胺基N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-4-甲基-4'-(4-甲基哌嗪-1-基)-[11,1'-联苯]-3-甲酰胺(化合物B-6)的制备

以4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯硼酸频哪醇酯为原料，经过与合成化合物B-1类似的反应，得到目标化合物，灰白色固体，产率65.8％。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.59(s,1H),8.27(t,J＝4.9Hz,1H),7.68(s,1H),7.49(d,J＝8.8Hz,2H),7.29(d,J＝2.0Hz,1H),7.00(d,J＝8.8Hz,2H),6.55(dd,J＝17.0,10.2Hz,1H),6.25(dd,J＝17.0,2.0Hz,1H),5.86(s,1H),5.76(dd,J＝8.6,1.6Hz,1H),4.30(d,J＝4.9Hz,2H),3.17(t,J＝5.0Hz,4H),2.45(t,J＝5.0Hz,4H),2.22(s,3H),2.20(s,3H),2.16(s,3H),2.11(s,3H).ESI-MS m/z 536.2636(M+Na)⁺，计算值：536.2737。

实施例18 3-丙烯酰胺-N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-2-甲基-5-(6-(4-甲基哌嗪-1-基)吡啶-3-基)苯甲酰胺(化合物B-7)的制备

以2-(4-甲基哌嗪-1-基)吡啶-5-硼酸嚬哪醇酯为原料，经过与合成化合物B-1类似的反应，得到目标化合物，褐色固体，产率62.5％。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.63(s,1H),8.39(d,J＝2.6Hz,1H),8.27(t,J＝4.9Hz,1H),7.81(dd,J＝8.9,2.6Hz,1H),7.68(s,1H),7.31(d,J＝2.0Hz,1H),6.90(d,J＝8.9Hz,1H),6.55(dd,J＝17.1,10.2Hz,1H),6.25(dd,J＝17.0,2.0Hz,1H),5.86(s,1H),5.79–5.74(dd,1H),4.30(d,J＝4.9Hz,2H),3.52(t,J＝5.0Hz,4H),2.40(t,J＝5.0Hz,4H),2.22(s,3H),2.20(s,3H),2.17(s,3H),2.11(s,3H).ESI-MS m/z 537.2592(M+Na)⁺，计算值：537.2590。

实施例19 5-丙烯酰胺基N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-4-甲基-4'-(三氟甲氧基)-[1,1'-联苯]-3-甲酰胺(化合物B-8)的制备

以4-(三氟甲氧基)苯基硼酸频那醇酯为原料，经过与合成化合物B-1类似的反应，得到目标化合物，产率57.3％。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ11.46(s,1H),9.63(s,1H),8.30(t,J＝5.0Hz,1H),7.76(s,1H),7.59(d,J＝8.1Hz,2H),7.39(d,J＝8.0Hz,2H),7.34(d,J＝2.0Hz,1H),6.56(dd,J＝17.1,10.1Hz,1H),6.26(dd,J＝17.0,2.0Hz,1H),5.86(s,1H),5.77(dd,J＝10.2,2.0Hz,1H),4.30(d,J＝4.9Hz,2H),2.20(s,3H),2.19(s,3H),2.11(s,3H).ESI-MS m/z 538.2511(M+K)⁺，计算值：538.2702。

实施例20 4-(5-(3-丙烯酰胺基-5-(((4,6-二乙基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)氨基甲酰基)-4-甲基苯基)吡啶-2叔丁酯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(化合物C-1)的制备

步骤1 3-丙烯酰氨基5-溴-N-((4,6-二乙基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-2-甲基苯甲酰胺

将3-(((2-氯-9-异丙基-9H-嘌呤-6-基)氨基)甲基)-4,6-二甲基吡啶-2(1H)-酮(500mg，1.76mmol)、3-(氨基甲基)-4,6-二乙基吡啶-2(1H)-酮(412.15mg，2.29mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)(607.3mg，3.17mmol)、1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑(HOAT)(431.2mg，3.17mmol)、N-甲基吗啉(0.97mL，8.8mmol)加入15ml二甲基亚砜(DMSO)中，室温反应过夜。反应完毕后，将反应液倒入30ml冰水中，有白色固体析出，过滤干燥得到目标化合物。白色固体714mg，产率：90.9％。

步骤2 4-(5-(3-丙烯酰胺基-5-(((4,6-二乙基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)氨基甲酰基)-4-甲基苯基)吡啶-2叔丁酯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(化合物C-1)

将3-丙烯酰氨基5-溴-N-((4,6-二乙基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-2-甲基苯甲酰胺(400mg，0.90mmol)，6-(4-Boc-1-哌嗪并)吡啶-3-硼酸频哪醇酯(523.31mg，1.34mmol)，碳酸钠(379.90mg，3.6mmol)加入到二氧六环/水＝4:1的混合溶液中，氮气置换五次。随后加入[1,1'-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯二氯甲烷络合物(65.79mg，0.09mmol)，氮气置换五次。100℃加热4小时，真空条件下减压浓缩，乙酸乙酯萃取，有机层合并后采用流动相为二氯甲烷︰甲醇＝20︰1的柱层析条件提纯得到产物，灰白色固体416mg，产率:73.5％。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ11.46(s,1H),9.62(s,1H),8.41(d,J＝2.6Hz,1H),8.28(t,J＝4.9Hz,1H),7.83(dd,J＝8.9,2.6Hz,1H),7.68(s,1H),7.32(d,J＝1.9Hz,1H),6.92(d,J＝8.8Hz,1H),6.55(dd,J＝17.2,10.5Hz,1H),6.25(dd,J＝17.1,2.0Hz,1H),5.92(s,1H),5.80–5.74(dd,1H),4.32(d,J＝4.9Hz,2H),3.54(t,J＝4.6Hz,4H),3.44(t,J＝5.4Hz,4H),2.57(q,J＝7.5Hz,2H),2.42(q,J＝7.6Hz,2H),2.18(s,3H),1.43(s,9H),1.14(t,J＝7.5Hz,6H).ESI-MS m/z 651.3272(M+Na)⁺，计算值：651.3271。

实施例21 3-丙烯酰胺-N-((4,6-二乙基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-2-甲基-5-(6-(哌嗪-1-基)吡啶-3-基)苯甲酰胺(化合物C-2)的制备

将化合物C-1(160mg，0.254mmol)加入到二氯甲烷中，加入0.2ml三氟醋酸，室温条件下反应8h。TCL检测反应完毕后，减压浓缩反应液。搅拌条件下，向浓缩液中加入饱和NaHCO₃溶液，调pH至8～9，有灰色固体析出。过滤、真空干燥得到目标化合物C-2。灰色固体130mg，产率：96.6％。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ11.39(s,1H),9.57(s,1H),8.32(d,J＝2.5Hz,1H),8.22(t,J＝5.0Hz,1H),7.72(dd,J＝8.9,2.6Hz,1H),7.61(s,1H),7.24(s,1H),6.80(d,J＝8.9Hz,1H),6.49(dd,J＝17.0,10.1Hz,1H),6.19(dd,J＝17.0Hz,1H),5.86(s,1H),5.70(dd,J＝10.2Hz,1H),4.26(d,J＝5.0Hz,2H),3.37(t,J＝5.1Hz,4H),2.71(t,J＝5.0Hz,4H),2.50(q,J＝7.5Hz,2H),2.36(q,J＝7.5Hz,2H),2.11(s,3H),1.07(t,J＝7.5Hz,6H).ESI-MS m/z 529.2921(M+H)⁺，计算值：529.2925。

实施例22 5-丙烯酰胺基N-((4,6-二乙基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-4-甲基-4'-吗啉代-[1,1'-联苯]-3-甲酰胺(化合物C-3)的制备

以3-丙烯酰氨基5-溴-N-((4,6-二乙基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-2-甲基苯甲酰胺、4-吗啉基苯硼酸频哪醇酯为原料，经过与合成化合物C-1类似的反应，得到目标化合物灰色固体65mg，产率44.23％。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ11.46(s,1H),9.59(s,1H),8.29(t,J＝4.9Hz,1H),7.69(s,1H),7.51(d,J＝8.7Hz,2H),7.30(d,J＝2.0Hz,1H),7.01(d,J＝8.8Hz,2H),6.55(dd,J＝17.3,10.4Hz,1H),6.25(dd,J＝17.0,2.1Hz,1H),5.92(s,1H),5.76(dd,J＝10.2,2.1Hz,1H),4.32(d,J＝4.9Hz,2H),3.75(t,J＝4.8Hz,4H),3.15(t,J＝4.8Hz,4H),2.56(q,J＝7.6Hz,2H),2.42(q,J＝7.5Hz,2H),2.17(s,3H),1.16–1.11(m,6H).ESI-MS m/z 551.2642(M+Na)⁺，计算值：551.2635。

实施例23 5-丙烯酰胺基N-((4,6-二乙基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-4-甲基-3'-吗啉代[1,1'-联苯]-3-甲酰胺(化合物C-4)的制备

以3-丙烯酰氨基5-溴-N-((4,6-二乙基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-2-甲基苯甲酰胺、3-(4-吗啉基)苯基硼酸频哪酯为原料，经过与合成化合物C-1类似的反应，得到目标化合物灰白色固体86mg，产率36.3％。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ11.45(s,1H),9.62(s,1H),8.29(t,J＝4.9Hz,1H),7.72(s,1H),7.34(d,J＝2.0Hz,1H),7.29(d,J＝7.9Hz,1H),7.12(d,J＝2.1Hz,1H),7.05(d,J＝8.0Hz,1H),6.94(dd,J＝8.2,2.4Hz,1H),6.55(dd,J＝17.2,10.3Hz,1H),6.25(dd,J＝17.0,2.1Hz,1H),5.92(s,1H),5.76(dd,J＝10.1,2.0Hz,1H),4.32(d,J＝4.9Hz,2H),3.75(t,J＝4.8Hz,4H),3.16(t,J＝1.8Hz,4H),2.56(q,J＝7.6Hz,2H),2.42(q,J＝7.6Hz,2H),2.19(s,3H),1.14(td,J＝7.6,2.8Hz,6H).ESI-MS m/z 551.2628(M+Na)⁺，计算值：551.2630。

实施例24 5-丙烯酰胺基N-((4,6-二乙基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-4-甲基-4'-(吗啉代甲基)-[1,1'-联苯]-3-甲酰胺(化合物C-5)的制备

以3-丙烯酰氨基5-溴-N-((4,6-二乙基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-2-甲基苯甲酰胺、4-(4-吗啉甲基)苯硼酸频哪酯为原料，经过与合成化合物C-1类似的反应，得到目标化合物白色固体75mg，产率41.13％。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ11.45(s,1H),9.62(s,1H),8.31(t,J＝5.0Hz,1H),7.76(s,1H),7.58(d,J＝8.1Hz,2H),7.38(d,J＝8.0Hz,2H),7.35(d,J＝1.9Hz,1H),6.56(dd,J＝17.0,10.2Hz,1H),6.26(dd,J＝17.0,2.1Hz,1H),5.92(s,1H),5.77(dd,J＝10.2,2.0Hz,1H),4.32(d,J＝4.9Hz,2H),3.58(t,J＝4.6Hz,4H),3.49(s,2H),2.56(q,J＝7.6Hz,2H),2.42(q,J＝7.6Hz,2H),2.37(t,J＝4.6Hz,4H),2.20(s,3H),1.13(td,J＝7.6,1.3Hz,6H).ESI-MS m/z 565.2797(M+Na)⁺，计算值：565.2791。

实施例25 5-丙烯酰胺基N-((4,6-二乙基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-4-甲基-4'-(4-甲基哌嗪-1-基)-[11,1'-联苯]-3-甲酰胺(化合物C-6)的制备

以3-丙烯酰氨基5-溴-N-((4,6-二乙基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-2-甲基苯甲酰胺、4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯硼酸频哪醇酯为原料，经过与合成化合物C-1类似的反应，得到目标化合物白色固体52mg，产率21.4％。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ11.45(s,1H),9.59(s,1H),8.28(t,J＝5.0Hz,1H),7.68(s,1H),7.48(d,J＝8.8Hz,2H),7.29(d,J＝2.0Hz,1H),7.00(d,J＝8.9Hz,2H),6.55(dd,J＝17.1,10.2Hz,1H),6.25(dd,J＝17.0,2.1Hz,1H),5.92(s,1H),5.76(dd,J＝10.2,2.1Hz,1H),4.32(d,J＝4.9Hz,2H),3.18(t,J＝5.0Hz,4H),2.56(q,J＝7.6Hz,2H),2.46(t,J＝5.1Hz,4H),2.41(q,J＝7.5Hz,2H),2.22(s,3H),2.17(s,3H),1.14(t,J＝7.5Hz,6H).ESI-MS m/z 564.2952(M+Na)⁺，计算值：564.2951。

实施例26 3-丙烯酰胺-N-((4,6-二乙基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-2-甲基-5-(6-(4-甲基哌嗪-1-基)吡啶-3-基)苯甲酰胺(化合物C-7)的制备

以3-丙烯酰氨基5-溴-N-((4,6-二乙基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-2-甲基苯甲酰胺、2-(4-甲基哌嗪-1-基)吡啶-5-硼酸频哪醇酯为原料，经过与合成化合物C-1类似的反应，得到目标化合物褐色固体54mg，产率29.6％。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ11.46(s,1H),9.62(s,1H),8.39(d,J＝2.6Hz,1H),8.28(t,J＝5.2Hz,1H),7.80(dd,J＝8.9,2.6Hz,1H),7.68(s,1H),7.31(d,J＝2.0Hz,1H),6.90(d,J＝8.9Hz,1H),6.55(dd,J＝17.1,10.2Hz,1H),6.25(dd,J＝17.0,2.1Hz,1H),5.92(s,1H),5.76(dd,J＝10.2,2.1Hz,1H),4.32(d,J＝4.9Hz,2H),3.52(t,J＝5.0Hz,4H),2.57(q,J＝7.6Hz,2H),2.44(q,J＝7.5Hz,2H),2.40(t,J＝5.1Hz,4H),2.22(s,3H),2.18(s,3H),1.14(t,J＝7.5Hz,6H).ESI-MS m/z 565.2900(M+Na)⁺，计算值：565.2903。

实施例27 5-丙烯酰胺基N-((4,6-二乙基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-4-甲基-4'-(三氟甲氧基)-[1,1'-联苯]-3-甲酰胺(化合物C-8)的制备

以3-丙烯酰氨基5-溴-N-((4,6-二乙基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-2-甲基苯甲酰胺、4-(三氟甲氧基)苯基硼酸频哪醇酯为原料，经过与合成化合物C-1类似的反应，得到目标化合物白色固体76mg，产率36.87％。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ11.46(s,1H),9.65(s,1H),8.33(t,J＝6.5Hz,1H),7.79(s,1H),7.76(d,J＝8.7Hz,2H),7.45(d,J＝8.3Hz,2H),7.38(s,1H),6.56(dd,J＝17.1,10.2Hz,1H),6.26(dd,J＝17.0,1.9Hz,1H),5.92(s,1H),5.81–5.75(dd,1H),4.33(d,J＝4.9Hz,2H),2.57(q,J＝7.6Hz,2H),2.42(q,J＝7.6Hz,2H),2.21(s,3H),1.13(t,J＝7.5Hz,6H).ESI-MS m/z 550.1929(M+Na)⁺，计算值：550.1930。

实施例28 4-(5-(3-丙烯酰胺基-5-(((4-乙基-6-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)氨基甲酰基)-4-甲基苯基)吡啶叔丁酯吡啶-2-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(化合物D-1)的制备

步骤1 3-丙烯酰氨基5-溴-N-((4-乙基-6-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-2-甲基苯甲酰胺

将3-(((2-氯-9-异丙基-9H-嘌呤-6-基)氨基)甲基)-4,6-二甲基吡啶-2(1H)-酮(1320mg，4.65mmol)、3-(氨基甲基)-4-乙基-6-甲基吡啶-2(1H)-酮(1158mg，6.97mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)(1606mg，8.37mmol)、1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑(HOAT)(1144mg，8.37mmol)、N-甲基吗啉(2.57mL，23.25mmol)加入20ml二甲基亚砜(DMSO)中，室温反应过夜。反应完毕后，将反应液倒入30ml冰水中，有白色固体析出，过滤干燥得到目标化合物。白色固体1.46g，产率：72.6％。

步骤2 4-(5-(3-丙烯酰胺基-5-(((4-乙基-6-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)氨基甲酰基)-4-甲基苯基)吡啶叔丁酯吡啶-2-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(化合物D-1)

将3-(((2-氯-9-异丙基-9H-嘌呤-6-基)氨基)甲基)-4,6-二甲基吡啶-2(1H)-酮(300mg，0.69mmol)，6-(4-Boc-1-哌嗪并)吡啶-3-硼酸频哪醇酯(405.2mg，1.04mmol)，碳酸钠(294.3mg，2.77mmol)加入到二氧六环/水＝4:1的混合溶液中，氮气置换五次。随后加入[1,1'-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯二氯甲烷络合物(50.7mg，0.07mmol)，氮气置换五次。100℃加热4小时，真空条件下减压浓缩，乙酸乙酯萃取，有机层合并后采用流动相为二氯甲烷︰甲醇＝20︰1的柱层析条件提纯得到产物，灰白色固体，产率:78.5％。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ11.47(s,1H),9.62(s,1H),8.41(d,J＝2.5Hz,1H),8.27(t,J＝5.1Hz,1H),7.83(dd,J＝8.9,2.6Hz,1H),7.69(s,1H),7.31(s,1H),6.92(d,J＝8.9Hz,1H),6.55(dd,J＝17.0,10.3Hz,1H),6.25(dd,J＝17.0,2.0Hz,1H),5.91(s,1H),5.76(dd,J＝9.4,2.0Hz,1H),4.31(d,J＝4.8Hz,2H),3.53(t,J＝6.7Hz,4H),3.43(t,J＝6.8Hz,4H),2.55(q,J＝7.7Hz,2H),2.17(s,3H),2.13(s,3H),1.43(s,9H),1.13(t,J＝7.5Hz,3H).ESI-MS m/z 637.3120(M+Na)⁺，计算值：637.3115。

实施例29 33-丙烯酰胺基N-((4-乙基-6-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-2-甲基-5-(6-(哌嗪-1-基)吡啶-3-基)苯甲酰胺(化合物D-2)的制备

将化合物D-1(150mg，0.244mmol)加入到二氯甲烷中，加入0.2ml三氟醋酸，室温条件下反应8h。TCL检测反应完毕后，减压浓缩反应液。搅拌条件下，向浓缩液中加入饱和NaHCO₃溶液，调pH至8～9，有灰色固体析出。过滤、真空干燥得到目标化合物D-2。灰色固体113mg，产率：90.0％。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ11.47(s,1H),9.62(s,1H),8.38(t,J＝2.5Hz,1H),8.27(d,J＝5.2Hz,1H),7.79(d,J＝7.8Hz,1H),7.67(s,1H),7.30(s,1H),6.86(d,J＝8.9Hz,1H),6.55(dd,J＝17.0,10.2Hz,1H),6.25(dd,J＝17.0,2.0Hz,1H),5.91(s,1H),5.76(dd,J＝9.9,2.0Hz,1H),4.31(d,J＝4.9Hz,2H),3.44(t,J＝4.9Hz,4H),2.78(t,J＝4.9Hz,4H),2.55(q,J＝7.7Hz,2H),2.17(s,3H),2.13(s,3H),1.13(t,J＝7.6Hz,3H).ESI-MS m/z515.2768(M+H)⁺，计算值：515.2770。

实施例30 5-丙烯酰胺基N-((4-乙基-6-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-4-甲基-4'-吗啉代-[1,1'-联苯]-3-甲酰胺(化合物D-3)的制备

以4-(4-吗啉基)苯基硼酸频哪酯为原料，经过与合成化合物D-1类似的反应，得到灰白色目标化合物，产率57.9％。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ11.47(s,1H),9.59(s,1H),8.28(t,J＝5.0Hz,1H),7.69(s,1H),7.51(d,J＝8.8Hz,2H),7.29(d,J＝2.0Hz,1H),7.01(d,J＝8.9Hz,2H),6.55(dd,J＝17.0,10.2Hz,1H),6.25(dd,J＝17.0,2.0Hz,1H),5.91(s,1H),5.76(dd,J＝10.2,2.1Hz,1H),4.31(d,J＝4.9Hz,2H),3.74(t,J＝4.9Hz,4H),3.15(t,J＝4.8Hz,4H),2.55(q,J＝8.0Hz,2H),2.17(s,3H),2.13(s,3H),1.13(t,J＝7.5Hz,3H).ESI-MS m/z 537.2480(M+Na)⁺，计算值：537.2478。

实施例31 5-丙烯酰胺基N-((4-乙基-6-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-4-甲基-3'-吗啉代[1,1'-联苯]-3-甲酰胺(化合物D-4)的制备

以3-(4-吗啉基)苯基硼酸频哪酯为原料，经过与合成化合物D-1类似的反应，得到褐色目标化合物，产率82.4％。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ11.46(s,1H),9.63(s,1H),8.28(t,J＝4.9Hz,1H),7.72(s,1H),7.34(s,1H),7.29(d,J＝8.0Hz,1H),7.12(s,1H),7.05(d,J＝7.6Hz,1H),6.94(dd,J＝8.3,2.4Hz,1H),6.55(dd,J＝17.1,10.4Hz,1H),6.26(dd,J＝17.0,2.1Hz,1H),5.91(s,1H),5.76(dd,J＝10.3,2.0Hz,1H),4.32(d,J＝4.9Hz,2H),3.75(t,J＝4.7Hz,4H),3.16(t,J＝4.8Hz,4H),2.56(q,J＝7.5Hz,2H),2.18(s,3H),2.12(s,3H),1.13(t,J＝7.5Hz,3H).ESI-MS m/z 537.2480(M+Na)⁺，计算值：537.2478。

实施例32 5-丙烯酰胺基N-((4-乙基-6-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-4-甲基-4'-(吗啉代甲基)-[1,1'-联苯]-3-甲酰胺(化合物D-5)的制备

以4-(4-吗啉甲基)苯硼酸频哪酯为原料，经过与合成化合物D-1类似的反应，得到目标化合物，淡黄色固体，产率50.4％。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ11.47(s,1H),9.63(s,1H),8.31(t,J＝4.9Hz,1H),7.76(s,1H),7.62–7.57(d,2H),7.39(d,J＝7.6Hz,2H),7.35(s,1H),6.56(dd,J＝17.0,10.0Hz,1H),6.26(dd,J＝17.1,2.3Hz,1H),5.91(s,1H),5.77(dd,J＝10.0,2.0Hz,1H),4.32(d,J＝5.1Hz,2H),3.58(t,J＝4.7Hz,4H),3.49(s,2H),2.55(q,J＝7.8Hz,2H),2.36(t,J＝4.8Hz,4H),2.20(s,3H),2.13(s,3H),1.13(t,J＝1.9Hz,3H).ESI-MS m/z 551.2630(M+Na)⁺，计算值：551.2630。

实施例33 5-丙烯酰胺基N-((4-乙基-6-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-4-甲基-4'-(4-甲基哌嗪-1-基)-[1,1'-联苯]-3-甲酰胺(化合物D-6)的制备

以4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯硼酸频哪醇酯为原料，经过与合成化合物D-1类似的反应，得到目标化合物，产率64.7％。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.59(s,1H),8.29(t,J＝4.9Hz,1H),7.68(s,1H),7.48(d,J＝8.7Hz,2H),7.29(d,J＝2.0Hz,1H),7.00(d,J＝8.8Hz,2H),6.55(dd,J＝17.1,10.2Hz,1H),6.25(dd,J＝17.1,2.1Hz,1H),5.90(s,1H),5.76(dd,J＝10.1,2.1Hz,1H),4.31(d,J＝4.9Hz,2H),3.17(t,J＝4.2Hz,4H),2.55(q,J＝7.6Hz,2H),2.45(t,J＝5.1Hz,4H),2.22(s,3H),2.17(s,3H),2.12(s,3H),1.13(t,J＝7.6Hz,3H).ESI-MS m/z 550.2792(M+Na)⁺，计算值：550.2794。

实施例34 3-丙烯酰胺基N-((4-乙基-6-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-2-甲基-5-(6-(4-甲基哌嗪-1-基基)吡啶-3-基)苯甲酰胺(化合物D-7)的制备

以2-(4-甲基哌嗪-1-基)吡啶-5-硼酸嚬哪醇酯为原料，经过与合成化合物D-1类似的反应，得到目标化合物，产率52.6％。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.63(s,1H),8.39(d,J＝2.5Hz,1H),8.29(t,J＝5.1Hz,1H),7.80(dd,J＝8.9,2.6Hz,1H),7.68(s,1H),7.30(d,J＝1.9Hz,1H),6.90(d,J＝8.9Hz,1H),6.55(dd,J＝17.1,10.2Hz,1H),6.25(dd,J＝17.0,2.0Hz,1H),5.90(s,1H),5.76(dd,J＝10.2,2.0Hz,1H),4.31(d,J＝4.8Hz,2H),3.52(t,J＝5.0Hz,4H),2.55(q,J＝7.8Hz,2H),2.40(t,J＝5.1Hz,4H),2.22(s,3H),2.17(s,3H),2.12(s,3H),1.13(t,J＝7.6Hz,3H).ESI-MS m/z 551.2745(M+Na)⁺，计算值：551.2745。

实施例35 45-丙烯酰胺基N-((4-乙基-6-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-4-甲基-4'-(三氟甲氧基)-[1,1'-联苯]-3-甲酰胺(化合物D-8)的制备

以4-(三氟甲氧基)苯基硼酸频那醇酯为原料，经过与合成化合物D-1类似的反应，得到目标化合物，产率67.8％。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ11.47(s,1H),9.65(s,1H),8.32(t,J＝4.9Hz,1H),7.79(s,1H),7.76(d,J＝8.6Hz,2H),7.45(d,J＝8.3Hz,2H),7.37(d,J＝1.9Hz,1H),6.56(dd,J＝17.1,10.5Hz,1H),6.26(dd,J＝17.0,2.0Hz,1H),5.91(s,1H),5.78(dd,J＝10.2,2.0Hz,1H),4.32(d,J＝4.9Hz,2H),2.55(q,J＝7.6Hz,2H),2.21(s,3H),2.12(s,3H),1.13(t,J＝7.6Hz,3H).ESI-MS m/z 536.1769(M+Na)⁺，计算值：536.1773。

实施例36 3-丙烯酰胺-N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-5-甲基-1-(1-苯基乙基)-1H-吡唑-4-甲酰胺(化合物E-1)的制备

步骤1 3-氨基-5-甲基-1-(1-苯基乙基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯

将氢化钠(591mg，60％，14.78mmol)溶于10ml N,N-二甲基甲酰胺加入烧瓶中，原料3-氨基-5-甲基-1H-吡唑-4-羧酸乙酯(1000mg，5.91mmol)溶于20ml N,N-二甲基甲酰胺加入烧瓶中，混合溶液于40℃搅拌0.5h。冷却至室温后，加入原料1-溴乙基苯(1.09ml，7.15mmol),室温搅拌过夜。TLC检测反应完毕后，加入60ml冷水淬灭反应，乙酸乙酯萃取。无水硫酸钠干燥，过滤，柱层析得到目标化合物。白色固体，630mg。产率：39.0％。

步骤2 3-氨基-5-甲基-1-(1-苯基乙基)-1H-吡唑-4-羧酸

将3-氨基-5-甲基-1-(1-苯基乙基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯(630mg，2.30mmol)、氢氧化钠(277mg，6.90mmol)加入到甲醇/水混合溶液中(15ml/15ml)中，反应液在80℃下反应16h。TCL监测反应完全后，真空条件下浓缩反应液。加入水和乙酸乙酯萃取，调节pH至3～4，收集有机相。浓缩，真空干燥得目标化合物。淡黄色固体509mg，产率：90.1％。

步骤3 3-丙烯酰氨基-5-甲基-1-(1-苯基乙基)-1H-吡唑-4-羧酸

将3-氨基-5-甲基-1-(1-苯基乙基)-1H-吡唑-4-羧酸(200mg，0.81mmol)、碳酸钾(337.9mg，2.43mmol)加入到四氢呋喃中，0℃条件下滴加丙烯酰氯(132μL，1.62mmol)。反应液在室温条件下反应4h。TCL监测反应完全后，真空条件下浓缩反应液。加入水和乙酸乙酯萃取，调节pH至4～5，收集有机相。柱层析得目标化合物3-丙烯酰氨基-5-甲基-1-(1-苯基乙基)-1H-吡唑-4-羧酸。淡黄色固体90mg，产率：37.12％。

步骤4 3-丙烯酰胺-N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-5-甲基-1-(1-苯基乙基)-1H-吡唑-4-甲酰胺(化合物E-1)

将3-丙烯酰氨基-5-甲基-1-(1-苯基乙基)-1H-吡唑-4-羧酸(67mg，0.224mmol)、3-(氨基甲基)-4,6-二甲基吡啶-2(1H)-酮(68.13mg，0.448mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)(77.29mg，0.403mmol)、1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑(HOAT)(54.88mg，0.403mmol)、N-甲基吗啉(123μL，1.12mmol)加入10ml二甲基亚砜(DMSO)中，室温反应过夜。反应完毕后，将反应液倒入10ml水中，二氯甲烷萃取。收集有机相，柱层析得到目标化合物。淡黄色固体38mg，产率：39.1％。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ11.40(s,1H),10.10(s,1H),7.32(dd,J＝8.1,6.5Hz,2H),7.26(d,J＝7.2Hz,1H),7.22–7.15(m,3H),6.32(dd,J＝17.1,10.2Hz,1H),6.06(d,J＝17.0Hz,1H),5.80(s,1H),5.68–5.58(m,2H),4.15(d,J＝2.2Hz,2H),2.35(s,3H),2.09(d,J＝1.7Hz,6H),1.74(d,J＝6.9Hz,3H).ESI-MS m/z 434.21(M+H)⁺，计算值：434.21。

实施例37 3-丙烯酰胺-N-((4,6-二乙基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-5-甲基-1-(1-苯基乙基)-1H-吡唑-4-甲酰胺(化合物E-2)的制备

以3-(氨基甲基)-4,6-二乙基吡啶-2(1H)-酮为原料，经过与合成化合物E-1类似的反应，得到目标化合物。淡黄色固体，产率：43.2％。

¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ11.91(s,1H),9.77(s,1H),7.41(s,1H),7.31–7.25(m,2H),7.23(d,J＝7.2Hz,1H),7.18–7.13(m,2H),6.41–6.30(m,1H),5.96(s,1H),5.72–5.56(m,1H),5.41(q,J＝6.9Hz,1H),4.49–4.41(m,2H),2.68(q,J＝7.8Hz,2H),2.50(q,J＝7.6Hz,2H),2.33(s,3H),1.89(d,J＝7.1Hz,3H),1.20(q,J＝7.5Hz,6H).ESI-MS m/z484.2328(M+Na)⁺，计算值：484.2325。

实施例38 3-丙烯酰氨基-5-甲基-N-((1-甲基-3-氧代-2,3,5,6,7,8-六氢异喹啉-4-基)甲基)-1-(1-苯基乙基)-1H-吡唑-4-甲酰胺(化合物E-3)的制备

以4-(氨基甲基)-1-甲基-5,6,7,8-四氢异喹啉-3(2H)-酮为原料，经过与合成化合物E-1类似的反应，得到目标化合物。淡黄色固体，产率：36.7％。

¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ12.22(s,1H),11.25(s,1H),9.74(s,1H),7.28(d,J＝8.8Hz,3H),7.19(d,J＝7.5Hz,2H),6.39(s,1H),5.68(dd,J＝8.5,3.5Hz,1H),5.42(q,J＝7.0Hz,1H),4.49(d,J＝5.2Hz,2H),2.61(s,3H),2.42(t,J＝6.2Hz,4H),2.15(s,3H),1.89(d,J＝6.9Hz,3H),1.77–1.66(m,2H),1.61(d,J＝9.6Hz,2H).ESI-MS m/z496.2327(M+Na)⁺，计算值：496.2325。

实施例39 3-丙烯酰胺基N-((4-乙基-6-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-5-甲基-1-(1-苯基乙基)-1H-吡唑-4--甲酰胺(化合物E-4)的制备

以3-(氨基甲基)-4-乙基-6-甲基吡啶-2(1H)-酮为原料，经过与合成化合物E-1类似的反应，得到目标化合物。淡黄色固体，产率：40.2％。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ11.42(s,1H),10.09(s,1H),7.40(s,1H),7.35–7.30(m,2H),7.28–7.24(m,1H),7.21–7.17(m,2H),6.32(dd,J＝17.1,10.2Hz,1H),6.05(d,J＝17.2Hz,1H),5.84(s,1H),5.63(dd,J＝4.4,2.5Hz,1H),4.16(dd,J＝5.0,1.9Hz,2H),2.44(q,J＝7.6Hz,2H),2.35(s,3H),2.14–2.08(m,3H),1.74(d,J＝6.8Hz,3H),1.05(t,J＝7.6Hz,3H).ESI-MS m/z 470.2168(M+Na)⁺，计算值：470.2168。

实施例40 3-丙烯酰胺基-1-苄基-N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-5-甲基-1H-吡唑-4-甲酰胺(化合物F-1)的制备

以苄化溴为原料，经过与合成化合物E-1类似的反应，得到目标化合物。淡黄色固体，产率：40.2％。

¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ11.21(s,1H),10.11(s,1H),7.40(s,1H),7.27(d,J＝7.8Hz,3H),7.14–7.06(m,2H),6.38(s,2H),5.92(s,1H),5.73–5.67(m,1H),5.30(s,2H),4.46(d,J＝5.7Hz,2H),2.36(s,3H),2.34(s,3H),2.20(s,3H).ESI-MS m/z 442.1858(M+Na)⁺，计算值：442.1855。

实施例41 3-丙烯酰胺基-1-苄基-N-((4,6-二乙基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-5-甲基-1H-吡唑-4-甲酰胺(化合物F-2)的制备

以苄化溴、3-(氨基甲基)-4,6-二乙基吡啶-2(1H)-酮为原料，经过与合成化合物E-1类似的反应，得到目标化合物。淡黄色固体，产率：39.5％。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ11.42(s,1H),10.04(s,1H),7.44(s,1H),7.37–7.31(m,2H),7.30–7.27(m,1H),7.17–7.11(m,2H),6.31(dd,J＝17.3,10.0Hz,1H),6.05(d,J＝17.0Hz,1H),5.87(s,1H),5.64(dd,J＝10.2,1.9Hz,1H),5.26(s,2H),4.18(d,J＝5.1Hz,2H),2.46(q,J＝7.5Hz,2H),2.40(q,J＝6.2Hz,5H),1.13(t,J＝7.6Hz,3H),1.07(t,J＝7.6Hz,3H).ESI-MS m/z 470.2166(M+Na)⁺，计算值：470.2168。

实施例42 3-丙烯酰胺基-1-苄基-5-甲基-N-((1-甲基-3-氧代-2,3,5,6,7,8-六氢异喹啉-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-甲酰胺(化合物F-3)的制备

以苄化溴、4-(氨基甲基)-1-甲基-5,6,7,8-四氢异喹啉-3(2H)-酮为原料，经过与合成化合物E-1类似的反应，得到目标化合物。淡黄色固体，产率：48.4％。

¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ12.54(s,1H),10.21(s,1H),7.62(s,1H),7.36–7.19(m,3H),7.10(d,J＝7.2Hz,2H),6.47–6.32(m,1H),5.73–5.64(m,1H),5.29(s,2H),5.17–5.04(m,1H),4.49(d,J＝5.6Hz,2H),3.48(s,3H),2.42(s,4H),2.17(d,J＝3.7Hz,3H),1.73(d,J＝6.3Hz,4H).ESI-MS m/z 482.2168(M+Na)⁺，计算值：482.2168。

实施例43 3-丙烯酰胺-N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-1-(1-苯基乙基)-1H-吡唑-4-甲酰胺(化合物G-1)的制备

以3-氨基-1H-吡唑-4-羧酸乙酯为原料，经过与合成化合物E-1类似的反应，得到目标化合物。淡黄色固体，产率：56.7％。

¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ12.00(s,1H),10.23(s,1H),7.82(s,1H),7.57(t,J＝5.5Hz,1H),7.19(dd,J＝5.5,1.9Hz,3H),7.11(dd,J＝7.0,2.7Hz,2H),6.39(d,J＝16.4Hz,1H),5.90(s,1H),5.76–5.64(m,1H),5.40(d,J＝7.0Hz,1H),4.42(d,J＝5.4Hz,2H),2.30(s,3H),2.16(s,3H),1.69(d,J＝7.0Hz,3H).ESI-MS m/z 442.1851(M+Na)⁺，计算值：442.1855。

实施例44 3-丙烯酰胺-N-((4,6-二乙基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-1-(1-苯基乙基)-1H-吡唑-4-甲酰胺(化合物G-2)的制备

以3-氨基-1H-吡唑-4-羧酸乙酯、3-(氨基甲基)-4,6-二乙基吡啶-2(1H)-酮为原料，经过与合成化合物E-1类似的反应，得到目标化合物。淡黄色固体，产率：65.6％。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ11.45(s,1H),10.17(s,1H),8.37(s,1H),7.82(s,1H),7.34(ddd,J＝7.7,6.2,1.6Hz,2H),7.31–7.27(m,1H),7.26–7.21(m,2H),6.15(d,J＝17.0Hz,1H),5.90(s,1H),5.72(dd,J＝10.2,1.9Hz,1H),5.52(q,J＝7.0Hz,1H),4.22(d,J＝4.8Hz,2H),2.47(q,J＝7.6Hz,2H),2.41(q,J＝7.6Hz,2H),1.76(d,J＝7.1Hz,3H),1.13(t,J＝7.5Hz,3H),1.07(t,J＝7.6Hz,3H).ESI-MS m/z 470.2171(M+Na)⁺，计算值：470.2160。

实施例45 3-丙烯酰胺-N-((1-甲基-3-氧代-2,3,5,6,7,8-六氢异喹啉-4-基)甲基)-1-(1-苯基乙基)-1H-吡唑-4-甲酰胺(化合物G-3)的制备

以3-氨基-1H-吡唑-4-羧酸乙酯、4-(氨基甲基)-1-甲基-5,6,7,8-四氢异喹啉-3(2H)-酮为原料，经过与合成化合物E-1类似的反应，得到目标化合物。淡黄色固体，产率：55.3％。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ11.47(s,1H),10.17(s,1H),8.35(s,1H),7.71(s,1H),7.34(dd,J＝8.1,6.4Hz,2H),7.30–7.27(m,1H),7.26–7.22(m,2H),6.14(d,J＝16.9Hz,1H),5.72(dd,J＝10.2,1.9Hz,1H),5.52(d,J＝7.0Hz,1H),4.23(d,J＝4.3Hz,2H),2.65(d,J＝6.6Hz,2H),2.35(d,J＝6.2Hz,2H),2.10(s,3H),1.76(d,J＝7.1Hz,3H),1.61(t,J＝3.6Hz,4H).ESI-MS m/z 482.2170(M+Na)⁺，计算值：482.2168。

实施例46 3-丙烯酰胺基N-((4-乙基-6-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-1-(1-苯基乙基)-1H-吡唑-4-甲酰胺(化合物G-4)的制备

以3-氨基-1H-吡唑-4-羧酸乙酯、3-(氨基甲基)-4-乙基-6-甲基吡啶-2(1H)-酮为原料，经过与合成化合物E-1类似的反应，得到目标化合物。淡黄色固体，产率：63.2％。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ11.46(s,1H),10.16(s,1H),8.36(s,1H),7.80(s,1H),7.34(dd,J＝8.1,6.5Hz,2H),7.29(d,J＝6.9Hz,1H),7.26–7.21(m,2H),6.15(d,J＝16.9Hz,1H),5.88(s,1H),5.72(dd,J＝10.1,1.9Hz,1H),5.52(q,J＝7.0Hz,1H),4.22(d,J＝5.0Hz,2H),2.49–2.44(m,2H),2.12(s,3H),1.76(d,J＝7.0Hz,3H),1.06(t,J＝7.5Hz,3H).ESI-MS m/z456.2008(M+Na)⁺，计算值：456.2012。

实施例47 1-([1,1'-联苯]-4-基甲基)-3-丙烯酰胺基N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-5-甲基-1H-吡唑-4-甲酰胺(化合物H-1)的制备

以4-(溴甲基)-1,1'-联苯为原料，经过与合成化合物E-1类似的反应，得到目标化合物。淡黄色固体，产率：48.4％。

¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ10.11(s,1H),7.52(dd,J＝11.4,7.9Hz,4H),7.42(t,J＝7.5Hz,3H),7.34(d,J＝7.2Hz,1H),7.20(d,J＝7.9Hz,2H),6.40(s,1H),5.89(s,1H),5.77–5.64(m,1H),5.32(d,J＝19.2Hz,3H),4.46(d,J＝5.8Hz,2H),2.41(s,3H),2.34(s,3H),2.19(s,3H).ESI-MS m/z 518.2164(M+Na)⁺，计算值：518.2168。

实施例48 1-([1,1'-联苯]-4-基甲基)-3-丙烯酰胺基N-((4,6-二乙基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-5-甲基-1H-吡唑-4-甲酰胺(化合物H-2)的制备

以4-(溴甲基)-1,1'-联苯、、3-(氨基甲基)-4,6-二乙基吡啶-2(1H)-酮为原料，经过与合成化合物E-1类似的反应，得到目标化合物。淡黄色固体，产率：58.2％。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ11.42(s,1H),10.06(s,1H),7.63(d,J＝7.8Hz,4H),7.45(t,J＝7.5Hz,3H),7.36(t,J＝7.3Hz,1H),7.25(d,J＝8.0Hz,2H),6.32(dd,J＝17.1,10.3Hz,1H),6.06(d,J＝16.4Hz,1H),5.87(s,1H),5.65(dd,J＝10.3,1.9Hz,1H),5.31(s,2H),4.19(d,J＝5.1Hz,2H),2.46(d,J＝7.9Hz,2H),2.41(d,J＝15.9Hz,5H),1.13(t,J＝7.6Hz,3H),1.07(t,J＝7.5Hz,3H).ESI-MS m/z 546.2480(M+Na)⁺，计算值：546.2481。

实施例49 1-([1,1'-联苯]-4-基甲基)-3-丙烯酰胺基-5-甲基-N-((1-甲基-3-氧代-2,3,5,6,7,8-六氢异喹啉-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-甲酰胺(化合物H-3)的制备

以4-(溴甲基)-1,1'-联苯、4-(氨基甲基)-1-甲基-5,6,7,8-四氢异喹啉-3(2H)-酮为原料，经过与合成化合物E-1类似的反应，得到目标化合物。淡黄色固体，产率：49.8％。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ11.43(s,1H),10.06(s,1H),7.63(d,J＝7.9Hz,4H),7.45(t,J＝7.6Hz,2H),7.37(d,J＝7.4Hz,1H),7.34(s,1H),7.25(d,J＝8.0Hz,2H),6.30(dd,J＝17.0,10.3Hz,1H),6.03(d,J＝17.1Hz,1H),5.64(dd,J＝10.2,1.9Hz,1H),5.31(s,2H),4.19(d,J＝5.0Hz,2H),2.62(d,J＝6.2Hz,2H),2.43(s,3H),2.33(d,J＝6.3Hz,2H),2.08(s,3H),1.61(q,J＝4.0,3.4Hz,4H).ESI-MS m/z 558.2487(M+Na)⁺，计算值：558.2481。

实施例50 1-([1,1'-联苯]-4-基甲基)-3-丙烯酰胺基N-((4-乙基-6-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-5-甲基-1H-吡唑-4-甲酰胺(化合物H-4)的制备

以4-(溴甲基)-1,1'-联苯、3-(氨基甲基)-4-乙基-6-甲基吡啶-2(1H)-酮为原料，经过与合成化合物E-1类似的反应，得到目标化合物。淡黄色固体，产率：42.6％。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ11.43(s,1H),10.06(s,1H),7.63(d,J＝7.8Hz,4H),7.45(t,J＝7.5Hz,3H),7.36(t,J＝7.3Hz,1H),7.25(d,J＝8.0Hz,2H),6.32(dd,J＝17.2,10.2Hz,1H),6.06(d,J＝17.3Hz,1H),5.85(s,1H),5.65(dd,J＝10.2,1.9Hz,1H),5.31(s,2H),4.18(d,J＝5.1Hz,2H),2.46(m,2H),2.43(s,3H),2.11(s,3H),1.06(t,J＝7.5Hz,3H).ESI-MS m/z 532.2327(M+Na)⁺，计算值：532.2325。

实施例51 3-丙烯酰胺-N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-1-(1-(4-硝基苯基)乙基)-1H-吡唑-4-甲酰胺(化合物I-1)的制备

以1-(1-溴乙基)-4-硝基苯为原料，经过与合成化合物E-1类似的反应，得到目标化合物。淡黄色固体，产率：32.7％。

¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ11.29(s,1H),10.22(s,1H),8.04(d,J＝8.6Hz,2H),7.90(s,1H),7.59(s,1H),7.29(d,J＝8.7Hz,2H),6.40(d,J＝16.3Hz,1H),5.93(s,1H),5.79–5.73(m,1H),5.50(d,J＝7.2Hz,1H),4.41(d,J＝5.0Hz,2H),2.31(s,3H),2.20(s,3H),1.75(d,J＝7.1Hz,3H).ESI-MS m/z 465.1884(M+H)⁺，计算值：465.1886。

以下通过试验例证明本发明的有益效果。

试验例1本发明化合物抑制EZH2^WT体外酶活性及抑制淋巴瘤细胞SU-DHL-6的增殖

(1)本发明化合物抑制EZH2^WT酶活性：采用AlphaLISA筛选方法对化合物进行EZH2^WT酶活性测试。方法如下：分别取100μL不同浓度的化合物溶液加入到384孔检测板中，采用三倍稀释法，最高浓度为1000nM，最低浓度为1nM，每个药物浓度设置2个复孔。然后分别在各孔中加入5μL的EZH2酶溶液，1000rpm/min离心1min后孵育15min。再加入5μL底物(SAM：S-腺苷甲硫氨酸)，1000rpm/min分离心1min，室温孵育1h。孵育结束后加入5μL受体磁珠来终止酶反应，同样1000rpm/min离心1min，室温孵育1h，最后再避光条件下加入10μL供体磁珠，1000rpm/min离心1min，室温孵育30min，采用EnSpire的Alpha模式检测信号强度。计算化合物对EZH2酶活性的半数抑制浓度(IC₅₀)。

(2)本发明化合物抑制细胞增殖：淋巴瘤细胞株SU-DHL-6购自于美国标准生物品收藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)，RPMI 1640培养基，胎牛血清(FBS)均购买自美国GIBICO公司；青霉素和链霉素购自大连宝生物公司；培养细胞用平皿和96孔板等购买于Corning公司；各种规格的离心管购自BD公司；MTT试剂购自日本同仁化学研究所(Donjindo)。

淋巴瘤细胞株SU-DHL-6用含10％胎牛血清(FBS)、100IU/mL青霉素、100μg/ml链霉素的常规高糖RPMI1640或DMEM完全培养基培养于37℃、5％CO₂的培养箱中培养。本实验的目的是检测本发明化合物对淋巴瘤细胞株SU-DHL-6增殖影响。收集处于对数生长期的细胞，调整细胞浓度为1000～2000个/mL的单细胞悬液，按照每孔100uL接种于96孔板中。将化合物储备液(10mM/L溶于DMSO)用培养基稀释成不同浓度，采用三倍稀释法。按每孔100uL的体积加入96孔板中，最高浓度为50μM,最低浓度为0.08μM，每个药物浓度设置2个复孔，并用含0.1％DMSO培养基和纯培养基处理细胞作为阴性对照，置细胞培养箱中继续培养6天，采用MTT检测细胞线粒体琥珀酸脱氢酶活性，并计算新化合物对肿瘤细胞的半数有效抑制浓度(IC₅₀)值。

本发明化合物抑制EZH2^WT体外酶活性及抑制淋巴瘤细胞SU-DHL-6的增殖结果见下表1，其中，字母A表示IC₅₀值≤100nM；字母B表示100nM<IC₅₀值≤1000nM；字母C表示1μM<IC₅₀值≤10μM；字母D表示10μM<IC₅₀值≤50μM；字母E表示IC₅₀值>50μM。

表1本发明化合物对EZH2^WT体外酶活性及淋巴瘤细胞SU-DHL-6增殖的影响

从表1中可以看出，本发明中多数化合物在微摩尔浓度下能够有效抑制EZH2^WT体外酶活性，其中D-2、E-1的半数抑制浓度低于100nM，说明本发明化合物对EZH2有明显的抑制作用。

同时，表1数据显示本发明中化合物可有效抑制淋巴瘤增殖，其中，A-2、A-6、A-7、B-2、B-6、C-2、C-7、D-6、E-1等多个受试化合物对淋巴瘤细胞株SU-DHL-6增殖抑制活性较好，IC₅₀值为微摩尔水平。

试验例2本发明化合物的可逆类似物对EZH2^WT体外酶活性抑制作用明显弱于共价抑制剂

本发明中共价抑制剂的设计采用丙烯酰胺等基团为亲电弹头，与EZH2蛋白Cys663位富电子巯基发生迈克尔加成反应形成共价键。若将抑制剂对应位置的丙烯酰胺替换为丙烷酰胺，则抑制剂与Cys663位的巯基无法发生加成反应，其IC₅₀值会大大增加。据此，本发明设计合成了D-2、E-1的丙烷酰基可逆类似物D-2’、E-1’。采用AlphaLISA方法测试化合物对EZH2^WT酶活性抑制作用，结果见图1。

如图1所示，共价抑制剂D-2、E-1对EZH2^WT酶活性抑制作用明显强于其可逆类似物D-2’、E-1’。表明本发明中化合物的通过与EZH2蛋白发生共价作用是其具有较高抑制活性的关键。

试验例3延长EZH2蛋白与本发明化合物的作用时间，化合物对EZH2^WT酶活性抑制作用增强

由于共价抑制剂与靶蛋白形成共价键，一旦形成共价键，共价抑制剂将持续发挥作用，占据活性位点。随着孵育时间延长，越来越多的靶蛋白活性位点被共价抑制剂抑制，抑制剂的IC₅₀值将持续减小直至发挥最大活性。据此，本发明通过延长EZH2^WT蛋白与化合物的作用时间，检测不同孵育时间下化合物对EZH2^WT的抑制作用。

从图2可以看出，随着化合物与蛋白孵育时间从15分钟延长至120分钟，本发明化合物D-2、E-1对EZH2^WT的抑制作用明显增强。同时，其可逆类似物D-2’、E-1’及阳性化合物GSK126在不同作用时间下，抑制作用没有明显变化，且可逆类似物D-2’、E-1’的抑制活性明显弱于共价抑制剂D-2、E-1。

试验例4底物(SAM)竞争性实验表明本发明化合物共价结合EZH2蛋白

EZH2蛋白通过其SET结构域与SAM结合后，将SAM甲基转移到H3K27位点上，因此当小分子化合物占据EZH2的SET结构域时就可能达到抑制EZH2的酶活性的作用。本试验例采用本发明化合物与SAM竞争性结合EZH2实验来验证本发明化合物是否为共价抑制剂。若为可逆抑制剂，随着底物(SAM：S-腺苷甲硫氨酸)浓度的增加，化合物与底物竞争性结合占据劣势，其抑制作用降低。若为共价抑制剂，由于其与EZH2蛋白发生共价键结合，长期占据作用口袋，增加底物(SAM)浓度对化合物的抑制作用并不产生影响。

如图3所示，在化合物与EZH2蛋白作用时间较短(15min)时，化合物D-2、E-1与阳性对照GSK126类似，随着底物(SAM)浓度的增加，其抑制作用降低。随着孵育时间延长至120分钟，可以看到，化合物D-2、E-1对EZH2^WT的抑制作用没有发生明显变化，而其可逆类似物D-2’、E-1’及阳性化合物GSK126抑制作用仍降低明显。

试验例5本发明化合物可明显抑制细胞内组蛋白27位赖氨酸3甲基化水平

EZH2蛋白是PRC2的核心组成部分，起组蛋白甲基转移酶的作用，能使H3K27侧链上的ε氨基发生三甲基化。H3K27三甲基化被认为是在PcG沉默机制中起作用的主要存在形式。三甲化后的H3K27后能将PRC1复合物招募到特定基因位点，从而沉默与细胞分化、抑制增殖在内的基因，导致肿瘤的发生。因此，本发明考察了化合物D-2、E-1对细胞内的H3K27me3的表达水平的影响。

从图4可以看出，用10μM化合物D-2、E-1处理淋巴瘤细胞SU-DHL-61天、3天、5

天、7天，检测化合物不同作用时间对全细胞萃取物的H3K27me3水平的影响。可以看出，从第3天后开始，细胞内的H3K27me3水平开始被抑制。从第5天开始，细胞内的H3K27me3的表达受到显著抑制，并随着作用时间的增长抑制作用越来越明显作用

考察不同浓度的化合物D-2、E-1处理6天后，细胞内H3K27me3表达情况。结果显示，5μM开始可以明显抑制H3K27me3的表达，并呈现浓度依赖性。

试验例6本发明化合物在药物被洗脱后仍可抑制细胞内组蛋白27位赖氨酸3甲基化水平

由于共价抑制剂与细胞内的EZH2蛋白发生共价作用，从而长期占据结合口袋，达到持久抑制EZH2三甲基化的功能。故在化合物与细胞一定时间后，将含有药物的培养基换成普通培养基，由于共价抑制剂已经结合了EZH2蛋白，在洗脱后的一段时间内仍可抑制EZH2的功能。而可逆抑制剂被洗脱掉，无法达到持续抑制。

由图5可以看出，用不同浓度的化合物D-2、E-1处理淋巴瘤细胞SU-DHL-66天后，换掉含有化合物的培养基。在洗脱后的48小时内，细胞内的H3K27me3水平仍然受到抑制。而D-2、E-1的可逆类似物D-2’、E-1’无论有没有被洗脱，都无法抑制SU-DHL-6细胞内的H3K27me3水平。表明本发明化合物D-2、E-1与EZH2发生共价结合，可持续抑制EZH2的功能。

Claims

1.式Ⅰ所示的化合物或其药学上可接受的盐：

其中，当R₂与R₃不成环时，R₁、R₃独立地选自C1～C6烷基，R₂选自H；当R₂与R₃成环时，R₁选自C1～C6烷基，R₂与R₃相连形成

R₄选自

其中，R₈选自

R₉选自H或C1～C6烷基；R₁₀选自H或C1～C6烷基；R₁₁选自

其中，R₁₉～R₂₃独立地选自H、C1～C6烷基、硝基或苯基。

2.如权利要求1所述的化合物，其特征是：当R₂与R₃不成环时，R₁、R₃独立地选自甲基或乙基，R₂选自H；当R₂与R₃成环时，R₁选自甲基或乙基，R₂与R₃相连形成

3.如权利要求1所述的化合物，其特征是：R₉、R₁₀独立地选自H或C1～C3烷基。

4.如权利要求3所述的化合物，其特征是：R₉、R₁₀独立地选自H或甲基。

5.如权利要求1所述的化合物，其特征是：R₁₁选自

其中，R₁₉、R₂₀、R₂₁、R₂₃独立地选自H或C1～C3烷基，R₂₂选自H、C1～C3烷基、硝基或苯环。

6.如权利要求5所述的化合物，其特征是：R₁₁选自

其中，R₁₉、R₂₀、R₂₁、R₂₃选自H，R₂₂选自H、硝基或苯环。

7.如权利要求1～6任一项所述的化合物，其特征是：

8.权利要求1～7任一项所述化合物的制备方法，其特征是：

合成路线如下：

步骤2：将中间体K在碱的醇水溶液中水解得到中间体L；

步骤3：中间体L和丙烯酰氯在碱性条件下反应得到中间体M；

步骤4：利用偶联剂将化合物D偶联至中间体M上，制备得到化合物O；

其中，R₁～R₃、R₈～R₁₁选自权利要求1～7任一项所述化合物中的对应基团。

9.药物组合物，其特征是：它是以权利要求1～7任意一项所述化合物或其药学上可接受的盐为活性成分，加入药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。

10.权利要求1～7任意一项所述化合物或其药学上可接受的盐、权利要求9所述药物组合物在制备抗肿瘤药物或自身免疫疾病药物中的用途。

11.如权利要求10所述的用途，其特征是：所述肿瘤为脑癌、成胶质细胞瘤、白血病、淋巴瘤、Bannayan-Zonana综合征、考登病、Lhermitte-Duclos病、乳腺癌、炎性乳腺癌、维尔姆斯瘤、尤因肉瘤、横纹肌肉瘤、室管膜瘤、成神经管细胞瘤、结肠癌、胃癌、膀肤癌、头颈癌、肾癌、肺癌、肝癌、黑素瘤、肾脏癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肉瘤、骨肉瘤、骨巨细胞瘤或甲状腺癌；所述自身免疫性疾病为银屑病或红斑狼疮。