CN112336727A - 一种化合物在制备治疗脓毒症结肠损伤药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药技术领域，特别涉及TRPV4抑制剂HC067047在制备治疗脓毒症结肠损伤药物中的应用。实验表明，在革兰氏阴性细菌脂多糖（LPS）诱导的脓毒症小鼠结肠损伤模型中，TRPV4抑制剂HC067047可有效地抑制LPS诱导的脓毒症小鼠结肠黏膜层破损，炎症因子IL6、TNFα和IL18水平的上调，NLRP3炎性复合小体的释放，以及细胞焦亡关键基因GSDMD、Aim2的高表达。结果显示，TRPV4抑制剂HC067047可通过抑制结肠组织细胞焦亡，从而有效缓解脓毒症小鼠结肠损伤，可用于制备治疗脓毒症结肠损伤的药物制剂。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，特别涉及一种治疗脓毒症结肠损伤的药物，所述药物中包括TRPV4抑制剂HC067047。
背景技术
脓毒症是一类感染引起的严重危急重症，可诱发多组织器官的功能障碍，是重症ICU致死率较高的一类疾病。肠道是人体最大的细菌仓库，被认为是脓毒症诱发多器官衰竭的始动器官。肠道屏障完整性破坏后，会释放大量细菌及其内毒素进入内循环系统，导致促炎因子大量释放，多器官产生炎症风暴直至衰竭。脓毒症结肠损伤是影响患者生存率的关键因素之一。因此，如何有效防止脓毒症结肠损伤，这一问题值得深入探讨。
TRPV4属于瞬时受体电位通道香草素亚家族(TRPV)成员，是一种非选择性钙离子通道。它广泛分布在肺、大脑、心脏等组织，还包括结肠部位。作为一种特殊的细胞“感受器”，TRPV4在肺血管病变、脑缺血再灌注损伤、心肌缺血再灌注损伤等疾病中扮演重要角色。
HC067047是一种特异性TRPV4抑制剂，分子量为471.51，化学式为C26H28F3N3O2，CAS号为883031-03-6，其结构如下所示。
目前，关于HC067047在治疗脓毒症结肠损伤方面的应用未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种治疗脓毒症结肠损伤的药物，所述药物中包括TRPV4抑制剂HC067047。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
一种化合物在制备治疗脓毒症结肠损伤药物中的应用，所述化合物为TRPV4抑制剂HC067047；所述HC067047的结构式如下所示：
作为优选，所述治疗脓毒症结肠损伤药物还包括药学上可接受的辅料。
作为优选，所述药学上可接受的辅料选自填充剂、粘合剂、崩解剂、增溶剂、溶剂中的一种或几种。
作为优选，所述治疗脓毒症结肠损伤药物的剂型为注射型。
作为优选，所述注射给药的输注方式为腹膜内输注。
作为优选，所述治疗脓毒症结肠损伤药物可有效抑制结肠组织炎症因子IL6、TNFα、IL18和NLRP3炎性复合小体的释放。
作为优选，NLRP3炎性复合小体为NLRP3、Caspase 1、ASC中的一种或几种。
作为优选，所述治疗脓毒症结肠损伤药物可有效抑制结肠组织中细胞焦亡关键基因GSDMD、Aim2的高表达。
本发明观察TRPV4抑制剂HC067047对LPS诱导的脓毒症小鼠结肠损伤的影响，发现HC067047具有明显的结肠保护作用，并有效抑制炎症因子IL6、TNFα、IL18和NLRP3炎性复合小体的释放，以及细胞焦亡关键基因GSDMD、Aim2的高表达现象。
与现有技术相比，本发明的创新性为：
本发明第一次公开了TRPV4抑制剂HC067047可通过抑制炎症因子IL6、TNFα、IL18和NLRP3炎性复合小体的释放，以及细胞焦亡关键基因GSDMD、Aim2的高表达，从而有效防止脓毒症结肠损伤的发生，为脓毒症结肠损伤的治疗提供了新的可能性。
附图说明
图1为HE染色显示TRPV4抑制剂HC067047对脓毒症小鼠结肠的影响。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
本实验入选动物为8-9周C57BL/6雄性小鼠，体重22-25克，购自湖南斯莱克景达，许可证号：SCXK(湘)2019-0004，小鼠放至人工昼夜12小时循环照明环境中饲养，自由摄食摄水。C57BL/6雄性小鼠被随机分为生理盐水对照组(6只)、LPS造模组(6只)、LPS+HC067047给药组(6只)，生理盐水对照组小鼠只腹腔注射生理盐水，LPS造模组小鼠先腹腔注射生理盐水(10mg/kg)，1h后腹腔注射LPS(10mg/kg)；LPS+HC067047给药组先腹腔注射HC067047药物(10mg/kg)，1h后腹腔注射LPS(10mg/kg)；继续饲养1天后，使用4％水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，麻醉完全后取结肠，置于4％多聚甲醛中固定24h，用于HE染色。
结肠HE染色步骤：
(1)结肠组织按照以下程序脱水
30％乙醇(1h)-50％乙醇(1h)-70％乙醇(1h)-80％乙醇(1h)-90％乙醇(1h)-95％乙醇(1h)-100％乙醇(1h)-100％乙醇(1h)
(2)结肠组织按照以下程序透明化
无水乙醇/二甲苯(1:1,1h)-二甲苯(1h)-二甲苯(1h)
(3)结肠组织按照以下程序浸蜡
石蜡/二甲苯(1:1,0.5h)-石蜡(0.5h)-石蜡(0.5h)
(4)结肠组织按照以下程序包埋
将包埋用金属模块、镊子置于金属浴(65℃)上预热，迅速将石蜡液倒入包埋用金属模块中，覆盖模块底部，用预热镊子将浸蜡好的组织夹到模块底部，切面朝上，轻轻将模块水平置于冰盒上，待蜡块冷却凝固后，常温保存。
(5)结肠石蜡块切片
使用石蜡切片机将石蜡块切成5μm厚度的石蜡片。
(6)石蜡片按以下程序脱蜡水化
二甲苯(0.5h)-二甲苯(0.5h)-100％乙醇(1min)-100％乙醇(1min)-90％乙醇(1min)-80％乙醇(1min)-70％乙醇(1min)-蒸馏水(1min)
(7)石蜡片苏木素-伊红染色
将切片置于苏木素染液中浸泡5min后，1％盐酸酒精分化返蓝15sec，自来水冲洗15min。将切片浸泡在伊红染液中2min，在蒸馏水中放2sec。
(8)石蜡片脱水按照以下程序透明
70％乙醇(10sec)-80％乙醇(10sec)-90％乙醇(1min)-100％乙醇(1min)-100％乙醇(1min)-二甲苯(1min)-二甲苯(2min)
(9)石蜡片晾干后，滴加中性树脂，盖上盖玻片，显微镜下拍照。
实验结果见图1所示。
实验结果显示：LPS诱导的脓毒症小鼠结肠黏膜层出现明显损伤现象，例如：杯状细胞减少、腺体萎缩、炎性细胞浸润等。而TRPV4抑制剂HC067047可明显减少LPS诱导的脓毒症小鼠结肠损伤。
实施例2
实验动物来源、饲养条件以及给药处理过程均参照实施例1。在麻醉小鼠后，取结肠组织保存于-80℃，用于荧光定量PCR检测。
肠道组织荧光定量PCR步骤：
(1)RNA提取及逆转录：Trizol裂解液匀浆结肠组织，加入氯仿萃取得到上层水相，加入异丙醇混匀。离心析出RNA沉淀，加入75％乙醇清洗2次后，自然晾干后加入DEPC水溶解RNA；按照逆转录试剂盒(Thermo，货号：K1621)说明书将RNA逆转录成cDNA。
(2)RT-PCR：10μl反应体系：TB反应液5μl，ROX染料0.2μl，上下游引物(10μM)各0.4μl；cDNA 1μl；去酶水3μl。
步骤1：95℃，5min
步骤2：95℃，15s；60℃，15s；72℃，45s，40个循环
步骤3：GAPDH作为内参基因，通过2-ΔΔCT计算目标基因的相对表达量。
所采用Q-PCR引物及序列如下表1所示：
表1 Q-PCR引物及序列
实验结果见表2-4。
表2.HC067047对脓毒症小鼠结肠炎症因子基因表达水平的影响
**P﹤0.01，***P﹤0.001vs对照组；#P﹤0.05，##P﹤0.01vs LPS组。采用One-way ANOVA法进行统计分析。
表2实验结果显示：LPS诱导的脓毒症小鼠结肠组织中炎症因子IL6基因水平(5.09±1.083vs 0.97±0.154)与TNFα的基因水平(5.59±1.045vs 1.01±0.099)相比对照组上升5倍，炎症因子IL18的基因水平(1.52±0.099vs 1.00±0.102)上升了0.5倍.
表3.HC067047对脓毒症小鼠结肠NLRP3炎性复合小体基因表达水平的影响
*P﹤0.05，**P﹤0.01vs对照组；#P﹤0.05，###P﹤0.001vs LPS组。采用One-way ANOVA法进行统计分析。
表3实验结果显示：LPS诱导的脓毒症小鼠结肠组织中炎性复合小体组成成员NLRP3(5.09±1.083vs 1.03±0.085)、Caspase1(1.37±0.073vs 1.00±0.066)以及ASC的基因水平(1.35±0.089vs 1.00±0.040)明显高于对照组.
表4.HC067047对脓毒症小鼠结肠焦亡关键基因表达水平的影响
*P﹤0.05，***P﹤0.001vs对照组；#P﹤0.05，##P﹤0.01vs LPS组。采用One-way ANOVA法进行统计分析。
表4实验结果显示：LPS诱导的脓毒症小鼠结肠中细胞焦亡关键基因GSDMD(1.74±0.118vs 1.00±0.085)、Aim2(1.45±0.108vs 1.00±0.107)的表达水平明显高于对照组。
综上，TRPV4抑制剂HC067047可以有效抑制脓毒症小鼠结肠组织炎症因子IL6(2.08±0.379vs 5.09±1.083)、TNFα(2.26±0.145vs 5.59±1.045)、IL18(0.99±0.177vs 1.52±0.099)和炎性复合小体NLRP3(1.52±0.332vs 5.09±1.083)、Caspase1(0.79±0.076vs 1.37±0.073)、ASC(0.95±0.134vs 1.35±0.089)的表达；HC067047可明显抑制LPS诱导的脓毒症小鼠结肠中细胞焦亡关键基因GSDMD(1.21±0.153vs 1.74±0.118)、Aim2(0.83±0.086vs 1.45±0.108)的高表达现象。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
SEQUENCE LISTING
<110> 南华大学附属第一医院
<120> 一种化合物在制备治疗脓毒症结肠损伤药物中的应用
<130> 1
<160> 18
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
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tcacaagacc aggcatattc tt 22
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ctcccaacag acctgtctat ac 22
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ggggactggg atacagcctt 20
Claims (8)
1.一种化合物在制备治疗脓毒症结肠损伤药物中的应用，其特征在于，所述化合物为TRPV4抑制剂HC067047；所述HC067047的结构式如下所示：
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述治疗脓毒症结肠损伤药物还包括药学上可接受的辅料。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药学上可接受的辅料选自填充剂、粘合剂、崩解剂、增溶剂、溶剂中的一种或几种。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述治疗脓毒症结肠损伤药物的剂型为注射型。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述注射给药的输注方式为腹膜内输注。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述治疗脓毒症结肠损伤药物可有效抑制结肠组织炎症因子IL6、TNFα、IL18和NLRP3炎性复合小体的释放。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，NLRP3炎性复合小体为NLRP3、Caspase 1、ASC中的一种或几种。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述治疗脓毒症结肠损伤药物可有效抑制结肠组织中细胞焦亡关键基因GSDMD、Aim2的高表达。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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