CN112300289A

CN112300289A - RGD4C融合抗TNFα纳米抗体蛋白、制备方法及其应用

Info

Publication number: CN112300289A
Application number: CN201911398091.8A
Authority: CN
Inventors: 纪雪梅; 刘煜; 韩田振
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2019-12-30
Filing date: 2019-12-30
Publication date: 2021-02-02
Anticipated expiration: 2039-12-30
Also published as: CN112300289B

Abstract

本发明涉及生物医药领域，具体公开了一种RGD4C融合抗TNFα纳米抗体的设计，表达及抗肿瘤活性研究。本发明公开了一种RGD4C融合的抗TNFα纳米抗体蛋白，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；该RGD4C融合抗TNFα纳米抗体蛋白的构建表达及抗肿瘤研究包括以下内容：设计三种不同构型RGD4C融合的TNFα纳米抗体；酵母表达载体构建；酵母表达系统诱导蛋白表达；目的蛋白进行镊柱纯化；融合蛋白体外抗MDA‑MB‑231肿瘤的增殖、转移作用研究；MDA‑MB‑231荷瘤裸鼠体内进行给药后评价肿瘤增殖、转移及EMT转化作用。研究确定本发明V‑L‑R‑H构型的RGD4C融合抗TNFα纳米抗体，具有体内外抑制MDA‑MB‑231肿瘤细胞增殖、转移的作用，未来可进一步开发应用于乳腺癌的临床治疗中。

Description

RGD4C融合抗TNFα纳米抗体蛋白、制备方法及其应用

技术领域

本发明属于融合纳米抗体蛋白，具体涉及一种RGD4C融合抗TNFα纳米抗体(RGD4C-anti-TNFα-Nanobody)、制备方法及其在抗三阴性乳腺癌中的应用。

背景技术

乳腺癌是女性常见的癌症之一，约占女性所患癌症的30％左右。其中雌激素受体、孕激素受体和人类表皮生长因子受体-2表达均低于1％的乳腺癌类型即三阴性乳腺癌(Triple negative breast cancer,TNBC)占所有乳腺癌的15-20％，具有更强的增殖侵袭性和更差的临床预后。手术切除治疗、放疗、化疗是目前TNBC治疗的常用手段。但手术治疗极难切除干净，放疗具有极大的机体损伤，化疗易产生药物抵抗和剂量耐受，且预后都易复发^[1]。

TNFα最初被发现是因为其诱导实验性肿瘤快速出血坏死的能力，是一种主要的炎性细胞因子。1987年Leibovich在《Nature》发表文章证明低剂量的TNFα可促进肿瘤的增殖^[2]。它的结构是一种Ⅱ型跨膜蛋白，羧基端在胞外，氨基端在胞质内。TNFα存在跨膜型和游离型两种形式，跨膜型TNFα被切割后胞外端以游离态TNFα的形式存在。TNFα也存在TNFR1和TNFR2两种受体，两种受体发挥着不同的生理学作用。TNFα可激活不同的细胞反应通路，即细胞的存活与增殖、促炎基因的转录和细胞死亡。TNFR1结合TNFα后可以激活Ras/Raf/MEK1/ERK1,2以及PI3K/AKT信号通路促进细胞存活和增殖。TNFR2具有核转录因子NF-κB激活功能，可介导内皮/上皮酪氨酸激酶激活VEGFR2，促进血管生成和AKT的激活^[3-4]。研究表明，低浓度的TNFα发挥着促进肿瘤增殖和转移的作用，抗TNFα抗体可以体内抑制乳腺癌细胞的增殖和转移^[5]。在骆驼和鲨鱼体内存在一种特殊的抗体，抗体结构天然缺失轻链，克隆并表达重链可变区基因获得抗体片段，直径仅为几纳米，被称为纳米抗体Nanobody，简写为VHH(Variable region of heavy chain of heavy antibody)。该类型抗体具有高亲和活性，高稳定性，高表达量等特点，在肿瘤治疗和诊断中表现出优良的应用潜力^[6-7]。已有研究表明TNFα纳米抗体可以在体内外抑制乳腺癌细胞的增殖与转移^[8]。

整合素受体在静息的内皮细胞(Endothelial cell,EC)和其他正常组织中低表达而在多种肿瘤细胞表面高表达。它属于细胞粘附受体家族，为一种跨膜异二聚体，发挥着细胞外基质与细胞内骨架相互连接的作用。每种整合素都各由一个α和β亚基通过非共价键连接构成，18种α亚基和9种β亚基共形成24个整合素异二聚体。整合素αvβ3是整合素家族中最重要的成员之一，由一个αv(CD51)亚基和一个β3(CD61)亚基组成，又称玻连蛋白(Vitronectin,VN)受体。含有精氨酸-甘氨酸-天冬酰胺(RGD)基序的多肽和蛋白能够特异性结合整合素αvβ3受体，RGD是整合素αvβ3受体结合的最小识别单位。整合素αvβ3参与细胞与细胞间或者细胞与ECM间的“inside-out”和“outside-in”两种过程的“cross-talk”作用^[9]。通过这些信号传导，整合素αvβ3参与肿瘤细胞的存活、增殖和转移等过程^[10]。

利用RGD对整合素αvβ3特异性结合活性，已有大量研究针对肿瘤的靶向治疗和靶向诊断。此外，RGD肽本身也具有直接杀伤肿瘤细胞和诱导肿瘤细胞凋亡的作用。RGD4C即CDCRGDCFC是RGD多肽家族的一种，可高效结合哺乳动物细胞表面的多种整合素^[11]。

目前乳腺癌，特别是三阴性乳腺癌仍缺乏更有效的治疗手段，提示了亟需提供一种更加有效的治疗手段。

参考文献

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[3]Blonska M,Shambharkar P B,Kobayashi M,et al.TAK1 is recruited tothe tumor necrosis factor-alpha(TNF-alpha)receptor 1complex in a receptor-interacting protein(RIP)-dependent manner and cooperates with MEKK3 leadingto NF-kappaB activation[J].The Journal of biological chemistry,2005,280(52):43056-63.

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发明内容

本发明的目的在于提供一种RGD融合抗TNFα纳米抗体及其制备方法，并研究其在抗乳腺癌肿瘤活性中的应用，可以为进一步开发乳腺癌，特别是三阴性乳腺癌的临床治疗药物奠定基础。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

本发明的第一个目的是提供一种RGD4C融合TNFα纳米抗体，所述RGD融合TNFα纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。构型为N端-VHH-Linker-RGD4C-6HIS-C端，Linker为(G₄S)₂。

本发明的第二个目的是提供编码上述RGD4C融合TNFα纳米抗体的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

本发明的第三个目的是提供一种表达载体，所述表达载体包含SEQ ID NO.5所示编码RGD4C融合TNFα纳米抗体的基因。

进一步的，所述表达载体是将SEQ ID NO.5所示编码RGD4C融合TNFα纳米抗体的基因克隆到pPICZαA空载质粒中所得。

具体的，所述表达载体是PCR法扩增出SEQ ID NO.5所示RGD4C融合TNFα纳米抗体基因，将扩增出的基因片段和质粒载体pPICZαA用XhoI、XbaI内切酶于37℃双酶切，琼脂糖凝胶电泳后切胶回收目的产物，16℃连接。

PCR扩增所用引物为：

上游引物P1：5’-gaagaaggggtatctctcgagaaaagagaggctcaggtgcagctggtggagtc-3’(SEQ ID No.7)；

下游引物P4：5’-agatgagtttttgttctagatcaatgatgatgatgatgatggcagaagcaatctccgc-3’(SEQ ID No.10)

本发明的第四个目的是提供一种重组细胞，所述重组细胞包含上述表达载体。

进一步的，所述重组细胞以酵母菌GS115为宿主细胞。

本发明的第五个目的是提供一种RGD4C融合TNFα纳米抗体的制备方法，所述方法包括以下步骤：制备上述的表达载体，用所述表达载体转化宿主细胞，培养转化体，从培养物中分离得到所述RGD4C融合TNFα纳米抗体。

进一步的，上述RGD4C融合TNFα纳米抗体的制备方法的具体步骤为：将SEQ IDNO.5所示编码RGD4C融合TNFα纳米抗体的基因进行PCR扩增，扩增产物经XhoI和XbaI内切酶于37℃双酶切，与经相同酶切的pPICZαA空载质粒16℃连接，得到表达载体，将该表达载体转化酵母菌GS115，培养转化体，经甲醇诱导表达，从培养物中分离纯化，获得RGD4C融合TNFα纳米抗体；

优选的，用于PCR扩增上述编码RGD4C融合TNFα纳米抗体的基因的特异性引物为：

下游引物P4：5’-agatgagtttttgttctagatcaatgatgatgatgatgatggcagaagcaatctccgc-3’(SEQ ID No.10)。

本发明的第六个目的是提供上述RGD4C融合TNFα纳米抗体在制备预防或治疗乳腺癌的药物中的应用。

进一步的，所述乳腺癌为三阴性乳腺癌。

本发明技术方案所实现的有益效果为：

本发明首次将纳米抗体与αvβ3受体靶向性多肽RGD4C相融合，以发挥TNFα纳米抗体和RGD4C对三阴性乳腺癌治疗的协同作用，同时提高TNFα纳米抗体的肿瘤靶向性(肿瘤部位TNFα为低浓度)。由于VHH的抗原结合活性主要决定于CDR3区形成的凸型结构，RGD4C的受体结合能力依赖于其五元环的稳定性，两种多肽以不同方式结合，会产生不同的空间构型，从而影响两者与抗原或受体的结合能力。利用基因工程技术，构建并表达三种不同构型的RGD4C融合TNFα纳米抗体蛋白。

经L929细胞毒性实验，MDA-MB-231细胞黏附、增殖、迁移实验对三种融合蛋白进行活性比较，确定了核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示、氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示的N端-VHH-Linker-RGD4C-6HIS-C端(以下简写为V-L-R-H构型)具有高TNFα和αvβ3的抗原/受体结合活性，该融合纳米抗体蛋白可通过抑制PI3K/AKT/ERK/NF-κB和FAK信号通路协同抑制MDA-MB-231细胞的转移。体内实验也表明该融合纳米蛋白具有抑制MDA-MB-231增殖与转移的能力。该融合纳米抗体具有进一步开发为乳腺癌临床药物的潜能。

附图说明

图1三种构型重组质粒构建及鉴定。

图A，显示Anti-TNFα-VHH(1-3泳道)和RGD4C基因(4-6泳道)分别在400bp和100bp位置出现条带，与预计的目的条带大小396bp和97bp相一致。

图B，Overlap方法将VHH和RGD4两段序列连接起来进行扩增，结果显示在500bp处出现条带，与预计的大小493bp一致。

图C，酵母菌液PCR验证重组质粒电转化酵母细胞基因(1-6泳道)。结果显示在1000bp处有条带，其中包括589bp的载体序列和493bp的目的基因条带。

图2三种构型融合蛋白纯化效果SDS-PAGE电泳图。

图A、图B、图C分别为V-L-R-H、R-L-H-V和V-H-L-R，

M为Marker，1-5泳道分别是菌液上清、透析后上清、流穿液、50mM、100mM咪唑洗脱液；图B中6泳道为200mM咪唑洗脱液。

图3融合蛋白对TNFα细胞毒性的抑制作用。

图4融合蛋白对细胞粘附作用。

A为细胞粘附染色，B为0.5μM时细胞粘附定量结果。

图5三种融合蛋白抑制细胞的增殖作用。

图6融合蛋白抑制细胞的迁移。

图A为0h和24h的划痕对比图，

图B为图A中不同蛋白迁移抑制率的量化结果图，图B以对照组0h时为100％抑制迁移率和24h时为0％迁移抑制率计算得出。

图7Wesrern blotting检测不同蛋白处理后PI3K-AKT信号通路及FAK信号通路蛋白表达量变化。

图A为western blotting结果图；图B为量化结果。

图8不同组别处理后对瘤重、瘤体积、体重和肺转移的作用。

图A为给药两周肿瘤拍照，图B为不同时间瘤体积变化折线图，图C为瘤块重量，图D为肺转移肿瘤结节数。

图9不同组别治疗期间荷瘤小鼠体重变化。

图10不同组别肿瘤组织TNFα含量。

图A为生理盐水组、VHH组和V-L-R-H组的免疫组化图。图B为图A中染色的平均积分光密度量化结果图。

图11不同组别肿瘤组织HE染色。

图12不同组别肿瘤CD31表达。

图A为生理盐水组、VHH组和V-L-R-H组的免疫组化图。图B为量化结果图。

图13不同组别肿瘤Ki67表达。

图14不同组别肿瘤组织HIF-1α表达。

图15不同组别肿瘤组织EMT特征蛋白表达。

具体实施方式

实施例1三种构型抗TNFα纳米抗体/RGD4C融合蛋白重组质粒构建

(1)三种构型重组蛋白设计

根据Anti-TNFα-Nb(VHH)、6HIS标签、(G₄S)₂和RGD4C各结构与功能关系，设计三种RGD4C-anti-TNFα-Nb融合蛋白。Linker为(G₄S)₂。

三种构型连接方式分别为：

1)N端-VHH-Linker-RGD4C-6HIS-C端(简写为V-L-R-H，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示)；

2)N端-VHH-6HIS-Linker-RGD4C-C端(简写为V-H-L-R，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)；

3)N端-RGD4C-Linker-6HIS-VHH-C端(简写为R-L-H-V，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示)。

(2)三种融合蛋白基因扩增

将6HIS和(G₄S)₂的基因片段分别设计入引物中，在PCR扩增时连接在重组基因片段上。三种构型重组基因中的VHH和RGD4C分别用相应的上下游引物扩增，P1、P2扩增VHH，P3、P4扩增RGD4C。

P1、P2、P3、P4引物序列如下：

P1：5’-gaagaaggggtatctctcgagaaaagagaggctcaggtgcagctggtggagtc-3’(SEQ IDNO.7)

P2：5’-cgctaccgccgcctccagaggagacggtgacttgggt-3’(SEQ ID NO.8)

P3：5’-acccaagtcaccgtctcctctggaggcggcggtagcg-3’(SEQ ID NO.9)

P4：5’-agatgagtttttgttctagatcaatgatgatgatgatgatggcagaagcaatctccgc-3’(SEQ ID NO.10)

1)VHH的扩增。反应体系如表1-1；扩增反应条件如表1-2。

表1-1 VHH扩增反应体系

表1-2 VHH扩增反应条件

2)RGD4C扩增。反应体系如表1-3；扩增反应条件如表1-4。

表1-3 RGD4C扩增反应体系

表1-4 RGD4C扩增反应条件

PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳验证及胶回收。将三种构型重组基因的VHH和RGD4C扩增片段分别进行琼脂糖凝胶电泳验证，扩增体系50μL全部上样，与DNAladder作比较验证出现的条带分子量，将目标条带的琼脂糖凝胶回收，图1A显示Anti-TNFα-VHH和RGD4C基因分别在400bp和100bp位置出现条带，与预计的目的条带大小396bp和97bp相一致。。

(3)pPICZα-RGD4C-anti-TNFα-VHH载体构建

1)通过Overlap PCR将VHH与RGD4C连接。

将VHH和RGD4基因利用上下游引物通过Overlap PCR扩增连接；P1(SEQ ID NO.7)、P4(SEQ ID NO.10)分别为相应上下游引物。扩增反应体系相同，如表1-5；扩增反应条件相同，如1-6。

表1-5 Overlap PCR扩增反应体系

表1-6 Overlap PCR扩增反应条件

对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳及凝胶回收，图1B显示在500bp处出现条带，与预计的大小493bp一致。

2)分别酶切pPICZαA空载质粒和重组基因。

将pPICZαA空载质粒和三种构型重组基因分别用XhoI和XbaI双酶切。酶切体系如表1-7。酶切条件为37℃，5h。

表1-7双酶切体系

3)酶连pPICZαA空载质粒和重组基因。

将pPICZαA空载质粒分别与三种构型重组基因用T4 DNA连接酶进行酶连。酶连反应体系如表1-8；反应条件如表1-9。

表1-8酶连反应体系

表1-9酶连反应条件

实施例2三种构型抗TNFα纳米抗体/RGD4C融合蛋白表达

1.RGD4C融合TNFα纳米抗体GS115酵母表达细胞构建

(1)重组质粒线性化与浓缩：

依照质粒大提试剂盒中的步骤，对三种构型重组质粒菌液进行质粒提取，后分别用SacI进行线性化酶切。加入2倍体积的无水乙醇和0.1倍体积3M醋酸钠溶液对线性化质粒进行浓缩。

(2)制备酵母感受态细胞：

本实验室冻存的GS115酵母菌通过划线接种YPDS平板，30℃恒温培养3天，直至长出单菌落。挑取单菌落于25mL YPD中，200rpm，30℃过夜培养种子液。将500μL种子液加入到150mL YPD中，200rpm，30℃过夜培养至菌液OD600在1.3～1.5之间。将全部菌液低温1500g离心7min，沉淀先后用预冷的去离子水和1M山梨醇溶液各重悬和洗涤2次。最后沉淀用240μL预冷的1M山梨醇溶液重悬，分装为3管，置冰上备用。

(3)酵母细胞电转化

1)向三管80μL的酵母感受态细胞中分别加入10μL的三种浓缩的线性化重组质粒，轻轻混匀，分别转移至预冷的电转杯中，低温静置5min。

2)轻弹电转杯，分别放入电转仪，按照仪器上预设毕赤酵母的电转参数进行电击。

3)取出电转杯，快速加入750μL预冷的1M山梨醇溶液并混匀，分别转移至1.5mL离心管中，30℃静置培养1.5h。

4)培养结束后，分别吸取适量溶液涂布于三个含100μg/mL博莱霉素的YPDS上，30℃条件下培养3天左右，直至长出单克隆。

(4)含重组质粒的酵母阳性克隆筛选

1)酵母菌液PCR检测。分别挑取电转化后YPDS板上长出的若干单克隆，分别进行25mL YPD过夜培养。过夜培养的菌液各取1mL，2500g离心5min，弃上清，沉淀用PBS洗涤，再用50μL的去离子水重悬。

2)将细胞悬液沸水煮10min，-80℃冻存30min，再沸水煮10min。

3)2000g离心3min，以菌液上清为模板分别进行PCR鉴定，图1C显示在1000bp处有条带，其中包括589bp的载体序列和493bp的目的基因条带，即筛选出含重组质粒的酵母阳性克隆。

2.RGD4C融合TNFα纳米抗体蛋白的诱导表达和纯化

(1)融合蛋白诱导

1)分别将含三种构型重组质粒的酵母进行菌液PCR筛选，阳性菌株分别接种25mLYPD培养基进行活化种子液，活化条件为30℃、200rpm、18h。

2)分别转接100μL的活化种子液到150mL YPD，同样条件过夜培养14h左右，至菌液OD600在1.3～1.5之间。加入培养基体积1％的甲醇进行诱导表达，继续培养。

3)为诱导菌株持续表达蛋白，每隔24h补加相同体积的甲醇，诱导表达三天后各取500μL菌液进行10000rpm离心10min，将上清通过SDS-PAGE和Western Blot进行阳性表达检测。

(2)融合蛋白的分离纯化

1)将大量诱导表达的菌液进行10000rpm离心10min取上清，上清液用Ni柱亲和纯化平衡缓冲液透析3天，再用0.45μm滤器过滤除杂。

2)将Ni柱安装在纯化系统上后用平衡缓冲液进行柱平衡，约10倍柱体积，流速为1mL/min。

3)将过滤除杂的上清液进行过Ni柱纯化，流速为0.5mL/min，并收集流穿液。

4)上清液过完Ni柱后，再用平衡缓冲液清洗柱子，约10倍柱体积至基线平稳。

5)然后分别用50mM、100mM、250mM咪唑梯度洗脱液洗脱，流速为1mL/min，分别收集各浓度洗脱液。

6)将纯化前上清液、流穿液和不同浓度咪唑的梯度洗脱液同时一起做SDS-PAGE检测纯化效果。V-L-R-H和R-L-H-V两种构型可以被高效纯化，产量约为25mg/L，纯度高于95％；V-H-L-R构型不能被有效纯化，产量约为2mg/L(附图2)。

实施例3 RGD4C融合TNFα纳米抗体体外抗三阴性乳腺癌活性研究

1.三种构型RGD4C融合TNFα纳米抗体蛋白对TNFα细胞毒性的抑制活性比较

1)将培养好的L929细胞消化并离心，用完全培养基重悬计数并调整浓度至12×10⁴cells/mL，接种于96孔板，6重复，100μL/孔；继续培养12h。

2)用含有浓度100pg/mL TNFα和1μg/mL放线菌素D的完全培养基将V-L-R-H、V-H-L-R、R-L-H-V和VHH同稀释梯度浓度为2nM、1nM、0.5nM、0.25nM、0.125nM、0.0625nM、0.03125nM、0.0156nM，100μL/孔，加入相应孔；同时设空白组(无细胞、有培养基)和细胞对照组(有细胞、不加TNFα)和TNFα对照组(有细胞、加TNFα)，继续培养24h。

3)进行MTT检测。

结果显示，V-L-R-H、V-H-L-R、R-L-H-V和VHH的IC50值分别是0.1062nM、0.1133nM、0.1870nM和0.09519nM。由此可知，V-L-R-H构型中和TNFα的能力最强；R-L-H-V构型中和TNFα的能力最弱，此构型对VHH结构部分活性影响最大，见附图3。

2.三种融合蛋白对细胞的粘附活性比较

1)用PBS将V-L-R-H、V-H-L-R、R-L-H-V和VHH稀释为0.5μM，设PBS为空白对照，100μL/孔，6重复，4℃过夜包被96孔板。

2)用注射器吸去包被液，PBS清洗5次，用3％BSA进行，100μL/孔，放37℃封闭2h。

3)弃去封闭液，PBS清洗96孔板5次，用无血清培养基将消化重悬的MDA-MB-231细胞调整浓度为24×10⁴cells/mL，100μL/孔，放37℃使细胞粘附2h。

4)取出96孔板，PBS清洗96孔板5次，用甲醇室温固定30min，100μL/孔，放于通风处晾干。

5)用0.1％的结晶紫溶液室温染色30min，100μL/孔，PBS润洗96孔板5次。

6)用33％的醋酸溶液室温溶解96孔板中的结晶紫30min，100μL/孔，并于570nm测得吸光度。

结果显示，VHH对MDA-MB-231细胞没有粘附能力，而三种构型的融合蛋白对细胞的粘附能力比较为V-H-L-R>V-L-R-H>R-L-H-V，此结果体现了融合蛋白中RGD4C部分的结构活性，见附图4。

3.三种融合蛋白对细胞的增殖抑制活性比较

1)将培养好的MDA-MB-231细胞消化并离心，用完全培养基重悬计数并调整浓度至6×10⁴cells/mL，接种于96孔板，6重复，100μL/孔；继续培养12h。

2)用完全培养基将V-L-R-H、V-H-L-R、R-L-H-V和VHH分别稀释20μM、15μM、10μM、5μM、1μM五个浓度，100μL/孔，加入相应孔；同时设空白组(有培养基、无细胞)和阴性组(有培养基、有细胞)，继续培养24h。

3)MTT测定，计算增殖抑制率＝(阴性组-实验组/阴性组-空白组)×100％，数据用GraphPad prism5进行结果分析。

三种构型的融合蛋白都能抑制MDA-MB-231细胞的增殖，具有浓度依赖性。抑制活性大小为V-L-R-H>R-L-H-V>V-H-L-R，见附图5。

4.三种融合蛋白对细胞的迁移抑制作用比较(划痕实验)

1)将培养好的MDA-MB-231细胞消化并离心，用完全培养基重悬计数并调整浓度至25×10⁴cells/mL，接种于24孔板，500μL/孔；继续培养12h。

2)用200μL枪头在每孔中平行划出3条划痕，PBS清洗掉划掉的细胞2次，用含100pg/mL TNFα的条件培养基稀释V-L-R-H、V-H-L-R、R-L-H-V和VHH浓度为0.5μM，加入相应孔，500μL/孔，同时设阴性组；在显微镜下选择低倍镜拍照划痕宽度，记做0h；继续培养24h。

3)取出24孔板在显微镜下拍照划痕宽度。

4)用Image J软件计算出每孔三条划痕的均值，计算每组的迁移抑制率＝(阴性组-实验组)/阴性组×100％。

三种构型融合蛋白抑制细胞迁移的能力大小为V-L-R-H>V-H-L-R>R-L-H-V。相较VHH，融合蛋白的迁移抑制率提高了15％-30％。

对三种构型融合蛋白的纯化效率和生物活性综合比较，体内实验选用纯化效率高和生物活性强的V-L-R-H构型进行进一步研究，见附图6。

实施例3融合蛋白V-L-R-H发挥生物学作用的分子机制探究

1.Western实验步骤

1)收集样品：将培养好的MDA-MB-231细胞消化并离心，用完全培养基重悬计数并调整浓度至30×10⁴cells/mL，接种于6孔板，2mL/孔；继续培养12h；并用含100pg/mL TNFα的条件培养基稀释V-L-R-H和VHH浓度为10μM，同时设置空白对照。

2)蛋白提取：预冷PBS清洗细胞2次，加入细胞裂解液提取总蛋白。每管加入150μL裂解液，并在使用前数分钟内加入最终浓度为1mM的PMSF，所有操作在冰上进行；充分裂解后，12,000g离心，4℃，15min，取上清。

3)测定蛋白浓度：用BCA法测各组蛋白浓度。

4)样品准备：各组加入相应体积5×Loading buffer混匀，沸水煮5min，放-80℃冰箱保存备用。

5)电泳：SDA-PAGE分离胶为12％，每组加样40μg总蛋白；80V恒压浓缩30min，120V恒压分离100min。

6)转膜：根据蛋白Marker整齐切下相应分子量的蛋白凝胶条带，根据凝胶条带大小剪去同样大小和数量的PVDF膜并编号，将PVDF膜在甲醇中活化30s，再置于转膜缓冲液中备用。准备10长大小和整块凝胶相近的薄滤纸，置于转膜缓冲液中备用。将转膜夹板打开置于转膜缓冲液中，黑色在下，白色在上。依次在黑板上铺上：一层海绵→5张滤纸→凝胶条带→PVDF膜→5张滤纸→海绵。操作时注意边缘对齐，并用赶走气泡，合上夹板，放入预先冰浴转膜槽中。300mA恒流转膜，转膜时间由蛋白的分子量来定，分子量越大，转膜时间越长。

7)封闭：5％脱脂奶粉室温封闭2h。

8)一抗：一抗(抗FAK、p-FAK、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、ERK、p-ERK、P65和p-P65的抗体)用5％脱脂奶粉稀释至工作液浓度，4℃孵育过夜。

9)二抗：膜用TBST清洗5次，5min/次。抗体用5％脱脂奶粉稀释至工作液浓度，室温孵育2h；TBST清洗7次，5min/次。

10)曝光检测：避光条件将ECL发光显色液中的A液和B液按1:1混合，先选择自动曝光程序，然后再根据条带深浅自行设定曝光时间。

Western blot分析p-FAK、p-PI3K、p-AKT、p-ERK和p-P65蛋白表达均显著降低。与VHH相比，V-L-R-H显著的降低了此信号通路中相关蛋白的磷酸化水平，表明V-L-R-H具有抑制FAK和PI3K-AKT信号通路的作用(附图7)。

实施例4抗TNFα纳米抗体/RGD4C融合蛋白体内抗三阴性乳腺癌活性评估

1.小鼠MDA-MB-231乳腺癌皮下移植瘤模型的建立

(1)3只BALB/c裸鼠在SPF级动物房以基础性饲料喂养，活泼好动，体重、进食和饮水均正常，适应7天后，进行MDA-MB-231移植瘤造模。

(2)取处于对数生长期的人乳腺癌MDA-MB-231细胞，胰酶消化后用PBS洗涤2次，并用无血清培养液调整细胞浓度为25×10⁶cells/mL，将100μL细胞悬液接种于经75％酒精消毒的BALB/c裸鼠右侧腋窝皮下，接种后局部出现明显凸起。

(3)一周后3只被接种BALB/c裸鼠皮下均出现结节，BALB/c裸鼠MDA-MB-231细胞移植瘤模型建立成功。

(4)待肿瘤块长一周到足够大时选取其中一只脱颈处死，将肿瘤块在无菌条件下剥出，在生理盐水中将肿瘤块剪成1mm³大小的小瘤块，将小瘤块接种在另外15只裸鼠右侧腋窝皮下，一周后瘤块未消失即为移植瘤模型建立成功。

2.荷瘤小鼠治疗方案和样本处理

(1)将移植瘤模型建立成功的裸鼠随机分成三组：生理盐水组、VHH组、V-L-R-H组。

(2)移植瘤模型成功后一周开始给药，每组五只进行给药，给药方式为瘤旁皮下给药，给药周期设1/day；给药剂量为10mg/kg，将蛋白药物稀释为1mg/mL，根据小鼠体重进行注射相应的体积，生理盐水组注射体重相应的生理盐水；每四天测一此瘤体积和体重。

(3)各组荷瘤裸鼠均在给药后第21天脱颈椎处死，剥取移植瘤组织、肺组织，称量瘤重，计数肺组织表面结节数。

(4)将组织放于4％多聚甲醛溶液中固定，用于制备石蜡切片进行免疫组化、免疫荧光染色分析。

3.荷瘤小鼠给药后治疗效果评价

(1)荷瘤小鼠瘤重、瘤体积、肺转移肿瘤结节数

荷瘤小鼠给药治疗21天，期间每四天测一次瘤体积，21天后脱颈处死，剥去新鲜的肿瘤和肺组织，肿瘤进行拍照和称重，肺组织进行肺结节计数。

结果表明，VHH组和V-L-R-H组均可明显抑制移植瘤生长，V-L-R-H的平均抑制率为68％，与VHH(抑制率40％)有显著性差异。肺转移统计结果显示，V-L-R-H抑制作用显著大于VHH组，且都优于生理盐水组，结果见附图8。

(2)小鼠体重变化

为了验证融合蛋白V-L-R-H是否具有明显的毒副作用，观测荷瘤小鼠治疗期间的活动状况，并持续监测小鼠体重变化，每4天测量一次体重。

结果表明，所有荷瘤小鼠在治疗期间活动状况正常，未出现皮肤红肿，溃烂等情况。体重变化曲线结果表明，三组小鼠治疗后期均有体重下降的趋势，生理盐水组下降最为显著，V-L-R-H组小鼠的体重变化最小，统计学结果显示，V-L-R-H与对照组间小鼠间体重的差异无显著性差异(P＞0.05)。这表明V-L-R-H对荷瘤小鼠无明显的毒副作用，结果见附图9。

(3)肿瘤组织部位TNFα的表达量

通过免疫组化结果评价融合蛋白对肿瘤组织内TNFα的中和作用。

免疫组化方法：

1)将剥取的移植瘤放入4％多聚甲醛中进行固定。

2)采用逐渐提高酒精浓度进行梯度脱水，80％乙醇脱水3min，95％乙醇脱水2次，3min/次，100％乙醇再脱水2次，3min/次。放入透明剂二甲苯中浸泡透明2次，5min/次，用二甲苯将组织中的酒精替换出，进行浸蜡包埋。

3)将完全浸蜡的组织放入溶蜡中，放入冷水上待其冷却凝固后可切片。

4)蜡块用切片机连续切片，片厚约5-8μm，切片皱折需放到热水中烫平，再贴到载玻片上，放45℃恒温箱中烘干使用。

5)将切片放入60℃烘箱中进行脱蜡。将切片放入二甲苯3次，10min/次，再一次放入100％酒精、95％酒精、85％和70％酒精各2次，5min/次，最后在PBS中浸泡5min。

6)在3％H₂O₂浸泡15min，用PBS漂洗2次，加入0.01M柠檬酸缓冲液，按程序高温加热，待其冷却后用PBS洗3次，5min/次。

7)吸去切片多余的水分，滴加5％血清，37℃封闭30min。

8)加一抗：吸去切片多余的水分，加封闭液稀释的一抗，4℃过夜孵育。

9)加二抗：将切片用PBS洗5次，5min/次；吸去切片多余的水分，加封闭液稀释的二抗，37℃孵育30min。

10)加SP：将切片用PBS洗5次，5min/次；吸去切片多余的水分，加上SP，37℃孵育30min。

11)加显色剂：将切片用PBS洗5次，5min/次；吸去切片多余的水分，加上DAB显色液，镜下控制显色时间。

12)将切片一次用PBS、75％乙醇、85％乙醇、95％乙醇和无水乙醇各浸泡2次，5min/次，二甲苯浸泡3次，10min/次。中性树胶封片，过夜风干。光学显微镜下观察，拍照。

图10中A为生理盐水(Saline)组、VHH组和V-L-R-H组的免疫组化图，蓝色为细胞核，棕色为TNFα。图B为图A中染色的平均光密度量化结果，显示VHH和V-L-R-H组均显著降低肿瘤TNFα的水平，VHH和V-L-R-H无显著性差异。

结果表明，V-L-R-H融合蛋白能有效中和肿瘤内TNFα，结果见附图10。

(4)肿瘤细胞组织形态HE染色分析

采用HE染色观察肿瘤细胞形态结构。

HE染色方法为：

1)将切片放入苏木精水溶液中染色数分钟。

2)酸水及氨水中分色，各数秒钟。

3)流水冲洗1h后入蒸馏水片刻。

4)在70％和90％酒精中脱水各10min。

5)酒精伊红染色液染色2-3min。

6)染色后的切片经纯酒精脱水，再经二甲苯使切片透明。

7)将已透明的切片滴上加拿大树胶，盖上盖玻片封固。显微镜下观察，拍照。

苏木精染料为碱性，主要使细胞核内的染色质和细胞质内的核酸染为紫蓝色。伊红为酸性染料，主要使细胞质或细胞外基质成分染为红色。

图11为HE染色结果，显示生理盐水组中细胞核和细胞质染色较深，细胞形态完整，组织结构致密。与VHH组相比，V-L-R-H组细胞核和细胞质染色较浅，细胞间隙更大。结果表明，V-L-R-H组表现出更强的肿瘤杀伤作用，结果见附图11，由左至右分别为生理盐水组、VHH组和V-L-R-H组。

(5)肿瘤组织部位CD31，Ki67，HIF-1α表达量

CD31主要表达于血管内皮细胞，用于评估肿瘤血管生成。CD31表达越高，肿瘤血管生成越强。采用前述免疫组化法分析瘤组织CD31分子，图12中A为生理盐水组、VHH组和V-L-R-H组的免疫组化图，箭头指示为CD31分子结果显示，VHH与V-L-R-H组均能显著降低肿瘤内CD31的表达。与VHH相比，V-L-R-H抑制效果更显著。

结果表明，V-L-R-H融合蛋白能显著降低肿瘤血管的生成，发挥抑瘤作用，结果见附图12。

Ki67是表达于细胞核内的一种非组蛋白。细胞增殖能力越强，其表达越多，是反映肿瘤细胞增殖活性最可靠的指标。免疫组化分析瘤组织Ki67分子，图13中A为生理盐水组、VHH组和V-L-R-H组的免疫组化图，箭头指示为Ki67分子。

结果显示，与生理盐水组相比，VHH和V-L-R-H两组均显著降低肿瘤细胞核内Ki67的表达，V-L-R-H作用更显著。

结果表明，V-L-R-H融合蛋白能显著抑制肿瘤细胞的增殖活性，结果见附图13。

HIF-1α为缺氧诱导因子1α，是表达于核内的转录调控因子。其使肿瘤细胞适应缺氧环境，同时促进肿瘤生长和血管生成，增加肿瘤的侵袭性和放化疗抵抗性。临床数据显示，HIF-1α高表达于乳腺癌，与原发肿瘤直径和淋巴结转移性有关。免疫组化分析瘤组织HIF-1α分子，图14中A为生理盐水组(Saline)、VHH组和V-L-R-H组的免疫组化图，箭头指示为HIF-1α分子。

结果显示，与生理盐水组相比，VHH和V-L-R-H两组显著降低肿瘤细胞核内HIF-1α的表达，V-L-R-H作用更显著。

结果表明，V-L-R-H融合蛋白能显著抑制肿瘤增长和血管生成，见附图14。

6)融合蛋白V-L-R-H治疗对肿瘤组织EMT的影响

肿瘤组织免疫荧光切片分析，

免疫荧光方法为：

1)脱蜡、抗原修复、封闭和加一抗步骤同免疫组化。

2)在避光条件下滴加荧光素标记的二抗，37℃孵育30min，PBS洗片5次，5min/次。

3)把核染液DAPI染色液用PBS稀释，50μL/片，染色10min。

4)用甘油缓冲液封片，荧光显微镜观察并拍照。

DAPI蓝色荧光标记细胞核，红色荧光标记Vimentin，绿色荧光标记E-cadherin。在EMT过程中Vimentin表达量上调，E-cadherin表达量下调。

结果如图15，在VHH组和V-L-R-H组中，绿色荧光标记E-cadherin表达提高，红色荧光标记Vimentin表达降低，EMT过程受到了抑制作用，细胞与周质之间粘附性增加，转移能力变弱。

结果表明，与VHH相比，V-L-R-H抑制肿瘤发生EMT的作用更强，结果见附图15。

序列表

<110> 中国药科大学

<120> RGD4C融合抗TNFα纳米抗体蛋白、制备方法及其应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 438

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

caggtgcagc tggtggagtc tggcggtggc ttggtgcaag ctggcggctc cctgagactg 60

tcctgtaccg cctctggaca aacaagcagc acggctgata tgggctggtt ccgccagcct 120

ccaggcaagg gccgtgagtt tgtcgctaga attagcggca ttgacggtac cacctactac 180

gatgaaccgg tgaagggccg tttcaccatc tccagagaca aagcccaaaa caccgtgtat 240

ctgcaaatgg atagcctgaa gccggaggac acggctgtgt attactgtag aagccctcgt 300

tatgccgatc aatggagcgc ctatgattat tggggccaag gcacccaagt caccgtctcc 360

tctcatcatc atcatcatca tggaggcggc ggtagcggtg gaggtggcag ctgcgattgt 420

cgcggagatt gcttctgc 438

<210> 2

<211> 146

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Gln Thr Ser Ser Thr Ala

20 25 30

Asp Met Gly Trp Phe Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Arg Ile Ser Gly Ile Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Asp Glu Pro Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Lys Ala Gln Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Arg Ser Pro Arg Tyr Ala Asp Gln Trp Ser Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser His His His His His His Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys Asp Cys Arg Gly Asp Cys

130 135 140

Phe Cys

145

<210> 3

<211> 438

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgcgattgtc gcggagattg cttctgcgga ggcggcggta gcggtggagg tggcagccat 60

catcatcatc atcatcaggt gcagctggtg gagtctggcg gtggcttggt gcaagctggc 120

ggctccctga gactgtcctg taccgcctct ggacaaacaa gcagcacggc tgatatgggc 180

tggttccgcc agcctccagg caagggccgt gagtttgtcg ctagaattag cggcattgac 240

ggtaccacct actacgatga accggtgaag ggccgtttca ccatctccag agacaaagcc 300

caaaacaccg tgtatctgca aatggatagc ctgaagccgg aggacacggc tgtgtattac 360

tgtagaagcc ctcgttatgc cgatcaatgg agcgcctatg attattgggg ccaaggcacc 420

caagtcaccg tctcctct 438

<210> 4

<211> 146

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Cys Asp Cys Arg Gly Asp Cys Phe Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

1 5 10 15

Gly Gly Ser His His His His His His Gln Val Gln Leu Val Glu Ser

20 25 30

Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr

35 40 45

Ala Ser Gly Gln Thr Ser Ser Thr Ala Asp Met Gly Trp Phe Arg Gln

50 55 60

Pro Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val Ala Arg Ile Ser Gly Ile Asp

65 70 75 80

Gly Thr Thr Tyr Tyr Asp Glu Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser

85 90 95

Arg Asp Lys Ala Gln Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asp Ser Leu Lys

100 105 110

Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Arg Ser Pro Arg Tyr Ala Asp

115 120 125

Gln Trp Ser Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val

130 135 140

Ser Ser

145

<210> 5

<211> 438

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

caggtgcagc tggtggagtc tggcggtggc ttggtgcaag ctggcggctc cctgagactg 60

tcctgtaccg cctctggaca aacaagcagc acggctgata tgggctggtt ccgccagcct 120

ccaggcaagg gccgtgagtt tgtcgctaga attagcggca ttgacggtac cacctactac 180

gatgaaccgg tgaagggccg tttcaccatc tccagagaca aagcccaaaa caccgtgtat 240

ctgcaaatgg atagcctgaa gccggaggac acggctgtgt attactgtag aagccctcgt 300

tatgccgatc aatggagcgc ctatgattat tggggccaag gcacccaagt caccgtctcc 360

tctggaggcg gcggtagcgg tggaggtggc agctgcgatt gtcgcggaga ttgcttctgc 420

catcatcatc atcatcat 438

<210> 6

<211> 146

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Gln Thr Ser Ser Thr Ala

20 25 30

Asp Met Gly Trp Phe Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Arg Ile Ser Gly Ile Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Asp Glu Pro Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Lys Ala Gln Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Arg Ser Pro Arg Tyr Ala Asp Gln Trp Ser Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125

Gly Gly Ser Cys Asp Cys Arg Gly Asp Cys Phe Cys His His His His

130 135 140

His His

145

<210> 7

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gaagaagggg tatctctcga gaaaagagag gctcaggtgc agctggtgga gtc 53

<210> 8

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cgctaccgcc gcctccagag gagacggtga cttgggt 37

<210> 9

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

acccaagtca ccgtctcctc tggaggcggc ggtagcg 37

<210> 10

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

agatgagttt ttgttctaga tcaatgatga tgatgatgat ggcagaagca atctccgc 58

Claims

1.一种RGD4C融合TNFα纳米抗体，其特征在于，所述RGD4C融合TNFα纳米抗体的氨基酸序列如SEQIDNO.6所示。

2.编码权利要求1所述RGD4C融合TNFα纳米抗体的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示。

3.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含权利要求2所述编码RGD4C融合TNFα纳米抗体的基因。

4.根据权利要求3所述表达载体，其特征在于，所述表达载体是将权利要求2所述编码RGD4C融合TNFα纳米抗体的基因克隆到pPICZαA空载质粒中所得。

5.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞包含权利要求3所述表达载体。

6.根据权利要求5所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞以酵母菌GS115为宿主细胞。

7.一种RGD4C融合TNFα纳米抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：制备权利要求3所述的表达载体，用所述表达载体转化宿主细胞，培养转化体，从培养物中分离得到所述RGD4C融合TNFα纳米抗体。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，具体步骤为：将权利要求2所述编码RGD4C融合TNFα纳米抗体的基因进行PCR扩增，扩增产物经XhoI和XbaI双酶切，与相同酶切的pPICZαA空载质粒连接，得到表达载体，将该表达载体转化酵母菌GS115，培养转化体，经甲醇诱导表达，从培养物中分离纯化，获得RGD4C融合TNFα纳米抗体；

优选的，用于PCR扩增权利要求2所述编码RGD4C融合TNFα纳米抗体的基因的特异性引物为：

9.权利要求1所述的RGD4C融合TNFα纳米抗体在制备预防或治疗乳腺癌的药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述乳腺癌为三阴性乳腺癌。