CN112268962B - 长链酰基肉碱作为缺血性脑卒中生物标志物的应用 - Google Patents
长链酰基肉碱作为缺血性脑卒中生物标志物的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112268962B CN112268962B CN202010933423.4A CN202010933423A CN112268962B CN 112268962 B CN112268962 B CN 112268962B CN 202010933423 A CN202010933423 A CN 202010933423A CN 112268962 B CN112268962 B CN 112268962B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- long
- ischemic stroke
- chain acyl
- acyl carnitine
- carnitine
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
- G01N30/06—Preparation
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
- G01N30/72—Mass spectrometers
- G01N30/7233—Mass spectrometers interfaced to liquid or supercritical fluid chromatograph
- G01N30/724—Nebulising, aerosol formation or ionisation
- G01N30/7266—Nebulising, aerosol formation or ionisation by electric field, e.g. electrospray
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/86—Signal analysis
- G01N30/8665—Signal analysis for calibrating the measuring apparatus
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/86—Signal analysis
- G01N30/8675—Evaluation, i.e. decoding of the signal into analytical information
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/86—Signal analysis
- G01N30/8696—Details of Software
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/92—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving lipids, e.g. cholesterol, lipoproteins, or their receptors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
- G01N2030/042—Standards
- G01N2030/045—Standards internal
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/28—Neurological disorders
- G01N2800/2871—Cerebrovascular disorders, e.g. stroke, cerebral infarct, cerebral haemorrhage, transient ischemic event
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Library & Information Science (AREA)
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
Abstract
本发明公开了一种长链酰基肉碱作为缺血性脑卒中生物标志物的应用,属于生物医药领域,本发明基于脂质组学的研究技术和生物信息学的筛查分析,发现长链酰基肉碱在小鼠急性缺血性脑卒中模型缺血半影区中的表达上调。具体地,本发明涉及长链酰基肉碱在制备用于脑卒中诊断、罹患风险评估、患病严重程度的诊断治疗效果的评估、预后恢复的判断等的产品中的应用,不仅可以快速有效地进行脑卒中的早期诊断、风险评估和预警,还可以为后期患病严重程度及治疗效果的评估、预后的判断提供重要依据,辅助医生的治疗方案。另外,本发明所述长链酰基肉碱还可以为筛选预防和治疗缺血性脑卒中药物和临床治疗提供靶点。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域,具体涉及长链酰基肉碱作为缺血性脑卒中生物标志物的应用。
背景技术
缺血性脑卒中是世界范围内的常见病,具有发病率高、致残率高、致死率高的特点。近年来虽然静脉溶栓和机械取栓等血管再通方法对缺血性脑卒中的治疗有一定的进展,但是能在时间窗内接受血管再通治疗的患者比例仍然非常低,给家庭和社会带来了沉重的负担。目前诊断急性缺血性脑卒中主要依靠CT、MRI等影像学手段,但CT、MRI扫描并不是完全可信的方法,CT对早期的缺血性脑卒中只有16%的灵敏度,而对于出血性脑卒中却有89%的灵敏度。20%的缺血性脑卒中并不能够被MRI扫描技术探测到。且影像诊断技术并不存在于所有诊疗中心中,这些都阻碍了脑卒中的快速诊断和药物的及时应用。
生物标志物是指可以标记系统、器官、组织、细胞及亚细胞结构或功能的改变的生化指标,可用于疾病诊断、判断疾病分期或用于评价新药或新疗法在目标人群中的安全性及有效性。然而现有的缺血性脑卒中生物标志物十分缺乏。因此,探索缺血性脑卒中的新型生物标志物具有重要的意义。
近年来,脂质组学的发展促进了对脂质生物学功能及其在生命体中重要作用的认识,可为疾病的发病机制提供全新和深入的了解。脂质组学技术目前已广泛应用于糖尿病、心血管疾病和神经退行性疾病等,但在AIS中的应用较少。因此,基于脂质组学检测AIS病理过程中脂质谱的动态变化有助于挖掘缺血性脑卒中的新型生物标志物,为精准实现AIS预测、预后提供数据支持,也有助于深化对AIS病理过程的认识,为临床治疗提供新思路。
酰基肉碱是脂肪酸与肉碱结合的一种脂类物质,根据酰基碳原子的数目可以分为短链(C2-C5),中链(C6-C11)和长链(C12-C22)酰基肉碱(long chain acylcarnitine,LCAC)。LCAC由长链脂肪酸与肉碱在位于线粒体外膜的棕榈酰肉碱转移酶-1的催化下生成,然后LCAC通过线粒体内膜上的肉碱酰基转移酶转运至线粒体内,由棕榈酰肉碱转移酶-2重新分解为脂肪酰辅酶A后进入脂肪酸β-氧化过程。缺血性脑卒中发病过程中,脂肪酸氧化的关键代谢酶失调可能导致脂肪酸不完全氧化,进而导致LCAC等脂代谢中间产物的堆积。高水平的LCAC已经成为遗传性线粒体脂肪酸氧化障碍、二型糖尿病、心肌缺血等疾病的标志物。然而,LCAC是否能作为缺血性脑卒中诊断标志物,以及其在缺血性脑卒中病理进程中的调控作用及机制目前尚不明确。
发明内容
本发明目的是提供一种长链酰基肉碱作为缺血性脑卒中生物标志物的应用。
为实现上述目的,本发明提供了如下方案:
本发明的第一个方面,提供一种长链酰基肉碱作为缺血性脑卒中的生物标志物的应用,所述长链酰基肉碱为碳原子数≥12的酰基肉碱。
进一步地,所述长链酰基肉碱的碳原子数为12-22。
进一步地,所述长链酰基肉碱选自下组中的一种或多种:C12、C13、C14、C14:1、C15、C16、C16:1、C16:2、C16-OH、C17、C18、C18:1、C18:1-OH、C18:2、C19、C20、C20:1、C20:2、C20:3、C20:4、C22:1、C22:2、C22:3、C22:4、C22:6;
具体如下表1所示:
表1
进一步地,所述长链酰基肉碱在缺血性脑卒中生物样品中表达上调。
进一步地,所述生物样品包括血液、细胞和/或组织。
进一步地,所述长链酰基肉碱用于制备检测缺血性脑卒中的试剂或检测试剂,所述检测包括诊断缺血性脑卒中、评估缺血性脑卒中罹患风险、评估缺血性脑卒中严重程度、评估对缺血性脑卒中治疗效果、判断缺血性脑卒中预后。
进一步地,所述长链酰基肉碱用于制备筛选预防或治疗缺血性脑卒中相关药物的试剂或检测试剂。
本发明的第二个方面,提供一种用于检测缺血性脑卒中发生的系统,所述系统包括检测长链酰基肉碱的物质和数据处理装置;
所述数据处理装置内设采集比较模块和处理模块;
所述采集比较模块的功能为:采集并比较待测者与对照者的样本中长链酰基肉碱的表达量;
所述处理模块的功能为:根据比较的结果确定待测者是否为缺血性脑卒中患者,具体包括:若所述待测者的样本中所述长链酰基肉碱的表达量显著高于所述对照者的样本中所述长链酰基肉碱的表达量,则所述待测者为或候选为缺血性脑卒中患者;反之,则所述待测者不为或候选不为缺血性脑卒中患者;所述对照者为健康人。
本发明的第三个方面,提供一种用于检测缺血性脑卒中的产品,所述产品用于检测样品中长链酰基肉碱含量。
进一步地,所述产品包括:试剂、试纸、试剂盒、芯片、质谱检测中的一种或多种。
本发明公开了以下技术效果:
本发明公开了一种与脑卒中相关的脂质长链酰基肉碱,并进一步证实长链酰基肉碱在脑卒中梗死侧半影区中表达上调。利用长链酰基肉碱检测脑卒中不仅能够做到快速有效地早期检测,而且为治疗效果、预后评估、基因治疗、药物治疗等临床应用提供了治疗靶点和重要依据。
附图说明
图1 为实施例1 OPLS-DA法筛选梗死灶半影区与其对侧半球相应脑区的差异脂质。
图2 为实施例1 WGCNA法筛选梗死灶半影区与其对侧半球相应脑区的差异脂质。
图3 为实施例1 OPLS-DA法与WGCNA法共同筛选到的差异脂质。
图4 为实施例2 质谱MRM法检测酰基肉碱的色谱图。
图5 为实施例2 p<0.01,FC>1.5的差异酰基肉碱。
图6 为实施例2 长链酰基肉碱在缺血性脑卒中小鼠梗死灶半影区中表达上调。
具体实施方式
下面结合附图进一步说明本发明的实施例,该详细说明不应认为是对本发明的限制,而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式,并非用于限制本发明。另外,对于本发明中的数值范围,应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明,否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料,但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入,用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时,以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下,可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化,这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等,均为开放性的用语,即意指包含但不限于。
实施例1
UPLC-Orbitrap质谱系统筛选差异脂质
一、所用仪器和试剂
Q-Exactive Plus 质谱仪 (Thermo Scientific)
UHPLC Nexera LC-30A 超高效液相色谱仪 (SHIMADZU)
低温高速离心机 (Eppendorf 5430R)
色谱柱:Waters, ACQUITY UPLC CSH C18,1.7μm,2.1mm×100mm column
乙腈 (Thermo Fisher)
异丙醇 (Thermo Fisher)
甲醇 (Thermo Fisher)
甲酸铵 (Sigma,70221)
二、项目试验流程
2.1 局灶性脑缺血再灌注动物模型的制备
参照Longa法使用头端包被多聚赖氨酸的尼龙线栓(型号:1622A4,北京西浓科技有限公司,中国)制备C57BL/6J小鼠大脑中动脉闭塞(middle cerebral arteryocclusion,MCAO)模型。C57BL/6J小鼠术前禁食8h,腹腔注射4%水合氯醛(0.1ml/10g,无菌生理盐水配置)麻醉小鼠,将小鼠以仰卧固定于特制的手术纸板上,碘伏消毒后,于颈正中偏左侧剪开一条适中小口,分离出右侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉。使用电凝笔结扎颈外动脉的远心端,使用活结形式结扎右侧颈总动脉后,于右境外动脉上剪“V”型小口并从剪口插入拴线直至出现阻力,表明拴线已经到达大脑中动脉,结扎拴线固定,并以沾有生理盐水的棉球覆盖创口,保持伤口湿润。缺血60min后,缓慢抽出拴线并结扎颈外动脉,松开颈总动脉恢复右侧颈动脉血流,缝合伤口并以碘伏消毒伤口,完成局灶性脑缺血再灌注模型。术后,将小鼠置于电热板上保温至清醒后放回笼中,室温正常饲养。再灌注损伤1天、2天、3天后安乐死,取出脑组织后立即置于冷的PBS中洗去血厚置于小鼠脑组织的铁制模型中,在距额叶前端3mm和5mm处进行冠状切片,取中间2mm厚的脑组织块,然后沿着此脑组织块的矢状缝两侧约1mm处,从上至下切取两侧半脑的正中结构。余下的左右两侧脑块,沿着矢状切面旁开2mm处,并于矢状切面呈30°斜切,取内侧皮层即缺血半影区为d1-ip,d2-ip,d3-ip组。同时,取其对侧半球的相应区域作为d1-con,d2-con,d3-con组。
2.2 样品前处理
脑组织样本在4℃环境缓慢解冻后取30mg于MP管中,加入200μL水,匀浆均匀,加入240μL预冷甲醇,涡旋混合,加入800μL MTBE,涡旋混合,低温水浴中超声20min,室温放置30min,14000g,10℃离心15min,取上层有机相,氮气吹干,质谱分析时加入200μL 90%异丙醇/乙腈溶液复溶,涡旋,14000g,10℃离心15min,取上清进样分析。等量取各组样本混合为QC,在分析过程中每七个样品注入一次。
2.3 色谱/质谱分析
样品采用UHPLC Nexera LC-30A超高效液相色谱系统进行分离。柱温45℃;流速300μL/min;进样量3μL。流动相组成为A液:10mM 甲酸铵乙腈水溶液(乙腈:水=6:4,v/v),B液:10mM 甲酸铵乙腈异丙醇溶液(乙腈:异丙醇=1:9,v/v)。梯度洗脱程序如下:0-2 min,B维持在30%;2-25min,B从30%线性变化至100%;25-35min,B维持在30%。整个分析过程中样品置于10℃自动进样器中。为避免仪器检测信号波动而造成的影响,采用随机顺序,进行样本的连续分析。分别采用电喷雾电离(ESI)正离子和负离子模式进行检测。样品经UHPLC分离后采用Q Exactive plus质谱仪(Thermo ScientificTM)进行质谱分析。ESI源条件如下:Positive: Heater Temp 300℃, Sheath Gas Flow rate 45 arb, Aux Gas Flow Rate15arb, Sweep Gas Flow Rate 1arb, spray voltage 3.0 KV, Capillary Temp 350℃, S-Lens RF Level 50%. MS1 scan ranges: 200-1800;Negative: Heater Temp 300℃,Sheath Gas Flow rate 45 arb, Aux Gas Flow Rate 15 arb, Sweep Gas Flow Rate 1arb, spray voltage 2.5 KV, Capillary Temp 350℃, S-Lens RF Level 60%. MS1scan ranges: 250-1800。脂质分子和脂质碎片的质量电荷比按照下列方法采集:每次全扫描后采集10个碎片图谱(MS2 scan,HCD)。MS1在M/Z 200时分辨率为70,000,MS2在M/Z 200时分辨率为17,500。
2.4 数据预处理
使用LipidSearch软件(Thermo Fisher Scientific)分别对阳性和阴性电离模式下的脂质表达量数据进行定性和相对定量,使用默认参数进行Q Exactive脂质搜索和校准。对齐后,所有识别出的脂质原始峰面积导出到Microsoft Excel中,并根据以下预先确定的质量控制标准进行过滤: Rej (Reject parameter)= 0; PQ(Peak Qualityparameter)大于0.85;CV(standard deviation divided by the average peak areaacross triplicate injections of a representative pooled biological sample)小于0.4;R(linear correlation across a three-point dilution series of therepresentative pooled sample)大于0.9。
2.5 多变量统计分析
应用SIMCA-P 14.1软件(Umetrics, Umea, Sweden)对原始数据进行ParetoPareto (par) scaling和log变换后进行多变量统计分析。使用R包ggbiplot和ggfortify对处理后的数据进行非监督的主成分分析(PCA)以及可视化,观察样本的聚集情况并识别离群样本。为了最大程度地解释观测值并实现对响应变量的预测,接着使用 R包ropls 进行有监督的判别分析,即正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)。R包ropls 实现了基于NIPALS算法的PCA和OPLS-DA方法同时,我们可以得到经过交叉检验的Q2Y、R2Y、变量投影重要性(VIP)和置换检验的p值。
2.6 加权基因共表达网络分析(WGCNA)
使用R包WGCNA (version:1.68)进行共表达网络分析。首先,使用sample Tree命令对所有的样本进行聚类以发现离群点,并以cutHeight=50删除离群点。其次,选择共表达网络的软阈值。软阈值使邻接矩阵为0~1之间的连续值,使构建的网络符合幂律分布,更接近真实的生物网络状态。然后利用blockwiseModules函数构建无标度网络,通过模块划分分析识别基因共表达模块,将表达模式相似的脂质分子进行分组。通过使用动态剪切数算法将聚类树切割成分支来定义模块,并分配不同的颜色进行可视化。利用邻接矩阵算法,将聚类树状图与模块颜色一起显示,形成网络热图。根据基于拓扑重叠矩阵(TOM)的相异度进行层次聚类划分。然后,计算每个模块的模块特征基因(ME:模块特征基因,表示每个模块的整体表达水平),接着计算并绘制每个模块的ME与组别的相关关系。
三、结果
为了发现缺血性脑卒中早期的稳定生物标志物,我们同时应用先验的(OPLS-DA法)和基于未可知论(WGCNA法)的两种统计学方法对数据进行分析。在OPLS-DA法中,我们以VIP>1、p<0.05、差异倍数>1.5作为潜在脂质生物标志物的入选标准,筛选了缺血再灌注后3天内均满足上述标准的脂质分子作为脂质生物标志物并确定了47个差异脂质分子,如图1所示。在WGCNA法中,我们将差异脂质定义为WGCNA模块的pink模块,greenyellow模块和magenta模块的脂质分子,并确定了70个脂质分子如图2所示。最后,我们对这两种方法筛选到的脂质分子取交集得到潜在的脂质生物标志物,ROC分析显示出优秀的诊断效能,如图3和表2所示。在16个差异脂质标志物中有5个为长链酰基肉碱,且其AUC值均大于0.9。
表2 差异脂质ROC曲线下面积
实施例2
MRM法验证LCAC在缺血性脑卒中小鼠梗死灶半影区高表达
一、所用仪器和试剂
13个氘同位素标记的肉碱标品,货号分别为NSK-B(8个)和NSK-B-G(5个);
13个非同位素标记的脂酰肉碱标准品,货号分别为NSK-B-US(8个)和NSK-B-G-US(5个),均购自美国剑桥同位素实验室公司(Cambridge Isotope Laboratories,Inc);
液相色谱-质谱级别(LC-MS)甲醇和乙腈均购自Fisher Scientific公司。液相色谱-质谱级别(LC-MS)甲酸购自美国Sigma-Aldrich公司。其他实验材料均购自上海安谱实验科技股份有限公司。主要设备包括安捷伦超高效液相色谱仪(型号1290 Infinity II)和安捷伦串联四极杆质谱联用仪(型号6470A QQQ)、全自动样品快速研磨仪(型号JX-24,上海净信实业发展有限公司)和Eppendorf高速冷冻离心机(型号5430R)。
二、项目实验流程
2.1 样本制备
精密称重待测脑组织样本,每毫克脑组织加8μL的乙腈/异丙醇(乙腈/异丙醇体积比为3:1),-40℃静置10min,采用全自动样品快速研磨仪(型号JX-24,上海净信实业发展有限公司)进行冷冻研磨均质(频率40Hz)4min;加两倍体积(μL/毫克)的纯水,涡旋混匀,于15000g和4℃离心15min;取200μL上清液,加50μL同位素内标,温和氮气干燥;干燥残渣复溶于50μL 50%乙腈水溶液,离心后取上清液,进行超高效液相色谱-串联质谱分析。质控样本制备方法如下,取所有样本的提取上清液,等体积混合,其它步骤同样本制备。
2.2 定量校正标准曲线样本制备
内标溶液配制:取货号为NSK-B和NSK-B-G的同位素标记脂酰肉碱混标粉剂各1vial,分别溶解于1ml甲醇,得到两种同位素混标的储备液。取两种储备液,等体积混合,并进一步得到最终200倍稀释液,作为混合同位素内标溶液,记作D200-IS。取货号为NSK-B-US和NSK-B-G-US的非同位素脂酰肉碱混标粉剂,分别复溶于1ml甲醇,母液浓度如下表3所示;等体积混合,并进一步稀释5倍,得到稀释10倍的混标母液;对混标母液进行梯度稀释,得到覆盖20-5000倍稀释的非同位素混标溶液。取以上梯度稀释混标溶液与内标溶液D200-IS等体积混合,得到定量标准曲线样本。
表3
2.3 超高效液相色谱-串联质谱分析
采用美国Agilent公司超高效液相色谱仪(Agilent 1290)和三重四极杆质谱仪(Agilent 6470)进行检测分析。色谱柱为Waters公司UPLC BEH C18色谱柱(100mm X2.1mm,1.7μm)。采用线性梯度洗脱模式进行色谱分离,流速为0.4 mL/min。流动相组成为:(A) 含0.1%甲酸的水溶液,(B) 含0.1%甲酸的纯乙腈。梯度分离条件为:起始2% B并维持至1min,至3min线性升到15% B,至8min升至20%B,至10min升至75% B,第15.5min升至90% B,第16min升至98% B并维持到18min,18.1min回到2% B平衡到20min。色谱柱温度为40℃。采用电喷雾离子源(ESI+)正离子模式对经色谱分离的脂酰肉碱进行离子化。质谱参数如下:干燥气温度(Gas Temp)为300℃;鞘气温度(SheathGasHeater)为300℃;干燥气流速(GasFlow)为5L/min;雾化器压力(Nebulizer)为45 psi;鞘气流速(SheathGasFlow)为11 L/min,毛细管电压(Capillary)为4000V。采用动态多反应监测(dynamic multiple reactionmonitoring,dMRM)模式进行定性定量检测。Fragmentor电压和碰撞能量(CE)值如Supplementary Table 1所示。每个扫描周期时间设定为300毫秒。Agilent公司MassHunter软件(版本B.08.00)用于控制仪器和采集数据。
三、质谱数据分析
采用Agilent公司MassHunter工作站软件(版本B.08.00)对原始数据进行处理,使用默认参数并辅助人工检查,以确保每个化合物的定性定量的准确性,积分并输出各目标物质的峰面积,以用于定量计算。
四、结果
我们进一步通过基于UPLC-MS/MS的靶向脂质组学,成功地对42种长链酰基肉碱进行了绝对定量,色谱图如图4所示。梗死灶半影区LCAC显著上升,其中以d3-ip组上升最为明显。为了进一步确定在驱动酰基肉碱中占主导地位的酰基肉碱分子,图5显示了在缺血再灌注后第1、2、3天均满足p<0.01和Fold change>1.5的酰基肉碱分子,结果表明这些显著上升的酰基肉碱分子以LCAC为主,例如AcCa(C16),AcCa(C18)和AcCa(18:1),如图6所示。这一结果证实缺血再灌注后LCAC表达上调。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述,并非对本发明的范围进行限定,在不脱离本发明设计精神的前提下,本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进,均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (3)
1.长链酰基肉碱作为缺血性脑卒中的生物标志物的应用,其特征在于,所述长链酰基肉碱为:C14、C16、C16:1、C18:1和C20:1;所述长链酰基肉碱在缺血性脑卒中血液、细胞和/或组织中表达上调。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述长链酰基肉碱用于制备检测缺血性脑卒中的试剂或检测试剂,所述检测包括诊断缺血性脑卒中、评估缺血性脑卒中罹患风险、评估缺血性脑卒中严重程度、评估对缺血性脑卒中治疗效果、判断缺血性脑卒中预后。
3.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述长链酰基肉碱用于制备筛选预防或治疗缺血性脑卒中相关药物的试剂或检测试剂。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202010933423.4A CN112268962B (zh) | 2020-09-08 | 2020-09-08 | 长链酰基肉碱作为缺血性脑卒中生物标志物的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202010933423.4A CN112268962B (zh) | 2020-09-08 | 2020-09-08 | 长链酰基肉碱作为缺血性脑卒中生物标志物的应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN112268962A CN112268962A (zh) | 2021-01-26 |
CN112268962B true CN112268962B (zh) | 2022-12-23 |
Family
ID=74349118
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202010933423.4A Active CN112268962B (zh) | 2020-09-08 | 2020-09-08 | 长链酰基肉碱作为缺血性脑卒中生物标志物的应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN112268962B (zh) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN115267214A (zh) * | 2022-08-10 | 2022-11-01 | 南方医科大学珠江医院 | 一种脂质代谢标志物、其筛选方法及其在颅内动脉瘤中的应用 |
CN115779091A (zh) * | 2022-11-30 | 2023-03-14 | 苏州大学 | 血小板中Erbin基因在制备结直肠癌肺转移药物中的应用 |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2678670A1 (en) * | 2007-02-22 | 2009-09-04 | Tethys Bioscience, Inc. | Metabolic markers of diabetic conditions and methods of use thereof |
-
2020
- 2020-09-08 CN CN202010933423.4A patent/CN112268962B/zh active Active
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Distinguishing intracerebral hemorrhage from acute cerebral infarction through metabolomics;Xuxin Zhang et al.;《REV INVES CLIN.》;20171231;第69卷;摘要,第322页至第323页左栏,第324页,图1,图4 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN112268962A (zh) | 2021-01-26 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Khamis et al. | Mass spectrometric based approaches in urine metabolomics and biomarker discovery | |
Lin et al. | Exploring metabolic syndrome serum profiling based on gas chromatography mass spectrometry and random forest models | |
CN112268962B (zh) | 长链酰基肉碱作为缺血性脑卒中生物标志物的应用 | |
AU2006291988B2 (en) | Method for the diagnosis of colorectal cancer and ovarian cancer by the measurement of vitamin E-related metabolites | |
CN104515860B (zh) | 生物标记用于制备心脏衰竭诊断组合物的用途及诊断装置 | |
JP5977795B2 (ja) | 多発性硬化症を診断するための生物マーカー、及びその方法 | |
CN104713971B (zh) | 一种利用食管癌初步筛查用血清代谢组学分析模型分析血清代谢组学的方法 | |
JP2009528544A (ja) | 質量分析法を用いて異性体を識別するための方法 | |
WO2022206264A1 (zh) | 用于诊断和治疗脑白质病变的方法及其应用 | |
CN111562338B (zh) | 透明肾细胞癌代谢标志物在肾细胞癌早期筛查和诊断产品中的应用 | |
CN104713970B (zh) | 一种血清代谢组学分析模型的构建方法 | |
CN112305121B (zh) | 代谢标志物在动脉粥样硬化性脑梗死中的应用 | |
Yang et al. | Serum metabolic profiling study of endometriosis by using wooden-tip electrospray ionization mass spectrometry | |
Yang et al. | A green and efficient pseudotargeted lipidomics method for the study of depression based on ultra-high performance supercritical fluid chromatography-tandem mass spectrometry | |
Chen et al. | Targeting amine-and phenol-containing metabolites in urine by dansylation isotope labeling and liquid chromatography mass spectrometry for evaluation of bladder cancer biomarkers | |
Saidi et al. | Neuropeptidomics: Comparison of parallel reaction monitoring and data‐independent acquisition for the analysis of neuropeptides using high‐resolution mass spectrometry | |
CN115112776B (zh) | 联合标志物及在诊断心房颤动中应用及诊断试剂或试剂盒 | |
Chacko et al. | Metabolomics work flow and analytics in systems biology | |
Yang et al. | Multi-dimensional metabolomic profiling reveals dysregulated ornithine metabolism hallmarks associated with a severe acute pancreatitis phenotype | |
Yang et al. | Analysis of Fatty Acid in Biological Samples Using Liquid Chromatography–Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometry Under Parallel Reaction Monitoring Mode | |
Mil’man et al. | Mass spectrometric analysis of medical samples and aspects of clinical diagnostics | |
Hu et al. | LC-MS-based plasma metabolomics reveals metabolic variations in ovariectomy-induced osteoporosis in female Wistar rats | |
Zhang et al. | Mass Spectrometry‐Driven Metabolomics for Metabolites and Metabolic Pathway Analysis | |
CN114137192B (zh) | 7-甲基黄嘌呤作为检测靶点在制备2型糖尿病高危个体筛查试剂盒中的应用 | |
Lu et al. | Metabolomics and its application in the evaluation of toxicity of traditional Chinese medicine |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |