CN112263541A - 一种双层金属基一体化水凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents

一种双层金属基一体化水凝胶及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112263541A
CN112263541A CN202011077954.4A CN202011077954A CN112263541A CN 112263541 A CN112263541 A CN 112263541A CN 202011077954 A CN202011077954 A CN 202011077954A CN 112263541 A CN112263541 A CN 112263541A
Authority
CN
China
Prior art keywords
hydrogel
metal
ions
copper
layer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202011077954.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112263541B (zh
Inventor
王蕾
崔文国
杨仁豪
李亘
齐进
庄澄宇
虞佩
叶庭均
刘敬峰
张胤
邓廉夫
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ruinjin Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine Co Ltd
Original Assignee
Ruinjin Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ruinjin Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine Co Ltd filed Critical Ruinjin Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine Co Ltd
Priority to CN202011077954.4A priority Critical patent/CN112263541B/zh
Publication of CN112263541A publication Critical patent/CN112263541A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112263541B publication Critical patent/CN112263541B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/06—Ointments; Bases therefor; Other semi-solid forms, e.g. creams, sticks, gels
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/02—Inorganic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
    • A61K47/38—Cellulose; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/02—Inorganic materials
    • A61L27/025—Other specific inorganic materials not covered by A61L27/04 - A61L27/12
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/20—Polysaccharides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/22—Polypeptides or derivatives thereof, e.g. degradation products
    • A61L27/222—Gelatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/52—Hydrogels or hydrocolloids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/54—Biologically active materials, e.g. therapeutic substances
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/58—Materials at least partially resorbable by the body
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/10—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices containing or releasing inorganic materials
    • A61L2300/102—Metals or metal compounds, e.g. salts such as bicarbonates, carbonates, oxides, zeolites, silicates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/40—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices characterised by a specific therapeutic activity or mode of action
    • A61L2300/404—Biocides, antimicrobial agents, antiseptic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/40—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices characterised by a specific therapeutic activity or mode of action
    • A61L2300/412—Tissue-regenerating or healing or proliferative agents

Abstract

本发明提供了一种双层金属基一体化水凝胶及其制备方法与应用，属于生物医学材料技术领域。该一体化水凝胶主要由水凝胶基料和两种金属离子共混交联制得；所述两种金属离子分别位于水凝胶基料的上层和下层，并与水凝胶基料相互关联后分别构成上层金属基水凝胶和下层金属基水凝胶，所述上层金属基水凝胶和下层金属基水凝胶为双层融合一体化结构。本发明提供的水凝胶具有增强的力学性能，并能实现金属离子的负载和调控释放，从而实现多层结构组织的修复和疾病治疗的多功能。

Description

一种双层金属基一体化水凝胶及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医学材料技术领域，涉及一种水凝胶材料，具体涉及一种双层金属基一体化水凝胶及其制备方法和应用。
背景技术
水凝胶(Hydrogel)，是将部分疏水基团和亲水残基引入水溶性高分子的网状交联结构中而形成一类具有三维网状结构的高分子材料，其中亲水残基和水分子相结合，将水分子包裹于网状结构内部，疏水残基则遇水膨胀。水凝胶具有含水量高、粘弹性好、质地柔软且生物相容性好等优点，使得其在支架涂层、细胞载体、组织工程、药物载体等生物医学方面得到广泛的应用。
在组织工程运用方面，水凝胶作为载体是最为主要的运用方式。目前水凝胶的携载手段主要为直接共混或载体复合。其中，水凝胶直接共混载药是将药物直接混合于水凝胶中进行负载，这一制备方法较为简便，但是存在负载物释放过快、对药物选择性大、多种负载物相互干扰、药物负载量和均匀性差等问题。也就是说，虽然水凝胶在组织工程等方面有着诸多的应用，但是单纯混合后的水凝胶材料存在着性能单一性、携载能力差等问题，故这种方式很难满足疾病治疗的复杂要求。
载体复合的载药方式通常指将药物或者携载物通过一定的交联方式与水凝胶体系进行复合，实现水凝胶具备负载能力，这种方式便于调控释放负载物。其中，交联方式有很多，主要是通过化学交联和物理交联，但是在制备该类水凝胶之前需要针对携载物的特性选择合适的交联方式，例如加热交联就会对于蛋白、因子、抗体等药物造成构型、活性等方面的影响继而影响药效。
作为主要交联方式之一，化学交联载水凝胶体系构建中的运用非常广泛，通过对水凝胶体系中加入特定基团，并利用化学配位对目的携载物进行携载，从而可以实现携载目的分子并调控其释放。同时，通过化学基团反应对水凝胶体系进行构建后，会进一步增强其理化性质，例如粘附性、强度、降解率等。因此，构建负载水凝胶体系使其在维持和强化水凝胶特性的同时，还具备对携载物的负载和调控释放的功能，以实现组织修复和疾病治疗的多功能性，这对于拓展水凝胶在生物医学领域中的应用具有重要意义。
金属离子在人体正常生命活动中起到着重要作用，包括维持机体正常功能，调节体内代谢，促进机体修复，加强细胞功能等。例如Cu、Ca、Ag等金属离子可以通过影响成骨细胞、破骨细胞及其之间的平衡来促进骨再生。Zn离子可以通过促进细胞外基质的合成和分泌来修复损伤皮肤。在不同种组织内的金属离子含有很大差别，不同的生物活性离子对组织再生具有组合或协同作用。而不同组织对金属离子的选择性尤为重要，例如含Ca离子的有机玻璃用于骨修复，含Zn 离子的管型支架用于跟腱修复等。目前，对于在损伤组织复杂的环境中，同时实现不同组织选择性吸收不同金属离子促进损伤组织重建和再生具有重大的挑战，该方面的研究尚未攻克。
在临床上，肩袖损伤在肩关节疾病中的发生率最高，主要是由于术后腱-骨愈合欠佳。正常的腱骨交界面中的组织形态是逐层演变的，包括矿物质含量的渐变，胶原纤维的交错排列，顺应性的基质组织增厚等。但由于其间组织的差异性，难以实现两种组织平衡生长，且易形成疤痕样组织，故腱骨愈合较难实现完全再生。当前所用于肩袖损伤治疗的组织工程材料多以再生支架为主，例如定向排列的胶原纤维编织物、聚乳酸(l-乳酸)支架、分层脱细胞外基质支架、以及同种异体移植物等，但是部分材料整合性差、不良反应较多，且诱导再生的组织难以实现完全的同步再生，从而难以实现完全再生并引起修复后的肩袖组织结构混乱和生物力学性能较差。
因此，能否基于金属离子负载水凝胶的理论，来构建出具有分层梯度结构和促进修复再生能力的材料，以期达到分别促进骨、肌腱组织再生，并能实现诱导交界面内腱骨再生，从而构建不同组织梯度变化的腱骨组织，成为生物医学材料领域亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的就是为了解决上述技术问题，而提供一种双层金属基一体化水凝胶及其制备方法和应用。本发明通过不同金属离子具有诱导不同组织再生的能力，基于不同金属离子对组织选择性强的优点，设计出一种新型负载金属离子的水凝胶生物材料，实现了解决不同组织梯度化过度生长的难题。该水凝胶材料能够具备优良的机械性能、生物相容性和抗菌性能，其力学性能得到增强；同时能实现不同金属离子的携同负载和同步调控释放。本发明的水凝胶有望实现修复类似的具有过渡层的复杂微结构组织。
本发明的目的之一是提供一种双层金属基一体化水凝胶，其主要由水凝胶基料和两种金属离子共混交联制得；所述两种金属离子分别位于水凝胶基料的上层和下层，并与水凝胶基料相互关联后分别构成上层金属基水凝胶和下层金属基水凝胶，所述上层金属基水凝胶和下层金属基水凝胶为双层融合一体化结构。
本发明构建了一种同时携载两种金属离子，并存在不同种类离子分层和水凝胶结构分层的一体化水凝胶体系。本发明是基于金属离子与水凝胶基料(特别是巯基化明胶)可通过配位键原位交联，从而构建出了双层金属离子基一体化水凝胶，并通过金属离子间的相互渗透，实现局部类似于生理组织结构的金属离子梯度化，能够重建具有组织梯度变化的肩袖组织。该双重金属离子螯合水凝胶还具有很好的孔隙率、金属离子控释能力、操作机械强度、生物可降解性；能够缓慢释放两种金属离子，从而实现金属离子很好的抗菌作用。
本发明的双层金属基一体化水凝胶，可以实现两种金属离子良好的结合，并避免界面分离作用的产生，并形成有一定分层梯度的金属共混界面，无论在交界面中还是水凝胶整体中，分子间的配位键结合，可以显著增强水凝胶的综合力学性能。
此外，该双重金属离子螯合水凝胶还具有良好的生物相容性和生物活性，经体内实验表明如含铜离子螯合水凝胶可以有效地诱导间充干细胞的成骨分化，含锌离子螯合水凝胶可以促进肌腱细胞成腱相关基因和蛋白的表达上调。并且通过原位放置该水凝胶可以很好地促进大鼠肩袖损伤模型的修复，重建肩袖组织中腱骨交界面中的微组织结构。
以采用Zn2+离子和Cu2+离子为例，对本发明的技术构思及机理解释如下：
为了实现肌腱-骨界面的愈合，本发明利用了明胶水凝胶的细胞外基质模拟特性，铜和锌离子的组织修复能力以及金属离子的出色抗菌能力，基于金属离子与巯基基团的配位交联特性，构建了上下双层分别携载有Zn、Cu离子的水凝胶体系，并利用离子相互渗透原理构建出稳定的梯度化金属离子交界层，再通过水凝胶的降解缓慢释放出两种不同的金属离子分别促进骨、肌腱组织再生，并通过两层间的双金属离子梯度层诱导交界面内腱骨再生，从而构建不同组织梯度变化的腱骨组织。该水凝胶在具备良好机械性能、生物相容性及抗菌性能的基础上，可以实现金属离子的携载与缓释，利用Cu离子促进成骨，Zn离子促进成腱，并利用金属离子交界层中两种离子共同的诱导再生作用促进腱骨交界面的再生，以期修复类似的具有过渡层的复杂微结构组织。
本发明采用金属离子与水凝胶相结合制备水凝胶，利用金属离子与巯基化明胶中巯基基团进行配位键反应，可以实现稳定携载金属离子，形成稳定的金属基水凝胶，实现金属离子在水凝胶内的均匀分布；并减小金属离子的突释，使得金属离子的释放与水凝胶降解接近同步，从而实现水凝胶中调控释放的性能。
根据化学机理，巯基基团称氢硫基或硫醇基。是由一个硫原子和一个氢原子相连组成的负一价官能团。巯基与金属离子有很强的螯合作用，特别是重金属离子，本发明利用了巯基对金属离子的强螯合作用，实现金属离子的携带，并且因为强螯合能力会紧密结合金属离子，使得金属基水凝胶中大部分的金属离子只能随着降解而不断释放，实现水凝胶调控释放的性能。
本发明可通过利用金属离子与巯基基团间的螯合作用，既有稳定结合，又有均一分散到水凝胶中，进而实现水凝胶稳定携载和调控释放。在本发明的实施例中，所述负载金属离子的携载率在50％以上，有良好的均一性和分散特性，并有理想的持续释放能力，经交联后的一体化水凝胶能够稳定携载不同金属离子并能持续释放7天以上。
本发明所述的双层金属基一体化水凝胶，存在稳定的交界面并可将双层体现为一体化，以下为其机理：在交界面的成胶过程中，两种水凝胶中的离子可以分别渗透进另一种水凝胶内并与另一种水凝胶的Gelatin上的巯基进行配位键反应形成稳定的螯合产物，随着交联时间的增加，交界面内这两种离子的不断的相互渗透和交联，逐渐出现了一定的离子分布浓度梯度，并随着交联时间的延长和交界面内不断的渗透交联，逐渐形成稳定的、相互交联的交界过渡层，完成双层一体化水凝胶体系的构建。
进一步的是，所述水凝胶基料包括明胶及其衍生物、透明质酸及其衍生物水凝胶、BSA及其衍生物水凝胶、纤维素及其衍生物水凝胶、壳聚糖及其衍生物水凝胶、海藻盐及其衍生物水凝胶或胶原蛋白及其衍生物水凝胶；优选为巯基化明胶，所述巯基化明胶的数均分子量为8000～14000。本发明对所述水凝胶材料的来源没有特殊限制，可以采用市售产品，也可以自行制备。其中的巯基化明胶是采用明胶和2-亚氨基硫烷反应制备，具体可将明胶与2-亚氨基硫烷在双蒸水 (ddH2O)存在的条件下于水浴锅37℃进行反应，其中，明胶与2-亚氨基硫烷的质量之比可为5:1；反应体系为60ml；反应时间为1h～1.5h；反应环境为避光，得到反应液。将反应液倒入截留分子量为8000～14000的透析袋中，透析过程为 3天～4天；透析环境为避光，PH＝5～7。透析完成后，收集透析袋内的液体，进行冷冻干燥或其他方式干燥，得到巯基化明胶材料，保存至-20℃以备用。
进一步的是，所述两种金属离子包括Cu2+离子、Zn2+离子、Li+离子、Mg2+离子、Mn2+离子、Ca2+离子中的任意两种，优选为Cu2+离子和Zn2+离子。本发明中负载在水凝胶体系内的金属离子成分较为优选的为Cu2+离子和Zn2+离子，水凝胶中缓慢释放出的Cu2+离子和Zn2+离子能够对金黄色葡萄球菌产生抗菌作用；同时Cu2+离子能促进成骨，Zn2+离子能促进成腱，本发明通过构建上下双层分别携载有Zn2+、Cu2+离子的水凝胶体系，并利用离子相互渗透原理构建出稳定的梯度化金属离子交界层，再通过水凝胶的降解缓慢释放出这两种不同的金属离子分别促进骨、肌腱组织再生，并通过两层间的双金属离子梯度层诱导交界面内腱骨再生，从而构建不同组织梯度变化的腱骨组织。
除上述两种金属离子外，本发明还可以选用其他可以促进组织再生修复的金属离子，如Li+离子、Mg2+离子、Mn2+离子、Ca2+离子等。所述负载金属离子的携载率均在50％以上，有良好的均一性和分散特性，并有理想的持续释放能力。
作为优选的方案，本发明所述上层金属基水凝胶为锌金属离子基水凝胶，所述下层金属基水凝胶为铜金属离子基水凝胶。
作为优选的方案，所述Cu2+离子的来源包括硫酸铜、硝酸铜或氯化铜；所述 Zn2+离子的来源包括硫酸锌、硝酸锌或氯化锌。本发明对所述金属离子的来源没有特殊限制，可以采用市售产品，也可以自行制备。本发明所利用的金属离子可以有很多来源，例如硫酸铜、硝酸铜、氯化铜以及硫酸锌、硝酸锌、氯化锌等。本发明利用金属离子具有很好的水溶性，并在溶剂中有很好的分散均一性，这样也有利于成胶过程中金属离子均一性分布。
本发明的目的之二是提供上述双层金属基一体化水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将Zn2+金属离子溶液和Cu2+金属离子溶液分别与巯基化明胶在60～ 70℃条件下混合交联5～10分钟后，分别得到锌基水凝胶和铜基水凝胶；
(2)在铜基水凝胶混合交联30秒后将锌基水凝胶覆盖在其上面，再进行混合交联5～10分钟，即得。
本发明与金属离子共混后，可以保持水凝胶的柔韧性，同时也具有良好的强度。共混交联的时间可为5～10min，优选为5min。
本发明制备所得双层金属基一体化水凝胶的平均孔径可为5～40μm，优选为 10μm～30μm。所述双层金属基一体化水凝胶可简写为S-Cu/Zn-gelatin或S-CZ，其形貌结构为：水凝胶表面及其网络结构中，金属离子与巯基间以配位键结合，还有部分是以非价键的形式存在。从而显著增强水凝胶的压缩、拉伸、弹性等综合力学性能。
进一步的是，步骤(1)中所述Zn2+金属离子溶液和Cu2+金属离子溶液的浓度为0.05～1M，优选为0.05～0.2M，更优选为0.05M。
进一步的是，步骤(1)中所述巯基化明胶的浓度为5％～20％w/w，优选为5％～15％w/w，更优选为8％～12％w/w。
进一步的是，步骤(1)中所述巯基化明胶按照以下步骤制得：将2-亚氨基硫烷与明胶以1:5的干重在37℃水浴锅下搅拌避光反应1～1.5h混合，在避光透析72小时后冻干即得。
本发明的目的之三是提供上述双层金属基一体化水凝胶或由上述方法制备得到的双层金属基一体化水凝胶的应用，其主要是将该双层金属基一体化水凝胶用于制备组织修复和/或疾病治疗中的相关药剂。在本发明的一些实施例中，可通过局部填塞、放置等方式实现复杂微组织结构的完全再生，例如肩袖损伤修复、骨软骨修复等。本发明所述的双层金属基一体化水凝胶可根据疾病及其康复需求按时段释放，而且也为植入性材料功能化奠定了基础，对水凝胶在生物医学领域的拓展应用具有重要意义。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
(1)本发明构建了一种同时携载两种金属离子，并存在不同种类离子分层和水凝胶结构分层的一体化水凝胶体系，提供了一种新型负载金属离子的水凝胶生物材料，实现了解决不同组织梯度化过度生长的难题；
(2)本发明的双层金属离子基一体化水凝胶能够通过金属离子间的相互渗透，实现局部类似于生理组织结构的金属离子梯度化，能够实现修复类似的具有过渡层的复杂微结构组织；
(3)本发明的双层金属离子基一体化水凝胶具有很好的孔隙率、金属离子控释能力、操作机械强度、生物可降解性；能够缓慢释放两种金属离子，并避免界面分离作用的产生，并形成有一定分层梯度的金属共混界面，无论在交界面中还是水凝胶整体中，分子间的配位键结合，可以显著增强水凝胶的综合力学性能。
(4)本发明的双重金属离子螯合水凝胶还具有良好的生物相容性和生物活性，经体内实验表明本发明的水凝胶材料中的含铜离子螯合水凝胶可以有效地诱导间充干细胞的成骨分化，含锌离子螯合水凝胶可以促进肌腱细胞成腱相关基因和蛋白的表达上调；并且通过原位放置该水凝胶可以很好地促进大鼠肩袖损伤模型的修复，重建肩袖组织中腱骨交界面中的微组织结构。
附图说明
图1为水凝胶的形态和特征：A)制备铜基水凝胶(s-Cu-gelatin)，锌基水凝胶 (s-Zn-gelatin)和巯基化明胶(s-gelatin)的化学机理；B-D)各组的SEM图像 (bar＝100μm)；E-G)各组的SEM局部图像(bar＝50μm)；H,K)在ddH2O中Zn2+和Cu2+离子的释放速率。铜基水凝胶和锌基水凝胶的不同离子浓度在0.15％ColI 胶原酶溶液(I，L)和ddH2O(J，M)中的降解率。
图2为梯度化双金属离子水凝胶的细胞相容性和抗菌性能。A)代表性的荧光图像显示活钙黄绿素染色的(绿色)和死的PI标记的(红色)BMSC在两种凝胶中培养1、3和5天(bar＝100μm)后；B)第1、4和7天培养后的BMSC的 CCK8检测结果；C，D)两种凝胶的琼脂扩散试验均采用0.05M的金属离子溶液对金黄色葡萄球菌的抗菌敏感性(bar＝1cm)；E)在双金属离子水凝胶中培养3天(bar＝100μm)后，用鬼笔环肽对肌动蛋白丝(红色)和DAPI对核(蓝色)成骨细胞和肌腱细胞进行双染的共聚焦；F)细胞骨架及细胞核的细节(bar ＝50μm)；G)在新型水凝胶中培养1、3和5天后，对成骨细胞和肌腱细胞的活 /死染色；H)CCK8检测在第1、4和7天培养的成骨细胞增殖情况；I)CCK8 检测在第1、4和7天培养的肌腱细胞增殖情况(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.01)。
图3为体外试验对细胞行为的影响。A)第1、3、7、14天的碱性磷酸酶染色的大体照片(bar＝2毫米)；B)碱性磷酸酶活性的定量分析数据；C)第1、7、14、21 天用碱性磷酸酶茜素红染色的大体照片(bar＝2mm)；D)茜素红染色矿化结节的定量分析；E,F,G,H)培养7天后骨形成相关基因Runx2,ColI,ALP,14天后骨形成相关基因OCN的表达；I)在培养3天后，不同浓度的锌离子对肌腱细胞的CCK8 检测结果；J)不同浓度的锌离子刺激肌腱细胞中ColI、ColIII、MMP13、SCX和 GAPDH蛋白表达水平；K,L,M)锌离子刺激下的ColI、ColIII、SCX细胞中腱相关基因的表达。(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)。
图4为双层金属水凝胶的组织修复能力。A)术后8周，MRI扫描图像结果(橙色为突出标记，bar＝5mm)；B)术后8周的micro-CT图像(橙色为突出标记)；C,D) 修复后的肩袖组织的最大应力和应变；E,F)不同组的术后BVD和BV/TV。(*P< 0.05，**P<0.01，***P<0.001)。
图5为术后的肌腱-骨界面组织的形态学分析结果图；(A)各组间术后组织HE染色切片结果；(B)不同组间肌腱成熟评分；(C)术后组织甲苯胺蓝染色的切片结果；(D)不同组间新生纤维软骨面积，(*P<0.05, **P<0.01,*** P<0.001)；E, F)不同组的术后BMD和BV/TV；(*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001)。
图6为水凝胶的储存模量和损失模量测试结果图，(A-C)铜基水凝胶、锌基水凝胶和巯基明胶的G'(储存模量)和G'(损失模量)变化。
图7为水凝胶的平均直径和FITR谱，(A-B)铜基水凝胶、锌基水凝胶和巯基明胶的(A)平均直径和(B)FITR谱。
图8为流式细胞术分析不同浓度锌离子诱导的细胞在第3天的凋亡情况。
图9为术后4周，采用单纯缝合修复(Control)、巯基化明胶水凝胶(S-Gelatin)和双金属离子基水凝胶(S-Cu/Zn-Gelatin)处理各组micro-CT测试结果图。
图10为术后8周，采用单纯缝合修复(Control)、巯基化明胶水凝胶(S-Gelatin)和双金属离子基水凝胶(S-Cu/Zn-Gelatin)处理的天狼星红染色切片结果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行具体描述，有必要指出的是，以下实施例仅仅用于对本发明进行解释和说明，并不用于限定本发明。本领域技术人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1
一种双层金属基一体化水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
(1)将1M浓度Zn2+金属离子溶液和1M浓度Cu2+金属离子溶液分别与10％浓度的巯基化明胶溶液在60～70℃条件下混合交联，放置于室温环境下1～3分钟后，分别得到1M的锌基水凝胶和1M的铜基水凝胶；
(2)在铜基水凝胶混合交联10秒后将锌基水凝胶覆盖在其上表面，放置于室温环境下再进行混合交联1～2分钟左右，即得。
上述巯基化明胶的制备方法为：将明胶与2-亚氨基硫烷在双蒸水(ddH2O) 存在的条件下于水浴锅37℃进行反应，其中，明胶与2-亚氨基硫烷的质量之比为5:1；反应体系为60ml；反应时间为1h～1.5h；反应环境为避光，得到反应液。将反应液倒入截留分子量为8000～14000的透析袋中，透析过程为3天～4天；透析环境为避光，PH＝5～7。透析完成后，收集透析袋内的液体，进行冷冻干燥或其他方式干燥，得到巯基化明胶材料，保存至-20℃以备用，其截留分子量为 8000～14000。(以下其它实施例的制备方法相同。)
本发明中金属基水凝胶的制备方法如下：取合适浓度的巯基化Gelatin溶液与适当浓度的铜离子溶液在60℃条件下混合，使得Cu2+离子与Gelatin上巯基进行充分的配位键反应，形成含Cu2+离子的螯合产物，完成交联过程。再交联5 分钟后，可以得到铜基水凝胶体系；同理可得锌基水凝胶。(以下其它实施例的制备方法相同。)
实施例2
一种双层金属基一体化水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
(1)将0.2M浓度Zn2+金属离子溶液和0.2M浓度Cu2+金属离子溶液分别与 10％浓度的巯基化明胶溶液在60～70℃条件下混合交联，放置于室温环境下 5～10分钟后，分别得到锌基水凝胶和铜基水凝胶；
(2)在铜基水凝胶混合交联20秒后将锌基水凝胶覆盖在其上表面，放置于室温环境下再进行混合交联2～3分钟左右，即得。
实施例3
一种双层金属基一体化水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
(1)将0.05M浓度Zn2+金属离子溶液和0.05M浓度Cu2+金属离子溶液分别与10％浓度的巯基化明胶溶液在60～70℃条件下混合交联，放置于室温环境下5～10分钟后，分别得到锌基水凝胶和铜基水凝胶；
(2)在铜基水凝胶混合交联30秒后将锌基水凝胶覆盖在其上表面，放置于室温环境下再进行混合交联3～5分钟左右，即得。
实施例4
一种双层金属基一体化水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
(1)将1M浓度Zn2+金属离子溶液和1M浓度Cu2+金属离子溶液分别与15％浓度的巯基化明胶溶液在60～70℃条件下混合交联，放置于室温环境下1～3分钟后，分别得到1M的锌基水凝胶和1M的铜基水凝胶；
(2)在铜基水凝胶混合交联10秒后将锌基水凝胶覆盖在其上表面，放置于室温环境下再进行混合交联1～2分钟左右，即得。
实施例5
一种双层金属基一体化水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
(1)将0.2M浓度Zn2+金属离子溶液和0.2M浓度Cu2+金属离子溶液分别与 15％浓度的巯基化明胶溶液在60～70℃条件下混合交联，放置于室温环境下 5～10分钟后，分别得到锌基水凝胶和铜基水凝胶；
(2)在铜基水凝胶混合交联20秒后将锌基水凝胶覆盖在其上表面，放置于室温环境下再进行混合交联2～3分钟左右，即得。
实施例6
一种双层金属基一体化水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
(1)将0.05M浓度Zn2+金属离子溶液和0.05M浓度Cu2+金属离子溶液分别与15％浓度的巯基化明胶溶液在60～70℃条件下混合交联，放置于室温环境下 5～10分钟后，分别得到锌基水凝胶和铜基水凝胶；
(2)在铜基水凝胶混合交联30秒后将锌基水凝胶覆盖在其上表面，放置于室温环境下再进行混合交联3～5分钟左右，即得。
经表征获得，本发明上述实施例1-6制备所得双层金属基一体化水凝胶的平均孔径为5～40μm，大多数孔径在10μm～30μm的较优范围内。上述双层金属基一体化水凝胶可简写为S-Cu/Zn-gelatin或S-CZ，其形貌结构为：水凝胶表面及其网络结构中，金属离子与巯基间以配位键结合，还有部分是以非价键的形式存在。从而显著增强水凝胶的压缩、拉伸、弹性等综合力学性能。
应用例1
将本发明上述制备的双层金属基一体化水凝胶用于制备组织修复和/或疾病治疗中，通过将双层金属基一体化水凝胶进行修剪，得到2*2*1mm左右的水凝胶支架，通过在单纯缝合将肩袖、水凝胶、骨组织紧密贴合的方式，达到铜基水凝胶紧密贴附骨组织，锌基水凝胶紧密贴附肩袖组织的效果，实现对复杂微组织结构的再生可通过局部填塞、放置等方式实现复杂微组织结构的完全再生，本发明的双层金属基一体化水凝胶可根据疾病及其修复阶段的再生需求按时段释放。
测试和结果例1
对本发明实施例1所得水凝胶进行形态和特征表征，其结果如图1。图1中： A)制备铜基水凝胶(s-Cu-gelatin)，锌基水凝胶(s-Zn-gelatin)和巯基化明胶 (s-gelatin)的化学机理；B-D)各组的SEM图像(bar＝100μm)；E-G)各组的SEM 局部图像(bar＝50μm)；H,K)在ddH2O中Zn2+和Cu2+离子的释放速率。铜基水凝胶和锌基水凝胶的不同离子浓度在0.15％ColI胶原酶溶液(I，L)和ddH2O (J，M)中的降解率。
图1中具体检测实施方法：
图1中，SEM检测步骤：1.样品准备：制备不同组别的金属离子基水凝胶，并将制备好的水凝胶切割成4～6mm3的小块，放入24孔板内或者盖玻片上。2. 样品脱水处理：样品放入-80℃冰箱进行进行预冷处理24h后，放入冻干机内进行冻干处理。3.喷镀及观察：将样品放在真空镀膜机内，镀金45s后，取出样品在扫描电镜中进行观察。
图1中，金属离子释放步骤：1.样品准备：制备不同组别的金属离子基水凝胶，并将制备好的水凝胶切割成1cm3的小块。2.金属离子释放实验：将金属离子基水凝胶放入装有4ml的ddH2O的离心管内，放入37℃的摇床，在不同的时间点，例如第1天、第4天、第7天，第14天，第21天等，通过电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-MS)对浸出液中金属离子的浓度进行检测。
图1中，金属离子在ddH2O中降解实验步骤：1.样品准备：制备不同组别的金属离子基水凝胶，并将制备好的水凝胶切割成1cm3的小块。2.样品重量检测：对水凝胶进行称重后，再将水凝胶放入装有4ml的ddH2O的离心管内，放入37℃的摇床，在不同的时间点，例如第1天、第4天、第7天，第14天，第21天等，分别取出进行称重记录。3.数据结果统计：根据初始重量为W0，不同时期检测的重量为Wt，最终的降解率(％)为＝(W0-Wt)/W0×100％。
图1中，金属离子在0.15％ColI酶溶液中降解实验步骤：1.样品准备：制备不同组别的金属离子基水凝胶，并将制备好的水凝胶切割成1cm3的小块。2. 样品重量检测：对水凝胶进行称重后，再将水凝胶放入装有4ml的0.15％ColI 酶溶液的离心管内，放入37℃的摇床，在不同的时间点，例如第1天、第4天、第7天，第14天，第21天等，分别取出进行称重记录。3.数据结果统计：根据初始重量为W0，不同时期检测的重量为Wt，最终的降解率(％)为＝(W0-Wt) /W0×100％。
对本发明实施例1所得水凝胶进行细胞相容性和抗菌性能测试，其结果如图2所示。图2中：A)代表性的荧光图像显示活钙黄绿素染色的(绿色)和死的PI标记的(红色)BMSC在两种凝胶中培养1、3和5天(bar＝100μm)后； B)第1、4和7天培养后的BMSC的CCK8检测结果；C，D)两种凝胶的琼脂扩散试验均采用0.05M的金属离子溶液对金黄色葡萄球菌的抗菌敏感性 (bar＝1cm)；E)在双金属离子水凝胶中培养3天(bar＝100μm)后，用鬼笔环肽对肌动蛋白丝(红色)和DAPI对核(蓝色)成骨细胞和肌腱细胞进行双染的共聚焦；F)细胞骨架及细胞核的细节(bar＝50μm)；G)在新型水凝胶中培养 1、3和5天后，对成骨细胞和肌腱细胞的活/死染色；H)CCK8检测在第1、4 和7天培养的成骨细胞增殖情况；I)CCK8检测在第1、4和7天培养的肌腱细胞增殖情况(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.01)。
图2中具体检测实施方法：
图2中钙黄绿素(CalceinAM)染色和碘化丙啶(PI)染色步骤：
1.利用活死染色试剂盒(KGAF001，凯基生物，中国)配置工作液：
1)取出钙黄素AM和PI试剂原液，室温平衡30分钟。
2)加入5μL 16mM的PI储液至10mL的PBS中，涡旋震荡混匀，得到8μM 的PI溶液。
3)将5μL 4mM的钙黄素AM储液加入到10ml的PI溶液中，涡旋混匀，确保充分混匀。
4)所得到的工作液(2μM钙黄素AM和8μM PI)可直接用于染色细胞。
注意：钙黄素AM和PI的浓度选择依据所用的细胞类型不同而有区别，应当根据具体细胞调节染料浓度以得到最佳效果。一般来说，满足信号足够的前提下，尽可能选择最低浓度的染料剂量。钙黄素AM和PI推荐浓度范围为 0.1～10μM。钙黄素AM的水溶液容易发生水解，应当当天用完。
2.细胞处理：1)在1cm*1cm*1cm左右的不同种金属离子水凝胶上种入1x105的细胞与6孔板上，并在37℃培养箱中分别培养1、3、5天后，运用4％多聚甲醛在室温进行固定，固定15min后放入1xPBS中准备染色。
3.染色：加入足量的上述工作液，保证没过单层细胞，室温孵育30～45分钟。
4.荧光显微镜下观察标记细胞。荧光图像由激光扫描共聚焦显微镜(LSCM，蔡司，德国)获取。
图2中CCK8检测步骤：将待检测细胞以1x104的密度种在96孔板，并以不同水凝胶的浸出液培养。孵育1、4、7天后，将CCK-8试剂(ck04,Dojindo，日本)与新鲜的DMEM培养基混合培养4小时，在450nm处用酶标仪(TECAN，瑞士)测定细胞活力。
图2中抗菌实验步骤：采用抑菌圈法测定金属离子基水凝胶对金黄色葡萄球菌的抑菌活性。先将金黄色葡萄球菌的密度调整到106CFU/ml，然后将菌悬液铺在琼脂表面接种。将不同种水凝胶分别置于琼脂板中央，37℃与金黄色葡萄球菌共培养12h或24h。通过从总抑制区的直径中减去每个水凝胶的直径，可以直观地测量抑制区的大小。
图2中，细胞骨架蛋白(鬼笔还肽)和细胞核(DAPI)染色实验步骤：
1.细胞处理：1)在1cm*1cm*1cm左右的不同种金属离子水凝胶上种入1x105 的细胞与6孔板上，并在37℃培养箱中分别培养1、3、5天后，运用4％多聚甲醛(PFA,E672002,Sangon Biotech,China)在室温进行固定，固定15min后放入1xPBS中准备染色。
2.染色：加入1:300稀释的鬼笔还肽染色试剂(Invitrogen,A12379,US)，保证没过单层细胞，室温孵育30～45分钟。用1xPBS洗涤后，再加入DAPI染色试剂(Sigma,S7113,US)，保证没过单层细胞，室温孵育30～45分钟。
3.荧光显微镜下观察标记细胞。荧光图像由激光扫描共聚焦显微镜(LSCM，蔡司，德国)获取。
对本发明实施例1所得水凝胶进行体外试验测试，其结果如图3所示。
图3为体外试验对细胞行为的影响，其中：A)第1、3、7、14天的碱性磷酸酶染色的大体照片(bar＝2毫米)；B)碱性磷酸酶活性的定量分析数据；C)第1、7、 14、21天用碱性磷酸酶茜素红染色的大体照片(bar＝2mm)；D)茜素红染色矿化结节的定量分析；E,F,G,H)培养7天后骨形成相关基因Runx2,ColI,ALP,14天后骨形成相关基因OCN的表达；I)在培养3天后，不同浓度的锌离子对肌腱细胞的CCK8检测结果；J)不同浓度的锌离子刺激肌腱细胞中ColI、ColIII、MMP13、 SCX和GAPDH蛋白表达水平；K,L,M)锌离子刺激下的ColI、ColIII、SCX细胞中腱相关基因的表达。(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)。
图3中碱性磷酸酶染色步骤：
(1)将用浸出液贴壁培养的细胞以及种入细胞的水凝胶用DPBS洗3遍。
(2)加入4％多聚甲醛，固定15min，然后用DPBS冲洗贴壁细胞3次。
(3)按照如下比例加入碱性磷酸酯酶显色试剂盒(C3206，碧云天，中国) 中的各溶液，混匀后配成BCIP/NBT染色工作液，确保能充分覆盖样品：
Figure BDA0002717816950000141
(4)室温避光孵育5～30min或更长时间(最长可达24h)，直至显色至预期深浅。
(5)DPBS洗3遍后，存放于DPBS溶液中保存，正置显微镜下拍照。
图3中茜素红染色步骤：
(1)将用浸出液贴壁培养的细胞以及种入细胞的水凝胶用DPBS洗3遍。
(2)加入4％多聚甲醛，固定15min，然后用DPBS冲洗贴壁细胞3次。
(3)以10mg/ml的浓度配置茜素红染色剂(ST1078，碧云天，中国)
(4)室温避光孵育5～30min或更长时间(最长可达24h)，直至显色至预期深浅。
(5)DPBS洗3遍后，存放于DPBS溶液中保存，正置显微镜下拍照。
图3中蛋白表达检测：
不同处理后的成骨细胞和TT-D6用PBS洗涤，在4℃用混合蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液匀浆30min，超声粉碎，离心细胞提取液，收集上清。上清总蛋白定量使用Branford蛋白检测试剂盒(KeyGEN Biotech，南京，中国)。用SDS-PAGE将总蛋白分离，转移到PVDF膜上，在5％脱脂牛奶中，用 0.1％TBS(TBST)稀释1h，然后在4℃与一抗孵育过夜。用TBST洗涤膜，然后与辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗在室温下孵育1h。免疫复合物在黑暗中用 ECL显影，并用荧光成像分析系统进行检测。通过Image J 5.0软件定量表达蛋白。
图3中基因表达检测：
使用Trizol试剂和RNeasy Mini试剂盒提取总RNA。使用cDNA转录试剂盒(Invitrogen)，总计有500ng的总RNA逆转录至cDNA。实时荧光定量PCR使用LightCycler480PCR(Indianapolis,IN)和20磅的SYBR Green反应体系。PCR 扩增50个周期。利用管家基因(GAPDH)表达水平对基因表达水平进行规范化。
对本发明实施例1所得水凝胶进行组织修复能力测试。图4为双层金属水凝胶的组织修复能力。A)术后8周，MRI扫描图像结果(橙色为突出标记，bar＝5 mm)；B)术后8周的micro-CT图像(橙色为突出标记)；C,D)修复后的肩袖组织的最大应力和应变；E,F)不同组的术后BVD和BV/TV。(*P<0.05，**P<0.01， ***P<0.001)。
图4中肩袖损伤修补手术步骤：
大鼠肩袖撕裂模型的手术方法:建立大鼠肩袖撕裂模型，评价离子基水凝胶的体内修复能力。本实验选用48只Sprague Dawley大鼠，随机分为4组，分别为双金属离子梯度水凝胶(命名为s-Cu/zn-gelatin)、纯硫醇-明胶组(命名为 s-gelatin)、缺陷组(命名为defect)和单纯缝合组组(命名为control)。手术步骤大致如下:先用异氟醚对动物进行通风，并对皮肤进行部分消毒，露出三角肌。切断三角肌，显露冈上肌，沿冈上肌与胫骨连接处分离冈上肌。用7号角针在肱骨大结节处钻洞，用5号线将棘上肌重新缝合到大结节处，可将5号线塞进材料中，完成肩袖损伤模型。所有动物实验和繁殖地点均由上海创伤骨科研究所动物馆提供。所有实验均按照动物福利协议进行。
图4中大鼠肩袖的MRI检测过程：在术后第8周将大鼠进行麻醉，吸入异氟醚(1-2％)，通过动物磁共振成像(MRI)系统(BioSpec70/20USR)进行测试和评估。将大鼠肱骨大结节固定在机器探头上，进行T1WI、T2WI、T2WI-fs系列相扫描。最后采用不同阶段的比较来评价不同组的肩袖修复情况。
图4和图9大鼠肩袖的Micro-CT检测过程：
术后的第4周和8周处死后，取下大鼠的肱骨，采用Micro-CT(Scanco Medical,Bassersdorf，瑞士)对肱骨近端形态进行评估。设等距分辨率为20微米。从整体和纵向切片记录三维图像。通过厂商提供的软件，对骨密度(BMD)、骨体积/总体积(BV/TV)等形态测量数据进行分析比较，评价不同组间的骨组织的修复情况。
对本发明实施例1所得水凝胶进行术后的肌腱-骨界面组织的形态学分析。图5为术后的肌腱-骨界面组织的形态学分析结果图。(A)各组间术后组织HE染色切片结果；(B)不同组间肌腱成熟评分；(C)术后组织甲苯胺蓝染色的切片结果； (D)不同组间新生纤维软骨面积。(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001)。
图5中组织切片的步骤：
在第4周和第8周献祭当天，各组未脱钙样品用4％中性甲醛缓冲液固定。样品经过乙醇系列的分级脱水后，经过充分的渗透和聚合，在纯化的甲基丙烯酸甲酯(MMA)中浸泡近60天。然后，对嵌入良好的样品进行纵向切割，厚度约为 50微米(德国，SP1600，Leica)。并对对应部位进行HE和台盼蓝染色。
对本发明实施例1所得水凝胶进行储存模量和损失模量测试，其结果如图6 所示。
图6中，(A-C)铜基水凝胶、锌基水凝胶和巯基明胶的G'(储存模量)和G'(损失模量)变化。
图6中流变步骤：制备好的水凝胶放置在40mm直径的夹板上进行振荡(oscillation)模式下的流变学研究，频率设置为10rad/s，温度为25℃，应力范围为0.1～1000％。
对本发明实施例1所得水凝胶进行平均直径和FITR谱测试，结果如图7。图7中，(A-B)铜基水凝胶、锌基水凝胶和巯基明胶的(A)平均直径和(B)FITR 谱。
图7的FITR检测步骤：将离子水凝胶经冻干后磨成细粉，与溴化钾(KBr) 混合后压成粉末。在500-4000nm进行FTIR扫描。
采用流式细胞术分析不同浓度锌离子诱导的细胞在第3天的凋亡情况，其结果如图8所示。
图8中细胞流式分析步骤：将细胞接种于6孔板，1×105个/孔，培养24h 后，用不同浓度的硫酸锌溶液处理24h。然后使用FITCAnnexinV凋亡检测试剂盒(BD Biosciences,SanJose,CA,USA)按照生产厂家的说明书检测细胞凋亡。荧光强度使用Becton-DickinsonFACS口径流式细胞仪(BD Biosciences)测量。
对术后4周，采用单纯缝合修复(Control)、巯基化明胶水凝胶(S-Gelatin)和双金属离子基水凝胶(S-Cu/Zn-Gelatin)处理各组进行micro-CT测试，其结果见图 9。
对术后8周，采用单纯缝合修复(Control)、巯基化明胶水凝胶(S-Gelatin)和双金属离子基水凝胶(S-Cu/Zn-Gelatin)处理的天狼星红染色切片进行测定，其结果见图10。
图10，对对应部位的肩袖组织切片进行天狼星红染色。
所有结果均以平均值±标准差表示。数据分析采用单因素方差分析，然后采用Tukey’s检验(GraphPad Prism软件)，p<0.05表示差异显著。(*p<0.05；**p <0.01，***p<0.005)
对比例1:
本发明的实施例中，对于铜基水凝胶的制备而言，当金属离子溶液浓度超过 2M时，则会导致铜基水凝胶的成胶速度过快，而不能与锌基水凝胶完成交界面的成胶过程：
(1)如果金属离子溶液的浓度超过2M时，例如将2M浓度Zn2+金属离子溶液和2M浓度Cu2+金属离子溶液分别与10％浓度的巯基化明胶溶液在60～ 70℃条件下混合交联，放置于室温环境下会快速成胶，分别得到2M的锌基水凝胶和2M的铜基水凝胶；
(2)两种水凝胶在各自的交联后会难以再通过相互覆盖形成交界面，而是两个相互分离的水凝胶。
对比例2:
在构建双层水凝胶的过程中，需严格按照本发明的制备方法进行，若两种水凝胶过早进行混合，则会导致两种离子层的交界面出现不稳定和两种水凝胶直接混合成胶；若两种水凝胶过晚进行混合，则会导致两种水凝胶分别成胶，无法形成交界面：
(1)例如将1M浓度Zn2+金属离子溶液和1M浓度Cu2+金属离子溶液分别与10％浓度的巯基化明胶溶液在60～70℃条件下混合交联，放置于室温环境下会快速成胶，分别得到1M的锌基水凝胶和1M的铜基水凝胶；
(2)在铜基水凝胶混合交联后立即将锌基水凝胶覆盖在其上表面，这样锌基水凝胶会与铜基水凝胶直接混合而导致两种水凝胶的混合，交界面无法形成。
对比例3:
本发明的实施例中反应条件需在60～70℃下进行，如果低于这个温度，例如在室温下，就会因为成胶过快而导致金属离子交界面难以稳定地形成：
(1)例如将1M浓度Zn2+金属离子溶液和1M浓度Cu2+金属离子溶液分别与10％浓度的巯基化明胶溶液在室温条件下混合交联会快速成交，分别得到1M 的锌基水凝胶和1M的铜基水凝胶；
(2)在铜基水凝胶混合交联后立即将锌基水凝胶覆盖在其上表面，这样锌基水凝胶会与铜基水凝胶会因为各自直接成胶而无法形成稳定的交界面。
对比例4:(采用明胶不能修复。以及采用不同浓度的巯基化明胶不能修复)
本发明的实施例中反应条件需在60～70℃下进行，如果低于这个温度，例如在室温下，就会因为成胶过快而导致金属离子交界面难以稳定地形成：
(1)例如将1M浓度Zn2+金属离子溶液和1M浓度Cu2+金属离子溶液分别与10％浓度的巯基化明胶溶液在室温条件下混合交联会快速成交，分别得到1M 的锌基水凝胶和1M的铜基水凝胶；
(2)在铜基水凝胶混合交联后立即将锌基水凝胶覆盖在其上表面，这样锌基水凝胶会与铜基水凝胶会因为各自直接成胶而无法形成稳定的交界面。
对比例5:
本发明例中，保证明胶与2-亚氨基硫烷的质量之比为5:1左右，若过高则会导致巯基基团过多，影响后期金属离子与巯基基团成胶网络的形成，若过低则会导致活性巯基基团数量不够，影响后期成胶交联时间。
(1)例如将明胶与2-亚氨基硫烷的质量之比改为2:1左右，则会导致交联成胶后的金属离子基水凝胶中，出现更多的S-S键，而减少了S-Cu或S-Zn键比例，使得后期金属离子的释放不稳定以及成胶后水凝胶网络已破坏；
(2)例如将明胶与2-亚氨基硫烷的质量之比改为8:1左右，则会导致过少交联成胶后的金属离子基水凝胶中，使得S-Cu或S-Zn键数量减少，使得后期金属离子的释放不够。

Claims (10)

1.一种双层金属基一体化水凝胶，其特征在于，主要由水凝胶基料和两种金属离子共混交联制得；所述两种金属离子分别位于水凝胶基料的上层和下层，并与水凝胶基料相互关联后分别构成上层金属基水凝胶和下层金属基水凝胶，所述上层金属基水凝胶和下层金属基水凝胶为双层融合一体化结构。
2.根据权利要求1所述的双层金属基一体化水凝胶，其特征在于，所述水凝胶基料包括明胶及其衍生物、透明质酸及其衍生物水凝胶、BSA及其衍生物水凝胶、纤维素及其衍生物水凝胶、壳聚糖及其衍生物水凝胶、海藻盐及其衍生物水凝胶或胶原蛋白及其衍生物水凝胶；优选为巯基化明胶，所述巯基化明胶的数均分子量为8000～14000。
3.根据权利要求1所述的双层金属基一体化水凝胶；其特征在于，所述两种金属离子包括Cu2+离子、Zn2+离子、Li+离子、Mg2+离子、Mn2+离子、Ca2+离子中的任意两种，优选为Cu2+离子和Zn2+离子。
4.根据权利要求3所述的双层金属基一体化水凝胶；其特征在于，所述上层金属基水凝胶为锌金属离子基水凝胶，所述下层金属基水凝胶为铜金属离子基水凝胶。
5.根据权利要求3所述的双层金属基一体化水凝胶，其特征在于，所述Cu2+离子的来源包括硫酸铜、硝酸铜或氯化铜；所述Zn2+离子的来源包括硫酸锌、硝酸锌或氯化锌。
6.一种如权利要求4所述的双层金属基一体化水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将Zn2+金属离子溶液和Cu2+金属离子溶液分别与巯基化明胶在60～70℃条件下混合交联5～10分钟后，分别得到锌基水凝胶和铜基水凝胶；
(2)在铜基水凝胶混合交联30秒后将锌基水凝胶覆盖在其上表面，再进行混合交联5～10分钟，即得。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述Zn2+金属离子溶液和Cu2+金属离子溶液的浓度为0.05～1M，优选为0.05～0.2M，更优选为0.05M。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述巯基化明胶的浓度为5％～20％w/w，优选为5％～15％w/w，更优选为8％～12％w/w。
9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述巯基化明胶按照以下步骤制得：将2-亚氨基硫烷与明胶以1:5的干重在37℃水浴锅下搅拌避光反应1～1.5h混合，在避光透析72小时后冻干即得。
10.如权利要求1～5任一项所述的双层金属基一体化水凝胶或由权利要求6-8任一项所述方法制备得到的双层金属基一体化水凝胶的应用，其特征在于，是将该双层金属基一体化水凝胶用于制备组织修复和/或疾病治疗中的相关药剂。
CN202011077954.4A 2020-10-10 2020-10-10 一种双层金属基一体化水凝胶及其制备方法和应用 Active CN112263541B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011077954.4A CN112263541B (zh) 2020-10-10 2020-10-10 一种双层金属基一体化水凝胶及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011077954.4A CN112263541B (zh) 2020-10-10 2020-10-10 一种双层金属基一体化水凝胶及其制备方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112263541A true CN112263541A (zh) 2021-01-26
CN112263541B CN112263541B (zh) 2023-09-19

Family

ID=74338378

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011077954.4A Active CN112263541B (zh) 2020-10-10 2020-10-10 一种双层金属基一体化水凝胶及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112263541B (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112999146A (zh) * 2021-03-19 2021-06-22 上海交通大学医学院附属瑞金医院 一种可注射黏附性水凝胶及其制备方法与应用
CN113318269A (zh) * 2021-04-22 2021-08-31 江苏大学 一种CuS纳米颗粒蛋白水凝胶及其制备方法与应用
CN113413487A (zh) * 2021-05-08 2021-09-21 江苏大学 一种可注射自愈合的载药蛋白水凝胶及其制备方法与应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004018472A (ja) * 2002-06-18 2004-01-22 Menicon Co Ltd 薬剤徐放可能ヒドロゲル材料
CN108203448A (zh) * 2016-12-19 2018-06-26 香港中文大学 促进矿化并提供生物活性离子的持续释放的可注射水凝胶
CN109054051A (zh) * 2018-06-25 2018-12-21 浙江大学 一种基于双重离子配位的高强韧自修复物理水凝胶及其制备方法
CN109369516A (zh) * 2018-10-24 2019-02-22 南华大学 一种Cu-Ag双金属水凝胶的制备方法与一种晶体的制备方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004018472A (ja) * 2002-06-18 2004-01-22 Menicon Co Ltd 薬剤徐放可能ヒドロゲル材料
CN108203448A (zh) * 2016-12-19 2018-06-26 香港中文大学 促进矿化并提供生物活性离子的持续释放的可注射水凝胶
CN109054051A (zh) * 2018-06-25 2018-12-21 浙江大学 一种基于双重离子配位的高强韧自修复物理水凝胶及其制备方法
CN109369516A (zh) * 2018-10-24 2019-02-22 南华大学 一种Cu-Ag双金属水凝胶的制备方法与一种晶体的制备方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
RENHAO YANG ET AL.: ""Gradient bimetallic ion–based hydrogels for tissue microstructure reconstruction of tendon-to-bone insertion"" *
TIMOTHY E L DOUGLAS 等: ""Novel injectable, self-gelling hydrogel–microparticle composites for bone regeneration consisting of gellan gum and calcium and magnesium carbonate microparticles"" *
娄翔等: ""巯基化壳聚糖/明胶的制备研究"" *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112999146A (zh) * 2021-03-19 2021-06-22 上海交通大学医学院附属瑞金医院 一种可注射黏附性水凝胶及其制备方法与应用
CN112999146B (zh) * 2021-03-19 2023-11-24 上海交通大学医学院附属瑞金医院 一种可注射黏附性水凝胶及其制备方法与应用
CN113318269A (zh) * 2021-04-22 2021-08-31 江苏大学 一种CuS纳米颗粒蛋白水凝胶及其制备方法与应用
CN113413487A (zh) * 2021-05-08 2021-09-21 江苏大学 一种可注射自愈合的载药蛋白水凝胶及其制备方法与应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN112263541B (zh) 2023-09-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112263541B (zh) 一种双层金属基一体化水凝胶及其制备方法和应用
Dang et al. Fabrication and evaluation of thermosensitive chitosan/collagen/α, β-glycerophosphate hydrogels for tissue regeneration
Zhao et al. Biomimetic mineralization of carboxymethyl chitosan nanofibers with improved osteogenic activity in vitro and in vivo
Man et al. The effects of co-delivery of BMSC-affinity peptide and rhTGF-β1 from coaxial electrospun scaffolds on chondrogenic differentiation
Adhikari et al. Magnesium incorporated chitosan based scaffolds for tissue engineering applications
Cao et al. Vascularization and bone regeneration in a critical sized defect using 2-N, 6-O-sulfated chitosan nanoparticles incorporating BMP-2
Wu et al. Biomimetic mineralization of novel hydroxyethyl cellulose/soy protein isolate scaffolds promote bone regeneration in vitro and in vivo
CN108310467B (zh) 一种组装型细胞衍生细胞外基质膜复合骨修复材料及其制备方法和应用
Cao et al. Bone regeneration using photocrosslinked hydrogel incorporating rhBMP-2 loaded 2-N, 6-O-sulfated chitosan nanoparticles
Li et al. Functional regeneration of ligament-bone interface using a triphasic silk-based graft
Wong et al. Elastin and collagen enhances electrospun aligned polyurethane as scaffolds for vascular graft
Medberry et al. Hydrogels derived from central nervous system extracellular matrix
Zhang et al. RGD-conjugated copolymer incorporated into composite of poly (lactide-co-glycotide) and poly (L-lactide)-grafted nanohydroxyapatite for bone tissue engineering
Hu et al. Biomimetic fabrication of icariin loaded nano hydroxyapatite reinforced bioactive porous scaffolds for bone regeneration
Xu et al. Synchronous delivery of hydroxyapatite and connective tissue growth factor derived osteoinductive peptide enhanced osteogenesis
Samavedi et al. Response of bone marrow stromal cells to graded co-electrospun scaffolds and its implications for engineering the ligament-bone interface
Xu et al. Hierarchically porous nagelschmidtite bioceramic–silk scaffolds for bone tissue engineering
Sangkert et al. Modified silk fibroin scaffolds with collagen/decellularized pulp for bone tissue engineering in cleft palate: morphological structures and biofunctionalities
Chomchalao et al. Fibroin and fibroin blended three-dimensional scaffolds for rat chondrocyte culture
Chen et al. A three-dimensional (3D) printed biomimetic hierarchical scaffold with a covalent modular release system for osteogenesis
Zhou et al. Surface biofunctionalization of the decellularized porcine aortic valve with VEGF-loaded nanoparticles for accelerating endothelialization
DeVolder et al. Modulating the rigidity and mineralization of collagen gels using poly (lactic-co-glycolic acid) microparticles
Cengiz et al. Entrapped in cage (EiC) scaffolds of 3D-printed polycaprolactone and porous silk fibroin for meniscus tissue engineering
Sadek et al. Enhancement of critical-sized bone defect regeneration using UiO-66 nanomaterial in rabbit femurs
Du et al. Bone morphogenic Protein-2 (rhBMP2)-loaded silk fibroin scaffolds to enhance the osteoinductivity in bone tissue engineering

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant