CN112255202A - 一种测量抗氧化能力的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种基于金纳米棒的抗氧化能力测量方法,属于纳米材料技术领域。方法包括以下步骤:(A)采用种子生长法制备金纳米棒溶液,将该溶液离心,去除水相,得到金纳米棒;(B)将得到的金纳米棒分散于三次蒸馏水中,离心,去除水相,得到纯化金纳米棒;(C)将得到的纯化金纳米棒分散于三次蒸馏水中,得到金纳米棒工作溶液;(D)将400μL金纳米棒工作溶液、50μL待测溶液及150μL刻蚀液混合后进行刻蚀反应;(E)将反应后的溶液离心,去除水相后溶解于10mM十六烷基三甲基溴化铵溶液中,重复上述步骤2次得到测量溶液;(F)测量。本发明提供的方法相比于现有的分光光度法具有准确、抗干扰能力强的优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于金纳米棒的抗氧化能力测量方法,属于纳米材料技术领域。
背景技术
活性氧包括过氧化氢、超氧自由基、羟基自由基及其下游产物和过氧化物等。活性氧在体内的过度积累可导致细胞内蛋白质变异、质脂过氧化和DNA损伤等,被认为同人体内的诸多疾病发病机理密切相关,如:动脉粥样硬化、糖尿病、慢性炎症、神经系统紊乱以及多种癌症。抗氧化剂对这些氧化诱导有害反应有抵御作用,可以保护重要的生物分子免受损伤,减少与衰老相关的慢性疾病的发生。
抗氧化能力测量包括体内法和体外法,体外法由于操作相对简单成本低廉应用更为广泛。体外测量方法包括电化学法、分光光度法、荧光法、化学发光法、色谱法以及毛细管电泳法等。其中,分光光度法是最常用的方法,分光光度法包括水溶性维生素E当量抗氧化能力检测法(TEAC)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除能力检测法、铁离子(FRAP)还原抗氧化能力检测法以及铜还原抗氧化能力法(CUPRAC,Talanta,2018,187,148-155)等。上述分光光度法中,如果从测量抗氧化剂的角度比较,CUPRAC是比较准确的方法,因为其对柠檬酸不发生响应。柠檬酸是食物和饮料中常见的成分,但是根据分类,柠檬酸不属于抗氧化剂。而其它分光光度法在测量过程中都会对柠檬酸产生响应,因此,这些方法测得的抗氧化能力值理论上有偏差。
但是,CUPRAC本身也会产生偏差,主要来自于铁离子的影响。铁离子会与该方法中使用的2,9-二甲基-1,10-菲罗啉(DPA)发生反应而影响实验结果。铁元素是地球上丰度很高的元素,广泛地存在于水体和土壤中,因此,食品和饮料中铁离子浓度较高。另外,由于包括CUPRAC在内的分光光度法是采用在可见光区有吸收的自由基或中性分子作为探针,并根据探针分子与各类氧化剂或抗氧化剂作用后吸收光谱的变化来测量抗氧化能力,因此,分光光度法在测量有颜色的样品时会受到干扰而产生误差。
发明内容
本发明解决的技术问题在于提供一种适合于各种有色样品的准确而稳定的测量抗氧化能力的方法。发明人实验发现,将CUPRAC法的主要成分2,9-二甲基-1,10-菲罗啉和氯化铜以一定的比例混合,加入一定浓度的络合剂硫氰化钾(KSCN)以及十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)后可以实现对金纳米棒的刻蚀。有鉴于此,本专利提供了一种基于金纳米棒刻蚀的抗氧化能力测量方法,其特征在于,包括以下步骤:
(A)采用种子生长法制备金纳米棒溶液,将该溶液离心,去除水相,得到金纳米棒;
(B)将步骤(A)得到的金纳米棒分散于三次蒸馏水中,离心,去除水相,重复上述步骤3次,得到纯化金纳米棒;
(C)将步骤(B)得到的纯化金纳米棒分散于三次蒸馏水中,得到金纳米棒工作溶液;
(D)将400μL金纳米棒工作溶液、50μL待测溶液及150μL刻蚀液混合后进行刻蚀反应;
(E)将步骤(D)得到的溶液离心,去除水相后溶解于10mM十六烷基三甲基溴化铵溶液中,重复上述步骤2次得到测量溶液;
(F)测量;
所述待测溶液是指样品溶液或标准溶液;
所述刻蚀液包含4mM 2,9-二甲基-1,10-菲罗啉、16~32mM氯化铜、400mM十六烷基三甲基溴化铵和2~8mM硫氰化钾;
所述测量是指用光谱测量装置扫描测量溶液,根据金纳米棒纵向局域表面等离子体共振吸收波长进行定量分析。
优选的,所述纯化金纳米棒的长径比为3.5~5.0。
优选的,步骤(D)中的所述刻蚀反应的温度为40~60℃。
优选的,步骤(D)中的所述刻蚀反应的时间为12~20min。
优选的,步骤(E)中的所述离心的速度为12000~15000转/分。
优选的,步骤(E)中的所述离心的时间为为20~30分钟。
本发明的提供的方法由于采用2,9-二甲基-1,10-菲罗啉和铜离子作为探针,因此不会氧化柠檬酸;由于在刻蚀液中加入了硫氰化钾,硫氰酸根可以和铁离子形成很强的络合物,从而消除了样品中铁离子的影响;刻蚀反应完毕后,通过离心将金纳米棒从带有颜色的样品溶液中分离出来,分散入无色溶液中进行测量,消除了样品基质颜色的影响,因此,本发明提供的方法具有准确、抗干扰能力强的优点。
附图说明
图1金纳米棒的TEM图
图2金纳米棒的紫外-可见吸收光谱
图3刻蚀液成分的影响
实验条件:曲线1,没有经过刻蚀反应的金纳米棒工作溶液;曲线2,刻蚀液的成分为4mM DPA和32mM氯化铜;曲线3,刻蚀液的成分为4mM DPA、32mM氯化铜和400mM NaCl;曲线4,刻蚀液的成分为4mM DPA、32mM氯化铜和400mM NaBr;曲线5,刻蚀液的成分为4mM DPA、32mM氯化铜和400mM CTAB。
图4在儿茶酚存在下刻蚀后的金纳米棒TEM图
图5刻蚀过程中没有抗氧化剂保护的金纳米棒TEM图
图6铁离子的影响及去除
曲线1,刻蚀液成分:4mM DPA、16mM氯化铜、400mM CTAB;待测溶液成分:三次蒸馏水;曲线2,刻蚀液成分:4mM DPA、16mM氯化铜、400mM CTAB;待测溶液成分:6mM FeCl3;曲线3,刻蚀液成分:4mM DPA、16mM氯化铜、400mM CTAB、2mM KSCN;待测溶液成分:6mM FeCl3;曲线4,刻蚀液成分:4mM DPA、16mM氯化铜、400mM CTAB、2mM KSCN;待测溶液成分:三次蒸馏水。
图7儿茶酚的浓度对纳米棒L-LSPR波长的影响
图中曲线1-5儿茶酚的浓度分别为10、30、50、70、90μM;曲线6为没有刻蚀的金纳米棒。
图8 CUPRAC法测量儿茶酚标准品的光谱图
图中曲线1-6中儿茶酚的浓度分别为1、10、30、50、70、90μM。
图9 CUPRAC法吸光度与浓度间校正曲线
具体实施方式
为了进一步理解本发明,下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述,但是应当理解,这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点,而不是对本发明权利要求的限制。
本专利提供了一种基于金纳米棒刻蚀的抗氧化能力测量方法,包括以下步骤:
(A)采用种子生长法制备金纳米棒溶液,将该溶液离心,去除水相,得到金纳米棒;优选的金纳米棒的长径比为3.5~5.0;
(B)将步骤(A)得到的金纳米棒分散于三次蒸馏水中,离心,去除水相,重复上述步骤3次,得到纯化金纳米棒;
(C)将步骤(B)得到的纯化金纳米棒分散于三次蒸馏水中,得到金纳米棒工作溶液;
(D)将400μL金纳米棒工作溶液、50μL样品溶液或标准溶液以及150μL由4mM 2,9-二甲基-1,10-菲罗啉、16~32mM氯化铜、400mM十六烷基三甲基溴化铵和2~8mM硫氰化钾组成的刻蚀液混合后进行刻蚀反应;优选的刻蚀反应的温度为40~60℃;优选的刻蚀反应的时间为12~20min;
(E)将步骤(D)得到的溶液离心,去除水相后溶解于10mM十六烷基三甲基溴化铵溶液中,重复上述步骤2次得到测量溶液;优选的离心的速度为12000~15000转/分;优选的离心的时间为为20~30分钟;
(F)用光谱测量装置扫描测量溶液,根据金纳米棒纵向局域表面等离子体共振吸收波长进行定量分析。
为了进一步理解本发明,下面结合附图和实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
本实施例进行金纳米棒的合成和纯化,所使用的所有玻璃器皿均经过王水浸泡,并用三次蒸馏水彻底清洗后晾干。
种子溶液制备:取4.7mL 0.1M十六烷基三甲基溴化铵(CTAB),加入25μL 50mM的氯金酸(HAuCl4),将混合物在30℃下轻微搅拌5min左右,随后,在剧烈搅拌下快速加入300μL10mM新制的冰冷NaBH4,30s后得到种子溶液,颜色呈棕黄色,该种子溶液在使用之前于30℃恒温保存。
生长液制备:将10mL 0.1M CTAB,190μL 1M HCl和100μL 50mM HAuCl4混合,缓慢搅拌5min,然后加入120μL AgNO3和100μL 100mM抗坏血酸(AA)并剧烈搅拌溶液直到颜色从深黄色变为无色。
金纳米棒合成:将制得的生长液恒温至30℃,然后将24μL种子溶液加入生长液中剧烈搅拌30s后将混合物在30℃下静置3h。
金纳米棒纯化:本步骤的目的是去除可能干扰抗氧化剂检测的背景成分,如AA和AgNO3。为此,将10.00mL金纳米棒溶液离心15min(15000r/min),移去9.90mL上清液后,将金纳米棒重新分散到9.90mL三次蒸馏水中,此离心/再分散的过程重复三次,得金纳米棒工作溶液储存备用。
透射电子显微镜(TEM)的实验结果显示,所合成的金纳米棒的长度约为40nm,直径约为10nm(图1),长径比约为4:1。紫外-可见光谱显示,该纳米棒在816nm处有一个非常强的纵向局域表面等离子体共振吸(L-LSPR),而位于521nm处的强度较弱的吸收峰为金纳米棒的横向LSPR(T-LSPR)。上述结果表明,金纳米棒合成成功。
实施例2
本实施探究刻蚀液中CTAB的影响。操作步骤如下:
在2mL的离心管中加入150μL刻蚀液、50μL三次蒸馏水和400μL金纳米棒工作溶液,充分混合后,将该溶液放入40℃的水浴中反应20min对金纳米棒进行刻蚀。然后,用冰水浴快速冷却反应溶液令刻蚀反应终止,将溶液于12000r/min下离心30分钟,去除水相后溶解于600μL 10mM CTAB中,重复此离心步骤2次得到测量溶液。扫描测量溶液的紫外-可见吸收光谱,记录金纳米棒的L-LSPR峰值的波长(λAE)。
刻蚀液1的成分为4mM 2,9-二甲基-1,10-菲罗啉(DPA)和32mM氯化铜,DPA和二价铜离子是CUPRAC的成分,因为一价铜离子与DPA之间可以形成稳定的络合物因此当试剂和抗氧化剂接触时,会促进二价铜离子发生还原反应生成一价铜离子。因此,DPA和氯化铜的混合液具有氧化型。但是,实验发现,从紫外-可见光谱图上可知,经过刻蚀反应后的金纳米棒的L-LSPR(图3,曲线2)与没有经过刻蚀反应的金纳米棒工作溶液的L-LSPR(图3,曲线1)波长一致。说明直接将CUPRAC试剂与金纳米棒混合不能产生刻蚀反应。
刻蚀液2的成分为4mM DPA、32mM氯化铜和400mM NaCl,由于氯离子可以和一价金离子之间形成络合物,因此理论上加入氯离子能促进刻蚀反应。但是,反应之后的金纳米棒L-LSPR波长反而有一些增加(图3,曲线3),说明金纳米棒没有刻蚀。少许增加的L-LSPR波长是由于溶液的折射率发生变化的缘故。
刻蚀液3的成分为4mM DPA、32mM氯化铜和400mM NaBr,溴离子可以和一价金离子之间形成更强的络合物,但是,从刻蚀反应之后的金纳米棒L-LSPR波长上看(图3,曲线4),金纳米棒也没有明显刻蚀。
刻蚀液4的成分为4mM DPA、32mM氯化铜和400mM CTAB,刻蚀反应之后的金纳米棒L-LSPR波长发生了显著的蓝移(图3,曲线5),说明金纳米棒发生了刻蚀反应。十六烷基三甲基化铵离子(CTA+)结合能力很强,它与金纳米棒刻蚀之后产生的Au+以及溶液中的Br-形成离子结合物,使氧化还原电对Au+/Au0的氧化还原电位大大降低,促进刻蚀反应的发生。
实施例3
本实施例评价抗氧化剂对金纳米棒刻蚀的影响。
在2mL的离心管中加入150μL刻蚀液(由4mM DPA、16mM氯化铜、400mM CTAB组成)、50μL 50μM儿茶酚溶液和400μL金纳米棒工作溶液,充分混合后,将该溶液放入60℃的水浴中反应12min对金纳米棒进行刻蚀。然后,用冰水浴快速冷却反应溶液令刻蚀反应终止,将溶液于15000r/min下离心20分钟,去除水相后溶解于600μL 10mM CTAB中,重复此离心步骤2次得到测量溶液。用TEM观察刻蚀反应后金纳米棒的形貌。
对比实验,用50μL三次蒸馏水代替上述实验中的50μL 50μM儿茶酚,其它条件相同。
TEM结果显示,刻蚀前加入50μL 50μM儿茶酚,反应之后的金纳米棒长度约28nm(图4),相比于刻蚀之前的40nm缩短了12nm左右;而没有加入儿茶酚的刻蚀反应得到的金纳米棒的长度约11nm(图5),缩短了29nm左右。以上的实验结果说明了抗氧化剂能阻止金纳米棒的刻蚀。
实施例4
本实施例探究铁离子的影响及去除。
铁离子是水体中广泛存在的离子,而且,铁离子与DPA之间有较强结合能力。因此,其对测量抗氧化性可能产生的影响不应忽视。
在2mL的离心管中加入150μL刻蚀液、50μL待测溶液和400μL金纳米棒工作溶液,充分混合后,将该溶液放入50℃的水浴中反应15min对金纳米棒进行刻蚀。然后,用冰水浴快速冷却反应溶液令刻蚀反应终止,将溶液于15000r/min下离心20分钟,去除水相后溶解于600μL 10mM CTAB中,重复此离心步骤2次得到测量溶液。扫描测量溶液的紫外-可见光谱。
刻蚀液和待测溶液的成分参照下表:
表1刻蚀液和待测溶液的成分
实验结果显示,条件1的金纳米棒L-LSPR位于665nm(图6,曲线2),如果样品中含有6mM铁离子(条件2),则L-LSPR波长移至720nm(图6,曲线1),产生了55nm的偏差,这会严重地影响实验结果的准确性。原因可能是Fe3+会与DPA之间形成络合物,从而影响DPA与Cu+之间的结合。为了消除Fe3+的影响,在刻蚀液中加入2mM硫氰化钾(KSCN);结果显示,在新的刻蚀液中,待测溶液为6mM FeCl3(条件3,图6,曲线4)与待测溶液为三次蒸馏水时(条件4,图6,曲线3),最终金纳米棒的L-LSPR波长都为660nm,说明刻蚀液中加入KSCN能消除背景中铁离子的影响。
实施例5
以食品和饮料中常见的8种抗氧化剂,即,抗坏血酸(AA)、儿茶酚(Catechol)、表儿茶素(EC)、表没食子儿茶素(EGC)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、儿茶素(Catechin)和水溶性维生素E(Trolox)为标准品,定量研究其对金纳米棒刻蚀的影响。
在2mL的离心管中加入150μL刻蚀液、50μL待测溶液和400μL金纳米棒工作溶液,充分混合后,将该溶液放入50℃的水浴中反应15min对金纳米棒进行刻蚀。然后,用冰水浴快速冷却反应溶液令刻蚀反应终止,将溶液于15000r/min下离心20分钟,去除水相后溶解于600μL 10mM CTAB中,重复此离心步骤2次得到测量溶液。
上述刻蚀液由4mM DPA、15mM氯化铜、400mM CTAB和8mM KSCN组成;待测溶液为三次蒸馏水或8种抗氧化剂的不同浓度标准溶液。
刻蚀反应后,用紫外-可见分光光度法测量金纳米棒的L-LSPR峰的波长偏移(Δλ),对抗氧化剂进行定量分析。(Δλ)定义为:
Δλ=λAE-λE
其中,λAE和λE分别表示待测溶液为抗氧化剂溶液和三次蒸馏水时被刻蚀的纳米棒的L-LSPR波长。通过绘制Δλ值与相应抗氧化剂浓度的关系曲线,可以建立△λ-CAntioxidant校准曲线。为了便于比较,参照文献中常用的方法选取儿茶酚(Catechol)为参考物质,定量计算时以其它7种标准品△λ-CAntioxidant校准曲线的斜率除以Catechol的△λ-CAntioxidant校准曲线斜率,得到的值为该标准品的相对抗氧化能力,称为Catechol当量抗氧化能力(catechol equivalent antioxidant capacities,CEAC)。其含义为:在相同条件下,溶液中当量标准品相对于Catechol还原能力的当量,本说明中选取的抗氧化剂的浓度为μM级别,因此,当量的单位为μM。
实验结果显示,当溶液中的抗氧化剂浓度增大时,刻蚀后的纳米棒的L-LSPR逐渐红移(以Catechol为例,图7),并且,波长位移与抗氧化剂浓度之间有良好的线性关系(表2)。
表2各种抗氧化剂的标准曲线及CEAC值
实施例6
将8种抗氧化剂按照不同的比例混合,配制3种混合标准溶液,根据表2中每种抗氧化剂的CEAC数据计算出混合标准溶液的理论CEAC值,然后采用实施例5中的实验条件对金纳米棒进行刻蚀,将波长位移值带入表2中Catechol的校正曲线方程,得到测量CEAC值。表3的结果显示,不同混合标准溶液的理论和测量CEAC值之间非常接近,说明本专利的方法具有较高的准确度。
表3混合标准品CEAC的测量
实施例7
本实施例考察标准CUPRAC法对抗氧化剂的定量特性。
CUPRAC法是一种常见的测量物质抗氧化能力的方法(Talanta,2018,187,148-155),本实施例参照文献的方法进行实验,条件如下:在5mL的离心管中,加入1mL 0.01MCuCl2、1mL 1M NH4Ac、1mL 7.5mM DPA、200μL待测溶液和200μL三次蒸馏水,将溶液充分混合并在室温下静置30min。然后,以三次蒸馏水为参考,在400-800nm内扫描溶液的紫外-可见吸收光谱。通过450nm处的吸光度与抗氧化剂(本实施例为儿茶酚)浓度的关系,绘制校准曲线。
所述待测溶液为不同浓度的儿茶酚标准溶液。
图8显示,随着待测溶液中儿茶酚浓度的增加,450nm处的吸光度也逐渐增强。吸光度和浓度之间呈现良好的线性关系(图9)。
实施例8
本实施例采用本发明的方法进行实际样品检测,并与标准CUPRAC法对照,以说明本发明的优点。
样品处理:市售瓶装红葡萄酒用三次蒸馏水稀释100倍,盒装橙汁摇匀后用三次蒸馏水稀释500倍,分别用0.22μm滤膜(九鼎高科,北京)过滤后用CUPRAC法(实验条件同实施例7)和本发明的方法(实验条件同实施例5)测量其抗氧化能力。
本实施例选择的两种实际样品的颜色分别与两种方法测量时产物的颜色相近。其中,红葡萄酒的颜色与采用本发明方法刻蚀之后金纳米棒的颜色相近,而橙汁与CUPRAC法产物的颜色接近。
表4显示,对于红葡萄酒稀释液,本发明法较CUPRAC法测得的结果稍高,这是由于两者的测量原理不完全相同所导致。本发明发是基于DPA和铜离子对金纳米棒的刻蚀引起L-LSPR波长的变化,而CUPRAC法是基于DPA和铜离子对抗氧化剂的氧化作用而引起450nm处吸光度的改变。但两者的结果有很好的可比性,比如,对采用以儿茶酚为标准的CEAC值,本发明的方法的加标回收率介于105%~114%,CUPRAC法的加标回收率介于91.3%~108%;待测溶液中加入柠檬酸之后带来的相对测量误差都不大,本发明不超过8.1%,CUPRAC法不超过9.1%。但是,当待测溶液中加入三价铁离子后,CUPRAC法引起较大的偏差,引入5μMFeCl3带来29.7%的相对偏差,而加入30μM FeCl3时的相对偏差则为74.1%。与之形成鲜明对比的是,对于本发明的方法,在待测溶液中加入5μM FeCl3和30μM FeCl3带来的相对偏差分别为0.55%和4.4%,这主要是本发明的刻蚀液含有KSCN,消除了铁离子的影响。以上结果说明,虽然红葡萄酒的颜色与刻蚀之后金纳米棒的颜色相近,样品的吸收峰与金纳米棒的L-LSPR峰有很大程度的重叠,但是,本发明将刻蚀后的金纳米棒离心后重新分散在没有颜色的10mM CTAB中测量,消除了样品颜色对测量结果的影响。
对于橙汁,由于其本身的颜色与CUPRAC法产物的颜色接近,样品本身的吸收峰与Cu(DPA)2 +的峰部分重叠,因此影响测量的准确度。从加标儿茶酚样品的回收率可以证明此结论,CUPRAC法中加入5μM和30μM儿茶酚的回收率分别为16.0%和58.3%,远远低于本发明的88.0%和111%。
表4本发明方法和CUPRAC法对实际样品CEAC值(μM)的测量
上述实施例说明,本发明提供的金纳米棒的长径比较均匀,采用含DPA、氯化铜、CTAB和KSCN的刻蚀液能对金纳米棒进行刻蚀,使其L-LSPR的波长产生位移,并且依据波长的位移可以实现对抗氧化剂的定量检测;本发明的方法不受具有一定还原性的、却不属于抗氧化剂的柠檬酸的影响;本发明提供的测量方法不受样品中存在的三价铁离子的影响;由于本发明将刻蚀后的金纳米棒离心后重新分散在10mM CTAB中测量,消除了样品颜色对测量结果的影响。因此,本发明提供的方法相比于现有的光谱法具有更稳定、更准确的优点。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出,对于本技术领域的专业技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以对本发明进行若干改进和修饰,这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (6)
1.一种测量抗氧化能力的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(A)采用种子生长法制备金纳米棒溶液,将该溶液离心,去除水相,得到金纳米棒;
(B)将步骤(A)得到的金纳米棒分散于三次蒸馏水中,离心,去除水相,重复上述步骤3次,得到纯化金纳米棒;
(C)将步骤(B)得到的纯化金纳米棒分散于三次蒸馏水中,得到金纳米棒工作溶液;
(D)将400μL金纳米棒工作溶液、50μL待测溶液及150μL刻蚀液混合后进行刻蚀反应;
(E)将步骤(D)得到的溶液离心,去除水相后溶解于10mM十六烷基三甲基溴化铵溶液中,重复上述步骤2次得到测量溶液;
(F)测量;
所述待测溶液是指样品溶液或标准溶液;
所述刻蚀液包含4mM 2,9-二甲基-1,10-菲罗啉、16~32mM氯化铜、400mM十六烷基三甲基溴化铵和2~8mM硫氰化钾;
所述测量是指用光谱测量装置扫描测量溶液,根据金纳米棒纵向局域表面等离子体共振吸收波长进行定量分析。
2.根据权利要求1所述的检测水体中汞离子的方法,其特征在于,所述纯化金纳米棒的长径比为3.5~5.0。
3.根据权利要求1所述的检测水体中汞离子的方法,其特征在于步骤(D)中的所述刻蚀反应的温度为40~60℃。
4.根据权利要求1所述的检测水体中汞离子的方法,其特征在于步骤(D)中的所述刻蚀反应的时间为12~20min。
5.根据权利要求1所述的检测水体中汞离子的方法,其特征在于步骤(E)中的所述离心的速度为12000~15000转/分。
6.根据权利要求1所述的检测水体中汞离子的方法,其特征在于步骤(E)中的所述离心的时间为为20~30分钟。
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