CN112219788A - 高脂饮食诱导的前部缺血性视神经病变色素兔模型的构建方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种前部缺血性视神经病变色素兔模型的构建方法，属于眼科疾病动物模型领域。本发明的方法包括：在兔维持饲料中添加重量比10％±3％的猪油和1％±0.5％胆固醇，持续喂养色素兔24周以上。本发明的方法仅需饮食控制，即可使动物产生非动脉炎性前部缺血性视神经病变的症状，简单便捷，易于产业化应用。
Description
技术领域
本发明属于眼科疾病动物模型领域。
背景技术
前部缺血性视神经病变(Anterior ischemic optic neuropathy,AION)是50岁以上人群中最常见的急性致盲性视神经病变，一直是眼科临床工作的重点及难点。AION系由于睫状后动脉循环障碍造成前部视神经(即视盘)供血不足，常双眼受累，先后发病间隔不一；在临床上可分为非动脉炎性前部缺血性视神经病变(NAION)和动脉炎性前部缺血性视神经病变(AAION)两种。前者占所有AION病例约85％，后者发病率较低，通常累及70岁以上人群。目前NAION病理生理的发病机制不清且存在争议，普遍认可的危险因素是“视盘拥挤”，组织学研究显示梗死区位于睫状后短动脉(short posterior ciliary arteries，SPCAs)供应的视乳头筛板区和筛板后区。并且FFA和ICGA研究报道无脉络膜循环受损的视乳头也存在充盈延迟及缺损，表明血管病变位于脉络膜分支动脉之后分布于视乳头周围的SPCA分支，而并非睫状短动脉本身；此外，夜间行性低血压、高血压、糖尿病、血液高凝状态、特定药物、高脂血症以及基因遗传因素等也都被报道与该病密切相关。由于目前NAION的病因未知，因此迫切需要加深对其认识，通过早期诊断和治疗，对控制病情发展和减少致盲具有重要意义。虽然目前报道了大量NAION的临床研究，但仍缺乏有效治疗手段。此外，由于医学伦理的限制，多数对NAION在视乳头视神经结构、功能及生化方面的研究不能直接以人作为研究对象，并且NAION本身不属于致死性疾病，临床受累标本来源困难，因此需要选择合适的动物疾病模型来指导其研究，通过模拟人NAION的特征来探索其发病机制和开发新型治疗以期阻止或者延缓NAION进程。
但是如何建立可靠的NAION实验模型仍是目前其研究的一个重点问题。
目前主要有两种NAION动物模型，即利用啮齿动物和灵长类动物的光动力栓塞模型模拟AION的临床特征。光动力栓塞方法首先是由Watson等于1985年报道用于诱导脑缺血。Mosinger和Olney于1989年报道利用该方法也可以诱导视网膜缺血。Fluhler等于1989年进行了改进，将孟加拉玫红进行大鼠静脉注射后随即将视乳头暴露在特定氩绿激光(514nm)下，几秒钟之内光敏的孟加拉玫红能选择性的破坏视乳头的毛细血管内皮细胞导致血栓，优点是没有热损失。由于小鼠在实验中更常用，并且具有转基因模型建立的优势，Smeyne等于1993年报道了利用Thy-1(CFP)/cfos(LacZ)双转基因小鼠可模拟NAION部分表型。Goldenberg-Cohen等于2005年利用该光化学诱导方法建立了NAION小鼠模型。但由于啮齿动物眼球小，且没有人的视网膜黄斑区，因此Chen等于2008年报道了运用光动力栓塞方法建立非人灵长类动物的模拟NAION模型。
这类模型模拟的单个视神经节细胞轴索缺血相关的早期组织学、电生理和分子改变与人NAION的发生过程相类似；也可以分析动物视神经梗死后视神经及视网膜的改变。有报道啮齿类动物的AION模型用于研究雌激素治疗AION的疗效，但是结果并没有增加对视神经保护作用。此外，这类模型也被用于研究AION相关的RGC细胞凋亡和视网膜变化。但是有研究认为这种光化学诱导的动物模型并不能真实反映人NAION发生过程和自然病程，而且该方法在造模过程中主要破坏的是供应视网膜内层的视网膜中央动脉，而不是深部的睫状后动脉。另外由于灵长类动物成本高以及动物伦理的问题，也很难广泛用于疾病模型的建立。
发明内容
本发明要解决的问题是：提供一种简单有效的NAION动物模型的构建方法。
本发明的技术方案如下：
本发明首先提供了一种非动脉炎性前部缺血性视神经病变色素兔模型的构建方法，在兔维持饲料中添加重量比10％±3％的猪油和1.5％±0.5％胆固醇，配成高脂饲料，以高脂饲料持续喂养色素兔24周以上。
进一步地，所述猪油和胆固醇分别以10％和2％的重量比添加到兔维持饲料。
进一步地，所述兔维持饲料含有：
20～27％(w/w)蛋白质、8～14％(w/w)脂肪和60～70％(w/w)碳水化合物。
进一步地，所述兔维持饲料含有：
23.5％(w/w)蛋白质、11％(w/w)脂肪和65.5％(w/w)碳水化合物。
进一步地，兔上午摄入10～20g/kg体重的高脂饲料，下午摄入15～30g/kg体重的高脂饲料。
进一步地，所述色素兔为青紫蓝兔。
本发明还提供了前述的方法得到的模型在药物筛选中的用途，所述药物为治疗非动脉炎性前部缺血性视神经病变的药物。
本发明还提供了一种用于构建非动脉炎性前部缺血性视神经病变色素兔模型的兔饲料，所述兔饲料是在兔维持饲料中加入重量比10％±3％的猪油和1.5％±0.5％的胆固醇制备而成。
如前述的兔饲料，所述兔维持饲料含有：
20～27％(w/w)蛋白质、8～14％(w/w)脂肪和60～70％(w/w)碳水化合物。
如前述的兔饲料，所述兔维持饲料含有：
23.5％(w/w)蛋白质、11％(w/w)脂肪和65.5％(w/w)碳水化合物。
术语“色素兔”，为有色素眼的兔品种，即非白化兔。
本发明通过在兔维持饲料中添加一定的猪油和胆固醇，即可在24周诱导出NAION，简单、快速、有效，利于产业化应用。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1：血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)的水平变化(*，P<0.05；两独立样本t检验)。
图2：血糖值变化以及第180天葡萄糖耐量值(*，P<0.05；两独立样本t检验)。
图3：眼底检查结果；左：眼底炫彩照相(multicolor)；中：自发荧光；右：光学相干断层扫描(OCT)(标尺＝200μm)。
图4：荧光素血管造影结果(标尺＝200μm)。
图5：HE染色和免疫组化结果(标尺＝50μm，*，P<0.05；两独立样本t检验)。
图6：电生理功能实验结果(*，P<0.05；两独立样本t检验)。
具体实施方式
实施例1 NAION色素兔模型的构建与验证
1.方法
1.1建模
将16周龄体重3.5±0.5kg的成年雄性青紫蓝兔分成两组，各10只，对照组(ND)饲喂兔维持饲料(北京科澳协力饲料有限公司)，高脂组(HFD)则饲喂高脂饲料(兔维持饲料添加重量比10％的猪油和重量比2％的胆固醇)，每只兔每天饲喂的量为上午40-60g(10～20g/kg体重)，下午60-90g(15～30g/kg体重)。
所述维持饲料是相对于繁殖饲料而言的，前者的蛋白和能量水平低于繁殖饲料，预防维持期(从断乳分离开始到性器官再次发育这段时期)动物过肥。维持饲料的营养成分：23.5％(w/w)蛋白质,11％(w/w)脂肪以及65.5％(w/w)碳水化化合物；能量：2.7kcal/g。
1.2生理指标检查
1)体重
测定时间：建模前及建模12、24周各测定1次。
2)血脂、血糖、游离脂肪酸检查
检测时间：建模前及建模后8、12、16、24周；
检测指标：血糖(GLU)、总胆固醇(CHOL)、甘油三酯(TG)、游离脂肪酸(NFFA)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)
3)葡萄糖耐量试验
测定时间：建模后第180天；
测定方法：采样检测前禁食至少12小时，不禁水。每只兔经腹腔注射1g/kg剂量葡萄糖(给药体积：2mL/kg，给药浓度：500mg/mL)，注射后0、0.5、1.5、2小时耳缘静脉穿刺取血10微升，罗氏血糖仪(卓越型)虹吸芯片吸取检测。
4)眼底检查
检测时间：建模前及建模后24周；
检测项目：眼底炫彩照相(multicolor)，自发荧光，光学相干断层扫描(OCT)，荧光素血管造影(FFA)。
5)眼球组织病理学检查
摘除各组兔眼球，沿角巩膜缘穿刺一小口，置于改良的Davidson’s固定液中4度过夜固定用于石蜡切片制备。病理染色：将各组切片进行苏木精-伊红染色及及其它免疫荧光染色(相关抗体见表1)，并行显微镜检查和计数分析。
表1主要抗体
6)电生理功能实验
检测时间：第24周。
将动物按照国际临床视觉电生理会标准参数给予刺激，即地电极接到待测动物眉心，作用电极分别接到左右眼角膜，将参考电极分别接入左右侧的外侧眼角；将动物头部固定于闪光刺激器头托上，使其平视前方。常规程序记录闪光1.0Hz flash-VEP。正常可辨别的波形为起始的负向波和其后的正向波，振幅为负向波的波谷与正向波波峰之间的距离，潜伏期为刺激开始到起始负向波谷出现的间期，记录各组数据并分析。
2.结果
2.1血脂、血糖、游离脂肪酸检查以及糖耐量检查
血液学检查显示，HFD组血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)于高脂饮食喂养第8周起开始明显较对照组升高，并一直持续到喂养第24周；TG、TC和LDL分别与HDL比值也较对照组升高(图1)。
HFD组血糖值于喂养第16周升高，喂养24周后葡萄糖耐量的AUC值明显高于对照组(图2)。
2.2眼底检查
眼底炫彩图显示，HFD组视盘周围神经纤维束稀疏，较对照组明显减少(白色箭头)；自发荧光显示视乳头周围有强荧光，类脂样物质沉积(黄色箭头)；OCT显示RPE层不连续，其下有类脂质沉积(黄色箭头)(图3)。
FFA显示HFD组在喂养24周后早期视盘呈节段性低荧光和荧光增强，晚期呈节段性强弱不等荧光(黄色和红色箭头)(图4)。
眼底检查结果均符合NAION的临床病理特征1-4。
2.3眼球组织病理学检查
HE染色显示，对照组的视乳头呈正常的凹陷状，板层区排列规则，神经节细胞轴索束层规则柱状排列；HFD组视乳头明显肿胀凸起(黄色箭头所示)，板层区神经轴索间隙增大，有空泡，轴索束明显水肿(红色箭头)，轴索间质增多(蓝色箭头)(图5)。
免疫组化结果显示，HFD组Brn3阳性神经节细胞数量较对照组明显减少(图5)。
眼球组织病理学检查结果均符合NAION的临床病理特征3-6。
2.4电生理功能实验
HFD组闪光VEP振幅比对照组明显降低，表明HFD组视神经视觉传导功能明显受损(图6)。
电生理功能实验结果符合NAION的临床病理特征4-7。
综上，高脂饮食喂养24周后的眼底检查、眼球组织病理学检查和电生理功能实验结果均表明，青紫蓝兔出现了NAION的临床病理特征，表明本发明的方法能够成功构建得到NAION动物模型。
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Claims (10)
1.一种非动脉炎性前部缺血性视神经病变色素兔模型的构建方法，其特征在于：在兔维持饲料中添加重量比10％±3％的猪油和1.5％±0.5％胆固醇，配成高脂饲料，以高脂饲料持续喂养色素兔24周以上。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述猪油和胆固醇分别以10％和2％的重量比添加到兔维持饲料。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述兔维持饲料含有：
20～27％(w/w)蛋白质、8～14％(w/w)脂肪和60～70％(w/w)碳水化合物。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述兔维持饲料含有：
23.5％(w/w)蛋白质、11％(w/w)脂肪和65.5％(w/w)碳水化合物。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：兔上午摄入10～20g/kg体重的高脂饲料，下午摄入15～30g/kg体重的高脂饲料。
6.如权利要求1～5任一所述的方法，其特征在于：所述色素兔为青紫蓝兔。
7.权利要求1～6任一所述的方法得到的模型在药物筛选中的用途，所述药物为治疗非动脉炎性前部缺血性视神经病变的药物。
8.一种用于构建非动脉炎性前部缺血性视神经病变色素兔模型的兔饲料，其特征在于：所述兔饲料是在兔维持饲料中加入重量比10％±3％的猪油和1.5％±0.5％的胆固醇制备而成。
9.如权利要求8所述的兔饲料，其特征在于：所述兔维持饲料含有：
20～27％(w/w)蛋白质、8～14％(w/w)脂肪和60～70％(w/w)碳水化合物。
10.如权利要求8所述的兔饲料，其特征在于：所述兔维持饲料含有：
23.5％(w/w)蛋白质、11％(w/w)脂肪和65.5％(w/w)碳水化合物。
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