CN112210506B - 一株对灵芝谷蛾有杀虫活性的苏云金芽孢杆菌jxbt-0350及其应用 - Google Patents

一株对灵芝谷蛾有杀虫活性的苏云金芽孢杆菌jxbt-0350及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物农药领域，具体涉及一株对灵芝谷蛾有杀虫活性的苏云金芽孢杆菌JXBT‑0350及其应用。本发明分离筛选的苏云金芽孢杆菌JXBT‑0350已保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2020073，该菌株分离至从江西省庐山丛林采集的土壤样品中。通过生物测定，表明该菌株的发酵产物对灵芝谷蛾有强效杀虫活性；还对灵芝尺蛾、灵芝夜蛾、二化螟、小菜蛾或菜青虫都有杀虫作用，本发明提供的菌株特别适合开发为一种防治灵芝害虫的生防菌剂。

Description

一株对灵芝谷蛾有杀虫活性的苏云金芽孢杆菌JXBT-0350及 其应用
技术领域
本发明属于生物农药领域，具体涉及一株对灵芝谷蛾有杀虫活性的苏云金芽孢杆菌JXBT-0350及其应用。
背景技术
苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)是一种自然界广泛存在的杆状细菌，其区别于其他芽孢杆菌的明显特征是在芽孢生长期能够产生伴胞晶体，这些伴胞晶体对许多种类的害虫有杀虫活性。除了伴胞晶体，Bt产生的具有杀虫活性的物质还包括：营养期杀虫蛋白、苏云金素、增效蛋白、辅助蛋白、几丁质酶、胶原酶、溶细胞素等(Malovichko Y.V.,Nizhnikov A.A.,Antonets K.S.Repertoire of the virulencefactors unrelated to major classes of protein toxins and its role inspecificity of host-pathogen interactions.Toxins,2019,11(6):347.)。Bt是目前应用最广泛的生防微生物之一，在生物杀虫剂和转基因抗虫育种方面具有重要的研究和应用价值(Lacey L A,Grzywacz D,Shapiro-Ilan D I et al.Insect pathogens asbiological control agents:Back to the future..J.Invertebr.Pathol.,2015,132:1-41.)。在自然界中Bt菌株资源非常丰富，而且不同的Bt菌株产生的杀虫活性物质的种类不同，杀虫谱也不同(Jouzani G.S.,Valijanian E.,Sharafi R.,Bacillus thuringiensis:a successful insecticide with new environmental features and tidings.Appl.Microbiol.Biotechnol.,2017,101:2691-2711.)。对于群体而言，Bt的杀虫谱特别广，其靶标害虫目前报道的有鳞翅目、双翅目、鞘翅目、半翅目、膜翅目、线虫等(SchnepfE.,CrickmoreN.,Van RieJ.,et al.Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystalproteins.Microbiol.Mol.Biol.Rev,1998,62(3):775-806)；但是对于个体而言，单个Bt菌株的杀虫特异性比较高，一般情况下某一个菌株只对某一类害虫具有杀虫活性(HerreroSalvador,Bel Yolanda,Hernández-Martínez Patricia et al.Susceptibility,mechanisms of response and resistance to Bacillus thuringiensis toxins inSpodoptera spp.[J].CurrOpin Insect Sci,2016,15:89-96.)，所以针对特定的靶标害虫筛选更多新型的、特异的高效杀虫菌株是生防微生物产品开发的重要工作。
灵芝(Ganodermalucidum)是一种珍贵的药用真菌，具有补益强壮、扶正固本的功效。随着灵芝栽培技术的进步和灵芝医药和保健产品的开发，灵芝在我国的栽培面积和规模不断扩大，灵芝病虫害的问题和化学农药残留的问题也日益严重。目前注册在食用菌上使用的化学农药比较少，生物农药更是严重短缺，所以灵芝病虫害的防治一直存在违规使用化学农药的问题。
灵芝谷蛾(Hapsiterabarbata)属鳞翅目(Lepidoptera)谷蛾科(Tineidae)。灵芝谷蛾在灵芝原基形成到子实体生长期都能造成危害，幼虫从灵芝子实体的幼嫩部位蛀食进入，使灵芝菌盖表面出现许多蛀食孔，造成子实体严重的破坏。同时大龄幼虫的孔道口会堆积成串的颗粒状粪便，极易引起灵芝子实体污染腐烂，灵芝的品质和产量严重下降。
目前在食用菌上登记注册的农药特别少，对于灵芝谷蛾的防治，除了农业措施和物理防治以外，主要依赖少数几种化学农药，例如氟氯氰-甲阿维、氟虫氰和磷化铝等，如果发生严重，只能使用违规的化学农药来防治，容易造成农药残留和环境污染，不仅影响产品出口，而且对人类的健康也造成威胁。
发明内容
申请人从江西省庐山山区丛林中采集大量土壤样品，集中对Bt菌株进行筛选，对筛选出的苏云金芽孢杆菌进行编号命名和菌种保存，以灵芝谷蛾为防治靶标，最终筛选到一株具有高效杀虫活性的苏云金芽孢杆菌菌株，该菌株已于2020年4月22号送至中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为：CCTCC NO：M2020073，分类命名：苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)JXBT-0350。
所述菌株JXBT-0350的生理生化特性和培养特性与普通的Bt相同。
苏云金芽孢杆菌JXBT-0350的在制备成微生物生防菌剂中的应用，包括利用该菌株制备成灵芝的生防菌剂，可用于制备成灵芝谷蛾、灵芝夜蛾或灵芝尺蛾的杀虫剂；该菌株还可制备成二化螟、小菜蛾或菜青虫的杀虫剂。
以上所述的菌株中，优选的，所述的微生物生防菌剂的有效成分为苏云金芽孢杆菌JXBT-0350TYS芽孢期发酵液。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明提供了一种对灵芝谷蛾具有特异性杀灭效果的苏云金芽孢杆菌JXBT-0350，该菌株发酵液对灵芝谷蛾具有强效的杀灭效果，对灵芝尺蛾和灵芝夜蛾也有杀灭效果，可以用于灵芝的微生物生防菌剂。
本发明提供的苏云金芽孢杆菌JXBT-0350还对二化螟、小菜蛾或菜青虫也有抑制作用。
附图说明
图1为苏云金芽孢杆菌JXBT-0350芽孢期晶体形态显微镜观察图片；
其中A为ICPM平板培养，B为TYS平板培养，培养时间均为3天。
图2为苏云金芽孢杆菌JXBT-0350芽孢期全蛋白凝胶电泳检测示意图；
其中M为蛋白质Marker，1为菌株JXBT-0350芽孢期全蛋白样品，2和3为其他两株菌株芽孢期全蛋白样品，点样量均为8ul。
图3为苏云金芽孢杆菌JXBT-0350的三种发酵液对灵芝谷蛾的杀虫活性检测示意图。
图4为苏云金芽孢杆菌JXBT-0350的芽孢期发酵液对灵芝谷蛾、灵芝尺蛾和灵芝夜蛾的杀虫活性比较示意图。
具体实施方式
以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。本发明所涉及的实验方法和操作，如未特别说明，均为本领域的常规技术和方法；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。在本发明实施例中，芽孢水悬液浓度的单位均为cfu/ml。
实施例1：
苏云金芽孢杆菌JXBT-0350的分离、筛选、鉴定和保藏
1.苏云金芽孢杆菌分离和筛选
申请人从江西省庐山山区丛林中采集大量土壤样品，采用创新的方法进行Bt菌株的分离和筛选，具体方法参考申请号为201810402728.5的技术方案。将所述筛选出的Bt菌株进行编号命名和菌种保存。不纯的菌株用平板划线法分离纯化，然后保存。保存方法为：长期保存用甘油管在-80℃保存，临时保存用芽孢期菌体水悬液在4℃保存。
2.杀虫活性菌株的筛选、鉴定和保藏
2.1对灵芝谷蛾有杀虫活性的Bt菌株筛选
本发明通过灵芝谷蛾高通量生物测定来筛选潜在的杀虫菌株，具体方法是：采摘新鲜的灵芝，切成1厘米见方的方块，表面用1/5稀释的Bt菌液涂抹，稍稍晾干后放入24孔板中，以1/5稀释的未接菌的培养液涂抹的灵芝块为对照。然后每孔接入5头健康的灵芝谷蛾二齢幼虫，置于灵芝菇房中，每天记录一次死虫数，3天后统计总的死亡数。
所述Bt菌液的培养方法为：在24孔深孔板中，每孔加入5毫升TYS培养基，按照1/100接种量分别接入筛选到的Bt菌株的芽孢水悬液，28℃220rpm摇床培养48小时，此时大部分的菌体已完全芽孢化，是Bt杀虫晶体蛋白表达量最高的时期。
所述TYS培养基，其配方为蛋白胨(Tryptone)4g/L，酵母粉(Yeast Extraction)1g/L，氯化钠(NaCl)5g/L，pH7.0。该培养基是本发明在LB培养基的基础上改进而来，其优点是培养的Bt菌体芽孢化比较一致，晶体蛋白表达量比较高，比常规芽孢化培养基配制简单方便，非常适合于高通量生物测定筛选杀虫活性菌株。
本发明从500多株Bt菌株中筛选到3株对灵芝谷蛾有明显杀虫活性的菌株，其中菌株JXBT-0350对灵芝谷蛾的活性最高，2天后的死亡率为100％。该菌株对灵芝谷蛾的定量生物测定参见实施例2。
2.2苏云金芽孢杆菌JXBT-0350芽孢期晶体形态观察
将保存的菌株JXBT-0350分别接种到ICPM平板和TYS平板上，30℃培养4天至芽孢期。用灭菌的枪头从培养4天的平板中挑取少许菌体，涂抹到滴有10ul无菌水的载玻片上，使菌体均匀延展到载玻片上，晾干后固定和染色，在光学显微镜100倍油镜下观察芽孢和晶体的形态。结果显示菌株JXBT-0350的晶体形态明显的不同于其他2株活性菌株(图1)。
2.3苏云金芽孢杆菌JXBT-0350芽孢期全蛋白凝胶电泳检测
菌体培养：将保存的菌株JXBT-0350接种到LB液体培养基进行活化培养，吸取活化的菌液100ul，转接到加有10mlTYS培养基的PA瓶中，28℃220rpm摇床培养48小时，此时大部分的菌体已完全芽孢化，晶体蛋白表达量达到最高。
凝胶电泳样品制备：吸取上述芽孢化的培养液1ml至1.5ml离心管中，4℃10000rpm离心1分钟，菌体沉淀用100ul无菌水悬浮，取80ul悬浮液加入到含有20ul 5XSDS-PAGE上样缓冲液(Loading Buffer)的离心管中，充分混匀后，100℃金属浴15分钟。4℃10000rpm离心5分钟，上清液即为凝胶电泳样品。
SDS-PAGE凝胶电泳：吸取8ul上述电泳样品上清液，点样到10％凝胶，120V电泳3.5小时，染色过夜，脱色后将凝胶拍照。结果显示菌株JXBT-0350的芽孢期全蛋白谱明显的不同于其他2株活性菌株(图2)。
3.菌株分类鉴定
在本专业领域，一般认为能够产生伴胞晶体的芽孢杆菌就是苏云金芽孢杆菌。为了进一步对菌株进行鉴定，本发明对菌株JXBT-0350进行了基因组测序，获得了菌株JXBT-0350的16sRNA的基因序列、重组酶基因rceA和核糖体蛋白基因rplC，这三个基因常用于蜡状芽孢杆菌群菌株的分类鉴定。通过在NCBI和EZBioCloud网站进行BLAST分析，结果显示菌株JXBT-0350属于蜡状芽孢杆菌群中的苏云金芽孢杆菌。该菌株已于2020年4月22号送至中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为：CCTCC NO：M2020073，地址：中国武汉武汉大学，分类命名：苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)JXBT-0350。
实施例2：
苏云金芽孢杆菌JXBT-0350对灵芝重要害虫的生物测定
1.生测发酵液的制备
为了充分验证苏云金芽孢杆菌JXBT-0350对灵芝重要害虫的杀虫活性，同时采用了LB、ICPM和TYS共3种液体发酵培养基来分别进行生测样品的发酵制备，具体方法是：在250ml三角瓶中加入100毫升液体发酵培养基，按照1/100接种量接入苏云金芽孢杆菌JXBT-0350的芽孢水悬液(芽孢浓度1.00E+07)，28℃220rpm摇床培养。
LB培养基培养12小时，此时发酵液中大部分的菌体处于营养期生长阶段，营养期杀虫蛋白和其他杀虫活性成分的表达量较高，此时的发酵在本实施例中称之为LB营养期发酵液，用于本发明实施例。
ICPM和TYS培养基培养48小时，此时发酵液中大部分的菌体已完全芽孢化，是Bt杀虫晶体蛋白表达量较高的时期，此时的发酵液在本实施例中称之为ICPM芽孢期发酵液和TYS芽孢期发酵液，用于本发明实施例。
所述LB培养基，其配方为蛋白胨(Tryptone)10g/L，酵母粉(Yeast Extraction)5g/L，氯化钠(NaCl)10g/L，pH7.0，其余为水。该培养基是Bt营养期培养常用的培养基。
所述ICPM培养基，其配方为蛋白胨(Tryptone)6g/L，葡萄糖(Glucose)5g/L，碳酸钙(CaCO3)1g/L，硫酸镁(MgSO4)0.5g/L，磷酸二氢钾(KH2PO4)0.5g/L，pH7.0，其余为水。该培养基是Bt芽孢化培养和晶体蛋白制备常用的培养基。
所述TYS培养基，其配方为蛋白胨(Tryptone)4g/L，酵母粉(Yeast Extraction)1g/L，氯化钠(NaCl)5g/L，pH7.0，其余为水。该培养基是本发明在LB培养基的基础上改进而来，其优点是培养的Bt菌体芽孢化比较一致，晶体蛋白表达量比较高，比常规芽孢化培养基配制简单方便，成本也比较低，非常适合于大规模高通量生物测定或大面积喷施的生物测定。
2.灵芝谷蛾的生物测定
将上述苏云金芽孢杆菌JXBT-0350的三种发酵液稀释至细胞(或芽孢)浓度为1.00E+08，然后分别进行1/5系列稀释，获得1.00E+08、2.00E+07、4.00E+06、8.00E+05、1.60E+05、3.20E+04、6.40E+03共7个浓度，分别喷施到生长健康的灵芝上，喷药量20ml/支，每个浓度3个重复，以喷施空白液体培养基为对照。喷施后的灵芝稍稍晾干，每支灵芝接入15头健康的灵芝谷蛾二齢幼虫，置于灵芝菇房中，每天记录一次死虫数，3天后统计总的死虫数，用SAS统计软件计算校正死亡率和LC50。结果显示三种发酵液对灵芝谷蛾均有杀虫活性，其中TYS芽孢期发酵液的杀虫活性最高，致死中浓度为1.33E+05cfu/ml(置信区间6.78E+04～2.23E+05cfu/ml)(见表1和图3)。
表1苏云金芽孢杆菌JXBT-0350的三种发酵液对灵芝谷蛾的杀虫活性比较
Figure GDA0003025568580000061
3.菌株JXBT-0350对灵芝谷蛾、灵芝尺蛾和灵芝夜蛾的杀虫活性比较
将上述苏云金芽孢杆菌JXBT-0350的TYS芽孢期发酵液稀释至1.00E+08，然后分别进行1/5系列稀释，获得1.00E+08、2.00E+07、4.00E+06、8.00E+05、1.60E+05、3.20E+04、6.40E+03共7个浓度，分别喷施到生长健康的灵芝上，喷药量20ml/支，每个浓度9个重复，以喷施空白液体培养基为对照。喷施后的灵芝稍稍晾干后每支灵芝接入15头健康的上述其中一种害虫的二齢幼虫，每个浓度的处理中每种害虫均有3个重复，接虫后的灵芝置于灵芝菇房中，每天记录一次死虫数，3天后统计总的死虫数，计算校正死亡率和LC50。结果显示菌株JXBT-0350对灵芝谷蛾的杀虫活性最高，致死中浓度为1.57E+05cfu/ml；对灵芝尺蛾和灵芝夜蛾的杀虫活性相对较低，致死中浓度分别为4.87E+06cfu/ml和4.17E+06cfu/ml(见表2和图4)。
表2.苏云金芽孢杆菌JXBT-0350芽孢期发酵液对灵芝谷蛾、灵芝尺蛾和灵芝夜蛾的杀虫活性比较
Figure GDA0003025568580000071
4.菌株JXBT-0350对水稻二化螟、小菜蛾和菜青虫的杀虫活性测定
将上述苏云金芽孢杆菌JXBT-0350的TYS芽孢期发酵液稀释至1.00E+08，然后分别进行1/5系列稀释，获得1.00E+08、2.00E+07、4.00E+06、8.00E+05、1.60E+05、3.20E+04、6.40E+03共7个浓度，分别涂抹到5cm长的水稻茎秆和5cm见方的白菜叶子上，以涂抹空白液体培养基为对照。涂抹后的水稻茎秆放入2.5cmX10cm的玻璃管中，每管放入3节稻茎秆，每管接入二化螟二齢幼虫15头，用棉花塞封口。涂抹后的白菜叶子放入培养皿中，每个培养皿接入小菜蛾或菜青虫的二齢幼虫15头。每个浓度的处理中每种害虫均有3个重复。接虫后将玻璃管和培养皿均放入养虫室内，每天记录一次死虫数，5天后统计总的死虫数，并计算校正死亡率。结果显示菌株JXBT-0350对二化螟、小菜蛾和菜青虫有较弱的杀虫活性，最高浓度发酵液引起的死亡率分别为43.18％、52.27％和47.73％(见表3)。
表3.苏云金芽孢杆菌JXBT-0350芽孢期发酵液对二化螟、小菜蛾和菜青虫的杀虫活性
Figure GDA0003025568580000081
5.菌株JXBT-0350对灵芝果蝇的趋避活性生物测定
将上述苏云金芽孢杆菌JXBT-0350的LB营养期发酵液稀释至1.00E+08，然后分别进行1/5系列稀释，获得1.00E+08、2.00E+07、4.00E+06、8.00E+05、1.60E+05、3.20E+04、6.40E+03共7个浓度，分别喷施到生长健康的灵芝和菌包上，喷药量20ml/支，每个浓度3个重复，以喷施空白培养基为对照。稍稍晾干后将不同处理的灵芝菌包放入各自单独的网套中，网套的一边留口，利于灵芝果蝇的自由出入，网套间要隔开至少0.5米的距离。将新鲜羽化的灵芝果蝇成虫在菇房的中央释放，按照房间的面积每平米至少释放20头。24小时后每天记录一次网套内灵芝和菌包上的果蝇数量，5天后统计总的果蝇数量。并计算趋避率，计算方法为：趋避率＝(对照组总虫数-处理组总虫数)/对照组总虫数*100％。
结果显示苏云金芽孢杆菌JXBT-0350的LB营养期发酵液对灵芝果蝇没有明显的趋避作用(见表4)。
表4.苏云金芽孢杆菌JXBT-0350发酵液对灵芝果蝇的趋避活性
Figure GDA0003025568580000091
6.菌株JXBT-0350对灵芝蛞蝓(鼻涕虫)的趋避活性生物测定
将上述苏云金芽孢杆菌JXBT-0350的LB营养期发酵液稀释至1.00E+08，然后分别进行1/5系列稀释，获得1.00E+08、2.00E+07、4.00E+06、8.00E+05、1.60E+05、3.20E+04、6.40E+03共7个浓度，分别喷施到生长健康的灵芝和菌包上，喷药量20ml/支，每个浓度5个重复，以喷施空白培养基为对照。稍稍晾干后将灵芝蛞蝓接到灵芝上，接虫量5头/支。接虫后的灵芝菌包置于菇房层架上，不同处理间隔0.5米，并保持光线、温度、湿度尽量一致。24小时后每天记录一次灵芝上的蛞蝓存留数量，5天后统计总的存留虫子数量。并计算趋避率，计算方法为：趋避率＝(接虫总数-存留总虫数)/接虫总数*100％。结果显示苏云金芽孢杆菌JXBT-0350的LB营养期发酵液对灵芝蛞蝓没有明显的趋避作用(见表5)。
表5.苏云金芽孢杆菌JXBT-0350营养期发酵液对灵芝蛞蝓的趋避活性
Figure GDA0003025568580000092

Claims (5)

1.一株分离的苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis），所述的苏云金芽孢杆菌的保藏编号为CCTCC NO: M2020073。
2.权利要求1所述的苏云金芽孢杆菌在制备灵芝微生物生防菌剂中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，所述的生防菌剂用于灵芝尺蛾、灵芝夜蛾或灵芝谷蛾的防治。
4.权利要求1所述的苏云金芽孢杆菌在制备杀虫剂中的应用，所述的虫为灵芝尺蛾、灵芝夜蛾、灵芝谷蛾、二化螟、小菜蛾或菜青虫。
5.根据权利要求2所述的应用，所述的微生物生防菌剂的有效成分为苏云金芽孢杆菌的芽孢期的TYS培养基发酵液，所述的苏云金芽孢杆菌的保藏编号为CCTCC NO: M2020073；所述TYS培养基，其配方为蛋白胨4g/L，酵母粉1g/L，氯化钠5g/L，pH7.0，其余为水。
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