CN112180088B - 一种食管癌早期筛查试纸条 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医药生物技术领域，公开了一种用于早期食管癌筛查的标志物，所述标志物为PDE1A蛋白或PDE1A蛋白与KPNA6蛋白的组合或PDE1A蛋白与CASK蛋白的组合。本发明进一步公开了上述标志物在制备用于早期食管癌筛查产品中的应用，所述用于早期食管癌筛查的产品为试纸条。本发明首次将PDE1A蛋白或PDE1A蛋白与KPNA6蛋白的组合或PDE1A蛋白与CASK蛋白的组合作为早期食管癌筛查的标志物，用于检测人血清中KPNA6自身抗体、PDE1A自身抗体、CASK自身抗体的表达水平，可以有效检测食管癌，尤其是早期食管癌。

Description

一种食管癌早期筛查试纸条
本申请是申请号为CN 202010367608.3，申请日为2020-04-30，名称为“一种早期食管癌联合筛查试纸条”的发明专利的分案申请。
技术领域
本发明属于医药生物技术领域，具体涉及一种早期食管癌联合筛查试纸条。
背景技术
食管癌是人类最常见的消化系统恶性肿瘤之一，在全球范围内食管癌发病率位于所有恶性肿瘤的第8位，病死率位于因癌症而死亡的第6位。我国是世界食管癌高发国家，组织类型主要为鳞状细胞癌(本发明中食管癌均指食管鳞状细胞癌，即食管鳞癌)。2018年出版的《中国肿瘤登记年报》最新数据显示，我国食管癌居恶性肿瘤发病第六位，死亡第四位，对人民生活质量和家庭幸福构成了严重威胁。
食管癌早期起病非常隐匿，大多数早期食管癌患者症状不典型或没有症状，当患者出现进行性吞咽困难等典型症状而去就诊时，往往已经到了中晚期，错失了最佳的治疗时机，导致生活质量较差、预后差，五年生存率仅约20％左右，远远低于早期食管癌患者的五年生存率(约90％以上)。由此可见，造成食管癌患者总体预后差的一个主要原因就是缺乏有效的早期筛查和诊断方法与手段。
目前食管癌的早期发现和诊断主要依赖内镜检查和黏膜病理活检，但这种办法具有诊断周期长、有创、接受度差、成本高等特点，并且效率偏低。常规的，对高发区、40岁以上、男性、吸烟、饮酒、家族史阳性的无症状人群，即食管癌无症状高危人群进行内镜筛查时，早期癌的发现率仅2％左右，约90％以上的无症状高危人群均为“陪伴检查”。这些均限制了内镜筛查在无症状人群中的推广应用。因此，为进一步降低食管癌的死亡率、改善患者的预后，提高食管癌的早发现、早诊断和早治疗仍是关键，而寻求一种新的可用于人群筛查的非侵入性诊断方法显得尤要。
外周血中肿瘤标志物的检测，具有快速、创伤小、易于接受等优势，适合大规模人群筛查，并且便于进行长期动态监测，为食管癌的早期发现提供了一种简单方便的无创诊断方法。尽管目前临床常用的一些肿瘤标志物，如CA125(癌抗原125)、CA199(癌抗原199)、CEA(癌胚抗原)和SCCA(鳞状细胞癌抗原)等可用于食管癌的诊断，但其敏感性和特异性均不高，尤其是对早期食管鳞癌患者的诊断价值不够高。
在肿瘤发生发展的过程中，肿瘤患者血液中存在多种与肿瘤发生有关的抗原(肿瘤相关抗原(tumor associated antigens，TAAs))及自身抗体(TAAbs)。近十余年来，肿瘤相关抗原自身抗体在多种肿瘤类型中作为早期生物标志物得到广泛研究，如肝癌、肺癌、乳腺癌等。自身抗体具有以下优势：1.肿瘤相关抗原自身抗体能够在血清中持续稳定的存在，且在正常个体血液中的浓度极低；2.肿瘤相关抗原自身抗体可以在肿瘤患者出现主要临床症状之前的数月甚至数年即被检测到；3.用于检测自身抗体的方法成熟，相关试剂已商品化。这些优势使得肿瘤相关抗原自身抗体可能成为非常有潜力的肿瘤诊断标志物。
食管癌发生亦是一个非常复杂的过程，不仅涉及环境-遗传-基因互作等多因素的影响，而且还涉及影响细胞生长、多组学(基因、RNA、蛋白质和代谢产物等)关键分子改变，即肿瘤发生的多因素和多阶段的复杂过程。已有研究发现，食管癌患者的血清中也存在肿瘤相关抗原的自身抗体。研究表明，单一一种肿瘤相关抗原自身抗体在肿瘤患者血清中出现的频率非常低，一般为10％-30％左右，难以达到食管癌早期诊断的目的，因此通过联合检测食管癌患者血清中存在的多种抗肿瘤相关抗原抗体对食管癌的早期诊断、高危人群筛查具有一定的可能性和可行性。
数年来，本研究团队一直致力于食管癌发生发展的机制研究，对食管癌的自身抗体谱也进行了大量的研究。以食管鱗癌患者血清为研究对象，利用本研究团队建立的食管癌基因组学数据库联合自身抗体芯片技术，筛选出3种肿瘤相关抗原(KPNA6、PDE1A和CASK)，其对应的肿瘤自身抗体在食管鱗癌患者血清中表达水平与正常对照组具有显著差异，且在食管癌早期阶段甚至是癌前病变的血液样品中都能检测到，3种肿瘤相关抗原自身抗体的组合对食管癌的早期诊断具有较高的敏感性和特异性。以往大部分相关研究中所应用到的TAAs均是通过其它类型肿瘤而并非从食管癌中鉴定出来的，其在食管癌检测中的敏感性和特异性尚需进行充分的评价；有的研究虽然使用蛋白质组学技术鉴定了食管癌相关肿瘤抗原，但较少对其诱发的自身抗体作为食管癌早期免疫诊断标志物进行全面和深入的评价。因此，本研究团队筛选出使用食管鳞癌患者血清筛选出来的TAAs，及肿瘤相关抗原自身抗体对食管鳞癌的早期诊断更具有可靠性。
KPNA6(核转运蛋白α6，又称输入蛋白α7)，是核转运蛋白Imp家族的一种，广泛存在于真核细胞，可实现大分子蛋白质的穿越核膜的转运，其配体中有许多重要的信号分子，如细胞周期蛋白、组蛋白、癌蛋白等，使其与细胞的信号转导、细胞分裂及生长发育、细胞调亡等重要生命活动密切相关。PDE1A(磷酸二酯酶1A)，主要通过水解细胞内的cAMP和cGMP，在参与细胞增殖的信号传导途径中起着关键作用。降低PDE1A的活性或表达量可以显著促进细胞凋亡，同时显著上调抑癌基因，此作用在黑色素瘤细胞系和急性淋巴细胞白血病细胞系上均有报道。CASK(钙/钙调蛋白依赖性丝氨酸蛋白激酶)，是膜结合的鸟苷酸激酶(MAGUK)家族的成员，定位于细胞粘附位点，结合多种靶蛋白形成多蛋白复合物，参与细胞增殖分化、基因转录、细胞膜骨架构建、细胞连接及传递细胞内外信息等过程。
因此，结合本实验室研究发现，KPNA6、PDE1A和CASK对应的3种肿瘤相关抗原自身抗体的组合，对早期食管鳞癌患者的检测具有较高的灵敏度和特异性，特别适用于对食管癌高发区无症状人群进行食管癌早期筛查(无创、简便、经济)，以期提高食管癌早期检出率，改善患者生存质量，减轻家庭和社会负担。
发明内容
针对现有技术中存在的问题和不足，本发明的目的之一旨在提供一种用于早期食管癌筛查的标志物，本发明的目的之二旨在提供一种用于早期食管癌筛查的标志物的应用，本发明的目的之三旨在提供一种早期食管癌联合筛查试纸条。
为实现发明目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明首先提供了一种用于早期食管癌筛查的标志物，所述标志物为KPNA6蛋白、PDE1A蛋白和CASK蛋白中的任意一种或任意两种的组合或三种的组合。
本发明还提供了一种上述用于早期食管癌筛查的标志物在制备用于早期食管癌筛查产品中的应用。
根据上述的应用，优选地，所述产品通过酶联免疫法检测样本中所述标志物的抗体，确定标志物对应的抗体的表达水平。更加优选地，所述抗体为标志物对应的自身抗体。
根据上述的应用，优选地，所述样本为血清。
根据上述的应用，优选地，所述产品为试纸条或试剂盒。
本发明还提供了一种早期食管癌联合筛查试纸条，所述试纸条包括结合垫和层析垫，所述结合垫上包被有鼠抗人IgG单克隆抗体和兔IgG单克隆抗体，鼠抗人IgG单克隆抗体和兔IgG单克隆抗体上均带有可检测的标记物；所述层析垫上设有三条检测线和一条质控线，检测线上包被有检测抗原，三条检测线包被的检测抗原分别为KPNA6蛋白、PDE1A蛋白、CASK蛋白；所述质控带上包被有羊抗兔IgG。
根据上述的早期食管癌联合筛查试纸条，优选地，所述标记物为胶体金颗粒。更加优选地，所述胶体金颗粒的直径范围为25～35nm。
根据上述的早期食管癌联合筛查试纸条，优选地，所述试纸条还包括样品垫、吸样垫和底板，所述样品垫、结合垫、层析垫和吸样垫依次固定在底板上；其中，结合垫的一端压在样品垫的下方，结合垫的另一端压在层析垫的上方；层析垫的一端压在结合垫的下方，层析垫的另一端压在吸样垫的下方。
根据上述的早期食管癌联合筛查试纸条，优选地，所述层析垫上的三条检测线和一条质控线按照以下次序排列而成：层析垫从靠近吸样垫一端到靠近结合垫一端依次为包被有羊抗兔IgG的质控线C、包被有CASK蛋白的检测线T3、包被有PDE1A蛋白的检测线T2、包被有KPNA6蛋白的检测线T1。
根据上述的早期食管癌联合筛查试纸条，优选地，层析垫上检测线T1、T2、T3以及质控线C之间的间隔均不小于5mm。
根据上述的早期食管癌联合筛查试纸条，优选地，所述样品垫的材质为吸水性玻璃纤维，所述结合垫的材质为玻璃纤维膜，所述层析垫的材质为硝酸纤维素膜；所述吸样垫的材质为吸水纸或吸水性玻璃纤维膜；所述底板为PVC底板、硬纸板或硬质纤维板。
本发明还提供了一种上述早期食管癌联合筛查试纸条的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备结合垫：用胶体金颗粒标记鼠抗人IgG单克隆抗体和兔IgG单克隆抗体，将胶体金颗粒标记的鼠抗人IgG单克隆抗体和兔IgG单克隆抗体包被在玻璃纤维膜上，冷冻干燥，得到结合垫；
(2)制备层析垫：将KPNA6蛋白、PDE1A蛋白、CASK蛋白、羊抗兔IgG分别包被在硝酸纤维素膜的检测线T1、T2、T3和质控线C上，包被完成后干燥，然后将硝酸纤维素膜放入封闭液中封闭，封闭后干燥，即得层析垫；
(3)试纸条组装：将结合垫和层析垫固定在底板上，结合垫的一端与层析垫的一端连接，在结合垫的另一端放置样品垫，在层析垫的另一端放置吸样垫，干燥，即完成试纸条组装，得到早期食管癌联合筛查试纸条。
根据上述的制备方法，优选地，步骤(1)的具体操作为：
(1a)向胶体金溶液中加入鼠抗人IgG单克隆抗体和兔IgG单克隆抗体混合均匀，室温放置15min，加入稳定剂，混匀后静置10min，12000rpm离心30min，弃上清，沉淀用缓冲液重悬，得到胶体金颗粒标记的鼠抗人IgG单克隆抗体和胶体金颗粒标记的兔IgG单克隆抗体的混合溶液；
(1b)通过喷涂或浸渍的方式将胶体金颗粒标记的鼠抗人IgG单克隆抗体和胶体金颗粒标记的兔IgG单克隆抗体的混合溶液包被在玻璃纤维膜上，冷冻干燥，得到结合垫。
根据上述的制备方法，优选地，步骤(1a)中，所述混合溶液中胶体金颗粒标记的鼠抗人IgG单克隆抗体和胶体金颗粒标记的兔IgG单克隆抗体的浓度均为20～40μg/mL。更加优选地，所述混合溶液中胶体金颗粒标记的鼠抗人IgG单克隆抗体和胶体金颗粒标记的兔IgG单克隆抗体的浓度均为30μg/mL。
根据上述的制备方法，优选地，步骤(1a)中，所述稳定剂为10％的BSA(牛血清蛋白)溶液。
根据上述的制备方法，优选地，步骤(1a)中，所述缓冲液为含有1％BSA、5％蔗糖的0.01mol/L PH8.0的PBS溶液。
根据上述的制备方法，优选地，步骤(2)中，所述KPNA6蛋白、PDE1A蛋白、CASK蛋白浓度均为0.6～1.5mg/mL；所述羊抗兔IgG浓度为1～3mg/mL。更加优选地，所述KPNA6蛋白、PDE1A蛋白、CASK蛋白浓度均为1.0mg/mL；所述羊抗兔IgG浓度为2mg/mL。
根据上述的制备方法，优选地，步骤(2)中，所述封闭液为含1％BSA的0.01mol/LPH8.0的PBS溶液。
根据上述的制备方法，优选地，步骤(3)中，组装前，先将样品垫放入样品垫封闭液中浸泡30min，37℃烘干备用。更加优选地，所述样品垫封闭液为含1％BSA、1.0％～2.0％蔗糖、0.1-0.5％Tween-20、0.1-1.0％PVP聚乙烯基吡咯烷酮的0.01mol/L PBS溶液(pH＝7.4)。
本发明还提供了一种含有上述试纸条的试纸卡，所述试纸卡包括上述的试纸条和卡壳，所述试纸条内嵌在卡壳中，所述卡壳上表面对应层析垫的位置设有观察窗口，所述观察窗口上设有与层析垫上检测线T1、T2、T3和质控线C所对应的标识字符；卡壳上表面上对应样品垫的位置设有加样孔。
本发明还提供了一种包含上述早期食管癌联合筛查试纸条的试剂盒。
本发明早期食管癌联合筛查试纸条的使用方法为：取全血3-5mL，自然凝集10min后,3500rmp离心10min，取上清即得到待测血清样品；取100μL待测血清样品，将试纸条样品垫插入待测血清样品中至少10s，5-15min内观察检测线和质控线颜色变化并记录结果。
本发明早期食管癌联合筛查试纸条的结果判定方法为：
阳性结果：在试纸条的层析垫T1、T2、T3任意1条检测线出现紫红色条带，质控线C上出现1条紫红色条带，判定检测结果为阳性。
阴性结果：试纸条层析垫上的T1、T2、T3检测线均未出现紫红色条带，仅质控线C上出现一条紫红色条带，判定检测结果为阴性。
无效结果：试纸条层析垫上的质控线C上未出现紫红色条带，判断检测结果为无效。
本发明早期食管癌联合筛查试纸条的检测原理为：
将试纸条插入待测血清样品中，样品流向吸样垫的方向，当流到结合垫上时，结合垫上金标鼠抗人IgG(胶体金标记的鼠抗人IgG)和金标兔IgG(胶体金标记的兔IgG)溶解，其中，金标鼠抗人IgG与血清样品中可能含有的KPNA6自身抗体、PDE1A自身抗体、CASK自身抗体结合分别形成KPNA6自身抗体-金标鼠抗人IgG免疫复合物、PDE1A自身抗体-金标鼠抗人IgG免疫复合物、CASK自身抗体-金标鼠抗人IgG免疫复合物；由于毛细管效应，胶体金标记的兔IgG与这三种免疫复合物向吸样垫泳动，免疫复合物与包被在层析垫检测线T1上的KPNA6抗原(KPNA6蛋白)、检测线T2上的PDE1A抗原(PDE1A蛋白)和检测线T3上的CASK抗原(CASK蛋白)发生特异性免疫结合反应，分别形成KPNA6抗原-KPNA6自身抗体-金标鼠抗人IgG三联体免疫复合物、PDE1A抗原-PDE1A自身抗体-金标鼠抗人IgG三联体免疫复合物、CASK抗原-CASK自身抗体-金标鼠抗人IgG三联体免疫复合物，上述三种三联体复合物依次被截留在检测线T1、T2、T3上，逐渐富集形成紫红色条带；金标兔IgG由于毛细效应继续向前泳动，与包被在质控线上的羊抗兔IgG发生特异的免疫反应被截留，逐渐富集在质控线上形成较深的紫红色条带，多余的未结合的物质继续层析到吸样垫上，因此在检测线和质控线都出现条带的判为阳性结果。若血清样品中不含KPNA6、PDE1A、CASK自身抗体，胶体金标记的鼠抗人IgG和兔IgG到达检测线时，不与包被在检测线上的KPNA6抗原、PDE1A抗原和CASK抗原发生免疫反应，因此在检测线处没有出现显色带，而金标兔IgG继续向前泳动与包被于质控线处羊抗兔IgG发生特异的免疫反应而被截留，逐渐富集在质控线上形成紫红色条带，因此仅在质控上出现条带判为阴性结果。如质控线未显色则表明该试剂无效。
与现有技术相比，本发明取得的积极有益效果为：
(1)本发明首次将KPNA6蛋白、PDE1A蛋白、CASK蛋白这三种蛋白作为早期食管癌筛查的标志物，用于检测人血清中KPNA6自身抗体、PDE1A自身抗体、CASK自身抗体的表达水平，可以有效检测食管癌，尤其是早期食管癌，而且，当三种蛋白作为一个组合用于联合检测人血清中KPNA6自身抗体、PDE1A自身抗体和CASK自身抗体时，其检测灵敏度高达88％(即早期食管癌患者中应用这3个肿瘤相关抗原自身抗体进行诊断时被正确的诊断为早期食管癌的比率为88％)，特异度达到了90％(即非食管癌患者中应用这3个肿瘤相关抗原自身抗体进行诊断时确定为未患食管癌者的比率为90％)，因此，本发明的标志物具有较高的灵敏度和特异度，极大地提高了早期食管癌的检出率，而且，对食管癌的检出率远高于现有临床内镜筛查食管癌的检出率，可用于食管癌高发区无症状人群的大规模筛查，有利于无症状食管癌高危人群早期发现，从而大大降低了食管癌患者的死亡率，为食管癌患者和家庭带来极大的福祉。
(2)本发明试纸条实现一个试纸条同时联合检测多个靶点，试纸条具有较高的灵敏度和特异度，针对早期癌的检测准确性高，极大地提高了早期食管癌的检出率，有利于无症状食管癌高危人群早期发现，从而大大降低了食管癌患者的死亡率，同时也为实现食管癌高发区无症状高危人群长期跟踪提供重要的检测手段，具有广阔的市场前景和社会效益。
(3)本发明早期食管癌联合筛查试纸条操作简便，使用方便，而且检测出结果时间短，只需将其测试端插入待检的样品液中10s左右,然后在15min内即可判定检测结果。
(4)本发明早期食管癌联合筛查试纸条不需其它仪器及试剂，非专业人员也可随时检测，可极大的降低检测成本和检测费用。
(5)本发明早期食管癌联合筛查试纸条的检测样本为血清，需血量少，群众痛苦小、接受度高。
附图说明
图1为本发明实施例1制备的早期食管癌联合筛查试纸条的示意图。
图2为3种TAA自身抗体在早期食管鳞癌组和对照组中的阳性率结果图。
图3为3种TAA自身抗体联合检测早期食管癌的ROC曲线。
图1中：1为吸样垫、2为层析垫，3为结合垫，4为样品垫，5为底板。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。
下列实施例所述的实验方法，如无特殊说明，均为本技术领域常规技术，或按照生产厂商所建议的条件；所用试剂、材料和仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：试纸条的制备
1、实验材料
本发明中所用的生物活性原料均为市售产品。其中，鼠抗人IgG单克隆抗体购自abcam公司，货号为ab211339；兔IgG单克隆抗体购自abcam公司，货号为ab133470；KPNA6蛋白购自Invitrogen公司，货号为PEP-1150；PDE1A蛋白购自abcam公司，货号为ab125661；CASK蛋白购自abcam公司，货号为ab131707；羊抗兔IgG单克隆抗体购自abcam公司，货号为ab238531。
PVC底板、硝酸纤维素膜、玻璃纤维膜、吸水纸等均为现有市售产品。
2、制备结合垫
(1)胶体金合成：
采用柠檬酸三钠还原法制备直径为25～35nm的胶体金溶液。在洗净的烧瓶中加入300mL 0.01％的氯金酸溶液，加热至沸。磁力搅拌下快速加入4.8mL 0.1％的柠檬酸三钠水溶液，继续加热煮沸15min，直至颜色逐渐稳定为透亮的酒红色。将烧瓶置于室温冷却，用蒸馏水恢复至原体积，4℃保藏。
(2)确定胶体金标记的最佳pH值：
用0.1M K2CO3将胶体金液pH调节至6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5，各取1mL上述不同pH的胶体金液，分别加入10μg鼠抗人IgG、10ug兔IgG，混合均匀，室温反应10min，静置2小时，观察溶液颜色变化。12000rpm离心10min，去上清，加入含1％BSA的PBS溶解沉淀，以沉淀完全溶解呈均匀的透明紫红色溶液管的值为最佳。结果显示胶体金标记的最佳pH都为8.0。
(3)胶体金颗粒标记的鼠抗人IgG单克隆抗体和胶体金颗粒标记的兔IgG单克隆抗体的制备：
用0.1M碳酸钾溶液将1mL胶体金溶液pH调至8.0，向胶体金溶液中加入鼠抗人IgG单克隆抗体和兔IgG单克隆抗体，混合均匀，室温放置15min，加入稳定剂(10％的BSA溶液)，混匀后室温静置10min，12000rpm离心30min，弃上清，沉淀用缓冲液重悬，得到胶体金颗粒标记的鼠抗人IgG单克隆抗体和胶体金颗粒标记的兔IgG单克隆抗体的混合溶液(该混合溶液中胶体金颗粒标记的鼠抗人IgG单克隆抗体和胶体金颗粒标记的兔IgG单克隆抗体的浓度均为35μg/mL)；其中，所述缓冲液为含有1％BSA、5％蔗糖的0.01mol/L PH8.0的PBS溶液。
(4)结合垫的制备：
选用玻璃纤维膜作为结合垫材料，将玻璃纤维膜在胶体金颗粒标记的鼠抗人IgG单克隆抗体和胶体金颗粒标记的兔IgG单克隆抗体的混合溶液中浸泡5-15min，取出后冷冻干燥，得到结合垫。
3、制备层析垫
选用硝酸纤维素膜作为层析垫材料，在硝酸纤维素膜上标记好三条检测线T1、T2、T3和一条质控线C的位置，彼此之间间隔6mm。将KPNA6抗原(KPNA6蛋白)、PDE1A抗原(PDE1A蛋白)、CASK抗原(CASK蛋白)均稀释至1mg/mL，羊抗兔IgG稀释至2mg/mL，用划膜仪在硝酸纤维素膜上三条检测线T1、T2、T3和三条质控线C的位置上按0.1-0.5μL/mm用量进行划线，37℃烘干过夜；然后将硝酸纤维素膜浸入1％BSA的0.01mol/l，PH8.0的PBS溶液中，然后取出硝酸纤维素膜用PBS清洗，干燥后得到层析垫。
4、样品垫制备
样品垫的材质为玻璃纤维膜，将玻璃纤维膜放入样品垫封闭液中浸泡30min，37℃烘干，即得样品垫；其中样品垫封闭液为含1％BSA、1.0％～2.0％蔗糖、0.1-0.5％Tween-20、0.1-1.0％PVP聚乙烯基吡咯烷酮的0.01mol/L PBS溶液(pH＝7.4)。
5、试纸条组装
试纸条由样品垫、结合垫、层析垫、吸样垫和底板组成，吸样垫的材料为吸水滤纸。
将样品垫、结合垫、层析垫、吸样垫依次裁剪成合适的尺寸，宽度为1cm，长度为8cm。将层析垫贴合在底板的中间，为检测区和质控区，即在层析垫上设置用以判读结果的检测线T1、T2和T3以及质控线C；层析垫右端(上段)为手持部位，固定有吸样垫(吸水滤纸)，吸收检测样品中多余液体；层析垫左端固定结合垫，吸附有胶体金标记的鼠抗人IgG、兔IgG；结合垫和吸样垫分别与硝层析垫的两端重叠；结合垫远离层析垫的一端(下段)固定有样品垫，用于接触待检测样品，组装完成后干燥，即得早期食管癌联合筛查试纸条(参见图1)。
6、试纸条的使用方法
将样品垫插入待测血清样品中至少10s，试纸条取出后平放静置5-15min，观察检测线和质控线颜色变化。
7、试纸条的检测结果判定
阳性结果：在试纸条的层析垫T1、T2、T3任意1条检测线出现紫红色条带，质控线C上出现1条紫红色条带，判定检测结果为阳性。
阴性结果：试纸条层析垫上的T1、T2、T3检测线均未出现紫红色条带，仅质控线C上出现一条紫红色条带，判定检测结果为阴性。
无效结果：试纸条层析垫上的质控线C上未出现紫红色条带，判断检测结果为无效。
8、试纸条检测时的注意事项
(1)被检样品在室温(20℃左右)条件下检测。
(2)要求被检样品为新鲜样品。样品收集1h内检测，保证结果的可靠性。
(3)本试纸条仅供体外检测粗筛，不能作为确认试剂，阳性结果必须进行进一步上消化道内镜检查协诊。
(4)30min后观察结果无效。
(5)试纸条应避光保存。
实施例2：试纸条的诊断价值分析
用本发明实施例1制备的试纸条检测经病理确诊的早期食管癌患者和正常人的血清样品，评估分析本发明试纸条用于早期食管癌筛查和诊断的价值。
1、样本来源
收集来自郑州大学第一附属医院的100例早期食管鳞癌患者血清样品，以及100例正常人血清作为对照。100例食管癌患者血清(食管癌组)均来自病理确诊且未接受任何放化疗的初诊病人，男性50例，女性50例，平均年龄59.1±6.8岁，年龄范围40～80岁；100例正常人血清(对照组)来自门诊健康体检人群，并经胃镜病理活检排除食管癌前病变或早期食管癌，无任何肿瘤相关证据，其中男性50例，女性50例，平均年龄58.8±6.5岁，年龄范围42～81岁。
2、实验方法
采用本发明实施例1制备的试纸条分别对食管癌组、对照组的血清样本进行检测。具体检测的方法为：取100μL待测血清样本，将试纸条下端的样品垫插入待测血清样本中10s～15s，取出试纸条，将试纸条平放静置5～15min，观察检测线和质控线颜色变化，判断检测结果。
根据结果判断标准，分别计算食管癌组和对照组中这3种肿瘤相关抗原自身抗体的阳性率(每组中检测出的阳性对象例数除以该组被检测对象总例数即为阳性率)，并应用Excel软件绘制4种肿瘤相关抗原的自身抗体在早期食管鳞癌组和对照组中阳性率的柱形图(图2)；应用spss26.0软件进行统计学检验，采用两独立样本卡方检验方法比较早期食管鳞癌和对照组中抗体阳性率，检验水平α＝0.05，当p＜0.05时，结果具有统计学意义，然后采用筛检试验的方法评价自身抗体检测食管鳞癌的诊断价值(表1和图3)。
3、结果分析
由表1和图2可知，3种KPNA6、PDE1A、CASK肿瘤相关自身抗体在食管癌组的阳性率均高于其在对照组中的阳性率，且食管癌组与对照组间的差异具有统计学意义(P＜0.05)。由此可见，KPNA6、PDE1A、CASK3这种肿瘤相关自身抗体可作为早期食管癌诊断检测指标，用于早期食管癌的检测，具有诊断价值。
表1不同肿瘤相关抗原自身抗体联合检测在食管癌中诊断价值的真实性评价
Figure BDA0002713699160000121
注：TAA表示肿瘤相关抗原；TAAb表示肿瘤相关自身抗体。
由表1可知，随着试纸条层析垫上并联检测指标(抗原)的增加，早期食管癌患者血清中，肿瘤相关抗原自身抗体的阳性率(即灵敏度)逐渐增大，而特异度则逐渐减小；当3种肿瘤相关抗原KPNA6、PDE1A、CASK联合使用时，检测灵敏度达到88％，也就是说食管癌患者中应用该检测方法能够正确诊断食管癌鳞癌的百分比为88％。虽然随抗原数目增加，检测特异度逐渐降低，但当3种肿瘤相关抗原联合时，其检测特异度仍然能够达到90％，也就是说非食管癌患者采用这种方法检测时，正确诊断为健康人的百分比为90％。
而且，与单独采用一种肿瘤相关抗原检测相比，3种肿瘤相关抗原KPNA6、PDE1A、CASK联合使用进行早期食管鳞癌诊断时，其灵敏度分别为单一指标KPNA6、PDE1A、CASK的3.4倍、2.7倍和2.4倍。
因此，使用KPNA6、PDE1A、CASK这3种肿瘤相关抗原组合检测血清样本中对应肿瘤相关抗原自身抗体进行早期食管癌筛查，可以保证诊断特异度的前提下，大幅提高诊断的灵敏度。
此外，约登指数在统计学上指灵敏度和特异度之和减去1，其范围为0～1，约登指数越接近1，其诊断价值就越高。本发明中，随着层析垫上包被抗原数量的增加，约登指数不断增加且逐渐趋于1，表明这3种肿瘤相关抗原联合用于诊断和筛查早期食管癌具有较好的诊断价值。
总之，采用KPNA6、PDE1A、CASK这3种肿瘤相关抗原的自身抗体联合检测早期食管癌，能保证较高的特异度和灵敏度，对待检测对象食管癌风险评估具有较好的诊断和应用价值。
由图3可知，应用KPNA6、PDE1A、CASK这3种肿瘤相关抗原自身抗体联合检测早期食管鳞癌血清中自身抗体时，随着指标组合数目的增加，ROC曲线下面积不断升高，3种指标联合时，ROC曲线下面积达到最大为0.890，说明该早期食管癌联合检测试纸条对早期食管鳞癌的诊断具有较高的灵敏度和特异度，该试纸条适合早期食管鳞癌的诊断和食管癌高危人群的筛查。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，但不仅限于上述实例，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种标志物在制备用于早期食管癌筛查产品中的应用，所述标志物为PDE1A蛋白或PDE1A蛋白与KPNA6蛋白的组合或PDE1A蛋白与CASK蛋白的组合。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品的检测样本为血清。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述产品为试纸条。
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