CN112176044A - 一种油封式基因测序芯片疏水性表面抗蛋白吸附的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种油封式基因测序芯片疏水性表面抗蛋白吸附的方法。通过在溶液中添加一种氟代烷基表面活性剂，所述表面活性剂的疏水端含有氟代烷基链，亲水端含有寡聚乙二醇基团。与常用的抗蛋白吸附试剂如非氟代的表面活性剂
Figure DDA0002118435110000011
以及聚乙二醇相比,氟代烷基表面活性剂能更好地抗蛋白吸附。本发明公开的抗蛋白吸附的方法可以应用到高通量测序，数字PCR，数字ELASA等高通量生物检测等方面。

Description

一种油封式基因测序芯片疏水性表面抗蛋白吸附的方法
技术领域
本发明涉及一种油封式基因测序芯片疏水性表面抗蛋白吸附的方法，属于生物化学领域，更精确的属于基因测序领域。
背景技术
基因测序是新兴的技术。近年来，基因安全和检测越来越受到人们的关注。现有的基因测序技术中，二代测序技术是主流的测序技术。三代测序技术由于其准确性等因素，尚未成熟。根据预测，二代基因测序技术在未来的十几年甚至更长的时间内还将是基因测序技术的主流。油封式的基因测序技术具备很多的好处，比如独立的反应室，不交叉的反应单元等等。油封式的测序技术中，表面的处理属于重大的研究方向。目前已知的技术中，表面是用氟代等硅烷进行处理，从而达到疏水的目的。油封式的测序过程中，多轮的反应会使得表面的性能降低，例如酶蛋白吸附在表面上等原因。因此，多轮的测序过程中的表面保持属于重要的课题。以前的现有技术并未在这个方向给出太多的提示。本发明公开一种油封式基因测序芯片疏水性表面抗蛋白吸附的方法，通过在水相反应液中和/或水相清洗液中添加氟代烷基表面活性剂及其它抗蛋白吸附分子的方法，抑制蛋白吸附，维持微坑阵列芯片表面的疏水性，减少表面残水。
发明内容
本发明公开一种油封式基因测序芯片疏水性表面抗蛋白吸附的方法，其特征在于，包括基因测序芯片，所述基因测序芯片的至少一个内表面上有预先加工好的微坑；所述基因测序芯片的至少部分内表面疏水修饰；测序过程中，基因测序芯片的内表面暴露在含有蛋白质的溶液中；通过在测序试剂或者清洗液中添加氟代烷基表面活性剂来减少蛋白分子在疏水性表面的吸附；所述氟代烷基表面活性剂结构特征在于疏水端含有氟代烷基链，亲水端含有聚乙二醇基团。
根据优选的实施方式，所述氟代烷基表面活性剂结构为CF3(CF2)m(CH2CH2O)nH及其异构体、衍生物，m和n为3至100之间的任一整数值。
根据优选的实施方式，所述氟代烷基表面活性剂结构为CF3(CF2)m(CH2CH2O)nH及其异构体、衍生物，m和n为3至20之间的任一整数值。
根据优选的实施方式，所述氟代烷基表面活性剂的浓度为1ppm至500ppm。
根据优选的实施方式，添加PEG和/或其衍生物作为表面活性剂助剂。
根据优选的实施方式，所述PEG和/或其衍生物分子量为200-80000，以质量体积比0.1％至5％的浓度添加到溶液中。
本发明公开一种油封式基因测序芯片检测系统疏水性表面抗蛋白吸附的方法，所述油封式基因测序芯片检测系统包括：1)微坑阵列，2)油相液体，3)水相反应液，4)水相清洗液；其中所述基因测序芯片包括高通量微坑阵列形成的微反应腔室以及覆盖在微反应腔室上面的流体腔室；所述微反应腔室至少部分表面疏水；所述油封的特征在于借助于微反应腔室外部的疏水表面，油相液体将水相反应液密封在微反应腔室内；所述的水相反应液含有一定量的蛋白分子；通过在水相反应液和/或水相清洗液中添加氟代烷基表面活性剂的方法，减少蛋白吸附，维持微坑阵列芯片表面的疏水性，从而减少表面残水。
根据优选的实施方式，所述氟代烷基表面活性剂疏水端含有的氟代烷烃链，亲水端含有寡聚乙二醇。
根据优选的实施方式，所述氟代烷基表面活性剂结构为CF3(CF2)m(CH2CH2O)nH及其异构体、衍生物，m和n为3至100之间的任一整数值。
根据优选的实施方式，所述氟代烷基表面活性剂以约1ppm至约500ppm的浓度存在。
根据优选的实施方式，添加PEG和/或其衍生物作为表面活性剂助剂。
根据权利要求10，所述PEG和/或其衍生物子量为200-80000，以质量体积比约0.1％至约5％的浓度添加到溶液中。
本发明公开一种油封式的生物化学检测系统，其特征在于，包括生物芯片，所述生物芯片包括流体入口和流体出口，包括流体室；所述生物芯片的至少一个内表面有预先加工好的微坑；所述生物芯片的的至少部分内表面疏水修饰；所述生物化学检测系统包括密封油；所述生物化学检测系统包括生物化学反应液和/或清洗液；所述生物化学反应液和/或清洗液中包含氟代烷基表面活性剂；所述结构特征在于疏水端含有氟代烷基链，亲水端含有聚乙二醇基团。
本发明公开一种减少油封的微坑阵列芯片系统表面残水的方法。所述油封的微坑阵列芯片系统包括1)微坑阵列芯片；2)油相液体；3)水相反应液；4)水相清洗液。其中所述微坑阵列芯片包括高通量微反应腔室以及覆盖在微反应腔室上面的流体腔室。所述微反应腔室至少外部表面为疏水表面。所述油封的特征在于借助于微反应腔室外部表面的疏水性，用油相液体将水相反应液密封在微反应腔室内，使得微反应腔室间相互隔绝。此系统可用于高通量测序，数字PCR，数字ELASA等高通量生物检测。所述水相的反应液中通常含有蛋白分子，如酶、抗原、抗体等。而蛋白分子极易吸附在微坑阵列芯片的表面改变表面的疏水性质，从而在油封的过程中形成水膜，导致表面残水。本发明通过在水相反应液中和/或水相清洗液中添加氟代烷基表面活性剂及其它抗蛋白吸附分子的方法，抑制蛋白吸附，维持微坑阵列芯片表面的疏水性，减少表面残水。通过在溶液中添加一种氟代烷基表面活性剂，所述表面活性剂的疏水端含有氟代烷基链，亲水端含有寡聚乙二醇基团。与常用的抗蛋白吸附试剂如非氟代的表面活性剂
Figure BDA0002118435090000041
Figure BDA0002118435090000042
以及聚乙二醇相比,氟代烷基表面活性剂能更好地抗蛋白吸附。
附图说明
图1.油封的微坑阵列芯片结构示意图。标注为：1.微坑阵列芯片，2.微反应腔室，3.流体通道，4.油相液体，5.水相反应液，6.输水表面；
图2.油封测序反应液后的残水图，实验条件分别为在测序反应液中不添加抗残水试剂(a)，以及在测序反应液中添加Tween20(b)，PEG(c)，PVP(d)等常规抗吸附试剂的残水图；图3.测序反应液中添加FA-OEG(a)，
Figure BDA0002118435090000043
FS10(b)，
Figure BDA0002118435090000044
FS50(c)，
Figure BDA0002118435090000045
FS81(d)，油封的残水效果图；
图4.测序反应液中添加FA-OEG及PEG混合物后，油封的残水效果图。
具体实施方式
为了进一步说明本发明的核心内容，现将本发明用下面的例子作为说明。实施例是为了进一步解释发明内容部分，并不对于本发明造成限制。
本发明可以用专利CN2017105741742，或者专利CN2017105741441，或者专利CN201710630287X中所述的芯片结构。这三个专利中的内容，能够以引用的方式加入本专利。
基因检测，药物筛选等领域常需要具有百万个至千万个微小反应腔室的微流体芯片以实现高通量、特异性的检测。该芯片内的每一个微小反应腔室为独立的检测单元，从反应过程到信号采集都独立分隔开以避免相互之间有物质交换。用油封含有若干微反应腔室的微坑阵列芯片是实现各反应腔室独立的一种方式。该微坑阵列芯片的组成通常包含一个带有高通量微反应腔室的芯片面板和覆盖在该面板上的流体腔室(见图1)。其中微反应腔室至少外部表面是疏水的。使用过程中，流体腔室内将被顺序通入一系列溶液：首先将反应液通入流体腔室，此时流体腔室内的溶液同样也会进入微反应腔室；再通入油，由于微反应腔室上表面的疏水性质，油将替换流体腔室内的反应液但不能进入微反应腔室，这样微反应腔室内的反应液就被油封在了其中，避免了微反应腔室间的分子扩散；最后再通入洗液将油及微坑内的反应液冲走。以上过程的循环使用可以用于DNA测序反应系统，如CN108070526所述。在生物检测领域中，这些反应液里都含有酶、抗原、抗体等蛋白分子，这些蛋白分子极容易吸附在芯片表面，改变表面的疏水性质，引起表面残水，从而不能影响油封的效果。本发明通过在水相反应液中和/或水相清洗液中添加氟代烷基表面活性剂及其它抗蛋白吸附分子的方法，抑制蛋白吸附，维持微坑阵列芯片表面的疏水性，减少表面残水。
本发明公开一种疏水性表面抗蛋白吸附的方法。所述疏水性表面暴露在含蛋白分子的溶液中。通过在溶液中添加一种氟代烷基表面活性剂来减少蛋白分子在疏水性表面的吸附。所述氟代烷基表面活性剂的疏水端含有氟代烷基链，亲水端含有寡聚乙二醇基团(perfluorinated alkanes capped with oligoethylene glycol，简称FA-OEG)。
所述氟代烷基表面活性剂结构为CF3(CF2)m(CH2CH2O)nH及其异构体、衍生物，m和n为3至100之间的任一整数值。所述氟代烷基表面活性剂以约1ppm至约500ppm的浓度存在。所述疏水表面至少部分区域接触角大于120°。所述蛋白分子为酶，抗原，抗体等。所述蛋白分子以质量体积比约0.1％至约5％的浓度存在。所述氟代烷基表面活性剂抗蛋白吸附功能，与常用的抗蛋白吸附试剂
Figure BDA0002118435090000061
以及聚乙二醇相比,有很大提高。
本发明公开一种减少油封的微坑阵列芯片系统表面残水的方法。所述油封的微坑阵列芯片检测系统包括1)微坑阵列芯片；2)油相液体；3)水相反应液；4)水相清洗液。其中所述微坑阵列芯片包括高通量微反应腔室以及覆盖在微反应腔室上面的流体腔室。所述微反应腔室至少外部表面为疏水表面。所述油封的特征在于借助于微反应腔室外部的疏水表面，油相液体将水相液体密封在微反应腔室内。所述的水相液体含有一定量的蛋白分子。所述的表面残水是指水相液体中的蛋白分子，容易吸附在微反应腔室外部疏水表面，改变表面的性质，从而在油封的过程中形成水膜，影响油封效果。本发明通过在水相反应液和/或水相清洗液中添加氟代烷基表面活性剂的方法，减少蛋白吸附，维持微坑阵列芯片表面的疏水性，从而减少表面残水。所述氟代烷基表面活性剂的疏水端含有氟代烷基链，亲水端含有寡聚乙二醇基团。所述氟代烷基表面活性剂结构为CF3(CF2)m(CH2CH2O)nH及其异构体、衍生物，m和n为3至100之间的任一整数值。所述氟代烷基表面活性剂以约1ppm至约500ppm的浓度存在。所述水相反应液和/或水相清洗液中还添加一种或更多种化合物，所述化合物优选地为PEG及其衍生物。所述化合物进一步抑制所述蛋白的吸附。所述PEG及其衍生物以质量体积比约0.1％至约5％的浓度存在。进一步地，所述微反应腔室外部疏水表面接触角大于120°。所述蛋白分子为DNA聚合酶，抗原，抗体等。所述蛋白分子以质量体积比约0.1％至约5％的浓度存在。所述油封的微坑阵列芯片系统可以重复油封至少100个循环，残水面积小于5％,优选地小于1％。可用于数字PCR,数字ELASA，高通量测序等领域。
根据优选的实施方式，所述氟代烷基表面活性剂结构为CF3(CF2)m(CH2CH2O)nH，m和n为3至80之间的任一整数值。
根据优选的实施方式，所述氟代烷基表面活性剂结构为CF3(CF2)m(CH2CH2O)nH，m和n为3至60之间的任一整数值。
根据优选的实施方式，所述氟代烷基表面活性剂结构为CF3(CF2)m(CH2CH2O)nH，m和n为3至50之间的任一整数值。
根据优选的实施方式，所述氟代烷基表面活性剂以约10ppm至约400ppm的浓度存在；更优选的30-400ppm，更优选的50-300ppm。
优选地，所述油封的微坑阵列芯片系统用于高通量测序。该系统除了上述微坑阵列芯片，油相液体，水相反应液，水相清洗液，还包括油相清洗液。所述油相清洗液为异丙醇，乙醇或者含有表面活性剂的水溶液。高通量测序时该系统工作流程为：1)微坑阵列芯片中通入水相清洗液，用于清洗芯片；2)通入水相反应液；3)通入油相液体，将水相反应液油封在微反应腔室内；4)通过外置设备触发测序反应发生，并采集信号；5)通入油相清洗液清洗油相液体；6)步骤1)-5)为一个反应循环，重复20以上或300个以上为一个测序循环。所述油可以是C11-C25的烷烃，杜邦或3M的氟油等物质。所述疏水性表面为氟代硅烷所修饰的表面。所述水相反应液中蛋白分子为DNA聚合酶，质量体积分数为0.5％-5％。本发明通过在水相反应液中添加氟代烷基表面活性剂，优选地为CF3(CF2)m(CH2CH2O)nH，m,n为3至15中几个不同整数值的混合物，显著减少了表面残水，残水面积下降至少50％。同时本发明还可以在水相清洗液中添加氟代烷基表面活性剂，一方面可以清洗掉表面吸附的蛋白分子，恢复表面的疏水性，另一方面可以在疏水表面预吸附一层氟代烷烃表面活性剂分子，抑制后续水相反应液进液后蛋白在表面的吸附。预想的机理有不完善的地方，基本靠实验来确定效果。
本发明进一步在水相反应液和/或水相清洗液中添加PEG(分子量6000，质量体积比1％)，残水面积进一步减少，残水面积下降至少10％，50％。此外，本发明还对比测试了一些常规的抗蛋白吸附试剂的抗残水效果，如
Figure BDA0002118435090000081
聚乙二醇(PEG)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，均没有很好的抗残水效果。又筛选了一系列其它种类的氟代烷基表面活性剂，其中包括
Figure BDA0002118435090000082
FS10(非离子氟表面活性剂),
Figure BDA0002118435090000084
FS50(两性氟表面活性剂),
Figure BDA0002118435090000083
FS81，抗残水均没有氟代烷基链连接寡聚乙二醇的氟代烷基表面活性剂效果好。
根据优选的实施方式，所述PEG分子量为200-80000，更优选的分子量为300-70000，更优选的分子量为500-50000。
根据优选的实施方式，所述油封的微坑阵列芯片检测系统还可以包括另一种洗液，用于清洗油相液体。
根据优选的实施方式，所述另一种洗液为异丙醇、乙醇或含有表面活性剂的水溶液。
根据优选的实施方式，优选地，所述油封的微坑阵列芯片检测系统工作流程为：水相清洗液清洗微坑阵列芯片，通入水相反应液至微坑阵列芯片，油封将水相反应液密封在微反应腔室内，油相清洗液清洗芯片。
根据优选的实施方式，所述油封的微坑阵列芯片系统可以重复油封100次以上，残水面积小于5％，优选地小于1％。
根据优选的实施方式，所述油封的微坑阵列芯片系统用于高通量测序。
根据优选的实施方式，所述蛋白分子为DNA聚合酶。
根据优选的实施方式，所述油可以是C11-C25的烷烃，杜邦或3M的氟油等物质。
根据优选的实施方式，所述氟代烷基表面活性剂抗残水效果，与常用的抗蛋白吸附试剂
Figure BDA0002118435090000091
以及聚乙二醇相比,表面残水面积下降至少50％，500％。
本发明所涉及的芯片可以参见申请人公开的专利CN2017105741742等，必要的时候，该专利中的部分内容可以加入本发明。
本发明的描述中，上方、下方等方位的词语并不表示严格的位置，只是相对的位置。例如，微反应腔室上面表示的意思是与微坑反应室平行的方位。
除特殊说明外，本发明中所涉及的词语均为本领域的常规意义。
实施例1
微坑阵列芯片组成由带有微反应腔室的芯片面板，双面胶，玻璃三者组装成而成。其中带有微反应腔室的芯片面板为光纤面板或二氧化硅类面板刻蚀而成，双面胶为中空结构提供流体腔室，同时还有流体进液口和出液口。微反应腔室芯片面板的上表面修饰有疏水性氟代硅烷。
准备试剂。其中水相反应液为：2U/μL Bst DNA聚合酶(蛋白质量体积比为1％)，1mM氯化锰,100nM的FAM染料(5-Carboxyfluorescein)溶解在缓冲液中(缓冲液为20mMTris-base,20mM氯化铵,50mM氯化钾，PH8.3)。此水相反应液为常规测序反应液组分，其中为了便于观察油封效果未加测序用核苷酸底物，换成了荧光染料FAM。油封所用有油为硅油。油相清洗液为异丙醇(IPA)。水相清洗液二为20mM Tris-base,20mM氯化铵,50mM氯化钾，PH8.3。以上试剂为常规油封试剂。本发明一种优选的改进实验组是在水相反应液中添加不同的表面活性剂和抗残水试剂。所添加的物质种类及含量如下表所示。其中FA-OEG为CF3(CF2)m(CH2CH2O)nH，m,n为3至15中几个不同整数值的混合物。
Figure BDA0002118435090000101
油封流程包括：
(1)放置好微坑阵列芯片和油封试剂；
(2)微坑阵列芯片中通入水相清洗液；
(3)温控平台冷却微坑阵列芯片至15℃；
(4)水相反应液通入芯片中；
(5)通入氟油进行油封；
(6)温控平台升温至65℃，保持反应时间为45秒；
(7)再次降温至15℃，采集信号；
(8)通入异丙醇，清洗油及微坑内反应液；
(9)重复过程(1)-(8)50次。
图2为常规抗残水试剂在油封测序试剂系统中残水情况。其中白色亮点为残水。实验条件分别为在测序反应液中不添加抗残水试剂(a)，在测序反应液中添加50ppm
Figure BDA0002118435090000111
(b)，1％分子量6000的PEG(c)，以及1％分子量240000的PVP(d)。图3为不同的氟代烷基表面活性剂在油封测序试剂系统中抗残水情况，实验条件分别为在测序反应液中添加50ppm FA-OEG(a)，
Figure BDA0002118435090000112
FS10(b)，
Figure BDA0002118435090000113
FS50(c)，
Figure BDA0002118435090000114
FS81(d)。对比图2和图3的结果50ppm FA-OEG的残水面积明显变少。进一步在50ppm FA-OEG基础上添加1％PEG6000,残水面积进一步减少，如图4所示。
通过结果可以发现，FA-OEG防止蛋白吸附的效果明显。各种试剂综合比较，FA-OEG防止残水的效果最好。另外，FA-OEG与PEG连用的时候，进一步提升防止蛋白吸附的效果。
需要说明的是，残水面积可能随着重复次数增多而增多。但是一般的，这种增多是类线性可见的。并不需要罗列大量的实验数据表明这种趋势，也不会违背本实验的结论。
申请人实验了各种浓度，总体来说，在一般文献教导的普通试剂浓度范围内，并没有太显著的差异。氟代烷基表面活性剂的浓度超过500PPM的时候，会导致表面缓慢变化，可以加剧残水，并不是实用的浓度条件。另外，一系列的实验也表明了，PEG或者其简单衍生物的应用也是有限制的。当其分子量太大或者太小的时候，并不利于去除残水。实验表明，PEG的合适分子量为200-80000，以质量体积比约0.1％至约5％的浓度添加到溶液中。
总结性的，表面残水具有强烈的不可预料性。经过大量的实验发现，一般的表面活性剂或者常用的表面活性剂并不适用于疏水表面的抗蛋白吸附。例如常见的离子或者非离子表面活性剂，或者实验室常见表面活性剂，都适用于疏水表面的抗蛋白吸附。只有FA-OEG或者其与PEG的联合才具备这种特殊的性质。在试验结果的接触上，理论推断，还存在其他的组合或者可能性，但是并不是本发明要求保护的重点。
经过试验可以发现，mn的数值范围并不是严重的影响因素。在试验中，当mn取值范围接近的时候，例如在前面具体实施例的基础上，将mn的取值范围修改为15-30中不同数值的组合，试验中并未有明显差别。另外，现有的合成方法或者市售产品中，FA-OEG是一个混合物的形式存在，但是这并不影响试验的效果。
本专利的实施例是对于本发明的进一步解释，并不影响专利的保护范围。

Claims (8)

1.一种油封式基因测序芯片疏水性表面抗蛋白吸附的方法，其特征在于，包括基因测序芯片，所述基因测序芯片的至少一个内表面上有预先加工好的微坑；所述基因测序芯片的至少部分内表面疏水修饰；测序过程中，基因测序芯片的内表面暴露在含有蛋白质的溶液中；通过在测序试剂或者清洗液中添加氟代烷基表面活性剂来减少蛋白分子在疏水性表面的吸附；所述氟代烷基表面活性剂结构特征在于疏水端含有氟代烷基链，亲水端含有聚乙二醇基团。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述氟代烷基表面活性剂结构为CF3(CF2)m(CH2CH2O)nH及其异构体、衍生物，m和n为3至100之间的任一整数值。
3.根据权利要求1所述的方法，所述氟代烷基表面活性剂的浓度为1ppm至500ppm。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，添加PEG和/或其衍生物作为表面活性剂助剂，分子量为200-80000，以质量体积比0.1％至5％的浓度添加到测序试剂或者清洗液溶液中。
5.一种油封式基因测序芯片检测系统疏水性表面抗蛋白吸附的方法，所述油封式基因测序芯片检测系统包括：1)微坑阵列，2)油相液体，3)水相反应液，4)水相清洗液；其中所述基因测序芯片包括高通量微坑阵列形成的微反应腔室以及覆盖在微反应腔室上面的流体腔室；所述微反应腔室至少部分表面疏水；所述油封的特征在于借助于微反应腔室外部的疏水表面，油相液体将水相反应液密封在微反应腔室内；所述的水相反应液含有一定量的蛋白分子；通过在水相反应液和/或水相清洗液中添加氟代烷基表面活性剂的方法，减少蛋白吸附，维持微坑阵列芯片表面的疏水性，从而减少表面残水；所述氟代烷基表面活性剂疏水端含有的氟代烷烃链，亲水端含有寡聚乙二醇。
6.一种油封式的生物化学检测系统，其特征在于，包括生物芯片，所述生物芯片包括流体入口和流体出口，包括流体室；所述生物芯片的至少一个内表面有预先加工好的微坑；所述生物芯片的的至少部分内表面疏水修饰；所述生物化学检测系统包括密封油；所述生物化学检测系统包括生物化学反应液和/或清洗液；所述生物化学反应液和/或清洗液中包含氟代烷基表面活性剂；所述结构特征在于疏水端含有氟代烷基链，亲水端含有聚乙二醇基团。
7.根据权利要求6所述的系统，其特征在于，所述氟代烷基表面活性剂结构为CF3(CF2)m(CH2CH2O)nH及其异构体、衍生物，m和n为3至100之间的任一整数值。
8.根据权利要求6所述的系统，其特征在于，所述氟代烷基表面活性剂的浓度为1ppm至500ppm；优选10ppm至450ppm。
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