CN112159830B - 4,6-α-葡萄糖基转移酶在降低淀粉黏度方面的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了4,6‑α‑葡萄糖基转移酶在降低淀粉黏度方面的应用，属于淀粉改性技术领域。本发明的方法利用来源于罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)121 4,6‑α‑葡萄糖基转移酶GtfB对淀粉进行改性，得到一种具有大分子低黏度特性的淀粉衍生物，对于扩展淀粉在食品中的应用具有重要意义。

Description

4,6-α-葡萄糖基转移酶在降低淀粉黏度方面的应用
技术领域
本发明涉及4,6-α-葡萄糖基转移酶在降低淀粉黏度方面的应用，属于淀粉改性技术领域。
背景技术
淀粉是一种廉价、可降解的碳水化合物，其经过糊化以后的黏度性质对于应用十分重要。为了拓展淀粉的应用范围，已经开发了各种方法来改变淀粉的黏度性质。化学法是这些方法中最为成熟的方法，但是化学改性淀粉应用于食品中存在一些安全隐患，人们更倾向于选择酶法改性的方式，符合当下清洁标签的理念。常用于改性淀粉的酶类有α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、普鲁兰酶、异淀粉酶、环糊精葡萄糖基转移酶、环糊精酶等，这些酶都是通过将淀粉水解成较小的分子，从而达到黏度下降的目的。虽然也存在4-α-葡萄糖基转移酶改性淀粉的例子，但改性后产物的流动性不是很好，实际应用中多用于形成凝胶。而至今仍然缺乏一种酶类改性淀粉，既能够保持大分子的数量级，又能够使黏度显著下降。将其应用于食品中，无论作为配料还是食品添加剂，都有利于生产内容物含量很多，但需要少量添加，符合食品标准，并能保持黏度很低的产品。因此，寻找一种酶类改性淀粉，既能保持大分子的数量级，又能够使其黏度显著下降，对于拓展淀粉的应用，提升淀粉的性能，满足人类的需要具有重要的意义。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种制备大分子低黏度淀粉衍生物的方法。该方法利用来源于罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)121 4,6-α-葡萄糖基转移酶GtfB对淀粉进行改性，得到一种大分子低黏度淀粉衍生物。
本发明的第一个目的是提供一种4,6-α-葡萄糖基转移酶在降低淀粉或含淀粉体系黏度中的应用，所述4,6-α-葡萄糖基转移酶是来源于罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)121的GtfB，利用其改性淀粉或含淀粉的体系，能够在保持大分子数量级的同时使黏度明显降低。
在本发明的一种实施方式中，所述4,6-α-葡萄糖基转移酶的NCBI登录号为Q5SBM0，公开于Bai等人(AEM(2015)81:7223-7232)。
在本发明的一种实施方式中，所述淀粉包括红薯淀粉、木薯淀粉、马铃薯淀粉、小麦淀粉、豌豆淀粉、玉米淀粉、蜡质玉米淀粉、大米淀粉和蜡质大米淀粉中的一种或多种。
本发明的第二个目的是提供一种制备适合婴幼儿或老年人群食用的米糊的方法，所述方法是采用4,6-α-葡萄糖基转移酶处理大米和/或杂粮，以降低米糊黏度，更适合婴幼儿或老年人群吞咽。
在本发明的一种实施方式中，所述方法中原料包括籼米、粳米、糯米、马铃薯、玉米、小麦中的一种或多种。
在本发明的一种实施方式中，所述原料，按照质量百分数计，包括籼米15％-55％、糯米5％-60％、玉米2％-40％和马铃薯10％-50％。
本发明的第三个目的是提供一种应用上述方法制备得到的适合婴幼儿或老年人群食用的米糊。
本发明的第四个目的是提供一种制备大分子低黏度改性淀粉的方法，所述方法是以淀粉或含淀粉体系为底物，配制成淀粉乳，然后向淀粉乳中添加GtfB进行反应，反应体系在pH3.5-7.0中进行；所述反应温度为30-55℃，反应结束后得到大分子低黏度改性淀粉。
在本发明的一种实施方式中，所述反应体系优选在pH5.0-7.0中进行。
在本发明的一种实施方式中，所述反应温度优选为35-50℃。
在本发明的一种实施方式中，所述反应时间为12-72h。
在本发明的一种实施方式中，所述淀粉乳的质量浓度为10-500mg/g。
在本发明的一种实施方式中，所述GtfB酶添加量为0.006-5.035U/g淀粉乳。
在本发明的一种实施方式中，所述淀粉乳的处理还包括将其在80-100℃加热，搅拌15-60min得到最终用于GtfB反应的淀粉底物。
在本发明的一种实施方式中，所述干燥方法包括常压干燥、冷冻干燥、微波干燥、喷雾干燥、滚筒干燥。
在本发明的一种实施方式中，所述方法还包括将反应得到的改性产物灭酶停止反应，离心、醇沉获得最终GtfB改性后的产物。
本发明的第五个目的是提供一种上述方法制得的大分子低黏度改性淀粉，所述改性淀粉黏度在1～500cP。
本发明的第六个目的是提供一种大分子低黏度改性淀粉在食品中的应用。
本发明的有益效果：
本发明的方法以淀粉或含淀粉体系为底物，添加罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)121 4,6-α-葡萄糖基转移酶GtfB进行改性，改性后的产物不仅仍能以大分子的形式存在，并且制备得到的淀粉衍生物黏度降低效果十分明显，能从8000cP降至15cP，黏度降低率达99％，较现有的α-淀粉酶和普鲁兰酶，具有更好的降黏作用，对于拓展淀粉的应用，提升淀粉的性能具有重要意义。
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解实施例是为了更好地解释本发明，不用于限制本发明。
样品的相对分子质量测定方法：
将50mg样品分散于10mL 90％二甲基亚砜中，煮沸1h并每隔10min涡旋震荡一次，直至溶液澄清透明。随后置于37℃气浴中以160rpm的转速分散至少24h。以0.1M的NaNO3溶液为流动相，在上样前以8倍体积无水乙醇醇沉2h，收集沉淀复溶于流动相中煮沸至澄清透明后过0.45μm有机膜，上样至高效凝胶渗透色谱仪-多角度激光光散射-折光检测器(HPSEC-MALLS-RI)系统中测定分子量，利用Astra 5.3.4对数据进行结果分析。
样品的糊化性质测定方法：
将3g样品加入25g去离子水中制成悬浮液，置于快速粘度分析仪(RVA)专用的测试铝盒中，并用配套的塑料搅拌桨不停搅拌防止淀粉颗粒沉降。随后置于仪器上按照设定的程序测定各样品的黏度。具体程序如下：样品在50℃保温1min，然后以12.2℃/min的升温速率升温至95℃，并在95℃保持2.5min；随后样品以11.8℃/min的速度降温至50℃并保温2min。在开始的10s时间内搅拌桨的转速为960r/min，使样品均匀分散，之后转速固定在160r/min。
实施例1：4,6-α-葡萄糖基转移酶的表达、纯化及酶活测定
参考现有技术(BAI Y,VAN DER KAAIJ R M,LEEMHUIS H,et al.BiochemicalCharacterization of the Lactobacillus reuteri Glycoside Hydrolase Family 70GTFB Type of 4,6-α-Glucanotransferase Enzymes That Synthesize Soluble DietaryStarch Fibers[J].Applied and Environmental Microbiology,2015,81(20):7223-7232.)中酶的表达及纯化方法，并进行适当调整。人工合成核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)的基因片段，以pET-15b构建重组质粒，利用E.coli BL21(DE3)表达菌株进行表达。将其置于含有100μg/mL氨苄青霉素(Amp)的LB液体培养基中，于37℃、200r/min的条件下培养，直至OD600值为0.4-0.6。之后取出冰浴15min，加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为1mmol/L，于18℃、160r/min的条件下培养24h诱导产酶。在4℃、10000r/min的条件下离心10min，收集菌体。按照1g菌体溶于5-6mL 20mmol/L Tris-HCl(250mmol/L NaCl，pH 7.5)将菌体重悬，于冰浴中超声破壁20min。破壁后的菌液在4℃、10000r/min的条件下离心30min，收集上清液即为粗酶液。利用镍亲和层析对粗酶液进行纯化，依次用20mmol/L Tris-HCl(250mmol/L NaCl，pH 7.5)和含有不同浓度咪唑的20mmol/LTris-HCl(250mmol/L NaCl，pH 7.5)进行洗脱，收集每部分的流穿液，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳条带验证。将得到的纯酶进行酶活测定，酶活为4.20U/mg。
下边是全氨基酸序列SEQ ID NO.1，本实施例采用的是截断的酶(氨基酸序列是下述加黑部分，第734-1619个氨基酸)
Figure BDA0002711451060000041
Figure BDA0002711451060000051
基因序列SEQ ID NO.2如下：
Figure BDA0002711451060000052
Figure BDA0002711451060000061
实施例2：
将红薯淀粉分散于pH 5.0的缓冲体系中配制成5％的淀粉乳，沸水浴糊化30min，稍作冷却后于40℃保温15min，添加1.32U/g实施例1制备得到的GtfB反应24h，沸水浴灭酶。反应样品冷却至室温后加入两倍体积无水乙醇醇沉12h，于4℃、8000r/min的条件下离心20min，收集沉淀常压烘干得到改性产物。将改性产物按照相对分子质量、糊化性质的测定方法，测定其相对分子质量和黏度，如表1所示。
实施例3：
将木薯淀粉分散于pH 5.0的缓冲体系中配制成5％的淀粉乳，沸水浴糊化60min，稍作冷却后于37℃保温15min，添加1.32U/g实施例1制备得到的GtfB反应24h，沸水浴灭酶。反应样品冷却至室温后加入两倍体积无水乙醇醇沉12h，于4℃、8000r/min的条件下离心20min，收集沉淀常压烘干得到改性产物。将改性产物按照相对分子质量、糊化性质的测定方法，测定其相对分子质量和黏度，如表1所示。
实施例4：
将马铃薯淀粉分散于pH 5.0的缓冲体系中配制成5％的淀粉乳，沸水浴糊化60min，稍作冷却后于37℃保温15min，添加1.32U/g实施例1制备得到的GtfB反应72h，沸水浴灭酶。反应样品冷却至室温后加入两倍体积无水乙醇醇沉12h，于4℃、8000r/min的条件下离心20min，收集沉淀常压烘干得到改性产物。将改性产物按照相对分子质量、糊化性质的测定方法，测定其相对分子质量和黏度，如表1所示。
实施例5：
将玉米淀粉分散于pH 5.0的缓冲体系中配制成5％的淀粉乳，沸水浴糊化60min，稍作冷却后于37℃保温15min，添加1.32U/g实施例1制备得到的GtfB反应72h，沸水浴灭酶。反应样品冷却至室温后加入两倍体积无水乙醇醇沉12h，于4℃、8000r/min的条件下离心20min，收集沉淀常压烘干得到改性产物。将改性产物按照相对分子质量、糊化性质的测定方法，测定其相对分子质量和黏度，如表1所示。
实施例6：
将蜡质玉米淀粉分散于pH 5.0的缓冲体系中配制成5％的淀粉乳，沸水浴糊化60min，稍作冷却后于37℃保温15min，添加1.32U/g实施例1制备得到的GtfB反应72h，沸水浴灭酶。反应样品冷却至室温后加入两倍体积无水乙醇醇沉12h，于4℃、8000r/min的条件下离心20min，收集沉淀常压烘干得到改性产物。将改性产物按照相对分子质量、糊化性质的测定方法，测定其相对分子质量和黏度，如表1所示。
实施例7：
将豌豆淀粉分散于pH 5.0的缓冲体系中配制成5％的淀粉乳，沸水浴糊化60min，稍作冷却后于37℃保温15min，添加1.32U/g实施例1制备得到的GtfB反应72h，沸水浴灭酶。反应样品冷却至室温后加入两倍体积无水乙醇醇沉12h，于4℃、8000r/min的条件下离心20min，收集沉淀常压烘干得到改性产物。将改性产物按照相对分子质量、糊化性质的测定方法，测定其相对分子质量和黏度，如表1所示。
表1不同处理样品的相对分子质量和黏度
Figure BDA0002711451060000071
Figure BDA0002711451060000081
实施例8：一种制备适合婴幼儿或老年人群食用的米糊的方法
一种制备适合婴幼儿或老年人群食用的米糊的方法，所述方法包括以下步骤：该米糊由下列重量份的原料组成：籼米15％-55％、糯米5％-60％、玉米2％-40％、马铃薯10％-50％和维生素类等。将籼米20g，糯米50g，玉米20g，马铃薯10g混合均匀后用粉碎机进行粉碎，用水进行混合调浆，调浆浓度为30％，在121℃糊化30min，降至40℃后添加1.32U/g底物实施例1制备得到的GtfB反应72h，高温灭酶后干燥。通过磨粉机将其磨碎成粉末，加入维生素类等保健物质，混合均匀。取混合后的粉末20g，加入150mL温水冲调，可形成黏度为325cP的米糊，制得的米糊黏稠适宜，适合婴幼儿或老年人群吞咽。
对比例1：
参照实施例2的方法处理红薯淀粉，区别在于，采用普鲁兰酶处理红薯淀粉，其中，酶解条件为淀粉酶的最适酶解条件。将红薯淀粉分散于pH 4.6的缓冲体系中配制成5％的淀粉乳，沸水浴糊化30min，稍作冷却后于55℃保温15min，添加1.32U/g普鲁兰酶反应24h，沸水浴灭酶。反应样品冷却至室温后加入两倍体积无水乙醇醇沉12h，于4℃、8000r/min的条件下离心20min，收集沉淀常压烘干得到改性产物。将改性产物按照糊化性质的测定方法测定其黏度。
表2不同处理样品的黏度
Figure BDA0002711451060000082
注：表中的“-”表示未检测到。
本发明的方法以淀粉或含淀粉体系为底物，添加罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)121 4,6-α-葡萄糖基转移酶GtfB进行改性，改性后的产物不仅仍能以大分子的形式存在，并且制备得到的淀粉衍生物黏度降低效果十分明显，能从8000cP降至15cP，黏度降低率达99％，较现有的普鲁兰酶，具有更好的降黏作用，对于拓展淀粉的应用，提升淀粉的性能具有重要意义。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (3)

1.一种制备大分子低黏度改性淀粉的方法，其特征在于，将蜡质玉米淀粉分散于pH5.0的缓冲体系中配制成5％的淀粉乳，沸水浴糊化60min，稍作冷却后于37℃保温15min，添加1.32U/g 4,6-α-葡萄糖基转移酶反应72h，沸水浴灭酶，待冷却至室温后加入两倍体积无水乙醇醇沉12h，于4℃、8000r/min的条件下离心20min，收集沉淀常压烘干得到大分子低黏度改性淀粉；
所述4,6-α-葡萄糖基转移酶是来源于罗伊氏乳杆菌121的GtfB，NCBI登录号为Q5SBM0。
2.应用权利要求1所述的方法制备得到的大分子低黏度改性淀粉。
3.权利要求2所述的大分子低黏度改性淀粉在食品中的应用。
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