CN112156121A - 玛咖提取物及玛咖多糖在制备治疗生精功能障碍疾病产品中的应用 - Google Patents

玛咖提取物及玛咖多糖在制备治疗生精功能障碍疾病产品中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开玛咖及玛咖多糖用于治疗睾丸生精障碍中的应用。具体涉及玛咖及玛咖多糖在治疗生精障碍包括少精症、弱精症和无精症，特别是由药物导致的无精症方面的用途。本发明使用白消安诱导小鼠的无精症模型验证了玛咖及玛咖多糖对白消安诱导的无精症小鼠的改善作用。

Description

玛咖提取物及玛咖多糖在制备治疗生精功能障碍疾病产品中 的应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及一种玛咖提取物及玛咖多糖在治疗生精功能障碍疾病方面的用途。
背景技术
根据卫世界卫生组织的报道，全球范围内有15％的育龄夫妇受不孕不育问题困扰，生育障碍人口显著增加，成为仅次于肿瘤和心脑血管病的第三大疾病。其中50％为男性因素，在医学中被称之为男性不育，成逐年增长的趋势。
男性生殖障碍成因复杂，按照现代医学描述，以受精不同过程划分，分为精子发生、精子输送、精子与卵子结合以及性功能障碍四类。
现有研究认为导致生精障碍的主要为激素分泌紊乱和睾丸固有损伤；激素分泌紊乱主要是由下丘脑垂体功能障碍引起的促性腺功能低下导致，可以通过激素替代疗法，如使用促性腺激素与人绒毛膜促性腺激素，或脉冲注射促性腺激素释放激素。
睾丸固有损伤有一部分是由于药物引起的。由药物导致的生精功能障碍(Spermatogenic dysfunction)，在医学上被称之为药源性不孕不育症，是指在原本生精功能正常的基础上，由药物导致睾丸生精系统损伤，包括化疗药物、利尿药、中枢性或者激素类降压药等。随着白血病、癌症和高血压等疾病发病日趋低龄化，如最新的统计学数据表明，我国每年新增白血病患者中，儿童占比已达50％。患者在经相应药物化疗或治疗后，生命系统极易受损，丧失生育能力。
而对于药源性引起睾丸损伤导致的生精功能障碍患者则没有很好的药物用于改善睾丸的损伤。精液冻存是男性患者的一条出路，但是这种方法对于患有恶性疾病(如白血病)的男性儿童并不适用。辅助生育技术的出现让患者得到生育机会，但不是所有患者体内都能找到合适的精子，并且取精手术是有创手术，对患者造成一定的机械损伤，而绕过精子形成过程的自然选择机制，使得遗传缺陷传递给下一代的风险增加。虽然有学者提出体外器官培养理论，但目前技术尚未成熟，且体外培养器官条件苛刻，成本高，临床应用潜力还有待研究。因此，寻找一种安全高效、能够治疗药源性生精功能损伤的新药迫在眉睫。
玛咖(Lepidium meyenii Walp.)为十字花科独行菜属草本植物，根茎中营养物质丰富，因其具有提高生育能力和改善性功能的特点广受关注，各类衍生产品种类繁多。大量文献表明，玛咖具有提高精子产生数目与活力，提高小鼠生仔数，促进性冲动与提高性能力的作用，其在增强雄性生殖功能方面已得到了广泛的认可，具有良好的抗氧化活性，因此从玛咖提取物中筛选治疗由药物引起的生精障碍的活性组分成为可靠途径。
发明内容
本发明的目的在于提供玛咖及玛咖多糖在改善生精功能障碍方面的用途。
技术方案
玛咖在制备用于治疗由药物导致的睾丸生精功能障碍的产品中的应用。
玛咖多糖在制备用于治疗由药物导致的睾丸生精功能障碍的产品中的应用。
所述的应用，其特征在于：所述生精功能障碍包括：少精症、弱精症、无精症。
所述的应用，其特征在于：所述由药物包括：白消安，奥硝唑，雷公藤多苷，腺嘌呤或乙酸棉酚。
所述的应用，其特征在于，所述玛咖由玛咖根茎经由粉碎、过筛、乙醇提取、浓缩后制得。
所述的应用，其特征在于：所述的玛咖多糖由如下步骤获得：
玛咖根茎，粉碎，以60％～80％工业乙醇加热回流提取三次，合并提取液，浓缩，缓慢加入50％～70％乙醇进行梯度沉降，最终乙醇浓度为70％～80％，室温放置20～24h，抽滤，滤液旋蒸至500mL，继续醇沉，调节乙醇浓度至70～80％，室温放置20～24h，抽滤；合并两次沉淀物，水溶解后去除无醇，获得玛咖粗多糖。
有益效果
本发明首次发现玛咖提取液和玛咖多糖对药物导致生精障碍具有治疗效果。
附图说明
图1：不同剂量玛咖提取物促进生精损伤小鼠的睾酮分泌(mean±SD)，#p<0.05,##p<0.01vs.空白组(Control)；*p<0.05,**p<0.01vs.模型组(Bu，Busulfan)；&p<0.05,&&p<0.01vs.褪黑激素组(MT，Melatonin)；@p<0.05,@p<0.01vs.玛咖M-5剂量组(M-5)。
图2：不同剂量玛咖提取物减少生精损伤小鼠附睾精子丢失(mean±SD)，#p<0.05,##p<0.01vs.空白组(Control)；*p<0.05,**p<0.01vs.模型组(Bu，Busulfan)；&p<0.05,&&p<0.01vs.褪黑激素组(MT，Melatonin)；@p<0.05,@p<0.01vs.玛咖M-5剂量组(M-5)。
图3：不同剂量玛咖提取物改善小鼠附睾精子活力(mean±SD)，#p<0.05,##p<0.01vs.空白组(Control)；*p<0.05,**p<0.01vs.模型组(Bu，Busulfan)；&p<0.05,&&p<0.01vs.褪黑激素组(MT，Melatonin)；@p<0.05,@p<0.01vs.玛咖M-5剂量组(M-5)。
图4：不同剂量玛咖提取物改善小鼠睾丸结构和精子形成(mean±SD).#p<0.05,##p<0.01vs.空白组(Control)；*p<0.05,**p<0.01vs.模型组(Bu，Busulfan)；&p<0.05,&&p<0.01vs.褪黑激素组(MT，Melatonin)；@p<0.05,@p<0.01vs.玛咖M-5剂量组(M-5)。A:组织病理学切片；B:生精小管纤维性颤动；C:曲精小管直径；D:精子细胞减少分数；E:ISE、PISE、ICSE评分，其中ISE代表完整生精上皮，PISE代表部分完整生精上皮，ICSE代表不完整生精上皮曲细精管比例；F:组织学评分。
图5：玛咖多糖促进生精损伤小鼠的睾酮分泌(mean±SD)，##p<0.01vs.空白组(Control)；**p<0.01vs.模型组(Bu，Busulfan)。
图6：玛咖多糖减少生精损伤小鼠附睾精子丢失(mean±SD)，###p<0.001vs.空白组(Control)；***p<0.001vs.模型组(Bu，Busulfan)。
图7：玛咖多糖改善小鼠附睾精子活力(mean±SD)，###p<0.01vs.空白组(Control)；*p<0.05vs.模型组(Bu，Busulfan)。
图8：玛咖多糖改善小鼠睾丸结构和精子形成(mean±SD)，###p<0.001,##p<0.01vs.空白组(Control)；*p<0.05,**p<0.01vs.模型组(Bu，Busulfan)。A:组织病理学切片；B:病理学评分；C:生精小管纤维性颤动；D:精子细胞减少分数；E:ISE、PISE、ICSE评分，其中ISE代表完整生精上皮，PISE代表部分完整生精上皮，ICSE代表不完整生精上皮曲细精管比例；F:曲精小管直径。其中玛咖组为M-5、M-10、M-15、M-20，玛咖多糖组为Maca-PS(MacaPolysaccharide)，阳性药组为MT(Melatonin)，模型组为Bu(Busulfan)。
具体实施方式：
下面通过实施例具体说明本发明的内容。在本发明中，以下所述的实施例是为了更好地阐述本发明，而非限制本发明的范围。
实施例1：玛咖提取物的制备
选取大小均匀的云南丽江玛咖根茎，粉碎后过60目筛。称取1kg玛咖粉末，以十倍体积70％工业乙醇热回流提取三次，合并提取液，旋蒸浓缩至浸膏，浸膏以双蒸水分散，溶解为混悬液。
实施例2：玛咖多糖的制备
选取大小均匀的云南丽江玛咖根茎，粉碎后过60目筛。称取1kg玛咖粉末，以60％～80％工业乙醇加热回流提取三次，合并提取液，旋蒸浓缩至1L，缓慢加入50％～70％乙醇进行梯度沉降，最终乙醇浓度为70％～80％，室温放置20～24h，抽滤，滤液旋蒸至500mL，继续醇沉，调节乙醇浓度至70～80％，室温放置20～24h，抽滤。合并两次沉淀物，双蒸水溶解后旋蒸至无醇味，再次溶解至1～2L，为玛咖粗多糖溶液。
实施例3：采用小鼠模型检测玛咖及玛咖多糖在改善生精障碍中的作用。
白消安造模原理：
(1)动物
ICR普通小鼠、雄性，体重20-25g，7-8周龄，SPF级
(2)小鼠饲养条件
所有小鼠均自由觅食和饮水，在室温(25±2)℃，相对湿度40％-70％下饲养。12h光照黑暗交替，小鼠适应性喂养一周后开始实验。
(3)小鼠分组与模型设置
ICR小鼠适应性喂养一周后，按照体重随机分为四组组空白组(control)、白消安模型组(Busulfan，Bu)、褪黑素阳性对照组(MT，Melatonin)，前期研究表明褪黑激素、左旋肉碱及其衍生物对白消安造成的生精功能障碍有一定的保护作用，但左旋肉碱副作用较多，容易出现肠胃不适、恶心、呕吐、腹泻甚至抽搐等不良反应，因此选择褪黑激素为本实验的阳性药。
玛咖提取物给药组(Maca)、玛咖多糖给药组(Maca-PS)。模型组和给药组小鼠均单次腹腔注射15～25mg/kg白消安溶液，空白组小鼠腹腔注射等比例DMSO。
(4)药物剂量设置
对给药组小鼠进行灌胃，玛咖提取物设置四个剂量组：5g生药/kg(M-5)、10g生药/kg(M-10)、15g生药/kg(M-15)和20g生药/kg(M-20)，每天一次。玛咖多糖溶液，设置一个剂量组：15～25g生药/Kg，每天一次。阳性药褪黑激素组设置一个剂量组：10mg/kg。
模型组和空白组：蒸馏水
(5)给药方法
给药途径：灌胃
给药体积：玛咖提取物(0.1mL/10g)、玛咖多糖(90～110微升/10g)
给药次数：连续四周给药，玛咖提取物，玛咖多糖溶液，每天一次
每组动物数：8只
(6)试验主要步骤
6-1.酶联免疫吸附试验。小鼠摘眼球采血，室温静置30min后，离心，1500rpm离心10min，取上清，用小鼠ELISA试剂盒测定各组血清样品中睾酮(Testosterone，T)含量。
6-2.精子悬浮液制备与精子计数。破碎左侧附睾，置1mlPBS中，37℃孵育1h，轻轻吹匀，根据不同组别精子密度酌情稀释，吹匀，取混悬液冲入血细胞计数池，计数精子数，根据稀释倍数计算出精子数，并根据每只附睾的重量计算每克附睾精子数。
6-3.精子活动度分析。取右侧附睾，置于载玻片上，滴两滴37℃PBS溶液，用眼科剪剪碎附睾尾，轻轻挤压，将附睾内容物与培养液混匀，盖上盖玻片。单个样品分别于高倍镜下随机记录200个精子泳动状态。由于受药物影响，精子密度较低，计算活动精子总和占比。
6-4.睾丸病理组织形态学变化观察。睾丸用4％甲醛固定后取材，进行常规脱水，石腊包埋。切片经HE染色，光学显微镜观察睾丸及附睾的病变，进行病理学评分，并用Image-Pro Plus 6.0计算病变后生精小管直径，评判其萎缩程度。参照Miosan法利用光学显微镜记录睾丸中“完整”生精上皮(Intact spermatogenic epithelium，ISE)、“部分完整”生精上皮(Partiallyintact spermatogenic epithelium，PISE)和“不完整”生精上皮(Incomplete spermatogenic epithelium，ICSE)曲细精管比例。
(7)结果
a)玛咖提取物改善生殖损伤
小鼠经腹腔注射白消安后，睾丸持续损伤，在经过一个完整的生精周期后，睾丸生精功能受到严重损伤。如图1显示，模型组小鼠血清睾酮含量呈极显著性降低，玛咖对白消安造成的生精损伤具有良好的治疗效果，相比模型组，经过玛咖提取物治疗的小鼠血清睾酮含量显著上升，表明小鼠睾酮功能有明显恢复。图2，3显示小鼠精子数量大幅度降低趋近于零，精子活力呈极显著下降，给药玛咖后，小鼠附睾精子丢失得到了显著抑制，且精子活力得到了较好的保护。从图4看出睾丸内生精小管大部分均严重空泡化，各级生精细胞丢失，仅有部分精原细胞在基底膜上稀疏排列，而玛咖能抑制生精小管中支持细胞萎缩、抑制生精小管空泡化，降低生精细胞丢失程度，促进生精上皮恢复，加快睾丸功能恢复。且玛咖各剂量组对于生殖功能的改善作用呈剂量依赖性。
b)玛咖多糖改善生殖损伤
小鼠生殖功能障碍模型同样采用腹腔注射白消安制得，生精功能受到极大损伤。图5显示玛咖多糖能使小鼠血清睾酮含量显著上升，睾酮功能明显恢复。图6,7可以看出，玛咖多糖能显著抑制小鼠附睾精子丢失，保护精子活力。图8表明在玛咖多糖的保护作用下，生精小管中支持细胞萎缩、生精小管空泡化得到抑制，生精细胞的丢失程度小于模型组，能够促进生精上皮恢复，加快睾丸功能恢复。
(8)结论
本研究利用白消安建立小鼠生殖障碍模型，验证玛咖提取物对生精功能的改善作用。结果表明，玛咖提取物可减轻生殖障碍小鼠的升级系统损伤。能有效抑制输精管的空泡化和间质细胞的增值，促进生精小管上皮的恢复，促进已损伤的睾丸组织恢复，有效改善生精微环境，保护精子的活力和数量。而且能够在激素水平上促进睾酮的生成，恢复睾酮水平，进一步促进精子生成。相较于阳性药组，玛咖提取物对生精功能障碍的改善效果显著优于褪黑激素。玛咖不仅能从激素层面促进精子的生成，而且能够改善受损的睾丸组织，这也是玛咖药效优于褪黑激素的可能因素。进一步对玛咖有效部位进行筛选，发现在同等生药量下，玛咖多糖作用类似于玛咖总提物，能够抑制生精小管中支持细胞萎缩，降低生精细胞丢失，促使睾丸恢复生精功能，维持精子活力，降低精子死亡率，是玛咖治疗生精功能障碍的主要药效部位之一。

Claims (6)

1.玛咖提取物在制备用于治疗由药物导致的睾丸生精功能障碍的产品中的应用。
2.玛咖多糖在制备用于治疗由药物导致的睾丸生精功能障碍的产品中的应用。
3.如权利1或2所述的应用，其特征在于：所述生精功能障碍包括：少精症、弱精症、无精症。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述由药物包括：白消安，奥硝唑，雷公藤多苷，腺嘌呤或乙酸棉酚。
5.根据权利1所述的应用，其特征在于，所述玛咖提取物由如下步骤制备获得：
选取云南丽江玛咖根茎，粉碎后过60目筛；称取粉末，以十倍体积70%工业乙醇热回流提取三次，合并提取液，旋蒸浓缩至浸膏，浸膏以双蒸水分散，溶解为混悬液。
6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的玛咖多糖由如下步骤获得：
玛咖根茎，粉碎，以 60%~80%工业乙醇加热回流提取三次，合并提取液，浓缩，缓慢加入50%~70%乙醇进行梯度沉降，最终乙醇浓度为 70%~80%，室温放置 20~24h，抽滤，滤液旋蒸至500mL，继续醇沉，调节乙醇浓度至70~80%，室温放置20~24h，抽滤；合并两次沉淀物，水溶解后去除无醇，获得玛咖粗多糖。
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