CN112143485B - 一种快速检测硫化氢的纳米荧光探针及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种快速检测硫化氢的纳米荧光探针及其制备方法，所述荧光探针为PAAO‑UCNPs‑EM1，制备方法如下：首先采用热分解法制备了UCNPs，再通过超声辅助在溶液中自组装制备了探针PAAO‑UCNPs‑EM1的储备液；由于荧光共振能量转移（FRET）效应，PAAO‑UCNPs‑EM1上转换荧光被淬灭，硫化氢（H2S）将EM1转换成EM2，抑制了FRET效应，引起PAAO‑UCNPs‑EM2的荧光恢复；探针溶液的上转换发光在540 nm、660 nm和800 nm的峰强度与H2S浓度之间存在线性关系，对H2S检测具有较低的检测限，可用于生物医学样品中H2S的高灵敏和选择性检测。

Description

一种快速检测硫化氢的纳米荧光探针及其制备方法
技术领域
本发明涉及到一种识别硫化氢的荧光探针及其制备方法，属于小分子荧光探针领域。
背景技术
硫化氢(H2S)是继一氧化氮和一氧化碳之后参与生命系统的第三重要气体信号分子。它在调节广泛的生理过程中发挥多功能作用，例如神经传递，血管舒张，肾脏排泄，炎症，氧化应激的细胞保护和局部缺血再灌注损伤。在哺乳动物细胞中，内源性H2S的产生通常依赖于胱硫醚γ-裂合酶(CSE)和胱硫醚β-合酶(CBS)催化合成。H2S也可以由D-半胱氨酸生产，并由D-氨基酸氧化酶(DAO)和3-巯基乙酸硫转移酶(3-MST)催化。人体组织中H2S的浓度可以在微摩尔范围内。用于维持生理细胞功能。据记录，内源性H2S的异常水平与多种人类疾病有关，包括结肠直肠癌，神经退行性疾病，阿尔茨海默氏病和高血压。在生理水平，H2S调节细胞内氧化还原状态和基本信号处理过程，包括监管血管紧张度，心肌收缩力，神经传递和胰岛素分泌。除H2S相关疾病的生物标志物外，据报道H2S还可以抑制次氯酸介导的氧化损伤，H2S相关探针可用于次氯酸相关研究，因此，H2S是与H2S相关疾病的理想生物标志物，对H2S进行检测对这些疾病的诊断具有重要意义。
传统的H2S检测方法包括比色法，电化学分析和气相色谱法。由于样品处理复杂，细胞或组织破坏，不适合实时和原位监测内源性H2S。然而，荧光探针的出现为H2S的实时原位监测提供了新的选择，其具有多种优点，例如高灵敏度和选择性，低侵入性和良好的相容性。
与传统的有机荧光探针相比，上转换颗粒(UCNPs)具有反斯托克斯位移，高信噪比，高光稳定性，无闪烁，穿透力更强，自发荧光背景为零，以及细胞毒性低等多种特征。由于这些优势，基于UCNPs的纳米探针在生物医学领域引起了广泛的关注，特别是活细胞和体内生物分析物的检测和成像。
此外，电致变色材料是指具有独特性质的膜或膜系统的材料，具有可逆的电势变化以及光学特性的变化。由于它们的良好的光电和电化学特性以及与电荷对应的颜色变化，它们已广泛用于液晶彩色显示器，智能窗，自动调光镜，电子开关，传感器，LED和腐蚀抑制剂等领域。但是，很少有文献记载电变色材料的例子被应用于生命系统的生物检测和成像。
截至目前，尚未检索到基于上转换和EM1/PAA的荧光纳米探针及其H2S检测的国内外文献和专利的报道。
发明内容
针对现有技术中有机小分子荧光探针在H2S分子的实时原位检测中面临的各种问题，本发明的第一个目的是提供一种一种具有响应时间快速和选择性好的H2S纳米荧光探针；本发明的第二个目的是提供上述纳米荧光探针的制备方法。
本发明采用以下技术方案合成：
一种快速检测硫化氢的纳米荧光探针，其特征在于，所述荧光探针为PAAO-UCNPs-EM1，其中与H2S反应的主要基团是探针上连接的电致变色材料EM1，其分子结构式如下所示：
Figure GDA0003462232660000021
研究发现，1,1,4,4-四芳基丁二烯(EM1)具有显著的电致变色行为，在H2S的存在下可以从紫色变成几乎无色的二烯(EM2)。它的特定吸收波长范围在500-850nm之间，我们将EM1作为H2S响应生色团组装到UCNPs中，以基于Foster共振能量转移(FRET)开发出可H2S激活的荧光纳米探针。
作为本申请的优选技术方案，所述UCNPs为NaYF4：Yb，Tm@NaYF4：Yb，Er。
在本发明中，我们首次设计了一种与电致变色生色团组装的新型上转换纳米探针，用于检测H2S；该纳米探针由三部分组成：NaYF4：Yb，Tm@NaYF4：Yb，Er(UCNPs)，1,1,4,4-四芳基丁二烯(EM1)和聚丙烯酸(PAA)。在980nm的激发下，纳米探针可以发射540nm的绿光，660nm的红光和800nm的近红外光。随后，由于吸收光谱重叠，可以用EM1淬灭540nm和660nm处的光。在H2S存在下，EM1可以转化为EM2，从而导致540nm，660nm和800nm处的光连续增强。最后，这种纳米探针可以通过上转换发光(540nm和660nm)成像，以高选择性和低细胞毒性灵敏地监测活细胞中的内源性和外源性H2S。
作为本申请的优选技术方案，所述PAAO、UCNPs、EM1均可以通过自行制备或者商业购买而来。
一种快速检测硫化氢的纳米荧光探针，其荧光探针的制备路径、检测方法如图1所示。
一种快速检测硫化氢的纳米荧光探针的制备方法如下：首先采用热分解法制备UCNPs，再通过超声辅助在溶液中自组装制备探针PAAO-UCNPs-EM1的储备液
具体的，通过以下步骤制备：按体积比1mL：500μL：300uL量取PAAO溶液、UCNPs溶液和EM1溶液；将UCNPs溶液加入到PAAO溶液中，并加入蒸馏水和EM1溶液，然后将混合物置于超声细胞破碎仪中处理，在黑暗中蒸发氯仿，将得到的最终溶液在离心机中离心，并且将收集的探针沉淀物溶解在去离子水中。
作为本申请的优选技术方案，所述UCNPs的质量浓度为50mg/mL；所述EM1的质量浓度为0.43mg/mL；所述PAAO由PAA制备而来，PAA的质量浓度为15mg/mL。
作为本申请的优选技术方案，所述UCNPs的制备方法如下：
(1)NaYF4：Yb，Tm的合成：采用高温热分解法合成，首先准备氯化铥、氯化钇、氯化铒和氯化镱；按摩尔比75％：25％：0.3％将含有Y，Yb和Tm的1mmol/L的RECl3添加到反应釜中，然后加入15mL 1-十八烯和6mL油酸到上述混合物；在室温下氮气排空20分钟后，将溶液加热到160℃30分钟；然后将混合物冷却至25℃；同时，将包括2.5mmol/L的NaOH和4mmol/LNH4F的甲醇5mL溶液添加到上述溶液中；在25℃搅拌30分钟后，将混合物加热以除去甲醇；快速将系统温度升至300℃并连续加热1小时后，停止加热，并将混合物的温度冷却至25℃，然后添加无水乙醇以沉淀混合物；然后将混合物用体积比v/v＝1/1的环己烷和无水乙醇洗涤；离心后，将其溶解在环己烷中以获得NaYF4：Yb，Tm的溶液UCNP；
(2)NaYF4：Yb，Tm@NaYF4：Yb，Er的合成：以步骤(1)的NaYF4：Yb，Tm为种子制备NaYF4：Yb，Tm@NaYF4：Yb，Er，实验步骤和方条件同步骤(1)，即的UCNPs。
优选的，所述氯化铥的制备方法如下：在反应容器中加入168mg氧化铥，3mL蒸馏水和3mL盐酸并加热直至粉末完全溶解；回流30分钟后，将混合物冷却至室温；然后将溶液转移至10mL容量瓶中，并用蒸馏水补足至10mL，即得氯化铥溶液。
优选的，所述氯化钇、氯化铒和氯化镱的制备同氯化铥，不同点在于，原料是对应的氧化物。
作为本申请的优选技术方案，所述PAAO的制备方法如下：分别称取0.48g NHS、0.8g EDCI添加到0.6g PAA的3mL DMF溶液中；搅拌6小时后，将含有233μL正辛胺的1mL DMF添加至上述混合溶液中；搅拌12小时后，将溶液透析纯化，得到PAAO溶液。
作为本申请的优选技术方案，所述EM1的制备方法如下：在氩气下，向含有101mgEM2的1.5mL无水二氯甲烷中的溶液中加入168mg(4-BrC6H4)3N·+BF4 -；然后将混合物在室温搅拌1.5小时；加入20mL无水乙醚，将沉淀物过滤，以浅紫色粉末形式得到化合物EM1。
一种快速检测硫化氢的纳米荧光探针的检测方法如下：向探针溶液中加入硫氢化钠水溶液，在37℃孵育10min后，测定不同H2S浓度下探针溶液的上转换发光光谱，拟合不同峰强度与H2S浓度之间的线性关系，构建定量检测H2S的荧光纳米探针；其中H2S的线性范围0-10μmol/L，检测限在0.01～0.13μmol/L。
其中，制备好的探针溶液200μg/mL(1mL)：NaHS溶液(100μmol/L,10μL)。
有效效果
本发明提供了一种基于UCNP、PAAO、EM1的机体内源性H2S检测的纳米荧光探针及其制备方法，与现有技术相比，具有如下有益效果：
(1)探针的合成比较简单，并且与H2S响应的机理是基于EM1与H2S之间的氧化还原反应；
(2)从响应前后的颜色变化和荧光强度变化就可以快速检测H2S，实现了裸眼检测的目的；
(3)该荧光探针的特点在于本身无荧光，但可与H2S快速反应之后，产生强荧光，从而实现对H2S选择性快速检测。
(4)该探针只与H2S特异性反应，产生强荧光，而不与其他可能的生物溶液反应，体现了该探针对H2S具有很好的选择性。
因此，本发明是一种简单快速，灵敏度高的H2S分子特异性检测探针，在生物分子检测领域和细胞内成像具有广阔的应用前景。
附图说明
图1探针PAAO-UCNPs-EM1的合成路径及与H2S的响应示意图；
图2探针PAAO-UCNPs-EM1与H2S响应前后的荧光发射图谱；
图3探针PAAO-UCNPs-EM1和不同浓度的H2S(0-10μmol/L)孵育后的荧光发射图谱；
图4探针PAAO-UCNPs-EM1和其他可能的生物溶液反应后的荧光发射图谱；
图5探针PAAO-UCNPs-EM1在不同细胞内的细胞内成像图。
具体实施方式
结合具体实施例，进一步阐明本发明。下列实施例中使用的仪器或试剂未做详细说明的均为常规仪器和试剂；未具体描述的试验操作方法均为本领域普通技术人员公知的常规操作方法。
主要试剂及仪器
本研究中使用的所有化学药品均购自合格的试剂供应商并直接使用。2-(2-甲基-4H-铬-4-亚甲基)丙二腈，4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)-苯甲醛，氧化铥，氧化钇，氧化镱，氧化铒，1-十八烯，正辛胺，油酸(>90％，OA)，NH4F，NaF，无水乙醇，NaOH，PAA(MW 3000，50％)，N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)获自百灵威科技有限公司。脂多糖(LPS)，青霉素，链霉素和磷酸盐缓冲液(PBS)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，哌啶，环己烷，二甲基亚砜(DMSO)，氯仿，甲醇，NaHS和乙酸均购自国药控股化学试剂公司。Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)从赛默飞世尔科技(中国)有限公司获得。人肝细胞癌(HepG2)细胞系，人肺癌(A549)细胞系，子宫颈癌(Hela)细胞系和人正常肝细胞(L02)细胞系购自凯基生物公司(中国南京)。
980nm激光源(2W光纤输出功率，陕西通光电子有限公司)用作外部激发光源，并连接到F97pro荧光分光光度计(上海棱镜)。质谱通过ABI Mariner ESI-TOF光谱仪(AppliedBiosystems，Thermo Fisher Scientific，美国)测量。用倒置荧光显微镜(Leica，DMi8，德国)记录活细胞的UCL成像。紫外可见光谱数据是在紫外可见分光光度计(Onedrop，南京，中国)上获得的。
实施例1
荧光探针的制备
1、制备步骤如下：
(1)合成金属氯化物：在25mL圆底烧瓶中加入氧化铥(Tm2O3，168mg)，蒸馏水(3mL)和盐酸(3mL)并加热直至粉末完全溶解。回流30分钟后，将混合物冷却至室温。然后将溶液转移至10mL容量瓶中，并用蒸馏水补足至10mL。氯化铥溶液用于下一步。
类似地，根据氯化铥的方案制备氯化钇，氯化铒和氯化镱的溶液。
(2)NaYF4：Yb，Tm@NaYF4：Yb，Er的合成：采用热分解法合成；将含有Y，Yb和Tm的RECl3(1mmol/L)(比率＝75％：25％：0.3％)添加到四颈烧瓶中，然后加入1-十八烯(15mL)和油酸(6mL)到上述混合物。在室温下氮气排空20分钟后，将溶液加热到160℃后保持30分钟。然后将混合物冷却至25℃。同时，将包括NaOH(2.5mmol/L)和NH4F(4mmol/L)的甲醇(5mL)溶液添加到上述溶液中。在25℃搅拌30分钟后，将混合物加热至75℃并保持30分钟，除去甲醇。快速将系统温度升至300℃并连续加热1小时后，停止加热，并将混合物的温度冷却至25℃，然后添加大量无水乙醇以沉淀混合物。然后将混合物用环己烷和无水乙醇(v/v＝1/1)洗涤3次。离心后，将其溶解在环己烷中以获得NaYF4：Yb，Tm的溶液。
同理，按照上述步骤(2)可以获得NaYF4：Yb，Tm@NaYF4：Yb，Er溶液(UCNPs)。
(3)EM1的合成：二烯EM2可以根据以前的合成方法获得。在氩气下，向EM2(101mg)在无水二氯甲烷(1.5mL)中的溶液中加入(4-BrC6H4)3N·+BF4 -(168mg)。然后将混合物在室温搅拌1.5小时。加入无水乙醚(20mL)，将沉淀物过滤，以浅紫色粉末形式得到化合物EM1(116mg)。
(4)PAAO的合成：将NHS(0.48g)和EDCI(0.8g)添加到0.6g PAA的DMF(3mL)溶液中。搅拌6小时后，将含有正辛胺(233μL)的DMF(1mL)添加至上述混合溶液中。搅拌12小时后，将溶液通过透析纯化3天。得到PAAO溶液。
(5)探针PAAO-UCNPs-EM1的合成：取步骤(2)获得的UCNPs溶液500μL加入到由步骤(4)获得的PAAO溶液种，并加入2mL蒸馏水和步骤(3)获得的EM1溶液(DMSO溶解)，然后将混合物置于超声细胞破碎仪中10分钟(强度为20％，超声3秒钟，间隔5秒钟)。在黑暗中将超声处理的产物搅拌2小时以蒸发氯仿。将得到的最终溶液在离心机中离心(13000rpm/min)。并且将收集的探针沉淀物溶解在去离子水中。
2、EM1、EM2、探针溶液以及不同浓度梯度NaHS溶液的制备
我们用DMSO制备EM1溶液；使用PBS溶液(pH 7.4，含50％DMSO)制备了不同浓度的探针溶液；使用蒸馏水配制了不同浓度的NaHS溶液；EM2溶液的获取由EM1与H2S反应后得到。
实施例2
探针PAAO-UCNPs-EM1与H2S响应后溶液的高分辨质谱
本实施例涉及的PAAO-UCNPs-EM1探针溶液和NaHS溶液的制备步骤同实施例1，其它具体步骤如下：向实施例1制得的探针溶液中加入NaHS溶液(100μmol/L,10μL)反应30秒,将反应后的溶液用蒸馏水稀释，用ABI Mariner ESI-TOF光谱仪测其质谱峰。
如附图2所示，反应后溶液中出现EM2的峰(684.41224)，这个结果说明，探针溶液与H2S响应的机理是探针上连接的EM1与其作用，并生成了EM2。
实施例3
本实施例涉及的PAAO-UCNPs-EM1探针溶液和NaHS溶液的制备步骤同实施例1，其它具体步骤如下：向实施例1制得的探针溶液中加入不同浓度的NaHS溶液(0-10μmol/L)反应30秒后，将反应后的溶液用外接在F97pro荧光分光光度计上的980nm激光器(100mw)照射，并获取其荧光发射光谱。
如附图3所示，我们可以看出，随着H2S浓度的增加，反应后的探针溶液在540nm和660nm处的荧光发射强度在增加，并且由计算得知，探针PAAO-UCNPs-EM1对H2S的检测限较低，检测范围可以达到0.01～0.13μmol/L，说明探针的检测效果好，灵敏度高。
实施例4
本实施例涉及的PAAO-UCNPs-EM1探针溶液和NaHS溶液的制备步骤同实施例1，其它具体步骤如下：用蒸馏水配制NaHS溶液(100μmol/L)，并且配制其他可能的生物溶液(Fe3+(100μM)，Na+(100μM)，Mg2+(100μM)，K+(100μM)，ClO-(1mM)，Gly(1mM)，Cys(1mM)，GSH(5mM)，Vc(1mM)，Hcy(1mM)，BSA(10μg/mL)，DTT(1mM)，SO2(100μM)，S2O3 2-(100μM))。向实施例1制得的探针溶液中分别加入上述配制好的溶液(10μL)反应30秒后，将反应后的溶液用外接在F97pro荧光分光光度计上的980nm激光器(100mw)照射，并获取其荧光发射光谱。
如附图4所示，我们可以看出，只有加入H2S后的溶液能与探针反应，反应后的探针溶液在540nm和660nm处的荧光发射强度增强，而其他可能的生物溶液均不与探针反应，在540nm和660nm处的荧光发射强度不变。这个结果表明我们的纳米探针PAAO-UCNPs-EM1对H2S具有选择特异性。
实施例5
本实施例涉及的PAAO-UCNPs-EM1探针溶液的制备步骤同实施例1，其它具体步骤如下：在DMEM培养基中培养HepG2细胞，并放在补充有10％胎牛血清(FBS)，青霉素(80units/mL)和链霉素(80mg/L)的CO2培养箱(37℃，5％CO2)中培养。并以相同的方式孵育L02细胞，Hela细胞和A549细胞。当四种细胞贴壁过夜孵育时，我们将探针PAAO-UCNPs-EM1(200μg/mL)与四种不同的细胞系(L02细胞，Hela细胞，HepG2细胞和A549细胞)孵育6小时，并在倒置荧光显微镜上观察绿色UCL和红色UCL的相对强度。
如附图5所示，与探针PAAO-UCNPs-EM1孵育的L02细胞仅在绿色UCL和红色UCL通道中显示非常弱的UCL发射，而其他三个细胞系在两个通道中均显示强UCL信号。该实验表明，探针PAAO-UCNPs-EM1成功实现了细胞内H2S的生物成像，且探针PAAO-UCNPs-EM1在肿瘤细胞中的H2S成像相较于正常细胞亮度更高，在生物学和医学领域有很好的应用前景。

Claims (10)

1.一种快速检测硫化氢的纳米荧光探针，其特征在于，所述荧光探针为PAAO-UCNPs-EM1；其中与硫化氢反应的主要基团是探针上连接的电致变色材料EM1，其分子结构式如下所示：
Figure FDA0003466813320000011
2.根据权利要求1所述的一种快速检测硫化氢的纳米荧光探针，其特征在于，所述UCNPs为NaYF4：Yb，Tm@NaYF4：Yb，Er。
3.权利要求1或2所述的一种快速检测硫化氢的纳米荧光探针的制备方法，首先采用热分解法制备UCNPs，再通过超声辅助在溶液中自组装制备探针PAAO-UCNPs-EM1的储备液。
4.根据权利要求3所述的一种快速检测硫化氢的纳米荧光探针的制备方法，其特征在于，通过以下步骤制备：按体积比1mL：500μL：300uL量取PAAO溶液、UCNPs溶液和EM1溶液；将UCNPs溶液加入到PAAO溶液中，并加入蒸馏水和EM1溶液，然后将混合物置于超声细胞破碎仪中辅助处理，接着在黑暗中蒸发氯仿，将得到的最终溶液在离心机中离心，并且将收集的探针沉淀物溶解在去离子水中。
5.根据权利要求4所述的一种快速检测硫化氢的纳米荧光探针的制备方法，其特征在于，所述PAAO和EM1均可以自行制备或通过商业购买得到。
6.根据权利要求3-5任一所述的一种快速检测硫化氢的纳米荧光探针的制备方法，其特征在于，所述UCNPs的制备方法如下：
(1)NaYF4：Yb，Tm的合成：采用热分解法合成，首先准备氯化铥、氯化钇和氯化镱；按摩尔比75％：25％：0.3％将含有Y，Yb和Tm的1mmol/L的RECl3添加到反应釜中，然后加入15mL 1-十八烯和6mL油酸到上述混合物；在室温下氮气排空20分钟后，将溶液加热到160℃30分钟；然后将混合物冷却至25℃；同时，将包括2.5mmol/L的NaOH和4mmol/L NH 4 F的甲醇5mL溶液添加到上述溶液中；在25℃搅拌30分钟后，将混合物加热以除去甲醇；快速将系统温度升至300℃并连续加热1小时后，停止加热，并将混合物的温度冷却至25℃，然后添加无水乙醇以沉淀混合物；然后将混合物用体积比v/v＝1/1的环己烷和无水乙醇洗涤；离心后，将其溶解在环己烷中以获得NaYF4：Yb，Tm的溶液UCNP；
(2)NaYF4：Yb，Tm@NaYF4：Yb，Er的合成：以步骤(1)的NaYF4：Yb，Tm为种子制备NaYF4：Yb，Tm@NaYF4：Yb，Er，实验步骤和条件同步骤(1)，即得UCNPs。
7.根据权利要求6所述的一种快速检测硫化氢的纳米荧光探针的制备方法，其特征在于，所述氯化铥的制备方法如下：在反应容器中加入168mg氧化铥，3mL蒸馏水和3mL盐酸并加热直至粉末完全溶解；回流30分钟后，将混合物冷却至室温；然后将溶液转移至10mL容量瓶中，并用蒸馏水补足至10mL，即得氯化铥溶液；所述氯化钇、氯化铒和氯化镱的制备同氯化铥。
8.根据权利要求4或5所述的一种快速检测硫化氢的纳米荧光探针的制备方法，其特征在于，所述PAAO的制备方法如下：分别称取0.48g NHS、0.8g EDCI添加到0.6g PAA的3mLDMF溶液中；搅拌6小时后，将含有233μL正辛胺的1mL DMF添加至上述混合溶液中；搅拌12小时后，将溶液透析纯化，得到PAAO溶液。
9.根据权利要求4或5所述的一种快速检测硫化氢的纳米荧光探针的制备方法，其特征在于，所述EM1的制备方法如下：在氩气下，向含有101mg EM2的1.5mL无水二氯甲烷中的溶液中加入168mg(4-BrC6H4)3N·+BF4 -；然后将混合物在室温搅拌1.5小时；加入20mL无水乙醚，将沉淀物过滤，以浅紫色粉末形式得到化合物EM1，其中EM2分子结构式如下：
Figure FDA0003466813320000021
10.权利要求1所述的一种快速检测硫化氢的纳米荧光探针的检测方法，其特征在于：向探针溶液中加入硫氢化钠水溶液，在37℃孵育10min后，测定不同H2S浓度下探针溶液的上转换发光光谱，拟合不同峰强度与H2S浓度之间的线性关系，构建定量检测H2S的荧光纳米探针；其中H2S的线性范围0-10μmol/L，检测限在0.01～0.13μmol/L。
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