CN112136050A - 用于监测或预测对牙周疾病治疗的响应的方法、用途和试剂盒 - Google Patents

用于监测或预测对牙周疾病治疗的响应的方法、用途和试剂盒 Download PDF

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Abstract

公开了一种用于评估或预测人类患者对牙周疾病治疗的响应的体外方法。该方法是基于确定生物标记物蛋白质的见解。因此，在患者的唾液样本中，测量特定蛋白质组合的浓度。一种此类组合是血红蛋白亚基δ(Hb‑δ)和丙酮酸激酶(PK)。另一种组合是α‑1‑酸糖蛋白(A1AGP)、丙酮酸激酶(PK)和基质金属蛋白酶‑8(MMP‑8)中的至少两种，以及角蛋白‑4(K‑4)。第三种组合是α‑1‑酸糖蛋白(A1AGP)、丙酮酸激酶(PK)和S100钙结合蛋白A8(S100A8)。基于所测量的浓度，确定反映该蛋白质的联合浓度的至少一个值。该至少一个值可以指示人类患者已经或将要成功治疗牙周炎的可能性。可以将该至少一个值与至少一个阈值进行比较，阈值以相同方式反映与牙周炎的成功治疗相关联的联合浓度。这种比较允许评估测试值是否是患者的牙周治疗状态的指示。

Description

用于监测或预测对牙周疾病治疗的响应的方法、用途和试 剂盒
技术领域
本发明属于口腔护理领域，并且涉及基于唾液的对牙周疾病治疗的响应的评价。特别地，本发明涉及一种用于评估或预测患有牙周疾病的患者的治疗的响应的试剂盒、用途和方法。
背景技术
牙龈炎症或牙龈炎是一种主要由牙齿细菌生物膜或牙菌斑粘附于牙齿表面而引起的非破坏性牙周疾病。如果没被检测到并且被治疗，可逆的牙龈炎通常会引发围绕牙齿的组织(即牙周组织)的炎症，这种病症定义为牙周炎，其是不可逆的并且导致组织破坏和牙槽骨缺失，最终导致牙齿的脱落。在牙龈疾病的发展过程中，通常存在与其相关的临床征兆和症状，诸如如牙龈肿胀、颜色从粉红色变为暗红色、牙龈出血、口臭以及牙龈变得更嫩或摸起来痛。
牙周炎是一种由口腔微生物引起的慢性多因素炎症性的疾病，并且其特征在于硬(骨)和软(牙周韧带)组织的渐进性破坏，最终导致牙齿移动和脱落。这与作为一种可逆牙龈组织感染和炎症的牙龈炎是有区别的。炎症性的牙周炎是最普遍的人类慢性疾病之一，并且是成人牙齿脱落的主要原因。牙周炎除了对口腔健康的实质性负面影响之外，越来越多的证据表明牙周炎还具有全身性后果，并且是导致一些全身性疾病的危险因素，包括心脏病(例如动脉粥样硬化、中风)、糖尿病、妊娠并发症、类风湿性关节炎和呼吸道感染。
因此，从口腔和整体健康两者的角度来看，牙周疾病的早期和准确诊断都是重要的。此外，期望能够准确地确定牙周疾病的治疗对患者是否有效或是否可能有效。特别地，期望能够在针对牙周疾病的治疗提供给患者之前或在治疗的早期阶段预测其是否可能有效。
在一般牙科实践中，牙周疾病的诊断仍然很差，导致治疗干预率相对较低以及显著量的未治疗病例。目前的诊断依赖于牙科专业人员对口腔组织状况(颜色、肿胀、探诊出血程度、探诊袋深度；以及从口腔X射线发现的骨缺失)的不准确的、主观的临床检查。这些传统方法非常耗时，并且所使用的一些技术(袋深、X射线)反映的是历史事件，诸如过去的疾病活动，而非当前疾病活动或对进一步的疾病的易感性。
类似地，对于接受治疗的牙周疾病患者，目前必须经由这些传统方法在治疗后在临床上评估对治疗的响应，导致高成本以及对患者状况的潜在不准确的监测。此外，预测治疗响应的可能性可以具有很大价值，因为可以相应地采取治疗策略。因此，期望衡量当前疾病活动、受试者对进一步牙周疾病的易感性，以及对该患者采取什么治疗可能是成功的。因此，更客观、更快速、更准确、更容易使用——理想地具有预测值——并且优选也可以由非专业人员执行的诊断是期望的。
唾液或口腔流体长期以来被提倡作为口腔和一般疾病的诊断流体，并且随着小型化生物传感器(也称芯片实验室)的出现，用于快速椅旁测试的即时(point of care)诊断已经获得了更大的科学和临床关注。特别地，对于牙周疾病检测，与组织炎症和分解相关的炎症性的生物标记物可能由于邻近而容易地在唾液中终止，这表明唾液具有用于牙周疾病检测的强大潜力。实际上，该领域因此获得了显著关注，并且已经呈现出了令人鼓舞的结果。例如，Ramsier等(J Periodontol.2009 Mar；80(3):436-46)识别出了与牙周疾病相关的宿主和细菌衍生生物标记物。然而，还没有出现明确的测试。
生物标记物代表支持临床表现的生物学指标，并且因而是诊断牙周疾病的临床结果的客观指标。最终，经证明的生物标记物可以被利用以评估针对未来疾病风险、在非常早的阶段识别疾病、识别对初始疗法的响应，以及允许预防性策略的实施。
先前限制针对唾液生物标记物的即时测试(point-of-care test)的发展的因素包括缺乏适于椅旁应用的技术，以及无法分析在个体样本中的多个生物标记物。而且，在此类测试中包括哪些多种生物标记物的选择没有在文献中充分地解决，也没有在实际测试中实施。
此外，牙周炎可以在从轻度到晚期疾病的整个严重程度范围内自己表现出来。为了容易地评估病情的严重性，牙科医生经常将患有牙周炎的患者分类为两组——患有轻度牙周炎患者和患有晚期牙周炎患者。然而，进行这种评估的可用方法涉及劳动密集型过程，使得牙科医生无法对每个患者和/或每次就诊进行例行操作，并且这是不可能由用户执行的(自诊断)。
期望提供一种更简单方法，并且尤其是仅需要从患者采集少量唾液样本，并且可以由患者自己采集的方法。期望将此类样本输入体外诊断设备中，该装置允许基于测量对唾液样本进行分类，从而设备可以返回关于患者的牙周疾病正被或可能被有效治疗的可能性的指示。
发明内容
为了更好地满足上述期望，在一个方面，本发明涉及一种用于评估或预测人类患者对牙周疾病治疗的响应的体外方法，该方法包括在来自患有牙周疾病的人类患者的唾液样本中检测至少下述蛋白质的浓度：
(i)血红蛋白亚基δ(Hb-δ)和丙酮酸激酶(PK)；或
(ii)α-1-酸糖蛋白(A1AGP)、丙酮酸激酶(PK)和基质金属蛋白酶-8(MMP-8)中的至少两种，以及角蛋白-4(K-4)；或
(iii)α-1-酸糖蛋白(A1AGP)、丙酮酸激酶(PK)和S100钙结合蛋白A8(S100A8)；
确定反映针对所述蛋白质所确定的联合浓度的至少一个所述测试值，并且将测试值与阈值进行比较，阈值以相同方式反映与牙周疾病的成功治疗相关联的联合浓度，以便评估测试值是否是针对所述患者的牙周疾病的成功治疗的指示。
在另一方面，本发明提出在人类患者的唾液样本中的上述识别的蛋白质作为生物标记物，用于评估患者是否将要响应或已经响应牙周疾病治疗的用途。
可选地，患者的年龄也用作生物标记物。
在另一方面，本发明在于一种用于评估或预测人类患者对牙周疾病治疗的响应的系统，该系统包括:
检测装置，能够并且适用于在人类患者的唾液样本中检测在第一方面中识别的蛋白质；以及
处理器，能够并且适于根据所确定的蛋白质的浓度确定患者的牙周疾病是否已经或将被成功治疗的指示。
该系统可选地包含到接口、尤其是到图形用户接口的数据连接，该数据连接能够呈现信息，优选还能够输入信息，所述接口是系统的一部分或是远程接口。
可选地，一个或多个前述项，尤其是处理器，被使得能够“在云中”起作用，即不是在固定的机器上，而是借助于基于互联网的应用。
在又一方面，本发明提供了一种用于检测人类患者唾液样本中的用于牙周疾病的至少两个生物标记物的试剂盒，所述试剂盒包括用于检测下述物质的检测剂：
血红蛋白亚基δ(Hb-δ)和丙酮酸激酶(PK)；或
α-1-酸糖蛋白(A1AGP)、丙酮酸激酶(PK)和基质金属蛋白酶-8(MMP-8)中的至少两种，以及角蛋白-4(K-4)；或
α-1-酸糖蛋白(A1AGP)、丙酮酸激酶(PK)和S100钙结合蛋白A8(S100A8)。
通常使用两种或更多种、三种或四种检测剂，检测剂中的每种与不同的生物标记物结合。在一个实施例中，第一检测剂用于检测Hb-δ，第二检测剂用于检测PK。在另一实施例中，第一检测剂用于检测K-4，第二检测剂用于检测A1AGP，并且第三检测剂用于检测PK。在另一实施例中，第一检测剂用于检测K-4，第二检测剂用于检测A1AGP，并且第三检测剂用于检测MMP-8。在另一实施例中，第一检测剂用于检测K-4，第二检测剂用于检测MMP-8，并且第三检测剂用于检测PK。在另一实施例中，第一检测剂用于检测A1AGP，第二检测剂用于检测PK，并且第三检测剂用于检测S100A8。在进一步的实施例中，第一检测剂用于检测角蛋白-4(K-4)，第二检测剂用于检测α-1-酸糖蛋白(A1AGP)，第三检测剂用于检测丙酮酸激酶(PK)，并且第四检测剂用于检测基质金属蛋白酶-8(MMP-8)。
在又一方面，本发明提供了一种用于确定在从第一时间点t1到第二时间点t2的时间间隔内人类患者体内由于疾病的治疗而引起的牙周疾病状态的变化的体外方法，该方法包括在t1时从患者获取的至少一个唾液样本中和在t2时从患者获取的至少一个唾液样本中检测下述蛋白质的浓度：
血红蛋白亚基δ(Hb-δ)和丙酮酸激酶(PK)；或
α-1-酸糖蛋白(A1AGP)、丙酮酸激酶(PK)和基质金属蛋白酶-8(MMP-8)中的至少两种，以及角蛋白-4(K-4)；或
α-1-酸糖蛋白(A1AGP)、丙酮酸激酶(PK)和S100钙结合蛋白A8(S100A8)；
以及比较浓度，由此浓度中的任何一个、两个、三个、四个或更多个的差异反映状态的变化。
在另一方面，本发明提供了一种确定人类患者是否已经成功、正在成功或将要成功治疗牙周疾病的方法，包括在人类患者的唾液样本中检测在上述第一方面中识别的蛋白质，以及基于所述样本中所述蛋白质的浓度评估人类患者是否已经成功或将要成功治疗牙周疾病。可选地，该方法包括治疗患者牙周炎的进一步步骤。
在又一方面，本发明提供了一种检测在人类患者体内的上述第一方面中识别的蛋白质的方法，包括：
(a)从人类患者获取唾液样本；以及
(b)通过将样本与用于结合所述蛋白质的两种或更多种检测剂接触，并且检测每种蛋白质与两种或更多种检测剂之间的结合，来检测在样本中是否存在蛋白质。如本文其它地方所述，通常，存在至少第一检测剂和第二检测剂，并且有时存在第三检测剂和第四检测剂。
附图说明
图1示意性地示出了用于本公开中的方法中的系统。
具体实施方式
在一般意义上，本发明是基于下述明智见解：人类患者的唾液样本中蛋白质生物标记物的某些组合可以用于评估或预测患者对牙周疾病治疗的响应。唾液中的生物标记物组合能够区分对牙周炎治疗的成功的响应与对牙周炎治疗的不成功的响应。该见解至少部分地基于下述发现：用于诊断牙周疾病的有用性(例如在治疗之前)的生物标记物不一定意味着其对于监测该牙周疾病的治疗也是有用的。目前的公开提出了各种等级的治疗响应的临床定义，并且识别唾液蛋白质标记物组合，该唾液蛋白质标记物组合使得能够从唾液蛋白质标记物组合的治疗后或治疗前(用于预测)浓度的测量来评估或预测治疗响应。
生物标记物蛋白质是血红蛋白亚基δ(Hb-δ)、丙酮酸激酶(PK)、角蛋白-4(K-4)、α-1-酸糖蛋白(A1AGP)、基质金属蛋白酶-8(MMP-8)和S100钙结合蛋白A8(S100A8)。根据本发明，这些蛋白质的下述组合用于监测或预测牙周疾病的治疗：
i.血红蛋白亚基δ(Hb-δ)和丙酮酸激酶(PK)；或
ii.α-1-酸糖蛋白(A1AGP)、丙酮酸激酶(PK)和基质金属蛋白酶-8(MMP-8)中的至少两种，以及角蛋白-4(K-4)；或
iii.α-1-酸糖蛋白(A1AGP)、丙酮酸激酶(PK)和S100钙结合蛋白A8(S100A8)。
受试者的年龄可以可选地作为附加的标记物包括在内。
在一个实施例中，该方法评估先前被诊断为患有牙周炎并且已经接受该牙周炎的治疗的人类患者的响应。通常可以在本实施例中检测血红蛋白亚基δ(Hb-δ)和丙酮酸激酶(PK)蛋白质的浓度。
在另一实施例中，该方法预测人类患者对牙周炎的治疗的响应。这可以在患者尚未接受治疗时进行。备选地，可能最近已经对患者施加了治疗，并且期望在早期阶段知道治疗是否可能有效。通常在使用本发明的方法评估患者之前，首先施加治疗至少约一周、约两周或约三周，例如至少约7天、至少约14天或至少约21天。治疗可以在评估前约一周之间到约一个月之间开始。可选地，可以在第一次治疗后以两周、三周或四周的间隔评估患者，例如在治疗后的第3周、第6周和第9周，或在治疗后的第4周、第8周和第12周。在这些预测性实施例中，可以检测角蛋白-4(K-4)，以及α-1-酸糖蛋白(A1AGP)、丙酮酸激酶(PK)和基质金属蛋白酶-8(MMP-8)中的至少两种蛋白质的浓度。备选地，可以检测α-1-酸糖蛋白(A1AGP)、丙酮酸激酶(PK)和S100钙结合蛋白A8(S100A8)蛋白质的浓度。
血红蛋白(Hb)是含铁氧转运金属蛋白，存在于几乎所有脊椎动物的红细胞以及一些无脊椎动物的组织中。血红蛋白亚基δ(也称为δ珠蛋白、HBD、δ-珠蛋白和血红蛋白δ)是一种珠蛋白，其与α珠蛋白(HBA)一起组成了成人血红蛋白的不太常见形式，即HbA-2。Hb-δ通常为147个氨基酸长，且分子量为16055Da。成人HbA-2是由两条α链和两条δ链组成的异四聚体。Hb-δ由人体染色体11上的HBD基因编码。
丙酮酸激酶用于催化糖酵解的最后步骤。有四种丙酮酸激酶的组织特异性同工酶，每种分别具有用于不同组织所需的特定动力学性质。
角蛋白-4(K4)，也称细胞骨架角蛋白-4(CYK4)或细胞角蛋白-4(CK-4)，是人体中由KRT4基因编码的蛋白质，角蛋白-4是角蛋白基因家族的成员。II型细胞角蛋白由碱性或中性蛋白组成，这些蛋白成对在简单和分层的上皮组织分化过程中共表达的异型角蛋白链对之中。II型细胞角蛋白CK4在具有家族成员KRT13的粘膜和食管上皮细胞的分化层特异性地被表达。这些基因中的突变与白色海绵痣相关，其特征为口腔、食管和肛门白斑。II型细胞角蛋白簇集在染色体12q12-q13的区域中。
α-1-酸糖蛋白(A1AGP)是主要由肝脏合成的血浆α-球蛋白糖蛋白，有时也称为血清类粘蛋白，其在血液中起到转运蛋白的作用，该转运蛋白作为碱性和中性带电亲脂化合物的载体。还认为α-1-酸糖蛋白调节血细胞和内皮细胞之间的相互作用。
MMP是负责细胞外基质组分(诸如胶原蛋白、蛋白聚糖、层粘连蛋白、弹性蛋白和纤连蛋白)降解的酶家族，MMP在生理和病理条件下均在牙周韧带(PDL)重塑中起到重要作用。MMP-8，也称嗜中性粒细胞胶原酶或PMNL胶原酶(MNL-CL)，是一种存在于大多数哺乳动物的结缔组织中的胶原蛋白酶。
S100钙结合蛋白A8是一种在炎症性的过程的调节和免疫响应中起显著作用的钙-结合和锌-结合蛋白，S100钙结合蛋白A8能够诱导嗜中性粒细胞趋化性和粘附。
上述蛋白质是本领域已知的。技术人员知道上述蛋白质的结构，以及在水性样本中(诸如唾液样本中)检测上述蛋白质的方法。下述蛋白质生物标记物组合统称为“本发明的生物标记物组”：
i.血红蛋白亚基δ(Hb-δ)和丙酮酸激酶(PK)；或
ii.α-1-酸糖蛋白(A1AGP)、丙酮酸激酶(PK)和基质金属蛋白酶-8(MMP-8)中的至少两种，以及角蛋白-4(K-4)，；或
iii.α-1-酸糖蛋白(A1AGP)、丙酮酸激酶(PK)和S100钙结合蛋白A8(S100A8)。
在一个实施例中，本发明的生物标记物组可以由识别的蛋白质生物标记物组成。优选地，本发明的生物标记物组由不超过四种本发明识别的蛋白质生物标记物组成。除本发明的生物标记物组之外，其它生物标记物和/或数据，诸如人口统计学数据(例如年龄、性别)，可以包含在用于牙周炎类型的确定的数据集中。附加的蛋白质生物标记物包括抑制蛋白、血红蛋白-δ、基质金属蛋白酶-9，以及肝细胞生长因子，在本示例中，蛋白质中的每种均存在于有效生物标记物组中。
当可选地包括其它生物标记物时，生物标记物的总数量(即本发明的生物标记物组加上其它生物标记物)通常为4个、5个或6个。
然而，本发明的一个期望优点在于，患者牙周疾病的分类可以通过测量优选不超过四种生物标记物，并且更优选仅测量三种生物标记物，或者甚至在一些实施例中仅测量两种生物标记物来确定。特定优选生物标记物组由下述生物标记物组成：
(i)血红蛋白亚基δ(Hb-δ)和丙酮酸激酶(PK)；或
(ii)α-1-酸糖蛋白(A1AGP)、丙酮酸激酶(PK)和S100钙结合蛋白A8(S100A8)；或
(iii)角蛋白-4(K-4)、α-1-酸糖蛋白(A1AGP)和丙酮酸激酶(PK)；或
(iv)角蛋白-4(K-4)、α-1-酸糖蛋白(A1AGP)和基质金属蛋白酶-8(MMP-8)；或
(v)角蛋白-4(K-4)、丙酮酸激酶(PK)和基质金属蛋白酶-8(MMP-8)；或
(vi)角蛋白-4(K-4)、α-1-酸糖蛋白(A1AGP)、丙酮酸激酶(PK)和基质金属蛋白酶-8(MMP-8)。
特别地，这种确定不需要涉及其它数据的使用，这有利地提供了简单和直接的诊断测试。本文识别的生物标记物组允许牙周炎治疗的成功结果的检测。
根据需要，该方法仅需要从受试者获取少量(例如液滴大小的)唾液样本。样本的尺寸通常为0.1μl-2ml，诸如1ml-2ml，由此较小量(例如0.1μl-100μl)就可以用于体外设备处理，并且由此，提取较大样本，诸如高达20ml，诸如7.5ml-17ml，也是可能的。
将该样本输入体外诊断设备中，该设备测量所涉及的蛋白质的浓度并且返回结果，基于牙周疾病治疗成功的可能性对受试者进行分类。
本发明的易用性使得可以定期(例如作为定期牙科检查的一部分或甚至在家)检测大多数患有牙周疾病的牙科患者。这尤其允许检测牙周炎的治疗是否成功或是否将要成功，从而能够实现更知情的牙周炎治疗方法，由此，成功的治疗可以继续，并且不成功的治疗则中止或不开始。评估疗法是成功的能力有益于确认例如患者的当前治疗是令人满意的。特别地，该方法还适用于自诊断，由此获取样本并且将样本置入设备中的步骤可以由患者自己执行。
在实施本发明时，通常可以知道患者患有牙周疾病。在实施本发明时，通常可以知道患者患有牙周炎。牙周炎可以是轻度的或晚期的。因此，在某些实施例中，本方法用于评估已知患有牙周炎的人类患者是否正在(或将要)成功地治疗该病症。
评估为成功或不成功的疗法可以是牙周疾病的任何疗法。治疗剂和牙科手术，或治疗剂和牙科手术的组合是已知的并且可以使用的。已知的治疗剂包括施用含抗微生物剂试剂，诸如漱口水、芯片、凝胶或微球。用于治疗牙龈炎和牙周炎的典型抗微生物剂是洗必泰。其它治疗剂包括抗生素，通常是口服抗生素，以及酶抑制剂，诸如强力霉素。已知的非手术治疗程序包括：破坏龈下菌斑生物膜的根面仪器；刮治和根面平整(SRP)；以及牙间清洁。已知的手术治疗包括手术袋复位、皮瓣手术、牙龈移植或骨移植。治疗优选是治疗剂，诸如抗微生物剂，通常是抗微生物漱口水。
可选的拜访牙科医生或卫生学家进行治疗的需求和次数可以根据临床需要和患者偏好而变化。临床治疗的初始阶段通常在次数较少但是时间较长的就诊中完成。在该实施例中，患者可以去牙科诊所就诊2次，每次就诊约1小时-2小时用于初始治疗。随后，早期治疗后期的频繁回访可以检查治愈情况、激励患者、加强口腔卫生，并且提供预防用于重新形成的牙菌斑的去除。这通常是在初始治疗期后的1-2个月内，以2-4周的间隔通过短时间(例如15-30分钟)就诊来实现。
因此，在某些实施例中，治疗阶段可以包括1-2次用于根面仪器治疗的临床就诊。此后，患者可以在大约3周、6周、9周后再次拜访牙科医生或卫生学家以复诊(口腔卫生的预防、激励、加强)。在该时间表内，可以根据个体的临床需要实施治疗方案。
在某些实施例中，本发明的评估或预测方法可以在初始疗法之后的任何临床拜访时执行。
本发明的方法通常包括使用一种或多种检测剂，检测构成本发明生物标记物组的上述至少两种蛋白质以及可选的其它生物标记物蛋白质。
通常，当炎症水平显著降低，而袋深可以保持相对较高(即与健康个体或牙龈炎患者相比)时，可以认为治疗是成功的。因此，对于治疗后的患者，根据疾病本身的唾液蛋白质标记物进行疾病分类(例如区分健康、牙龈炎、轻度牙周炎和重度牙周炎)可能不适合评估治疗响应。本发明的生物标记物蛋白质克服了这一问题，并且能够特异性地确定对治疗的响应。
根据本发明，测试的“唾液”可以是可以通过吐出或擦拭获得的未稀释唾液，或可以通过用流体冲洗口腔获得的经稀释的唾液。经稀释的唾液可以通过患者用无菌水(例如5ml或10ml)或其它适当流体冲洗口腔或漱口数秒并且吐到容器中来获得。经稀释的唾液有时可以称为口腔冲洗液。
“检测”是指测量、定量、评分或测定生物标记物蛋白质的浓度。包括生物标记物蛋白质在内的生物化合物的评价的方法是本领域已知的。公认的是，检测蛋白质生物标记物的方法包括直接测量和间接测量。本领域技术人员能够选择测定特定生物标记物蛋白质的适当方法。
术语蛋白质生物标记物的“浓度”被赋予其通常的含义，即蛋白质在体积中的丰度。蛋白质浓度通常以质量/体积测量，最通常以mg/ml或μg/ml测量，但有时低至pg/ml。另一替代测量是摩尔浓度、mol/L或“M”。浓度可以通过检测已知、所确定的或预先确定的体积样本中的蛋白质的量来确定。
确定浓度的备选方法是确定样本中的蛋白质生物标记物的绝对量，或确定样本中的生物标记物的质量分数，例如相对于样本中的所有其它蛋白质的总量的生物标记物的量。
“检测剂”是一种试剂或化合物，其特异性地(或选择性地)与感兴趣的蛋白质生物标记物结合、与感兴趣的蛋白质生物标记物相互作用，或检测感兴趣的蛋白质生物标记物。这种检测剂可以包括但不限于，优先结合蛋白质生物标记物的抗体、多克隆抗体或单克隆抗体。
术语“牙周疾病”是指牙龈炎和牙周炎(轻度和重度)。认为没有牙周疾病的患者是健康的。
当提及检测剂时，短语“特异性地(或选择性地)结合”或“特别地(或选择性地)与……发生免疫反应”是指决定蛋白质和其它生物制剂的异质群体中存在蛋白质生物标记物的结合反应。因此，在指定免疫测定条件下，特定检测剂(例如抗体)与特定蛋白质的结合至少是背景的两倍，并且基本上不与样本中存在的其它蛋白质以显著的量结合。这种条件下的特异性结合可以需要根据其对特定蛋白质的特异性而选择的抗体。可以使用多种免疫测定形式来选择与特定蛋白质发生特异性免疫反应的抗体。例如，固相ELISA免疫测定(酶联免疫吸附测定)常规地用于选择与蛋白质发生特异性免疫反应的抗体(可以被用于确定特异性免疫反应的免疫测定形式和条件的描述，参见例如Harlow&Lane,Antibodies,ALaboratory Manual(1988))。典型地，特异性或选择性反应将是背景信号或噪声的至少两倍，并且更典型地是背景的10倍-100倍以上。
“抗体”是指基本上由一个或多个免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因的片段编码的多肽配体，多肽配体特异性地结合并确识别表位(例如抗原)。经识别的免疫球蛋白基因包括κ和λ轻链恒定区基因、α、γ、δ、ε和μ重链恒定区基因，以及大量免疫球蛋白可变区基因。抗体例如作为完整的免疫球蛋白存在，或作为通过各种肽酶消化产生的若干充分表征的片段存在。这包括例如Fab'和F(ab)'2片段。本文所用的术语“抗体”还包括通过完整抗体产生的抗体片段的修改或使用重组DNA法从头合成的修改的抗体片段。抗体还包括多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或单链抗体。抗体的“Fc”部分是指免疫球蛋白重链的部分，包括一个或多个重链恒定区结构域CH1、CH2和CH3，但是不包括重链可变区。抗体可以是双特异性抗体，例如具有特异性地结合第一抗原的第一可变区和特异性地结合另一不同的第二抗原的第二可变区的抗体。使用至少一种双特异性抗体可以减少所需要的检测剂的数量。
诊断方法在其灵敏度和特异性方面不同。诊断测定的“灵敏度”是指测试为阳性的患病个体百分比(“真阳性”的百分比)。未通过测定检测到的患病个体是“假阴性”。未患病并且在测定中测试为阴性的受试者称为“真阴性”。诊断测定的“特异性”是1减去假阳性率，其中“假阳性”率被定义为未患病但是测试为阳性的个体比例。特异性也可以称为真阴性率。
本发明的(一种或多种)生物标记物蛋白质可以通过任何方式在样本中检测。用于生物标记物检测的优选方法是基于抗体的测定、蛋白质阵列的测定、基于质谱(MS)的测定和基于(近)红外光谱的测定。例如，免疫测定包括但不限于，使用诸如蛋白免疫印迹(western blots)、放射免疫测定、ELISA、“夹心”免疫测定、免疫沉淀测定、沉淀反应、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散测定、荧光免疫测定等技术的竞争性和非竞争性测定系统。这种测定是常规的并且是本领域公知的。示例性免疫测定将在下文中简要描述(但并非旨在作为限制)。
免疫沉淀方案一般包括在补充有蛋白质磷酸酶和/或蛋白酶抑制剂(例如EDTA、PMSF、抑肽酶、钒酸钠)的裂解缓冲液中裂解细胞群，诸如RIPA缓冲液(1％NP-40或TritonX-100、1％脱氧胆酸钠、0.1％SDS、0.15M NaCl、pH为7.2的0.01M磷酸钠、1％曲柳醇)，向细胞裂解物中添加感兴趣抗体，在4℃下孵育一段时间(例如1-4小时)，向细胞裂解物中添加蛋白质A和/或蛋白质G琼脂糖珠，在4℃下孵育约一小时或更长，在裂解缓冲液中洗涤珠粒，以及使珠粒在SDS/样本缓冲液中重新悬浮。抗体对免疫沉淀特定抗原的能力可以通过例如蛋白免疫印迹分析来评估。本领域技术人员熟知可以被修改以增加抗体与抗原的结合并且降低背景(例如用琼脂糖珠对细胞裂解物进行预清洁)的参数。
蛋白免疫印迹分析一般包括在聚丙烯酰胺凝胶(例如取决于抗原的分子量的8％-20％SDS-PAGE)中制备蛋白质样本、电泳蛋白质样本，将蛋白质样本从聚丙烯酰胺凝胶转移至膜，诸如硝化纤维、PVDF或尼龙，在封闭溶液(例如具有3％BSA的PBS或非脂乳)中封闭膜，在洗涤缓冲液(例如PBS-Tween20)中洗涤膜，用在封闭缓冲液中稀释的一抗(感兴趣的抗体)封闭膜，在洗涤缓冲液中洗涤膜，用二抗(其识别一抗，例如抗人抗体)封闭膜，二抗与稀释在封闭缓冲液中的酶底物(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)或放射性分子(例如32P或125I)缀合，在洗涤缓冲液中洗涤膜，以及检测抗原是否存在。本领域技术人员熟知可以被修改以增加检测信号并且降低背景的参数。
ELISA通常包括制备抗原(即感兴趣的生物标记物蛋白质或生物标记物蛋白质的片段)，用抗原包被“96-孔”微量滴定板的孔，向孔中添加缀合至诸如酶底物(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)等可检测化合物的感兴趣抗体，并且孵育一段时间，以及检测抗原是否存在。在ELISA中，感兴趣抗体不必与可检测化合物缀合；相反地，可以将与可检测化合物缀合的二抗(二抗识别感兴趣抗体)添加到孔中。此外，可以将抗体包被到孔中，而不是用抗原包被孔。在这种情况下，在将感兴趣抗原添加至包被孔中后，可以添加与可检测化合物缀合的二抗。本领域技术人员熟知可以被修改以增加检测信号的参数以及本领域已知的ELISA的其它变型。
由于使用了多个标记物，因而可以基于这些生物标记物的联合浓度来确定阈值。该阈值决定是否将患者分类为已成功治疗或没有被成功治疗。本发明反映了下述见解：基于如上所述的生物标记物组合的测量，可以足够准确地将对牙周炎治疗的成功响应与对牙周炎治疗的不成功响应区分开。
这种见解支持另一方面，本发明，即本发明的蛋白质组合，作为人类患者唾液样本中的生物标记物，用于评估对患者的牙周炎治疗是否成功或将要成功的用途。为了避免疑惑，本方面的蛋白质组合是：
血红蛋白亚基δ(Hb-δ)和丙酮酸激酶(PK)；或
α-1-酸糖蛋白(A1AGP)、丙酮酸激酶(PK)和基质金属蛋白酶-8(MMP-8)中的至少两种，以及角蛋白-4(K-4)；或
α-1-酸糖蛋白(A1AGP)、丙酮酸激酶(PK)和S100钙结合蛋白A8(S100A8)。
这种用途可以在基本上如上下文所述的方法中实现。
本发明的方法包括确定反映测量的所述蛋白质的联合浓度的至少一个测试值。联合浓度值可以是通过输入所确定的浓度并且对这些值进行算术运算而获得的任何值。联合浓度值可以是例如浓度的简单相加。联合浓度值还可以涉及将每个浓度乘以反映该浓度的期望权重的因子，然后将结果相加。联合浓度值还可以涉及将浓度彼此相乘，或乘法、除法、减法、取幂和加法的任意组合。联合浓度值还可以涉及取浓度的几次方。可选地，测试值反映了确定的蛋白质的联合浓度与受试者年龄的组合。
可以将得到的联合浓度值与一个或多个阈值进行比较，阈值以相同方式反映与牙周炎的成功治疗相关的联合浓度。这种比较允许评估测试值是否指示唾液接受测试的患者体内存在成功治疗。
阈值可以例如是联合浓度值，联合浓度值基于在与牙周炎成功治疗相关的参考样本中(例如在以前诊断为牙周炎并且已经治疗降低了疾病严重性的患者体内)，确定的相同蛋白质的浓度，以相同方式获得。通常，由此，反映相同或更高的联合浓度的值指示在受试患者体内成功治疗牙周炎。类似地，反映所测试的牙周炎患者唾液中较低联合浓度的值的牙周炎未成功治疗的指示。然而，应当理解的是，也可以计算阈值(例如通过使用负乘数)，使得指示成功治疗的测试值低于阈值，并且指示不成功治疗的测试值高于阈值。
阈值还可以基于测量一组样本中的存在的生物标记物蛋白质的浓度来确定，样本包括已知的被成功治疗的患者和未被成功治疗的患者。由此，可以对经测量的浓度值进行统计分析，可能地包括机器学习法，从而允许以期望灵敏度和特异性来区分被分类为已成功治疗或未成功治疗的患者。由此，可以获得所期望的一个或多个阈值。基于该阈值，待测试的样本可以进行相同的浓度测量，并且然后以与一个或多个阈值的获取方式相同的方式处理浓度值，以便确定可以与阈值比较的联合浓度值，从而允许将测试样本分类为成功治疗“是”或“否”。
在一个有趣的实施例中，联合浓度值以如下得分的形式获得。给每次测量分配数值(蛋白质浓度值，例如ng/ml)，并且这些值以线性或非线性组合使用，以计算0-1之间的得分。在基于如上所述的一组受试者确定阈值的情况下，0-1之间的得分通常利用将联合浓度作为输入的S形(sigmoid)函数来计算(如进一步所示)。
当评分超过一定阈值时，该方法指示牙周炎的成功治疗。可以基于所期望的灵敏度和特异性来选择阈值。
如本领域的所公认的临床定义基于下述：
牙龈指数(GI)
将基于按0-4的标度评定的Lobene改良牙龈指数(MGI)记录全口牙龈指数，其中：
0＝不存在炎症，
1＝轻度炎症；边缘或乳头状牙龈单元的任何部分但是并非整体边缘或乳头状牙龈单元的颜色轻微变化，质地几乎没有变化，
2＝轻度炎症；但涉及整个边缘或乳头状单元，
3＝中度炎症；边缘或乳头状单元着色、发红、浮肿和/或肥大，
4＝严重炎症；边缘或乳头状牙龈单元明显发红、水肿和/或肥大，自发性出血、充血或溃疡。
探诊深度(PD)
使用手动UNC-15牙周探针，将探诊深度记录至最接近的mm。探诊深度是从探针尖端(假定在袋的基部处)到游离牙龈缘的距离。
牙龈退缩(REC)
使用手动UNC-15牙周探针，将牙龈退缩记录至最接近的mm。牙龈退缩是从游离牙龈缘到牙骨质-牙釉质连接处的距离。牙龈退缩用正数表示，并且牙龈过度生长用负数表示。
临床附着丧失(CAL)
临床附着丧失计算为探诊深度+每个部位处的凹陷的之和。
探诊出血(BOP)
探诊之后，对每个部位进行探诊出血评估，如果出血发生在探诊之后30秒内，则给该部位分配得分1，否则分配得分0。
得到的受试者组(患者组)定义如下：
健康组(H)：所有部位PD≤3mm(但允许最后直立臼齿的远端处的多达四个4mm的袋)，没有具有邻间附着损失的部位，≤10％的部位中GI≥2.0，％BOP得分≤10％；
牙龈炎组(G)：＞30％的部位中GI≥3.0，没有具有邻间附着损失的部位，没有部位PD＞4mm，％BOP得分＞10％；
中度牙周炎组(MP)：≥8颗牙有5mm-7mm的邻间PD(相当于约2mm-4mm的CAL)，％BOP得分＞30％；
晚期牙周炎组(AP)：≥12颗牙有≥7mm的邻间PD(相当于约≥5mm的CAL)，％BOP得分＞30％。
在一个实施例中，本发明的方法利用如图1中示意性示出的系统。该系统可以是具有集成在其中的各种设备部件(单元)的单个设备。该系统还可以具有作为独立设备的各种部件，或这些部件中的一些。图1所示的部件是测量设备(A)、图形用户接口(B)和计算机处理单元(C)。
如上所述，本发明的系统包括到接口的数据连接，由此，接口本身可以是系统的一部分或者可以是远程接口。后者是指使用不同装置提供实际接口的可能性，优选诸如智能电话或平板电脑等手持装置。在这种情况下，数据连接将优选涉及无线数据传输，诸如通过Wi-Fi或蓝牙，或通过其它技术或标准。
测量设备(A)被配置为例如通过将唾液滴放在筒(A1)上来接收唾液样本，筒(A1)可以被插入装置(A)中。该设备可以是能够从同一唾液样本确定至少本发明的生物标记物蛋白质组合浓度的现有设备，即：
血红蛋白亚基δ(Hb-δ)和丙酮酸激酶(PK)；或
α-1-酸糖蛋白(A1AGP)、丙酮酸激酶(PK)和基质金属蛋白酶-8(MMP-8)中的至少两种，以及角蛋白-4(K-4)；或
α-1-酸糖蛋白(A1AGP)、丙酮酸激酶(PK)和S100钙结合蛋白A8(S100A8)。
测量设备(A)应当能够例如通过将唾液滴放在筒(A1)上来接收唾液样本，筒(A1)可以插入设备(A)中。该设备可以是能够从同一唾液样本确定本发明的至少两种蛋白质生物标记物(例如HB-δ和PK，或A1AGP、PK和S100A8)浓度的现有设备。
处理单元(C)从部件(A)接收蛋白质浓度的数值。单元(C)设置有软件(通常是嵌入式软件)，以允许其计算0-1之间的得分(S)。软件还包括阈值(T)的数值。如果计算值(S)超过(T)，单元(C)将向GUI(B)输出“牙周炎治疗成功”的指示(I)，否则单元(C)输出“牙周炎的治疗不成功”。另一实施例可以使用(S)的特定值来指示做出指示(I)的确定性。这在下述意义上来说可以是“直接的”，例如得分S＝0.8指示“牙周炎成功治疗”的确定性是80％。否则，例如可以通过限定R1-R2的范围来实现，使得当R1＜S＜R2时，指示(I)显示“不确定”。
例如，可以利用S形函数，通过逻辑回归实现得分的特定计算：
Figure BDA0002786394600000181
其中N是所用蛋白质/生物标记物的数量。c0、c1等是系数(数值)，B1、B2等是各蛋白质浓度。
系数Ci可以通过训练程序来确定：
选择对牙周炎治疗具有成功响应的N1个受试者(如牙科医生经由当前标准所确定的)和对牙周炎治疗具有不成功响应的N2个受试者。
从每个受试者获取唾液样本并且测定如上所述的生物标记物组合的蛋白质浓度(唾液样本可以来自尚未接受治疗的患者[用于预测响应]，或已经接受治疗的患者[用于评估响应])。
将成功响应的得分S定义为1，不成功响应的分数S定义为0。
将S形函数拟合到得分与蛋白质浓度值。
注意，备选地，可以使用任何现有回归或机器学习方法(例如线性回归、神经网络、支持向量机等)，其中成功响应治疗的患者得分S较高，并且未成功响应治疗的患者分数S较低。
特别地，已经使用临床研究对显示出牙周炎治疗成功响应或不成功响应的受试者施加了此类程序，是否成功响应由牙科专业人员通过临床评估来识别。这里，治疗后探诊出血百分比小于等于30(BOP≤30％)的患者被视为是治疗的高响应者/具有成功的治疗结果。治疗后BOP>30％的患者被视为是的低响应者/具有不成功的治疗响应。
如本文所使用的，“成功的治疗”通常表示经过牙周炎治疗后的探诊出血百分比小于等于30(BOP≤30％)。
可以使用指示“成功”状态的多类分类器。
通过留一法交叉验证(leave-1-out cross validation)来评估各种生物标记物组合的性能，得到本发明的优选生物标记物组合。
参考上述系统，在另一方面，本发明还提供了一种用于评估人类患者是否已经或将要成功治疗牙周炎的系统，系统包括:
-检测装置，能够并且适于在人类患者的唾液样本中检测下述蛋白质：
血红蛋白亚基δ(Hb-δ)和丙酮酸激酶(PK)；或
α-1-酸糖蛋白(A1AGP)、丙酮酸激酶(PK)和基质金属蛋白酶-8(MMP-8)中的至少两种，以及角蛋白-4(K-4)，；或
α-1-酸糖蛋白(A1AGP)、丙酮酸激酶(PK)和S100钙结合蛋白A8(S100A8)。
如上文所述，此类装置是已知的，并且技术人员可以容易地获得。典型地，提供了：
-容器，用于将受试者的口腔样本接纳在其中，容器内设置有检测装置；
-处理器，能够并且适于根据所确定的所述蛋白质的浓度确定对牙周炎治疗是否成功响应的指示。
可选地，该系统包括能够呈现信息的用户接口(或到远程接口的数据连接)，尤其是图形用户接口(GUI)；GUI是这样的用户接口：允许用户通过图形图标和诸如辅助符号的视觉指示符，而不是基于文本的用户接口、键入指令标签或文本导航(本发明中不排除任何此类接口)与电子设备交互；GUI一般是公知的，并且典型地用于手持移动设备，诸如MP3播放器、便携式媒体播放器、游戏设备、智能电话和较小的家庭、办公室和工业控制设备；如上所述，可选地，接口也可以选择为能够输入信息，诸如受试者的年龄、性别、BMI(体重指数)。
单独地或者作为上述系统的一部分，本发明还提供了一种用于检测人类患者唾液样本中的至少两个牙周疾病生物标记物的试剂盒，该试剂盒包括一种或多种检测剂，用于检测：
血红蛋白亚基δ(Hb-δ)和丙酮酸激酶(PK)；或
α-1-酸糖蛋白(A1AGP)、丙酮酸激酶(PK)和基质金属蛋白酶-8(MMP-8)中的至少两种，以及角蛋白-4(K-4)；或
α-1-酸糖蛋白(A1AGP)、丙酮酸激酶(PK)和S100钙结合蛋白A8(S100A8)。
典型地，试剂盒包括两种或三种检测剂，每种针对一种不同的生物标记物。更典型地，试剂盒中的检测剂包括下述检测剂或由下述检测剂组成：
用于检测血红蛋白亚基δ(Hb-δ)的第一检测剂，以及用于检测丙酮酸激酶(PK)的第二检测剂，
用于检测角蛋白-4(K-4)的第一检测剂，用于检测α-1-酸糖蛋白(A1AGP)的第二检测剂，以及用于检测丙酮酸激酶(PK)的第三检测剂；或
用于检测角蛋白-4(K-4)的第一检测剂，用于检测α-1-酸糖蛋白(A1AGP)的第二检测剂，以及用于检测基质金属蛋白酶-8(MMP-8)的第三检测剂；或
用于检测角蛋白-4(K-4)的第一检测剂，用于检测丙酮酸激酶(PK)的第二检测剂，以及用于检测基质金属蛋白酶-8(MMP-8)的第三检测剂；或
用于检测角蛋白-4(K-4)的第一检测剂，用于检测α-1-酸糖蛋白(A1AGP)的第二检测剂，用于检测丙酮酸激酶(PK)的第三检测剂，以及用于检测基质金属蛋白酶-8(MMP-8)的第四检测剂；或
用于检测α-1-酸糖蛋白(A1AGP)的第一检测剂，用于检测丙酮酸激酶(PK)的第二检测剂，以及用于检测S100钙结合蛋白A8(S100A8)的第三检测剂。
如上文关于本发明方法所讨论的，试剂盒可以包括更多检测剂，诸如用于其它蛋白质的检测剂。在一个优选实施例中，如所提及的，试剂盒中可用的检测剂由用于检测构成本发明生物标记物组的三种蛋白质的检测剂组成。
优选地，所述试剂盒包括固体支撑件，诸如含有所述检测剂的芯片、微量滴定板或珠粒或树脂。在一些实施例中，试剂盒包括质谱探针，诸如ProteinChipTM。
试剂盒还可以提供未结合检测剂或生物标记物的特异性洗涤液和/或检测剂(夹心型测定)。
在一个有趣的方面，本发明的生物标记物组的识别应用于在治疗的时段期间监测人类患者对牙周疾病的状态。因此，本发明还提供了一种用于确定患有牙周炎的人类患者在从第一时间点t1到第二时间点t2的治疗时间间隔内由于疾病的治疗而引起的牙周疾病状态的变化的体外方法，该方法包括在t1时从患者获取的至少一个唾液样本中和在t2时从患者获取的至少一个唾液样本中检测下述蛋白质的浓度：
血红蛋白亚基δ(Hb-δ)和丙酮酸激酶(PK)；或
α-1-酸糖蛋白(A1AGP)、丙酮酸激酶(PK)和基质金属蛋白酶-8(MMP-8)中的至少两种，以及角蛋白-4(K-4)；或
α-1-酸糖蛋白(A1AGP)、丙酮酸激酶(PK)和S100钙结合蛋白A8(S100A8)；
以及比较浓度，由此，优选一个、两个、三个或四个浓度的差异反映状态的变化。这种差异可以称为浓度差异，从而允许直接比较而无需首先生成0-1之间的数字，或任何其它分类。应当理解的是，在两个时间点处接收的测量也可以以与如上确定患者状态时相同方式的进行处理。
本发明还提供了一种诊断人类患者是否已经成功或将要成功治疗牙周疾病的方法，包括在患者的唾液中检测本发明的蛋白质的存在。基于在所述样本中的所述蛋白质的浓度来评估患者体内成功的疗法的存在。可选地，这一方面的方法包括治疗患者牙周疾病的进一步步骤。该可选治疗步骤可以包括施加已知治疗剂或牙科程序，或治疗剂和牙科程序的组合。已知的治疗剂包括施用含抗微生物剂试剂，诸如漱口水、芯片、凝胶或微球。用于治疗牙龈炎和牙周炎的典型抗微生物剂是洗必泰。其它治疗剂包括抗生素，通常是口服抗生素，以及酶抑制剂，诸如强力霉素。已知的非手术治疗程序包括刮治和根面平整(SRP)。已知的手术治疗包括手术袋复位、皮瓣手术、牙龈移植或骨移植。
本发明还提供了一种检测患者体内的本发明蛋白质的方法，包括：
(a)从人类患者获取唾液样本；以及
(b)通过使唾液样本与蛋白质的检测剂接触并且检测各个蛋白质与检测剂之间的结合，来检测在唾液样本中是否存在本发明的蛋白质。
本发明将参考下述非限制性示例进一步阐述。
示例
在一个临床研究中，71名受试者在两个独立的临床地点进行重复的临床就诊，接受牙周炎治疗，其中：
17人具有低/不成功响应
54人具有高/成功响应
我们获取了>0.75的接受者-操作者-特性曲线下面积值，用于检测成功治疗结果。
在统计学上，接受者操作特性曲线或ROC曲线是二元分类器系统在其鉴别阈值变化时的性能曲线图。该曲线通过在各种阈值设置下绘制真阳性率(TPR)与假阳性率(FPR)来创建。真阳性率也称为机器学习中的检测灵敏度、回忆或概率。假阳性率也称误检或虚警概率，并且可以计算为(1-特异性)。因此，ROC曲线是作为误检函数的灵敏度。一般地，如果用于检测和虚警的概率分布两者都是已知的，则可以通过针对阈值的每个值，将检测概率的累积分布函数的值(从负无穷到鉴别阈值的概率分布下面积)绘制在y轴上，并且将虚警概率的累积分布函数的值绘制在x轴上来生成ROC曲线。测试的准确度取决于测试将被测试组划分为有或者没有所讨论疾病的组的程度。通过ROC曲线下的面积测量准确度。面积为1表示完美测试；面积为0.5表示无价值测试。对诊断测试准确度进行分类的指导是传统学术点系统：
——0.90-1＝卓越(A)
——0.80-0.90＝良好(B)
——0.70-0.80＝一般(C)
——0.60-0.70＝差(D)
——0.50-0.60＝失败(F)
通过逻辑回归与留一法交叉验证(LOOCV)来评价各种生物标记物组合，得到本发明的生物标记物组合。可以看出，本发明的蛋白质生物标记物组合具有>0.75的AUC以检测成功的治疗结果。
基于以上，在上述临床研究的结果中，认为ROC AUC值大于0.75代表提供根据本发明的测试的理想准确度。
所研究的蛋白质生物标记物是：
·MMP8
·MMP9
·IL-1β
·HGF
·游离轻链(FLC)κ
·游离轻链(FLC)λ
·A1AGP
·Hb-β
·Hb-δ
·角蛋白4
·抑制蛋白
·丙酮酸激酶
·S100A8
·S100A9
此外，在所采用的逻辑回归中，我们将其视为附加预测因子κ+λ、κ-λ、κ/λ。
另外，我们包括了年龄作为预测因子。
这产生了总数为4204个的可能的非冗余组，具有至多4种蛋白质生物标记物(不考虑仅具有年龄的组)。这里的非冗余表示不考虑包括例如κ+λ和κ-λ作为预测因子的组，如在逻辑回归中，非冗余给出与包括κ和λ作为预测因子的对应组相同的结果。
注意，给定上述预测因子，在组中不限制蛋白质标记物的数量产生了98302个可能的非冗余组(不考虑仅具有年龄的组)。
为了基于治疗后标记物水平评估治疗响应，发现5组的AUC LOOCV性能为～0.75，这些组在下表中给出，在表中每个生物标记物组是本发明的优选实施例：
Figure BDA0002786394600000251
为了基于治疗前标记物水平的治疗成功的预测，发现下面的16个组提供了AUCLOOCV>0.75的性能：
Figure BDA0002786394600000252
这些组中的每个组是根据本发明的优选生物标记物组合。
虽然附图和以上描述中已经详细说明并描述了本发明，但这些说明和描述应视为说明性或示例性的，而非限制性的；本发明不限于所公开的实施例。
例如，不同单元中可以存在用于不同生物标记物的检测剂。或者，方便地，本发明的试剂盒可以包括固定检测剂组，用于实施例中必需的蛋白质生物标记物，即某些实施例中的K-4，以及柔性模块，柔性模块包括用于其它生物标记物，例如A1AGP和/或PK的检测剂。
在实践所要求保护的发明的过程中，通过学习附图、公开内容及所附权利要求，本领域技术人员对于所公开实施例的其它变型是可以理解并且实现的。在权利要求中，“包括”一词不排除其它元件或步骤，不定冠词“一”或“一个”不排除多个。本发明的某些特征被记载在相互不同的从属权利要求中的事实不指示这些特征的组合不能被用于获得优势。权利要求中的任何附图标记不应理解为限制其范围。
总之，我们在此公开了一种用于评估或预测人类患者对牙周疾病治疗的响应的体外方法。该方法是基于确定少至两种生物标记物蛋白质的选择的见解。因此，在来自患者的唾液样本中，测量本文所述蛋白质的浓度。基于所测量的浓度，确定反映所述蛋白质的联合浓度的值。该值通常用于计算成功的治疗的概率，并且与以相同方式反映与牙周炎的成功治疗相关联的联合浓度的相应阈值进行比较。该比较允许评估该测试值是否是所述患者的牙周炎的成功治疗的指示。

Claims (24)

1.一种用于评估或预测人类患者对牙周疾病治疗的响应的体外方法，其中所述方法包括：
-在来自患有牙周疾病的所述人类患者的唾液样本中检测下述蛋白质的浓度：
(i)血红蛋白亚基δ(Hb-δ)和丙酮酸激酶(PK)；或
(ii)α-1-酸糖蛋白(A1AGP)、丙酮酸激酶(PK)和基质金属蛋白酶-8(MMP-8)中的至少两种，以及角蛋白-4(K-4)；或
(iii)α-1-酸糖蛋白(A1AGP)、丙酮酸激酶(PK)和S100钙结合蛋白A8(S100A8)；
-确定反映针对所述蛋白质所确定的联合浓度的至少一个测试值；
-将所述测试值与阈值进行比较，所述阈值以相同方式反映与牙周疾病的成功治疗相关联的所述联合浓度，从而评估所述测试值是否指示对所述患者的牙周疾病的成功治疗。
2.根据权利要求1所述的体外方法，其中所述方法评估先前被诊断为患有牙周炎、并且已经接受针对所述牙周炎的治疗的人类患者的响应。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的体外方法，其中所述血红蛋白亚基δ(Hb-δ)和所述丙酮酸激酶(PK)蛋白质的浓度被检测。
4.根据权利要求1所述的体外方法，其中所述方法预测人类患者对牙周炎治疗的响应，可选地其中所述治疗在评估前不超过7天、6天、5天、4天、3天、2天或1天被提出或被施加。
5.根据权利要求1或权利要求4所述的体外方法，其中以下的蛋白质浓度被检测：所述α-1-酸糖蛋白(A1AGP)、所述丙酮酸激酶(PK)和所述基质金属蛋白酶-8(MMP-8)中的至少两种，以及所述角蛋白-4(K-4)。
6.根据权利要求1或权利要求4所述的体外方法，其中所述α-1-酸糖蛋白(A1AGP)、所述丙酮酸激酶(PK)和所述S100钙结合蛋白A8(S100A8)蛋白质的浓度被检测。
7.根据前述权利要求中任意一项所述的方法，其中确定受试者的年龄，并且所述测试值与所述受试者的所述年龄相结合反映了针对所述蛋白质所确定的联合浓度。
8.根据前述权利要求中任意一项所述的方法，其中所述阈值是基于在一个或多个参考样本中针对所述蛋白质所确定的一个或多个浓度，每个样本与牙周炎的成功治疗或牙周炎的不成功治疗相关联。
9.根据权利要求1所述的方法，其中检测下述蛋白质的浓度：
(i)血红蛋白亚基δ(Hb-δ)和丙酮酸激酶(PK)；或
(ii)α-1-酸糖蛋白(A1AGP)、丙酮酸激酶(PK)和S100钙结合蛋白A8(S100A8)；或
(iii)角蛋白-4(K-4)、α-1-酸糖蛋白(A1AGP)和丙酮酸激酶(PK)；或
(iv)角蛋白-4(K-4)、α-1-酸糖蛋白(A1AGP)和基质金属蛋白酶-8(MMP-8)；或
(v)角蛋白-4(K-4)、丙酮酸激酶(PK)和基质金属蛋白酶-8(MMP-8)；或
(vi)角蛋白-4(K-4)、α-1-酸糖蛋白(A1AGP)、丙酮酸激酶(PK)和基质金属蛋白酶-8(MMP-8)。
10.根据前述权利要求中任意一项所述的方法，其中所确定的浓度值被算术处理为0与1之间的数。
11.蛋白质在人类患者的唾液样本中的用途，所述蛋白质作为生物标记物，用于评估所述患者是否将要响应或已经响应牙周疾病治疗，所述蛋白质是下述蛋白质：
(i)血红蛋白亚基δ(Hb-δ)和丙酮酸激酶(PK)；或
(ii)α-1-酸糖蛋白(A1AGP)、丙酮酸激酶(PK)和基质金属蛋白酶-8(MMP-8)中的至少两种，以及角蛋白-4(K-4)；或
(iii)α-1-酸糖蛋白(A1AGP)、丙酮酸激酶(PK)和S100钙结合蛋白A8(S100A8)。
12.根据权利要求11所述的用途，其中所述人类患者的年龄也用作生物标记物。
13.一种用于评估或预测人类患者对牙周疾病治疗的响应的系统，所述系统包括:
-检测装置，能够并且适于在所述人类患者的唾液样本中检测下述蛋白质：
(i)血红蛋白亚基δ(Hb-δ)和丙酮酸激酶(PK)；或
(ii)α-1-酸糖蛋白(A1AGP)、丙酮酸激酶(PK)和基质金属蛋白酶-8(MMP-8)中的至少两种，以及角蛋白-4(K-4)；或
(iii)α-1-酸糖蛋白(A1AGP)、丙酮酸激酶(PK)和S100钙结合蛋白A8(S100A8)；
-处理器，能够并且适于根据所确定的所述蛋白质的浓度，确定所述患者的牙周疾病是否已经或将被成功治疗的指示。
14.根据权利要求13所述的系统，进一步包括容器，用于接收口腔流体样本，所述容器包括所述检测装置。
15.根据权利要求13或权利要求14所述的系统，进一步包括:
-用户接口，用于向用户呈现所述指示；以及
-数据连接，在所述处理器与所述用户接口之间，用于将所述指示从所述处理器传输给所述用户接口。
16.根据权利要求13至15中任意一项所述的系统，其中所述处理器借助于基于因特网的应用而启动。
17.根据权利要求13至16中任意一项所述的系统，其中所述接口能够输入关于所述受试者的年龄的信息，并且所述处理器能够并且适于根据所确定的所述蛋白质的浓度，确定关于所述患者已经或将被成功治疗的指示。
18.一种用于检测人类患者的唾液样本中的用于牙周疾病的成功治疗的至少两个生物标记物的试剂盒，所述试剂盒包括一种或多种检测剂，用于检测：
(i)血红蛋白亚基δ(Hb-δ)和丙酮酸激酶(PK)；或
(ii)α-1-酸糖蛋白(A1AGP)、丙酮酸激酶(PK)和基质金属蛋白酶-8(MMP-8)中的至少两种，以及角蛋白-4(K-4)；或
(iii)α-1-酸糖蛋白(A1AGP)、丙酮酸激酶(PK)和S100钙结合蛋白A8(S100A8)。
19.根据权利要求18所述的试剂盒，其中所述一种或多种检测剂可选地包括至少三种检测剂：
用于检测角蛋白-4(K-4)的第一检测剂，用于检测α-1-酸糖蛋白(A1AGP)的第二检测剂，以及用于检测丙酮酸激酶(PK)的第三检测剂；或
用于检测角蛋白-4(K-4)的第一检测剂，用于检测α-1-酸糖蛋白(A1AGP)的第二检测剂，以及用于检测基质金属蛋白酶-8(MMP-8)的第三检测剂；或
用于检测角蛋白-4(K-4)的第一检测剂，用于检测丙酮酸激酶(PK)的第二检测剂，以及用于检测基质金属蛋白酶-8(MMP-8)的第三检测剂；或
用于检测角蛋白-4(K-4)的第一检测剂，用于检测α-1-酸糖蛋白(A1AGP)的第二检测剂，用于检测丙酮酸激酶(PK)的第三检测剂，以及用于检测基质金属蛋白酶-8(MMP-8)的第四检测剂。
20.根据权利要求18或19所述的试剂盒，其中所述一种或多种检测剂被包含在固体支撑件上。
21.根据权利要求18至20中任意一项所述的试剂盒，其中所述一种或多种检测剂由用于下述蛋白质的检测剂组成：
(i)血红蛋白亚基δ(Hb-δ)和丙酮酸激酶(PK)；或
(ii)α-1-酸糖蛋白(A1AGP)、丙酮酸激酶(PK)和S100钙结合蛋白A8(S100A8)；或
(iii)角蛋白-4(K-4)、α-1-酸糖蛋白(A1AGP)和丙酮酸激酶(PK)；或
(iv)角蛋白-4(K-4)、α--1酸糖蛋白(A1AGP)和基质金属蛋白酶-8(MMP-8)；或
(v)角蛋白-4(K-4)、丙酮酸激酶(PK)和基质金属蛋白酶-8(MMP-8)；或
(vi)角蛋白-4(K-4)、α-1-酸糖蛋白(A1AGP)、丙酮酸激酶(PK)和基质金属蛋白酶-8(MMP-8)。
22.一种用于确定在从第一时间点t1到第二时间点t2的治疗时间间隔内、人类患者体内由于疾病治疗而引起的牙周疾病状态变化的体外方法，所述方法包括在t1时从所述患者获取的至少一个唾液样本中和在t2时从所述患者获取的至少一个唾液样本中检测以下蛋白质的浓度：
(i)血红蛋白亚基δ(Hb-δ)和丙酮酸激酶(PK)；或
(ii)α-1-酸糖蛋白(A1AGP)、丙酮酸激酶(PK)和基质金属蛋白酶-8(MMP-8)中的至少两种，以及角蛋白-4(K-4)；或
(iii)α-1-酸糖蛋白(A1AGP)、丙酮酸激酶(PK)和S100钙结合蛋白A8(S100A8)；
以及比较所述浓度，由此所述浓度中的任何一个、两个或三个或更多个的差异反映状态的变化。
23.一种确定人类患者是否已经成功或将要成功治疗牙周疾病的方法，包括在所述人类患者的唾液样本中检测下述蛋白质：
(i)血红蛋白亚基δ(Hb-δ)和丙酮酸激酶(PK)；或
(ii)α-1-酸糖蛋白(A1AGP)、丙酮酸激酶(PK)和基质金属蛋白酶-8(MMP-8)中的至少两种，以及角蛋白-4(K-4)；或
(iii)α-1-酸糖蛋白(A1AGP)、丙酮酸激酶(PK)和S100钙结合蛋白A8(S100A8)；
以及基于所述样本中所述蛋白质的浓度，评估所述人类患者是否已经成功或将要成功治疗牙周疾病。
24.一种检测在人类患者体内的下述蛋白质的方法：
(i)血红蛋白亚基δ(Hb-δ)和丙酮酸激酶(PK)；或
(ii)以及α-1-酸糖蛋白(A1AGP)、丙酮酸激酶(PK)和基质金属蛋白酶-8(MMP-8)中的至少两种，以及角蛋白-4(K-4)；或
(iii)α-1-酸糖蛋白(A1AGP)、丙酮酸激酶(PK)和S100钙结合蛋白A8(S100A8)；
所述方法包括：
(a)从人类患者获取唾液样本；以及
(b)通过将所述样本与用于结合所述蛋白质的一种或更多种检测剂接触，并且检测每种蛋白质与所述一种或更多种检测剂之间的结合，来检测在所述样本中是否存在所述蛋白质。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009018342A1 (en) * 2007-07-30 2009-02-05 The Regents Of The University Of Michigan Multi-analyte analysis of saliva biomarkers as predictors of periodontal and peri-implant disease
CN104620110A (zh) * 2012-09-10 2015-05-13 皇家飞利浦有限公司 使用ft-icr-ms/ms的对于牙龈炎和牙周炎的生物标志物的唾液蛋白质组分析

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006526140A (ja) * 2002-12-24 2006-11-16 バイオサイト インコーポレイテッド 鑑別診断のためのマーカーおよびその使用方法
WO2006074450A2 (en) * 2005-01-07 2006-07-13 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for detecting and modulating periodontal disorders and periodontal diseases
KR20110135911A (ko) * 2011-12-05 2011-12-20 경북대학교 산학협력단 바이오마커
CA2952630A1 (en) * 2014-06-28 2015-12-30 Relevance Health System for assessing global wellness

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009018342A1 (en) * 2007-07-30 2009-02-05 The Regents Of The University Of Michigan Multi-analyte analysis of saliva biomarkers as predictors of periodontal and peri-implant disease
CN104620110A (zh) * 2012-09-10 2015-05-13 皇家飞利浦有限公司 使用ft-icr-ms/ms的对于牙龈炎和牙周炎的生物标志物的唾液蛋白质组分析

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