CN112089715A

CN112089715A - 一种畜禽用抗呼吸道阳性菌感染的组合物及其应用

Info

Publication number: CN112089715A
Application number: CN202011031685.8A
Authority: CN
Inventors: 王守奎; 尚若锋; 耿英明; 李霞; 王晓敏; 张淼; 王洛菊
Original assignee: Shandong Qilu King Phar Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: Shandong Qilu King Phar Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2020-09-27
Filing date: 2020-09-27
Publication date: 2020-12-18

Abstract

本发明涉及一种畜禽用抗呼吸道阳性菌感染的组合物及其应用。所述的畜禽用抗呼吸道阳性菌感染的组合物，包括APTM与多西环素。所述APTM和多西环素的质量比为(20～80):(20～80)，同时本发明还提供了上述组合物的在制备复合制剂中的应用。本发明提供的畜禽用抗呼吸道阳性菌感染的组合物将APTM与多西环素联用，两者可以协同作用显示出较好的临床治疗效果，在相同剂量下，明显优于APTM或多西环素单一使用，对阳性球菌引起的呼吸道感染有显著的作用。

Description

一种畜禽用抗呼吸道阳性菌感染的组合物及其应用

技术领域

本发明涉及一种畜禽用抗呼吸道阳性菌感染的组合物及其应用，属于生物医药领域。

背景技术

畜禽呼吸道疾病是由一种或几种细菌、病毒、寄生虫、衣原体、环境因素等相互协同作用引起的，是当前影响我国养殖业发展的主要疾病，该病的发病率和死亡率均高，且容易继发其它病症，据报道，猪场发病率在30～60％，死亡率达5～30％，鸡场的死亡率为10～20％，若混合感染其它疾病则死亡率达50％以上，常给养殖业造成巨大的经济损失。某些人畜共患病还威胁着人类健康，已引起人们的普遍重视，所以针对性的开发有效的治疗畜禽呼吸道疾病的药物至关重要。

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是一种广泛存在于人体及动物体内的重要条件致病菌，可造成人类和动物患上许多感染性疾病。目前，由于抗生素的滥用，引起金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)对多数抗生素产生了耐药性，尤其是耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)，对畜禽的卫生带来严重的威胁，更为严重的是，某些人畜共患病还威胁着人类健康，所以针对性的开发有效的治疗畜禽呼吸道疾病的药物至关重要。

14-O-[(4-氨基-6-羟基嘧啶-2-基)巯乙酰基]姆体林(APTM，化学结构式如式1)是申请人通过对截短侧耳素C-14位侧链进行修饰，经体内外的抑菌试验、急性毒性试验、初步的稳定性试验等一系列研究，筛选出的一种截短侧耳素类候选药物。制备方法详见参考文件“Eur.J.Med.Chem.2015,101,179”。该类化合物主要是通过抑制肽基转移酶的活性，抑制细菌蛋白质的合成，从而达到抑菌的作用(Mol.Microbiol.2004,54,1287)。APTM对引起皮肤感染的大多数细菌或耐药菌，如金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、耐甲氧西林的表皮葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus Epidermidis,MRSE)等有着良好的抑菌活性(Eur.J.Med.Chem.2015,101,179；Pharmacol.Res.2018,129,424)。

式1.14-O-[(4-氨基-6-羟基嘧啶-2-基)巯乙酰基]姆体林分子结构式

多西环素为土霉素经6α-位上脱氧而得到的一种半合成四环素类抗生素，其抗菌机制与阶段测素类化合物相似，也是主要干扰细菌的蛋白质合成。它可以特异性地与细菌核糖体30S亚基在A位置结合，从而抑制氨基酰-tRNA在该位置上的联结，阻止肽链的延长。

中国专利文献CN106214628A一种兽用盐酸多西环素注射液，按重量百分比，其由下述原料组成：盐酸多西环素25％～30％；L-蛋氨酸5％～10％；半胱氨酸1％～2％；聚维酮1％～1.5％；抗氧剂0.5％～0.8％；金属络合剂1％～5％；其余为注射用水。该专利中的兽用盐酸多西环素注射液对革兰氏阳性球菌引起的上呼吸道感染有作用，但是其配方复杂并且治疗效果依然不够理想。

发明内容：

本发明要解决的技术问题是克服现有呼吸道阳性菌治疗药物和技术的缺陷与不足，提供一种畜禽用抗呼吸道阳性菌感染的组合物及其应用，即是将APTM与多西环素联用，能显著提单药对畜禽呼吸道阳性菌感染的疗效，具有很好的应用前景。

术语说明：

APTM：14-O-[(4-氨基-6-羟基嘧啶-2-基)巯乙酰基]姆体林，是截短侧耳素衍生物。

本发明的技术方案如下：

一种畜禽用抗呼吸道阳性菌感染的组合物，其特征在于，包括APTM与多西环素。

根据本发明优选的，所述阳性菌为金黄色葡萄球菌或耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。

根据本发明优选的，所述APTM和多西环素的质量比为(20～80):(20～80)。

根据本发明优选的，所述APTM和多西环素的质量比为(60～80):(20～40)。

根据本发明优选的，所述APTM和多西环素的质量比为60:40。

上述畜禽用抗呼吸道阳性菌感染的组合物在制备抗阳性菌复合制剂中的应用。

根据本发明优选的，所述应用的具体方法，包括步骤如下：

按配比称取APTM和多西环素后，加入二甲基亚砜和Tween-80，混匀搅拌，使其完全溶解；然后再加入注射用水搅拌均匀，用乙醇胺调节pH至7.2～7.8，得到抗阳性菌复合制剂。

根据本发明优选的，所述二甲基亚砜、Tween-80和注射用水的体积比为(0.4～0.6)：(0.8～1.2)：(8～10)。

有益效果：

本发明提供的畜禽用抗呼吸道阳性菌感染的组合物将APTM与多西环素联用，一方面APTM作为截短侧耳素衍生物可以通过抑制肽基转移酶的活性，抑制细菌蛋白质的合成，达到抑菌的作用；多西环素可以干扰细菌的蛋白质合成，阻止肽链的延长达到抑菌作用；另一方面，两者可以协同作用显示出较好的临床治疗效果，明显优于APTM或多西环素单一使用，在相同剂量下，产生了一加一大于二的效果，对阳性球菌引起的呼吸道感染有显著的作用，并且APTM毒性低、稳定性好，更加适合畜禽使用，能够有效降低养殖场由于该类疾病引起的经济损失。

附图说明

图1为实施例2中APTM、多西环素与组合物对小鼠MRSA感染模型的治疗效果图；

图中，图A：APTM，图B：组合物；横坐标：时间，单位：天，纵坐标：存活率。

图2为实施例2中APTM与复合制剂对治疗后小鼠肺部的细菌载量图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下通过优选实施例对本发明作进一步的描述，此处描述仅用于说明和解释，并不用于限定本发明。

实施例1.体外最小抑菌浓度(MIC)和抑菌圈的测定

1.实验材料

试验菌株：

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，S.aureus)、耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)、耐甲氧西林表皮葡萄球菌(MRSE)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis,B.subtilis)和大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)。

试验药物：

APTM、多西环素以及5组APTM和多西环素配制的组合物。

具体APTM和多西环素组合物的质量配比分别是：

配伍1：APTM：多西环素＝80:20，

配伍2：APTM：多西环素＝60:40，

配伍3：APTM：多西环素＝50:50，

配伍4：APTM：多西环素＝40:60，

配伍5：APTM：多西环素＝20:80。

配制方法：按上述配伍分别称取APTM和多西环素共12.8mg，溶解于1mL的DMSO中，再用超纯水稀释100倍，即APTM和多西环素的总浓度为128μg/mL；

按上述配伍分别称取APTM和多西环素共16mg，溶解于1mL的DMSO中，再用超纯水稀释100倍，即APTM和多西环素的总浓度为160μg/mL；

按上述配伍分别称取APTM和多西环素共8mg，溶解于1mL的DMSO中，再用超纯水稀释100倍，即APTM和多西环素的总浓度为80μg/mL。

培养基：

MHB液体培养基的配制：准确称取MHB 24g培养基溶于1000mL超纯水中，经121℃高压灭菌后，存放于4℃冰箱，保存备用。

MHA固体培养基的制备：准确称取MHA 36.5g培养基溶于1000mL超纯水中，经121℃高压灭菌后，候温，用大量程移液枪吸入一次性细菌培养皿中，每皿约25mL，凝固后存放于4℃冰箱，保存备用。

血琼脂平板培养基：蛋白胨10g、牛肉粉3g、氯化钠5g、脱纤维羊血50mL、琼脂15g、去离子水1000mL。

2.实验方法

联合用药的体外最小抑菌浓度(MIC)测定：参考美国临床实验室标准化委员会(NCCLs)标准与指南，在37℃条件下，分别取上述试验菌株接种至血琼脂平板培养基复苏3次后，再次接种至MHB液体培养基，培养6h后，用MHB液体培养基将0.5麦氏比浊度的菌悬液稀释500倍。在无菌96孔板每一列加入100μL无菌生理盐水(阳性组)，之后依次将APTM、多西环素以及5组APTM和多西环素的总浓度为128μg/mL的试验药物按每孔100μL加入无菌96孔板的第二列中，再向后继续倍比稀释。将上述培养基移取100μL加入96孔板每一列中，此时第二列浓度为64μg/mL，第十二列浓度为0.0625μg/mL放置37℃培养24h。每组重复3次。

抑菌圈测定：使用无菌液体培养基将菌液(S.aureus、MRSA和MRSE)稀释至10⁷CFU/mL，将稀释后的菌液100μL均匀涂布在制备的MHA固体培养基上，随后将牛津杯放置在琼脂平板表面上方，使各个牛津杯等距离放置，然后将5组APTM和多西环素的总浓度为160μg/mL试验药物、5组APTM和多西环素的总浓度为80μg/mL的试验药物，浓度为160μg/mL和80μg/mL的APTM，以及浓度为160μg/mL和80μg/mL的多西环素，按相同的体积分别加入牛津杯中，在35℃下，温育24h后测量不同试验药物的抑制区直径，该实验重复测定三次。

3.实验结果

APTM、多西环素、以及APTM和多西环素不同比例配伍的联合用药对S.aureus、MRSA、MRSE、B.subtilis和E.coli的MIC结果见表1，牛津杯测定实验结果见表2。

表1.APTM、多西环素、以及APTM和多西环素不同比例配伍的MIC值

表2.APTM、多西环素以及APTM和多西环素不同比例配伍的抑菌圈(mm)的测定

由表1可知，APTM和多西环素按配伍1～5的质量比配制的组合物在最小抑菌浓度方面均不高于APTM和多西环素单独使用时的最小抑菌浓度，说明在APTM和多西环素的总浓度和单一的APTM或单一的多西环素浓度相同的条件下，不同配伍的APTM和多西环素组合物抗菌活性均强于单一的APTM和单一的多西环素。

由表2可知，APTM和多西环素按配伍1～5的质量比配制的组合物在抑菌圈方面均不小于单一的APTM或单一的多西环素形成的抑菌圈，说明不同配伍的APTM和多西环素组合物的抑菌能力超过了单一的APTM或单一的多西环素的抑菌能力，在APTM和多西环素的总浓度和单一的APTM或单一的多西环素浓度相同的条件下，APTM和多西环素组合物的抑菌能力的提升达到了一加一大于二的效果。

以上体外抑菌试验研究结果表明，在APTM和多西环素的总浓度和单一的APTM或单一的多西环素浓度相同的条件下，APTM和多西环素配伍使用后的抗菌活性和抑菌效果均优于APTM和多西环素单独使用，尤其是APTM和多西环素的质量比为60:40时，能显著提高单药使用时的体外抑菌效果。

实施例2.APTM和APTM+多西环素复合制剂对小鼠MRSA感染模型的治疗作用试验

1.实验材料

试验菌株：

耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)，产品目录号为：ATCC43300。

试验药物

一种应用畜禽用抗呼吸道阳性菌感染的组合物制的复合制剂，该复合制剂的制备方法包括步骤如下：

称取0.48g、0.9g、1.2g、1.5g、2.4g的APTM和0.36g、0.6g、0.8g、1g、1.6g的多西环素，将两种成分按配伍2的质量比例混合，再分别加入50mL二甲基亚砜和100mL Tween-80，混匀搅拌，使其完全溶解；然后再加入850mL注射用水搅拌均匀，用乙醇胺调节pH至7.5，得到APTM和多西环素的总浓度分别为0.8、1.5、2、2.5、4mg/mL的畜禽用抗呼吸道阳性菌感染的复合制剂。

实验动物：

实验动物为28日龄的清洁级雄性BALB/c小鼠，体重22～25g，购自兰州大学实验动物中心，经检疫合格，进行后续的实验。试验期间，所有小鼠都保持标准条件下饲养。所有小鼠在使用前，先以150mg/kg体重注射环磷酰胺，四天后再次以100mg/kg体重注射环磷酰胺，得到免疫抑制的小鼠模型。

2.试验方法：

治疗试验：取120只免疫抑制的小鼠，随机分为12组，每组10只。其中1组设为空白对照组，不做任何处理，其余11组小鼠腹腔注射10％水合氯醛麻醉小鼠，使其头向上处于竖直状态，取80μL浓度为10⁸CFU/mL的耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)悬液缓慢对小鼠进行鼻腔内灌注。2h后，溶剂组(阳性组)注射不含任何药物的溶剂，注射量为每只小鼠0.2mL，其余各组小鼠根据体重分别腹腔注射给药，剂量分别为40、25、20、15、8mg/kg的APTM和试验药物畜禽用抗呼吸道阳性菌感染的复合制剂。给药后，每天观察临床症状，并记录每天死亡情况，共观察7天，根据死亡情况，用Bliss方法计算半数有效剂量(ED₅₀)。

肺部感染实验：取25只免疫抑制的小鼠，随机分为5组，每组5只，其中1组为阳性组、其余4组分别为APTM高、低剂量组和畜禽用抗呼吸道阳性菌感染的复合制剂高、低剂量组。所有小鼠按照上述方法接种MRSA，2h后，APTM高、低剂量组和畜禽用抗呼吸道阳性菌感染的复合制剂高、低剂量组分别以40和20mg/kg体重的剂量给药，2d后采用安乐死法处死小鼠，无菌条件下取出肺组织，无菌吸水纸除去血渍及其它液体，并用一定量的无菌生理盐水磨碎，吸取10μL的匀浆液进行十倍梯度稀释，并均匀涂布在MHA固体培养基的平板上，37℃培养24h后计数。

3.实验结果

不同给药剂量的APTM和畜禽用抗呼吸道阳性菌感染的复合制剂腹腔注射感染的小鼠，观察7天后，各组小鼠的存活率结果如图1所示。

由图1可知，未感染菌液的小鼠(空白组)表现出正常活动而没有任何死亡，溶剂组(阳性组)在感染后的2d内全部死亡。APTM和试验药物畜禽用抗呼吸道阳性菌感染的复合制剂的存活率均表现出明显的剂量依赖性，根据Bliss法计算出的ED₅₀分别为27.13和18.03mg/kg体重。

药物治疗2d后，各组小鼠肺组织匀浆中细菌载量见图2所示。

由图2可知，40mg/kg剂量的试验药物畜禽用抗呼吸道阳性菌感染的复合制剂组的细菌载量极显著性地低于阳性对照组和APTM的两个剂量组，20mg/kg剂量的试验药物畜禽用抗呼吸道阳性菌感染的复合制剂组与APTM的两个剂量组均显著性低于阳性对照组。

以上小鼠感染模型的治疗试验表明，畜禽用抗呼吸道阳性菌感染的复合制剂能显著降低小鼠的病死率和肺组织中的细菌载量，能够提高单独用药的疗效。

综上，本发明提供的畜禽用抗呼吸道阳性菌感染的组合物，通过APTM与多西环素联合使用，尤其是APTM与多西环素的质量比为60:40的配伍，能显著提高APTM的体内和体外抑菌活性，具有显著的协同增效作用，临床应用前景良好。

Claims

1.一种畜禽用抗呼吸道阳性菌感染的组合物，其特征在于，包括APTM与多西环素。

2.如权利要求1所述的畜禽用抗呼吸道阳性菌感染的组合物，其特征在于，所述阳性菌为金黄色葡萄球菌或耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。

3.如权利要求1所述的畜禽用抗呼吸道阳性菌感染的组合物，其特征在于，所述APTM和多西环素的质量比为(20～80):(20～80)。

4.如权利要求1所述的畜禽用抗呼吸道阳性菌感染的组合物，其特征在于，所述APTM和多西环素的质量比为(60～80):(20～40)。

5.如权利要求1所述的畜禽用抗呼吸道阳性菌感染的组合物，其特征在于，所述APTM和多西环素的质量比为60:40。

6.权利要求1～5所述的畜禽用抗呼吸道阳性菌感染的组合物在制备抗阳性菌复合制剂中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用的具体方法，包括步骤如下：按配比称取APTM和多西环素后，加入二甲基亚砜和Tween-80，混匀搅拌，使其完全溶解；然后再加入注射用水搅拌均匀，用乙醇胺调节pH至7.2～7.8，得到抗阳性菌复合制剂。

8.如权利要求7所述的应用方法，其特征在于，所述二甲基亚砜、Tween-80和注射用水的体积比为(0.4～0.6)：(0.8～1.2)：(8～10)。