CN112082966B - 一种纳米卟啉紫外传感检测半胱氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种纳米卟啉紫外传感检测半胱氨酸的方法，属于纳米材料制备及化学分析检测技术领域。本发明开发了一种基于纳米卟啉紫外传感特异性定量识别半胱氨酸的方法，通过自组装得到纳米化的四‑(4‑羧基苯基)钴卟啉，半胱氨酸通过其巯基特异性结合纳米化的四‑(4‑羧基苯基)钴卟啉，使其紫外吸光度降低，从而到达识别半胱氨酸的目的。利用不同浓度的半胱氨酸对纳米化的四‑(4‑羧基苯基)钴卟啉溶液进行不同程度的紫外响应，从而实现复杂基质中半胱氨酸的定量分析。本发明具有优良的稳定性，其制样简单、灵敏度高，为复杂基质中半胱氨酸的快速准确定量识别提供了新的思路。
Description
技术领域
本发明属于纳米材料制备及化学分析检测技术领域，具体涉及一种纳米卟啉紫外传感器的可控制备与其特异性定量识别半胱氨酸。
背景技术
半胱氨酸(Cys)是一种天然产生的氨基酸，是一种具有生理功能的氨基酸，是20多种氨基酸中唯一具有还原性基团巯基(-SH)的氨基酸，其广泛存在于蛋白质，细胞和生物组织中。作为一种与生命有关的生物硫醇，Cys参与了排毒和促进新陈代谢等多种生物过程，半胱氨酸在生物体内具有抱合作用等,对范围广泛的毒物如甲醛、氯仿、过氧化脂、PCB、酒精等具有有效的解毒作用，具有与金属离子(Ag+，Hg2+或Cu2+等)结合形成不溶性硫醇盐的能力。在人血浆中，Cys的浓度通常在微摩尔至毫摩尔的范围内，过量的Cys会引起神经元损伤。因此，由于其生物学功能，在生理条件下准确监测Cys的含量非常重要。由于卟啉含有一个大π共轭体系和多种取代基，可以使用光学方法来识别多种小分子(农药、有机挥发气体、氨基酸等)，而纳米卟啉由于其尺寸小、表面效应及量子隧道效应等，灵敏度、稳定性和化学活性相较于单体来说，纳米卟啉在光电传感器方面具有很大的潜力。迄今为止，已经开发了用于定量识别Cys的各种方法，包括液相色谱法，电化学方法及电子显微镜法等，这些方法具有分离能力强等特点，但其制样复杂、检测时间长等仍存在不足。因此研究一种快速的、高灵敏度定量识别分析半胱氨酸的方法具有重要的意义。本发明利用半胱氨酸对纳米化的四-(4-羧基苯基)钴卟啉溶液紫外吸光度降低的响应，从而实现复杂基质中半胱氨酸的定量分析。本发明可行性很高，相比传统色谱法检测半胱氨酸表现出优良的稳定性和选择性，为复杂体系中半胱氨酸的快速准确定性和定量分析提供了新的思路。
发明内容
本发明的目的是提供一种特异性强、稳定性好的快速准确定性和定量识别半胱氨酸的纳米卟啉紫外传感器，其具有操作简单，成本低廉等优点。
本发明采用自组装法将四-(4-羧基苯基)钴卟啉自组装纳米化，然后纳米化的四-(4-羧基苯基)钴卟啉作为紫外传感器，半胱氨酸通过巯基与其特异性结合，使得纳米化的四-(4-羧基苯基)钴卟啉溶液紫外吸光度降低，从而实现复杂基质中半胱氨酸的定量分析。
为解决上述问题采取的技术方案为：
一种纳米卟啉紫外传感检测半胱氨酸的方法，具体按如下步骤执行：
(1)纳米卟啉紫外传感器的合成：向溶解有十二烷基苯磺酸钠水溶液(SDBS)中加入完全溶解的四-(4-羧基苯基)钴卟啉的N,N-二甲基甲酰胺溶液，其中，四-(4-羧基苯基)钴卟啉与十二烷基苯磺酸钠的物质的量比为1：(50～250)，在30～80℃下剧烈搅拌反应5～30分钟，使四-(4-羧基苯基)钴卟啉自组装纳米化，溶液由浑浊变澄清，得到自组装纳米化的四-(4-羧基苯基)钴卟啉溶液，即纳米卟啉紫外传感器；
(2)纳米卟啉紫外传感器对半胱氨酸的识别与定量分析：将步骤1制得的自组装纳米化的四-(4-羧基苯基)钴卟啉溶液加入到pH为5.0～9.0的Tris-HCl缓冲液中制得检测溶液，所述检测溶液中，自组装纳米化的四-(4-羧基苯基)钴卟啉溶液的紫外吸光度为0.2-0.8；在所述检测溶液中加入待测半胱氨酸溶液，避光混合后，采集紫外光谱数据并计算加入半胱氨酸后紫外吸光度降低值与纳米卟啉原始紫外吸光度A0的比值((A0-A1)/A0)，其中A1为加入半胱氨酸后紫外吸光度值，根据标准拟合曲线或公式获得待测半胱氨酸溶液的浓度。其中，标准拟合曲线绘制方法如下：
分别在配制的检测溶液中加入不同浓度的半胱氨酸标准液，采集其避光混合后的紫外光谱数据，以半胱氨酸标准液的浓度为横坐标，加入半胱氨酸后紫外吸光度降低值与纳米卟啉原始紫外吸光度的比值为纵坐标，绘制获得标准拟合曲线。
进一步地，步骤(1)中四-(4-羧基苯基)钴卟啉与十二烷基苯磺酸钠的物质的量比优选为1：(100～180)。
进一步地，所所述步骤(1)中，制得的自组装纳米化四-(4-羧基苯基)钴卟啉的形貌为球形，直径约为100±20nm。
进一步地，Tris-HCl缓冲溶液优选为pH＝7.0，避光混合时间为3～15分钟。
进一步地，半胱氨酸浓度范围在2.0×10-6～9.0×10-6mol/L时与四-(4-羧基苯基)钴卟啉的紫外吸光度降低呈良好的线性关系，表示为：Y＝0.02708X+0.03197，可以根据公式计算半胱氨酸的浓度。
进一步地，步骤(2)中，纳米化的四-(4-羧基苯基)钴卟啉定量识别的氨基酸为含有巯基的半胱氨酸，包括D/L-半胱氨酸。
本发明中，自组装纳米化的四-(4-羧基苯基)钴卟啉溶液的浓度范围可以根据其紫外吸光度进行确定，优选为纳米化的四-(4-羧基苯基)钴卟啉浓度为1.1×10-6～9.38×10-6mol/L。其中，十二烷基苯磺酸钠水溶液的浓度以及四-(4-羧基苯基)钴卟啉的N,N-二甲基甲酰胺溶液的浓度可以根据纳米化的四-(4-羧基苯基)钴卟啉浓度及四-(4-羧基苯基)钴卟啉与十二烷基苯磺酸钠的物质的量比选择确定，优选地，十二烷基苯磺酸钠水溶液的浓度范围为：5.5×10-5～2.35×10-3mol/L；四-(4-羧基苯基)钴卟啉的N,N-二甲基甲酰胺溶液的浓度范围为1.1×10-4～9.38×10-4mol/L。其中，四-(4-羧基苯基)钴卟啉的N,N-二甲基甲酰胺溶液与十二烷基苯磺酸钠水溶液的体积比可以选用为100:1。
本发明中，所述检测溶液中还可以为包括金属离子或复杂基质的溶液，金属离子的加入及复杂基质对纳米化的四-(4-羧基苯基)钴卟啉定量检测半胱氨酸无明显影响。
本发明中纳米卟啉紫外传感器定量识别半胱氨酸的响应迅速，纳米卟啉紫外传感器加入半胱氨酸后，紫外吸光度迅速降低，1分钟可达到稳定值。采集其避光混合5分钟的紫外光谱数据。
本发明采用纳米化的四-(4-羧基苯基)钴卟啉作为紫外传感器，半胱氨酸通过巯基特异性结合纳米化的四-(4-羧基苯基)钴卟啉，使其紫外吸光度降低，从而快速准确定量识别半胱氨酸。本发明的制备方法绿色环保，可行性高，为复杂体系中半胱氨酸的快速准确定性和定量分析提供了新思路。
与现有技术相比，本发明有以下优异效果：
本发明所采用的方法相比传统色谱法检测半胱氨酸表现出许多优势，其制备简单，可行性高，表现出优良的稳定性、特异性及其抗干扰能力，为生物、医学等领域中复杂体系快速准确定量检测半胱氨酸提供了新的思路，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明一种纳米卟啉紫外传感检测半胱氨酸的方法示意图。
图2为本发明纳米化的四-(4-羧基苯基)钴卟啉紫外传感器的透射式电子显微镜(TEM)图片，其形貌为球形，直径为100nm左右。
图3为本发明纳米化前后的四-(4-羧基苯基)钴卟啉紫外吸收光谱图。
图4为本发明纳米卟啉传感检测通过巯基特异性结合不同浓度半胱氨酸前后的紫外光谱图，横坐标为波长，纵坐标为紫外吸光度(a–g为半胱氨酸的浓度，分别为a：0mol/L、b：2.0×10-6mol/L、c：4.0×10-6mol/L、d：6.0×10-6mol/L、e：8.0×10-6mol/L、f：1.0×10- 5mol/L、g：2.0×10-5mol/L)。
图5为本发明实施例1中纳米卟啉紫外传感器与不同浓度(2.0×10-6～9.0×10- 6mol/L)半胱氨酸特异性结合后线性相关图，横坐标为半胱氨酸的浓度，纵坐标为加入半胱氨酸后紫外吸光度降低值与纳米化的四-(4-羧基苯基)钴卟啉原始紫外吸光度的比值。
图6为本发明可逆纳米卟啉传感器的稳定性。纳米卟啉紫外传感器与半胱氨酸在多种金属离子干扰的情况下作用后的稳定性。横坐标为所加入的干扰物质，纵坐标为紫外吸光度。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不仅限于此。
实施例1
本实施例提供了一种纳米卟啉紫外传感检测人血清白蛋白中半胱氨酸的方法，其示意图如图1，具体步骤如下：
步骤1、四-(4-羧基苯基)钴卟啉自组装溶液紫外传感器的合成：将0.0075g四-(4-羧基苯基)钴卟啉放置于10mL的EP管中，加入N,N-二甲基甲酰胺溶液定容至8mL中，超声3min使四-(4-羧基苯基)钴卟啉完全溶解，将0.0139g十二烷基苯磺酸钠放置于100mL的圆底烧瓶中，用移液枪加入40mL的超纯水，通过超声5min使得十二烷基苯磺酸钠完全溶解，然后用移液枪加入400μL的四-(4-羧基苯基)钴卟啉N,N-二甲基甲酰胺溶液，通过磁力搅拌器在50℃下剧烈反应20分钟，溶液由浑浊变澄清，得到9.38×10-6mol/L自组装纳米化的四-(4-羧基苯基)钴卟啉溶液。如图2所示，其透射式电子显微镜表征显示为粒径100nm左右的纳米球。如图3所示，其纳米化前后紫外吸收光谱图，可以看出纳米化后最大吸收峰对应波长发生了蓝移，并且吸光度升高，表明纳米化成功。
步骤2、绘制拟合曲线：取100μL自组装纳米化的四-(4-羧基苯基)钴卟啉溶液、800μL pH＝7.0的Tris-HCl缓冲液和100μL的L-半胱氨酸，将其依次加入1.5mL的比色皿中，为使其充分稳定，测定其5分钟后的紫外光谱数据。以300～700nm的波长范围为横坐标，加入半胱氨酸前后四-(4-羧基苯基)钴卟啉的紫外吸光度为纵坐标作图，如图4所示，半胱氨酸与纳米卟啉紫外传感器结合，使四-(4-羧基苯基)钴卟啉紫外传感器吸光度随半胱氨酸的浓度增加而降低。以半胱氨酸溶液的浓度为横坐标，分别以加入半胱氨酸后紫外吸光度降低值与纳米化的四-(4-羧基苯基)钴卟啉原始紫外吸光度的比值(A0-A1)/A0为纵坐标作图，如图5所示，得到Y＝0.02708X+0.03197的标准拟合曲线，相关系数R2＝0.99787，线性范围为2.0×10-6～9.0×10-6mol/L。
步骤3、半胱氨酸定性与定量检测：
金属离子对纳米卟啉紫外传感检测半胱氨酸的干扰：取100μL自组装纳米化的四-(4-羧基苯基)钴卟啉溶液、700μL pH＝7.0的Tris-HCl缓冲液、100μL的L-半胱氨酸加入到1.5mL的比色皿中，然后取100μL的金属离子干扰溶液(1.0×10-4mol/L)和100μL超纯水作对照，分别加入含有上述溶液的比色皿中。测定其5分钟后的紫外光谱数据，以不同种类的金属离子溶液为横坐标，紫外最大吸光度为纵坐标作图，可以看出纳米卟啉紫外传感器分别在1.0×10-4mol/L金属离子(Na2SO4、CaCl2、ZnCl2、KCl)及混合干扰下，与半胱氨酸作用紫外吸光度几乎不变，其特异性较强，金属离子对检测的干扰很小，无明显影响，如图6。
复杂基质中半胱氨酸的检测：取100μL自组装纳米化的四-(4-羧基苯基)钴卟啉溶液、700μL pH＝7.0的Tris-HCl缓冲液加入1.5mL的比色皿中、将100μL不同浓度的L-半胱氨酸和100μL的人血清白蛋白(0.01g/mL)混合加入上述溶液中。测定其避光混合5分钟的紫外光谱数据进行分析，其回收如表1。
表1
实施例2
本实施例提供了一种纳米卟啉紫外传感检测半胱氨酸的新方法，其示意图如1，步骤如下：
步骤1、四-(4-羧基苯基)钴卟啉自组装溶液紫外传感器的合成：采用实施例1中步骤(1)的方法合成浓度为1.1×10-6mol/L纳米化的四-(4-羧基苯基)钴卟啉自组装溶液传感器。将十二烷基苯磺酸钠的浓度替换为5.5×10-5mol/L。四-(4-羧基苯基)钴卟啉与十二烷基苯磺酸钠的物质的量比为1：50，反应温度为80℃，反应时间为5分钟。
步骤2、采用步骤1中纳米化的四-(4-羧基苯基)钴卟啉对半胱氨酸进行识别与定量分析。
步骤3、采用金属离子对纳米化的四-(4-羧基苯基)钴卟啉检测半胱氨酸进行干扰研究，结果表明，该条件下的传感器具有优良的稳定性、特异性及其抗干扰能力。
步骤4、复杂基质中半胱氨酸的检测：采用实施例1中步骤(4)的方法进行加样，不同之处是将人血清白蛋白替换成胎牛血清，测定其避光混合5分钟的光谱数据，其回收如表2。
表2
实施例3
本实施例提供了一种纳米卟啉紫外传感检测半胱氨酸的新方法，其示意图如1，步骤如下：
步骤1、四-(4-羧基苯基)钴卟啉自组装溶液紫外传感器的合成：采用实施例1中步骤(1)的方法合成9.38×10-6mol/L纳米化的四-(4-羧基苯基)钴卟啉自组装溶液传感器。不同之处是将十二烷基苯磺酸钠的浓度替换为2.35×10-3mol/L，四-(4-羧基苯基)钴卟啉与十二烷基苯磺酸钠的物质的量比为1：250，反应温度为30℃，反应时间为30分钟。
步骤2、采用步骤1中纳米化的四-(4-羧基苯基)钴卟啉对半胱氨酸进行识别与定量分析。
步骤3、采用中金属离子对纳米化的四-(4-羧基苯基)钴卟啉检测半胱氨酸进行干扰研究，结果表明，该条件下的传感器具有优良的稳定性、特异性及其抗干扰能力。
步骤4、复杂基质中半胱氨酸的检测：采用实施例1中步骤(4)的方法进行加样，不同之处是将人血清白蛋白替换成胎牛血清，测定其避光混合5分钟的光谱数据，其回收如表3。
表3
上述结果说明，本发明的纳米卟啉紫外传感器稳定好。该纳米卟啉紫外传感器在0.01g/mL人血清白蛋白、胎牛血清及牛血清白蛋白下，与不同浓度的半胱氨酸作用后，回收率可达到91.7％～106.8％，n＝3时，RSD≤1.5％。
Claims (8)
1.一种纳米卟啉紫外传感检测半胱氨酸的方法，其特征在于，具体按如下步骤执行：
（1）纳米卟啉紫外传感器的合成：向溶解有十二烷基苯磺酸钠水溶液(SDBS)中加入完全溶解的四-(4-羧基苯基)钴卟啉的N,N-二甲基甲酰胺溶液，其中，四-(4-羧基苯基)钴卟啉与十二烷基苯磺酸钠的物质的量比为1：（50~250），在30~80℃下剧烈搅拌反应5~30分钟，使四-(4-羧基苯基)钴卟啉自组装纳米化，溶液由浑浊变澄清，得到自组装纳米化的四-(4-羧基苯基)钴卟啉溶液，即纳米卟啉紫外传感器；
（2）纳米卟啉紫外传感器对半胱氨酸的识别与定量分析：将步骤（1）制得的自组装纳米化的四-(4-羧基苯基)钴卟啉溶液加入到pH为5.0~9.0的Tris-HCl缓冲液中制得检测溶液，所述检测溶液中，自组装纳米化的四-(4-羧基苯基)钴卟啉溶液的紫外吸光度为0.2-0.8；在所述检测溶液中加入待测半胱氨酸溶液，避光混合后，采集紫外光谱数据并计算加入半胱氨酸后紫外吸光度降低值与纳米卟啉原始紫外吸光度A0的比值(A0-A1)/A0，其中A1为加入半胱氨酸后紫外吸光度值，根据标准拟合曲线或公式获得待测溶液中半胱氨酸的浓度；其中，标准拟合曲线绘制方法如下：
分别在配制的检测溶液中加入不同浓度的半胱氨酸标准液，采集其避光混合后的紫外光谱数据，以半胱氨酸标准液的浓度为横坐标，加入半胱氨酸后紫外吸光度降低值与纳米卟啉原始紫外吸光度的比值为纵坐标，绘制获得标准拟合曲线。
2.根据权利要求1所述的一种纳米卟啉紫外传感检测半胱氨酸的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，四-(4-羧基苯基)钴卟啉与十二烷基苯磺酸钠的物质的量比优选为1：（100~180）。
3.根据权利要求1所述的一种纳米卟啉紫外传感检测半胱氨酸的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，制得自组装纳米化四-(4-羧基苯基)钴卟啉的形貌为球形，直径为100±20nm。
4.根据权利要求1所述的一种纳米卟啉紫外传感检测半胱氨酸的方法，其特征在于，Tris-HCl缓冲溶液优选为pH=7.0，避光混合时间为3~15分钟。
5.根据权利要求1所述的一种纳米卟啉紫外传感检测半胱氨酸的方法，其特征在于，检测溶液中，纳米化的四-(4-羧基苯基)钴卟啉浓度为1.1×10 -6~9.38×10 -6 mol/L。
6.根据权利要求1所述的一种纳米卟啉紫外传感检测半胱氨酸的方法，其特征在于，半胱氨酸的浓度为2.0×10 -6~9.0×10 -6 mol/L时，与四-(4-羧基苯基)钴卟啉的紫外吸光度降低呈良好的线性关系，表示为：Y=0.02708X+0.03197，其中，Y是加入半胱氨酸后紫外吸光度降低值与纳米卟啉原始紫外吸光度的比值，X是半胱氨酸的浓度，根据公式计算半胱氨酸的浓度。
7.按照权利要求1所述的一种纳米卟啉紫外传感检测半胱氨酸的方法，其特征在于，所述检测溶液为含有金属离子或复杂基质的溶液。
8.根据权利要求1所述的一种纳米卟啉紫外传感检测半胱氨酸的方法，其特征在于，纳米化的四-(4-羧基苯基)钴卟啉紫外传感定量识别的氨基酸为D/L-半胱氨酸。
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