CN112079893A

CN112079893A - 一种基于固相化学合成法合成dna存储所需文本的方法

Info

Publication number: CN112079893A
Application number: CN202011005570.1A
Authority: CN
Inventors: 刘全俊; 闫汉; 张振; 朱立博
Original assignee: Shenzhen Institute Of Southeast University; Nanjing Yuanma Technology Partnership LP
Current assignee: Shenzhen Institute Of Southeast University; Nanjing Yuanma Technology Partnership LP
Priority date: 2020-09-23
Filing date: 2020-09-23
Publication date: 2020-12-15
Anticipated expiration: 2040-09-23
Also published as: CN112079893B

Abstract

本发明提供了一种基于固相化学合成法合成DNA存储所需文本的方法，该方法在原有的固相亚磷酸酰胺三脂法上进行了改善，通过去除原方法当中的Capping(盖帽)步骤，简化了DNA化学合成步骤，缩短了整体合成所需要的时间和成本。此外，合成后的DNA文本无需进行纯化步骤这又进一步地减少了工作量和整个流程的耗费。该方法增加了载体上DNA文本的合成数量，极大地提高了单位面积上的存储容量。在读取过程中该合成方法合成的DNA文本链之间存在一个可相互纠正的容错机制，通过高通量并行读取方式来提高读取的准确率。最后，在合成载体的选择方面该合成方法对合成载体没有特殊要求，通用的载体都可被用来进行DNA文本的合成。

Description

一种基于固相化学合成法合成DNA存储所需文本的方法

技术领域

本发明属于DNA存储技术领域，具体涉及一种基于固相化学合成法合成DNA存储所需文本的方法。

背景技术

互联网和人工智能的快速发展，人类已经进入大数据时代。几何级数增长的数据量已经超出了现有存储器存储容量的极限，传统的存储器件如：磁性存储(磁带，硬盘驱动器)、光学存储(蓝光)和固态存储(闪存)的存储能力已经无法满足急剧增长的存储需求。并且这些传统的存储介质在存储密度、保存时间、维护成本方面都存在不同程度的缺陷。因此，有别于传统的存储介质亟待需要被开发。

核酸(nucleic acid)是生物体遗传信息的主要载体，其蕴含着生物体生长、发育、进化、衰老、死亡的信息。核酸是自然界中天然的存储信息的载体，正是由于其稳定的信息存储，才使得亿万年来生命得以延续。正是具有天然的存储信息的优势，加之大多数的真核生物遗传物质为DNA，所以DNA存储慢慢被人们所关注。上世纪60年代Wiener和Neiman就提出过有关概念，但受限于当时合成和测序技术，此后的二十年间未有大的进展。直到Davis将“female Earth”编码并利用DNA存储技术将其转化为一幅存储容量为35bit的图像，该技术才再次受到研究者的广泛关注。近年来DNA存储发展迅速，相较于传统的存储介质，DNA存储具有以下几方面的优点：(1)存储密度高，DNA的存储密度高达10⁹GB/mm³，比传统的存储介质高6个数量级。(2)保存寿命极长，研究表明DNA在-5℃时每6830000年只降解1bp，与目前的数据存储技术相比，DNA存储的信息能够被保存到成百上千年。(3)易于复制，目前而言PCR技术可以短时间低成本的复制大量的副本，这些都更有利于对即将过期的存储信息的维护。传统的存储介质在这方面耗费极大。

DNA存储包括存储信息的编码、合成相应序列的DNA、信息存储、检索、测序、译码六个流程。信息的编码：将四种碱基组成的DNA序列信息转化成计算机的二进制语言信息0和1；DNA合成：利用各种DNA合成手段合成已经编码好的DNA序列；信息存储：将合成好的DNA序列存储于合适的载体上；信息检索：根据碱基对的特异性互补配对，索引相关序列的DNA链；测序：对索引出的DNA链进行序列信息检测以得到相应的序列信息；译码：根据对应的编码规则对其进行解码，得到相应的存储信息(如图1所示)。

基于固相亚磷酸酰胺三脂法的DNA化学合成，由四个反应步骤构成一个循环完成一个单体的合成，也就是说每增加一个循环，即在固体载体上不断增长的寡核苷酸链上增加一个碱基。其每个循环中包含的四个反应步骤具体为：第一个步骤中，连接在固相载体(一般为Au、Pt、Si、SiN_x、控孔玻璃珠(CPG)或聚苯乙烯微球(PS)等)上，5’端羟基被二甲氧基三苯甲基(DMT)保护的核苷酸(通常包含在一个合成柱内)通过加入三氯乙酸而去保护，从而获得游离的5'-羟基端，以供下一步合成反应，使DNA链在原有基础上增加一个单体。在第二个步骤中，将亚磷酰胺单体与四氮唑活化剂混合进入合成柱，形成亚磷酸酰胺四唑活性中间体(其5'端仍受DMT保护，3'端被活化)。第三个步骤为在序列中与先前连接在固相载体上核苷的5'-羟基发生偶联反应、形成亚磷酸三酯，从而使合成序列链向前延长一个碱基。第四个步骤为，采用碘的四氢呋喃溶液将不稳定，易被酸、碱水解亚磷酸酯键，转化为稳定的五价磷酸酯键。经过上述同样的循环步骤，即可得到存储所需的DNA文本样品。

在上述循环步骤中，会发生capping(“盖帽”)步骤，这是因为偶联反应中可能有极少数短链的5'-羟基没有参加反应，capping步骤中用试剂终止其后续发生反应。这样，所有的短链都被Capping后丧失了再延续的机会，因此这些链在存储时就变成了无效链，而大量无效链的存在不仅降低了信息存储的容量，还会增加纯化步骤，随着链长的增加对纯化的要求也就越高，整个成本就会大幅度的增加。

发明内容

本发明的目的是解决DNA存储过程中合成DNA文本步骤繁琐、合成的样品需要进一步的纯化、且存储容量低、耗费较高等问题，本发发明提供了一种基于固相化学合成法合成DNA存储所需文本的方法，该方法去除了原有固相化学合成中的Capping操作流程，一方面简化了传统亚磷酸酰胺三脂法DNA合成的步骤，另一方面可以在不增加操作复杂度的情况下大大提高合成产率，从而增加用于DNA合成的所需的DNA文本。

为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

一种基于固相化学合成法合成DNA存储所需文本的方法，包括以下步骤：

步骤1，去封闭：脱保护剂去除固相载体上所连核苷酸上的DMT，以暴露5′端羟基；

步骤2，活化：核苷酸单体与活化剂混合，形成活性中间体；

步骤3，偶联：所述活性中间体与所述固相载体上所连的核苷酸的5′-羟基发生偶联形成亚磷酸酯，核苷酸链在原有基础上被延长一个单体；

步骤4，氧化：将所述亚磷酸酯的亚磷酸酯键氧化为稳定的五价磷酸酯键；

步骤5，循环上述1到4步，将寡核苷酸链延伸至所需要长度；

上述循环中，存储信息的DNA序列，即核苷酸链不会发生capping“盖帽”。

进一步地，所述循环中的核苷酸链不会发生capping，使每个没有参加偶联反应的核苷酸链上的5'-羟基都继续发生偶联反应，形成只缺少部分碱基的核苷酸链。更进一步地，所述方法合成的核苷酸链之间存在一个可相互纠正的容错机制：在高通量并行读取过程中，所述缺少部分碱基的核苷酸链可参考其他核苷酸链的读取结果来修正相应位点的碱基从而完成纠错。

进一步地，所述固相载体上合成的DNA链不需要纯化。

进一步地，所述DNA的合成在无水环境中进行。

进一步地，所述DNA的合成方向为3′-5′。

进一步地，所述固相载体包括金Au、铂Pt、硅Si、二氧化硅Sio₂、氮化硅SiN_x、氮化钛TiN、控孔玻璃珠CPG或聚苯乙烯PS微球中的任意一种；在所述固相载体的表面合成所述DNA序列；所述固相载体的直径为50-200μm。

进一步地，所述步骤1：脱保护剂为三氯乙酸或二氯乙酸，三氯乙酸或二氯乙酸为较强酸，会有脱嘌呤作用，故反应处理时间不要超过规定时间。

进一步地，所述步骤2：活化剂相对于所述核苷酸单体过量，活化剂为四唑、咪唑中的一种或上述二者的混合物。

进一步地，所述步骤3：所述核苷酸单体相对于固相载体所连核苷酸上的5′-羟基过量。

进一步地，所述步骤4：氧化剂为碘的四氢呋喃溶液和/或双氧水。

本发明的有益效果如下：

本发明通过对原固相亚磷酸酰胺三脂法方法的优化，进一步的提高了化学固相DNA合成过程中DNA的产率。通过去除原有步骤中的Capping步骤，使每个短链都有机会发生继续偶联反应，因而会形成大量只缺少部分碱基的DNA合成链。

此外由于较高的合成率因此一个DNA文本链连续缺失碱基的概率极低，在概率上属于不可能发生事件，可以忽略不计，因此所合成的DNA链大多数情况下只会缺失个别碱基，这些缺失的碱基在读取过程中可以参考其他文本链的读取结果进行相应位点碱基的修正，DNA链彼此之间存在一个互相印证和容错关系；并且文本库越大这种印证关系和容错机制体现的越完美，体现在测序方面就是鲁棒性越好。

在大文本库读取过程中通过概率计算可以准确分辨出每个位点所该存在的正确碱基，这些特点使缺失碱基的DNA链也成为了有效链，相较于原有方法，原来方法的所有的短链都被Capping后丧失了再延续的机会，因此这些链在存储时就变成了无效链，而大量无效链的存在不仅降低了信息存储的容量，还会增加纯化步骤，随着链长的增加对纯化的要求也就越高，整个成本就会大幅度的增加；因此改进后的方法单位面积上不仅极大程度的提高了DNA存储的容量和读取过程的准确率，也避免了纯化所产生的耗费，更利于DNA存储商业化的发展。

综上，本发明方法通过去除原固相亚磷酸酰胺三脂法的Capping(“盖帽”)步骤，简化了DNA化学合成步骤，缩短了整体合成所需要的时间和成本。此外，合成后的DNA文本无需进行纯化步骤这又进一步地减少了工作量和整个流程的耗费。该方法增加了载体上DNA文本的合成数量，极大地提高了单位面积上的存储容量。在读取过程中本发明合成的DNA文本链之间存在一个可相互纠正的容错机制，通过高通量并行读取方式来提高读取的准确率(如图5至图7所示)。此外，本发明对合成载体没有特殊要求，通用的载体都可被用来进行DNA文本的合成，在各载体表面合成DNA不受空间限制，长链的合成效率高，DNA存储发生在表面材料上应用更广(因为表面合成可寻址，不同于溶液中合成，表面材料更易于商业转化，易携带和后续操作)。

附图说明

图1为DNA存储的流程图，其中虚线框中的为DNA合成部分示意图，即本发明针对的部分。

图2为载体示意图：(a)控孔玻璃珠CPG载体示意图；(b)si或SiN等载体示意图。

图3为偶联反应中载体和单体的连接臂和拴带的示意图；其中，连接臂(linkerarm)提供合适的反应空间，拴带(tether)为在需要切割时提供合适的切割位点，被保护的羟基(-O-DMT)提供反应位点，栓带是载体和第一个碱基之间的纽带，具体如图6中的长曲线所示。

图4为本发明优化后的固相亚磷酸酰胺三脂法的DNA化学合成法。

图5为传统合成和优化后合成方法合成产物以及读取测序的对比图：(a)传统方法，一旦有capping步骤，即不再延续就会形成短链；(b)本发明方法，无capping步骤，每个短链都有机会继续延续，仅仅是延续前缺失了部分碱基而已。

图6为合成用于存储DNA的文本示意图(读取过程彼此之间相互印证彼此纠错)。

图7为两种合成方法所得有效链的对比图：(a)传统方法；(b)本发明方法。

图8为实施例2的紫外吸收光谱图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明。

目前，DNA片段几乎完全使用自动化固相法合成。固相合成比溶液合成有许多优点，如：过量的溶液相试剂可用于迅速推动反应完成，杂质和过量的试剂被冲走，每一步都不需要纯化，且这些过程可以在计算机控制的固相合成器上实现自动化。在固相化学合成DNA的方法中亚磷酸酰胺法是偶联效率最高的，通常均在99％以上；而偶联效率是决定合成DNA序列长度最关键的指标。因此，亚磷酸酰胺法是目前最有效、广泛采用的DNA固相化学合成方法。然而目前的亚磷酸酰胺法在合成效率，合成量和合成长度方面都存缺陷。本实施例的优化原有合成方法过程后的亚磷酸酰胺法在这方面表现出了优势，一方面可并行合成很多只缺很少单体的DNA链，极大提高了合成效率；另一方面提高了合成量使得单位面积上合成的长DNA链数量得到极大的提高，增加了文本库存储信息的容量，除此之外由于去除了Capping步骤使所有的DNA文本链都有机会得到延长。另外在DNA存储的信息读取过程中该方法合成的DNA文本链之间可彼此相互印证(如图5至图7所示)，提高了读取的正确性，也即有更好的鲁棒性。

如图7所示，以合成100nt和200nt DNA片段为例，传统方法有效链所占比例分别为36.6％(0.99¹⁰⁰＝0.366)和13.4％(0.99²⁰⁰＝0.134)，随着合成长度的增加该比例还会进一步降低，因此合成长度越长，纯化难度越高，且成本越大。然而本实施例的方法不会出现这个问题，因为其中的链都是有效链，且文本库越大，DNA文本链连续缺失概率越小，链之间的自纠错效应越强，鲁棒性越强。此外单位面积上存储容量相较于传统方法有了两个以上数量级的提高(该提高是在合DNA的合成长度提高到500bp后计算出来的，以0.99合成率计算，0.99⁵⁰⁰＝0.00657，传统的方法在此长度和更长链的合成中合成率只有0.657％甚至更低；而本发明采用的合成方法几乎全部为有效链(100％)，即提高了两个数量级)。

在合成环节中，首先每次循环提供过量所需的寡核苷酸单体，以保证每次偶联反应单体之间的结合率。其次，在载体的选择方面，DNA固相合成使用的固相载体一般是不溶性颗粒，一般直径50-200μm。DNA合成仪固相合成使用的固相载体有许多类型，其中金(Au)、铂(Pt)、硅(Si)、二氧化硅(Sio₂)、氮化硅(SiN_x)、氮化钛(TiN)、控孔玻璃珠(ControlledPore Glass,CPG)和聚苯乙烯(PS)微球是最广泛使用的。该处本实施例以CPG为固相DNA合成的载体为例进行说明(如图2所示)，整个存储文本的合成均在CPG微孔中(更具体的是在微孔表面)进行。最后，当反应进行完全后对合成链样本进行保存。

在上述过程中，为了保证DNA目的链合成产率，所提供的单体必须过量，且发生时间必须充分。

进一步地，CPG是刚性和非膨胀的多孔载体，DNA主要在多孔中进行合成。50nm孔的CPG载体机械强度坚固，常用于合成短的DNA片段。然而在50nm孔的CPG载体制备长度超过40碱基的DNA序列时，合成产量就会急剧下降，这是因为不断增长的寡核苷酸堵塞了细孔，减少了试剂通过基质的扩散。虽然大孔CPG较为易碎，但100nm孔的载体在合成长达100个碱基的DNA序列方面已被证明是令人满意的，而200nm孔的载体可用于更长序列的DNA合成，因此在本实施例中采用200nm孔径的CPG。

在上述过程中，为了保证存储信息的DNA序列稳定性以及阵列空间的限制，存储信息的DNA序列合成须在无水环境中进行。

进一步地，合成过程需注意各个环节反应所需时间。

实施例1

本实施例以一段10个碱基的核酸序列作为信息储存序列，采用优化后的固相亚磷酰三酯法合成存储所需的DNA序列。

(1)基于固相载体原位合成一段核酸序列：

设计并合成一段10个碱基的核酸序列(SEQ NO.1所示)，使用原位合成的方法将合成序列固定在可控孔径玻璃珠(CPG)上。

本实施例采用的方法可以对批量序列进行操作，因此，可以将多段模板序列固定在芯片的阵列孔或其他载体上，如图1所示。

5′-AGCT AGCT AG-3′(SEQ NO.1)

(2)参照图4所示，DNA化学合成具体操作步骤如下：

其中，第5步偶联反应中的各物料比例如下：载体上核苷酸：核苷酸单体：MSNT＝1：5：15，单位为μmol。MSNT为2，4，6-三甲基苯磺硝基三唑。

为了验证上述DNA序列合成成功，采用如下验证步骤：

用乙腈洗涤载体多次，直到洗涤液与脱保护试剂反应无明显颜色，证明游离单体(未反应单体或核苷酸链上脱落的单体)均洗涤出来。

将2ml脱保护试剂加入到乙腈洗净后烘干的载体上反应10min，取上清液1ml与脱保护试剂反应复现颜色，说明核苷酸单体成功被连接。

实施例2：采用微米氮化钛TiN作为载体进行DNA合成。

1.活化：三个试管分别称量1g微米氮化钛TiN粉末，再用水：双氧水：浓氨水＝5：1：1(ml)的混合液在常温下振荡分别反应5、10、15min；

2.洗涤：用纯净水洗净(pH<8.0，一般大量水洗涤4-5次，pH可达到7.5)，然后乙醇洗涤2次，甲苯洗涤2次，80℃下烘干30min；

3.为载体做准备工作：上述干燥的微米氮化钛粉末置于5ml甲苯+250μl羟基硅烷+25μl正丁胺混合液中常温震荡反应4h，然后甲苯洗涤5次，置于110℃烘箱中干燥40min，得到硅烷化微米氮化钛粉末；

4.DNA链合成反应：在手套箱中操作：上述硅烷化微米氮化钛粉末置于1ml0.1M单体乙腈溶液+1ml 0.25M催化剂(4，5-二氰基咪唑)乙腈的混合溶液中，反应20min(期间不断振荡使其均匀)；

5.将上述TiN粉末与溶液离心分离，并用乙腈洗涤多次，直到洗涤液与脱保护试剂(3％三氯乙酸和二氯甲烷混合液)反应无明显颜色(每次约用45ml洗涤液，洗涤四次即可)；

6.将2ml脱保护剂加入到乙腈洗涤后烘干的微米TiN粉末中反应0min，5min，10min，15min，20min后离心，取1ml上清液于5ml容量瓶中；

7.用0.1M甲基苯磺酸一水化合物的乙腈混合液加入到容量瓶中稀释，定容到5ml，做紫外吸收光谱，读取最大吸收峰值。

如图8所示为检测结果。由于经历过上述步骤5的洗涤后，游离的单体均被清洗出去，再加入脱保护剂脱下来的保护基团就是连接在载体上面的最后一个单体所带有的，反应不同时间后所产生紫外吸收峰值与对照组(control)一致，即表明链合成成功。随着反应时间加长500nm附近波长吸收峰逐渐的变大，当时间由15min增加到20min后吸收峰值没有明显增加，表明载体上单体的保护基团基本被脱出完毕，随着时间增加不会再产生新的脱出保护基团。其中对照组为纯单体，其在脱保护剂作用下脱出保护基团从而产生紫外吸收峰值。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何非本质修改或等同变化，均仍属于本发明权利要求书的保护范围内。

Claims

1.一种基于固相化学合成法合成DNA存储所需文本的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤2，活化：核苷酸单体与活化剂混合，形成活性中间体；

步骤5，循环上述1到4步，将寡核苷酸链延伸至所需要长度；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述循环中的核苷酸链不会发生capping，使每个没有参加偶联反应的核苷酸链上的5'-羟基都继续发生偶联反应，形成只缺少部分碱基的核苷酸链。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述方法合成的核苷酸链之间存在一个可相互纠正的容错机制：在高通量并行读取过程中，所述缺少部分碱基的核苷酸链可参考其他核苷酸链的读取结果来修正相应位点的碱基从而完成纠错。

4.根据权利要求1-3任意之一所述的方法，其特征在于：所述固相载体上合成的DNA链不需要纯化。

5.根据权利要求1-3任意之一所述的方法，其特征在于：所述DNA的合成在无水环境中进行；所述DNA的合成方向为3′-5′。

6.根据权利要求1-3任意之一所述的方法，其特征在于：所述固相载体包括金Au、铂Pt、硅Si、二氧化硅Sio₂、氮化硅SiN_x、氮化钛TiN、控孔玻璃珠CPG或聚苯乙烯PS微球中的任意一种；

在所述固相载体的表面合成所述DNA序列；

所述固相载体的直径为50-200μm。

7.根据权利要求1-3任意之一所述的方法，其特征在于：所述步骤1：脱保护剂为三氯乙酸或二氯乙酸，三氯乙酸或二氯乙酸为较强酸，会有脱嘌呤作用，故反应处理时间不要超过规定时间。

8.根据权利要求1-3任意之一所述的方法，其特征在于：所述步骤2：活化剂相对于所述核苷酸单体过量，活化剂为四唑、咪唑中的一种或上述二者的混合物。

9.根据权利要求1-3任意之一所述的方法，其特征在于：所述步骤3：所述核苷酸单体相对于固相载体所连核苷酸上的5′-羟基过量。

10.根据权利要求1-3任意之一所述的方法，其特征在于：所述步骤4：氧化剂为碘的四氢呋喃溶液和/或双氧水。