CN112076126A - 一种山芙蓉中美白功效成分的分离方法及其在化妆品中的应用 - Google Patents

Abstract

一种山芙蓉中美白功效成分的分离方法及其在化妆品中的应用，分离步骤：将山芙蓉的根或茎或根茎混合，自然晾干，粉碎至10～20目，得木屑；以酒精为溶剂对木屑进行萃取，得萃取液；真空浓缩萃取液，至萃取液出现浑浊，往浓缩萃取液中添加纯水，混匀，得调配液；将调配液通过吸附柱吸附至饱和，并依次用1～4BV以下溶剂洗脱：①碱性水溶液，②酒精，③乙酸乙酯洗脱；收集酒精洗脱部分，旋蒸浓缩，得浓缩物；往浓缩物中加入乳化增融剂；混匀，过滤；利用聚酰胺树脂柱将台湾山芙蓉粗提物进一步纯化，筛选出具有美白功效的馏分应于美白护肤品，并通过人体临床试验证明其具有美白功效。

Description

一种山芙蓉中美白功效成分的分离方法及其在化妆品中的 应用

技术领域：

本发明涉及天然植物活性成分研究开发技术领域，具体及山芙蓉中美白功效成分的分离及在化妆品中的应用。

背景技术：

山芙蓉，特别是台湾山芙蓉(Hibiscus taiwanensis S.Y.Hu)，又名千面美人、山棉玫瑰，是台湾特有的一种灌木，广泛分布于台湾岛的各处。山芙蓉是当地常用的传统药材，其花苞可晾干作为清热凉茶，亦可作为沙拉或炒熟直接食用；其根茎更是具有抑菌、抗炎、抗糖尿病等活性，常被用于清肺止咳，凉血解毒。由于山芙蓉的生物活性受到了广泛的关注，已有专利公开或文献报道开发或应用方法。CN201310323003.4中，采用超临界二氧化碳萃取法，从山芙蓉根茎中分离出具有清除DPPH自由基的活性成分。文献：鄭景鴻.台灣山芙蓉與菲律賓千斤拔降血糖活性成分之探討[D].臺北醫學大學生藥學研究所學位論文采用柱层析法，对台湾山芙蓉根提取物进行分离，并对所分离得到物质的降血糖活性进行测试。

虽然文献报道山芙蓉粗提物有很多很好的活性，但其在化妆品的应用过程中发现以下问题。山芙蓉粗提物中的成分种类非常多，其中有些成分的稳定性和配伍性均较差，导致化妆品在货架期容易发生变色、异物析出，进而引发客诉，给消费者带来不便，同时损害企业的品牌形象。另外，山芙蓉粗提物颜色很深，且有很浓的酸臭味，导致添加该粗提取的化妆品色泽暗沉、有异味，严重影响产品的体验。

发明内容：

针对现有技术的上述问题，本发明目的在于提供了一种可以量产的山芙蓉中美白功效成分的分离方法及其在化妆品中的应用。

为达成上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种山芙蓉中美白功效成分的分离方法，包括以下步骤：

(1)将山芙蓉的根或茎或根茎混合，自然晾干，粉碎至10～20目，得木屑；

(2)以酒精为溶剂对木屑进行萃取，得萃取液；

(3)真空浓缩萃取液，至萃取液出现浑浊，往浓缩萃取液中添加纯水，混匀，得调配液；

(4)将调配液通过吸附柱吸附至饱和，并依次用1～4BV以下溶剂洗脱：①碱性水溶液，②酒精，③乙酸乙酯洗脱；

(5)收集酒精洗脱部分，旋蒸浓缩，得浓缩物；

(6)往浓缩物中加入乳化增融剂；混匀，过滤；滤液即山芙蓉中美白功效成分。

进一步，所述的步骤(2)萃取条件为：酒精浓度为60％～95％，料液比为1:2～1:30，萃取温度为室温至80℃，萃取时间为0.5h～4h，萃取次数为1～3次。

进一步，所述的步骤(4)：将调配液通过聚酰胺柱至吸附饱和，填料为60～100目的聚酰胺粉，吸附柱尺寸为9.5cm×120cm、BV≈8.5L；上样液流速为0.4L/min；洗脱流速为0.1L/min。

进一步，所述的步骤(4)：洗脱条件为：①0.5％碳酸氢钠×4L、②80％酒精×12L、③乙酸乙酯×6L。

进一步，所述的步骤(6)：所述的乳化增融剂为吐温-80和3.5份丁二醇，按重量比，往浓缩物中加入0.5份的吐温-80和3.5份丁二醇；混匀，过滤。

进一步，所述的步骤(2)萃取条件为：酒精浓度为80％、料液比为1:5、萃取温度为60℃、萃取时间为1.5h，萃取次数为2次。

一种山芙蓉中美白功效成分在化妆品中的应用，将上述的山芙蓉中美白功效成分添加入化妆品中美白护肤类产品中，所述产品为膏霜、乳液、精华液及面膜，其添加量为0.1％～20％。

进一步，添加量为2％～5％。

进一步，将山芙蓉中美白功效成分添加入膏霜中制得一种含有山芙蓉中美白功效成分的美白芙蓉霜，其配方如下：

序号	INCI	含量％
			1	鲸蜡硬脂醇橄榄油酸酯，	3
2	山梨坦橄榄油酸酯	2
			3	聚二甲基硅氧烷	1
4	角鲨烷	5.5
			5	辛酸/癸酸甘油三酯	5.5
6	水	68.37
			7	甘油	5
8	甘油聚醚-26	4
			9	甜菜碱	2
10	丙烯酰二甲基牛磺酸铵/VP共聚物	0.8
			11	苯氧乙醇	0.8
12	台湾山芙蓉提取物	2
			13	香精	0.03

上述技术方案主要原理及优势如下:美白活性更高：采用聚酰胺柱将山芙蓉分离成多个馏分，并用酪氨酸酶模型筛选山芙蓉中的美白成分，初步确定其具有阿魏酸类似物的结构。脱色：山芙蓉根茎中主要的色素为复杂的木质素类化合物，同时也含有少量的叶绿素和胡萝卜素类化合物。通过0.5％碳酸氢钠洗脱，能除去大部分的小分子量木质素类成分，而叶绿素及胡萝卜素类化合物由于极性很小吸附在柱子上。除味：山芙蓉粗提物中酸臭味的来源可能是木头中的低级脂肪酸及酚酸，特别是甲酸，0.5％碳酸氢钠能有效洗脱上述成分，从而使山芙蓉提取物呈现自然舒适的“木香”气。

本发明具有以下有益效果:筛选了山芙蓉根茎中的美白功效成分，与粗提物相比，本发明分离提取物的美白活性更强。脱除了台湾山芙蓉根茎粗提物中的不良异味和颜色，使其能应用于化妆品。可量产且成本相对较低。一般情况下聚酰胺柱等大孔吸附树脂柱的分离效率虽没有硅胶层析的分离效果好，但其具有配套设备简单、造价低、易放大等优点；另外，柱聚酰胺柱经过再生之后，可以重复使用。

附图说明：

以下用附图对本发明详细说明：

图1为本发明的台湾山芙蓉美白功效成分开发工艺；

图2为本发明实例2-醇提物(1#)色谱图；

图3为本发明实例2-碱洗脱(2#)色谱图；

图4为本发明实例2-80％醇洗脱(3#)色谱图；

图5为本发明实例2-乙酸乙酯洗脱(4#)色谱图；

图6为本发明水提法(5#)色谱图；

图7为本发明乙酸乙酯提取法(6#)色谱图；

图8为本发明组分光谱图(左：未知成分；右：阿魏酸)；

图9为本发明开发方案示意图；

图10为本发明美白功效人体临床评估皮肤黑色素含量图。

具体实施方式：

以下结合附图及实施例对本发明详述：

图1-图9所示，为本发明的实施例。

实施方式1-美白功效成分提取分离

(1)取台湾山芙蓉的根及茎自然晾干、粉碎至10～20目，得木屑；

(2)取100g木屑于烧杯内，加入75％酒精400mL；将烧杯置于60℃水浴锅加热2h；过滤得浸提液，残渣再次加入200mL75％酒精浸提一次；合并两次萃取液；

(3)真空萃取液至原来的二分之一，再按体积比1:1，往浓缩液中添加纯水、混匀，得调配液；

(4)制作聚酰胺吸附柱(填料大小60目～100目，柱尺寸3.8cm×40cm)，将调配液按10mL/min的流速通过聚酰胺柱，并依次用300mL 0.5％碳酸氢钠、600mL80％酒精、300mL乙酸乙酯洗脱；

(5)收集的80％酒精洗脱部分，旋蒸浓缩至无恒重，得浓缩物0.29g，即台湾山芙蓉80％酒精洗脱物。

实施方式2

(1)取台湾山芙蓉的根及茎自然晾干、粉碎至10～20目，得木屑；

(2)取5kg木屑于提取釜内，加入80％酒精20kg，设置萃取温度为65℃、保温1.5h；再次加入15kg的80％在相同条件下萃取1次，合并两次萃取液；

(3)按体积比1:1，往萃取液中添加纯水、混匀，得调配液；

(4)制作聚酰胺吸附柱(填料大小60目～100目，柱尺寸9.5cm×120cm)，将调配液按0.4L/min的流速通过聚酰胺柱至吸附饱和，并依次用0.5％碳酸氢钠×4L、80％酒精×12L、乙酸乙酯×6L洗脱；

(5)收集的80％酒精洗脱部分，旋蒸浓缩至无恒重，得浓缩物13.70g；

(6)往浓缩物中加入6.95g的吐温-80和47.95g丁二醇，混匀，过滤，得台湾山芙蓉美白功效成分约65mL。

实施方式3-美白芙蓉霜的制作

美白芙蓉霜的配方(200g)

制作工艺：

A，将序号1-5项原料投入油锅中，加热至80℃搅拌混合均匀；

B，将序号6-10项原料投入主锅中，加热至80℃搅拌混合均匀；

C，将A步骤混合好的原料投入主锅中，均质乳化，然后冷却；

D，冷却至45℃，投入序号11-13项原料，搅拌分散均匀，出料。

为了说明本发明的有效性，发明人进行以下补充试验：

5.1样品制备

(1)水提取法

以水为溶剂，取100g台湾山芙蓉木屑，按料液比1:5、提取温度60℃、浸提时间2h、用200目尼龙布过滤(大量胶状物)，经浓缩干燥之后得到台湾山芙蓉的水提物3.41g。

(2)乙酸乙酯萃取法

以乙酸乙酯为溶剂，取100g台湾山芙蓉木屑，按以下条件进行萃取，料液比1:5、提取温度60℃、浸提时间2h、浸提次数2次，萃取液经浓缩之后得到台湾山芙蓉的乙酸乙酯萃取物0.86g。

5.2感官检测

取0.5g的样品于50mL烧杯内，加入70％丁二醇10ml，超声使之溶解(或分散)，将烧杯置于白光400lx处观察溶液颜色。邀请三名测试者，对上述溶液的气味进行评述，满分(香气怡人)为10分，最低分(令人厌恶)为0。感官测评结果如下表所示，采用本发明所提供的工艺，能使山芙蓉提取物实现有效脱色脱味，以便其在化妆品中使用。

感官测评情况

编号	样品名称	外观	气味(均值，n＝3)
				1#	实例2-醇提物	深褐色	3(酸味)
2#	实例2-碱洗脱(步骤4)	深褐色	2(刺激酸味)
				3#	实例2-80％酒精洗脱	浅黄色	7(木香味)
4#	实例2-EtOAc洗脱(步骤4)	黄绿色	5(木香味，夹杂焦油味)
				5#	台湾山芙蓉水提物	深褐色	3(刺激酸味)
6#	台湾山芙蓉乙酸乙酯提取物	黄绿色	5(木香味，夹杂焦油味)

5.3液相色谱分析

采用液相色谱对部分提取分离方法的台湾山芙蓉提取物进行检测。仪器条件：岛津LC-16、自动进样器SIL-16、Colunm Oven CTO-16L柱温箱(40℃)、检测器SPD-M20A、色谱柱(WondaSil C18-WR，5μm，4.6×150mm)，进样体积5μL；色谱条件：流动相A-甲醇，流动相B-0.1％磷酸水溶液；梯度洗脱0min(10％A)→60min(100％A)。提取254nm处的色谱图，如图2～7所示。图2、图6、图7比对可以看出，采用不同溶剂从台湾山芙蓉木粉中萃取所得物的化学组成差异很大。图2～5则说明，本发明所提供的纯化方法能将提取物有效地分为三个馏分。图8为3#样品的主峰(Rt＝24.2min)和阿魏酸(Rt＝29.5min)的吸收光谱图，(左图：3#，Rt＝24.2min的光谱图；右图：阿魏酸，Rt＝29.5min)两种非常相似，但前者的最大吸收波长有差异(前者239nm，后者232nm)，故3#样品的主要成分可能是为阿魏酸衍生物或类似物。

5.4美白功效成分筛选

酪氨酸酶抑制活性是化妆品中常用的美白功效初筛模型，采用该模型对台湾山芙蓉提取物美白功效进行初步筛选。试验主要步骤如下：在96孔微板中分别加入10μL蘑菇酪氨酸酶水溶液(200U)、10μL L-DOPA(5mM)及10μL活性物(预先磷酸盐缓冲液溶解)，最后用磷酸盐缓冲盐水(PBS，50mM，pH6.8)补至200μL。将测定混合物在37℃下孵育30min，用酶标仪在490nm处测定所产生的多巴胺的吸光度。实验选取三个浓度(0.02、0.05、0.10mg/mL)分别测试了1#～6#样品及曲酸(7#)的酪氨酸酶活性抑制率，实验结果如图9所示。从图中可以看出，3#样品(80％醇洗脱物)具有较好的美白功效。

5.5美白功效人体临床评估

发明人对实施例3所制成的美白霜进行美白功效人体临床评估。该临床评估委托弘光科技大学完成，共招募20名健康女性志愿者(20-60岁)，测试周期为28天。测试的主要内容为受试者每天早晚使用实施例3所制的美白霜，并定期使用Mexameter 18测定面部皮肤黑色素含量。测试结果如图10所示，第1周、第2周、第3周和第4周皮肤黑色素含量(％)分别为-0.05％、-1.42％、-2.32％和-2.29％，说明了本发明实施例3所制备的美白霜对人体皮肤美白具有积极的效果。

本发明筛选了台湾山芙蓉根茎中的美白功效成分，与粗提物相比，本发明分离提取物的美白活性更强。脱除了台湾山芙蓉根茎粗提物中的不良异味和颜色，使其能应用于化妆品。可量产且成本相对较低。一般情况下聚酰胺柱等大孔吸附树脂柱的分离效率虽没有硅胶层析的分离效果好，但其具有配套设备简单、造价低、易放大等优点；另外，柱聚酰胺柱经过再生之后，可以重复使用。

上述说明示出并描述了本发明的优选实施例，如前所述，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。

Claims (9)

1.一种山芙蓉中美白功效成分的分离方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将山芙蓉的根或茎或根茎混合，自然晾干，粉碎至10～20目，得木屑；

(2)以酒精为溶剂对木屑进行萃取，得萃取液；

(3)真空浓缩萃取液，至萃取液出现浑浊，往浓缩萃取液中添加纯水，混匀，得调配液；

(4)将调配液通过吸附柱吸附至饱和，并依次用1～4BV以下溶剂洗脱：①碱性水溶液，②酒精，③乙酸乙酯洗脱；

(5)收集酒精洗脱部分，旋蒸浓缩，得浓缩物；

(6)往浓缩物中加入乳化增溶剂；混匀，过滤；滤液即山芙蓉中美白功效成分。

2.如权利要求1所述的一种山芙蓉中美白功效成分的分离方法，其特征在于，所述的步骤(2)萃取条件为：酒精浓度为60％～95％，料液比为1:2～1:30，萃取温度为室温至80℃，萃取时间为0.5h～4h，萃取次数为1～3次。

3.如权利要求1所述的一种山芙蓉中美白功效成分的分离方法，其特征在于，所述的步骤(4)：将调配液通过聚酰胺柱至吸附饱和，填料为60～100目的聚酰胺粉，吸附柱尺寸为9.5cm×120cm、BV≈8.5L；上样液流速为0.4L/min；洗脱流速为0.1L/min。

4.如权利要求1所述的一种山芙蓉中美白功效成分的分离方法，其特征在于，所述的步骤(4)：洗脱条件为：①0.5％碳酸氢钠×4L、②80％酒精×12L、③乙酸乙酯×6L。

5.如权利要求1所述的一种山芙蓉中美白功效成分的分离方法，其特征在于，所述的步骤(6)：所述的乳化增溶剂为吐温-80和丁二醇，按重量比，往浓缩物中加入0.5份的吐温-80和3.5份丁二醇；混匀，过滤。

6.如权利要求2所述的一种山芙蓉中美白功效成分的分离方法，其特征在于，所述的步骤(2)萃取条件为：酒精浓度为80％、料液比为1:5、萃取温度为60℃、萃取时间为1.5h，萃取次数为2次。

7.一种山芙蓉中美白功效成分在化妆品中的应用，其特征在于，将按权利要求1-6任意一项所述的一种山芙蓉中美白功效成分提取的山芙蓉中美白功效成分添加入化妆品中美白护肤类产品中，所述产品为膏霜、乳液、精华液及面膜，其添加量为0.1％～20％。

8.如权利要求7所述的一种山芙蓉中美白功效成分在化妆品中的应用，其特征在于，添加量为2％～5％。

9.如权利要求7所述的一种山芙蓉中美白功效成分在化妆品中的应用，其特征在于，将山芙蓉中美白功效成分添加入膏霜中制得一种含有山芙蓉中美白功效成分的美白芙蓉霜，其配方如下：

序号 INCI 含量％ 1 鲸蜡硬脂醇橄榄油酸酯， 3 2 山梨坦橄榄油酸酯 2 3 聚二甲基硅氧烷 1 4 角鲨烷 5.5 5 辛酸/癸酸甘油三酯 5.5 6 水 68.37 7 甘油 5 8 甘油聚醚-26 4 9 甜菜碱 2 10 丙烯酰二甲基牛磺酸铵/VP共聚物 0.8 11 苯氧乙醇 0.8 12 山芙蓉提取物 2 13 香精 0.03

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