CN112075340A - 一种快速打破水曲柳组培苗休眠芽并成功离体繁殖的方法 - Google Patents

Abstract

本发明是一种快速打破水曲柳组培苗休眠芽并成功离体繁殖的方法，以水曲柳带休眠芽点的组培苗或者带休眠芽茎段为材料，以WPM为基础培养基，添加不同浓度的TDZ，两种光照条件(光，暗)，两种培养方式(固体、液体)，温度为25℃，培养7d内，水曲柳休眠芽解除休眠状态，开始萌发，培养24d，固体培养的萌发率最高达57.14％，液体培养的萌发率最高达100％，在壮苗和增殖培养中，培养30d，A6培养基成活率100％，平均苗长为1.68cm，Z1培养基成活率75％，平均苗高2.65cm。该方法不仅可以快速打破水曲柳休眠芽进行离体繁殖，而且该方法可以进行循环使用，是一项可持续的循环培养生产方法，并且，该方法激素单一，浓度低，过程简单，具有可控性和低成本特征，适用于不同的生产条件，为规模化繁殖水曲柳苗木提供技术支持。

Description

一种快速打破水曲柳组培苗休眠芽并成功离体繁殖的方法

技术领域

本发明属于植物良种快繁技术领域，具体地说，涉及一种快速打破水曲柳组培苗休眠芽并成功离体繁殖的方法。

背景技术

水曲柳(Fraxinus mandshurica Rupr.)为木犀科白蜡树属落叶乔木。是东地区重要的珍贵阔叶树种，分布范围较广。主要分布于小兴安岭、长白山、辽宁东部山地，日本的北海道、本州，朝鲜半岛等地。生长迅速、材质优良、强度适中，木材利用价值极高，是著名的军用材种和高级的家具用材。但此树种的资源历来非常贫乏，加之长期的不合理地过渡采伐利用，其资源已尽枯竭。水曲柳己被列为渐危种。水曲柳主要用种子繁殖，也可用扦插繁殖和萌蘖更新。水曲柳是表现出显著发芽缓慢的树种之一。如果播种成熟的干燥种子，需要2年左右的时间才能发芽。同时种子繁殖有受结实大小年的影响等缺点；而萌蘖更新受伐根有无、数量、采伐季节等因素的制约，扦插繁殖因采条母树的年龄不同表现出极大的差异，因此，研究者开始从组织培养的角度研究扩繁水曲柳。

目前，对于水曲柳组织培养的研究也有一些报到，但无论是以哪种材料(成熟胚、体细胞胚、愈伤组织以及一年生枝条的腋芽等)为外植体，所获得的组培苗，在培养过程中都会存在顶芽和腋芽的休眠情况，随着继代的增加，组培苗枝干会木质化，芽点休眠，叶片逐渐老化脱落(如图1)，这严重影响了利用组织培养技术繁殖水曲柳植株的途径，这也是目前水曲柳组培繁殖不能工厂化的一个瓶颈。因此，打破组织培养过程中水曲柳芽点的休眠，并建立离体快速繁殖的技术至关重要，为水曲柳良种的繁殖奠定基础。

发明内容

本发明的目的旨在提供一种快速打破水曲柳组培苗休眠芽并成功离体繁殖的方法，为水曲柳种苗的快速繁殖提供技术平台。

一种快速打破水曲柳组培苗休眠芽并成功离体繁殖的方法，包括：

1、低浓度单一激素，促进休眠芽的萌发；

2、光照强度改变，提高休眠芽的萌发；

3、固液不同培养模式，提高休眠芽的萌发及增殖；

4、萌发的芽离体培养，获得水曲柳离体伸长、增殖的培养基；

5、萌发与伸长循环培养，建立一种快速打破水曲柳休眠芽并离体繁殖的循环培养技术。

本发明的有益效果

1、低浓度单一激素，促进休眠芽的萌发，有效减少激素种类及浓度，降低成本；2、降低光照强度，促进休眠芽萌发，有效节省能源的利用；3、固液不同培养模式，促进休眠芽萌发繁殖，可适用于不同的生产条件；4、休眠芽萌发后离体增殖培养，为快速繁殖水曲柳苗木提供技术；5、萌发与伸长循环培养，建立简单、可控、易操作的可持续的循环培养体系，减少成本，易于工厂化生产。

附图说明

图1水曲柳芽点休眠的组培苗

图2水曲柳休眠芽萌发及芽的二次萌发

图3液体暗培养下休眠芽萌发情况

图4水曲柳离体芽不同培养基培养情况(左A6，右Z1)

具体实施方式

一种快速打破水曲柳组培苗休眠芽并成功离体繁殖的方法，包括以下步骤：

步骤一 材料来源：选取带有休眠芽的组培苗(如图1)，或者将组培苗分成带芽点的茎段。

步骤二 适合休眠芽萌发的光照条件：将步骤一中的材料接种到WY1-WY3培养基中(WPM为基本培养基，添加不同浓度的TDZ(见表1)，蔗糖浓度为30g·L^-1，琼脂为5.6g·L^-1，pH 5.8)，一部分光照培养，光照强度为80μmol·m^-2·s^-1，光照时间为14h/d，一部分暗培养，温度25℃，培养3-7d休眠芽开始萌发，培养24d，光照条件下休眠芽萌发最高培养基是WY2(46.3％)，暗培养条件下休眠芽萌发最高培养基为WY3(57.14％)，暗培养条件下萌发的休眠芽会二次萌发，又伸出新芽(如图2)，虽然WY3培养基萌发率高，萌发的芽涨势较弱，而WY2培养基中萌发的芽长势较好。

步骤三 适合休眠芽萌发的培养方式：将步骤一中的材料接种到WY2的液体培养基中(WPM+0.6mg·L^-1TDZ+30g·L^-1蔗糖，pH 5.8)，黑暗条件下60r/min震荡培养，培养24d，腋芽和顶芽萌发率均达到100％，且芽较长，并能产生丛芽，比固体培养长势粗壮(如图3)

步骤四 萌芽离体伸长培养：将萌发的芽带少许茎段切下，接种于培养基A6(WPM+0.05mg·L^-1TDZ+2mg·L^-1GA3+0.6mg·L^-1BA，蔗糖浓度为30g·L^-1，琼脂为5.6g·L^-1，pH5.8，)，或培养基Z1(WPM+0.05mg·L^-1TDZ+0.6mg·L^-1BA，蔗糖浓度为30g·L^-1，琼脂为5.6g·L^-1，pH 5.8)培养基中，光照强度为80μmol·m^-2·s^-1，光照时间为14h/d，温度25℃，1个继代(20-30d)，A6培养基中成活率最高为100％，平均苗长为1.68cm，Z1培养基中成活率为75％，平均苗长为2.65cm(见表3)，培养1-2个继代获得水曲柳植株(如图4)。

步骤五 萌发与伸长循环培养：长成的水曲柳组培苗叶芽会休眠不再萌发，顶芽长到一定时间也会休眠，因此，如果需要扩大繁殖或者不移栽就需要继续促进其休眠芽的萌发，可重复步骤二、三、四的操作。

以上步骤中所用的WPM培养基成分包括：NH₄NO₃ 400mg·L^-1，KH₂PO₄ 170mg·L^-1，K₂SO₄990mg·L^-1，MgSO₄·7H₂O 370mg·L^-1，Ca(NO₃)₂·4H₂O 556mg·L^-1，CaCl₂·2H₂O96mg·L^-1，MnSO₄·4H₂O 22.5mg·L^-1，ZnSO₄·7H₂O 8.6mg·L^-1，CuSO₄·5H₂O 0.25mg·L^-1，H₃BO₃ 6.2mg·L^-1，Na₂MoO₄·2H₂O 0.25mg·L^-1，FeSO₄·7H₂O 27.8mg·L^-1，Na₂EDTA37.3mg·L^-1，烟酸(VB₃)0.5mg·L^-1，VB₁ 1mg·L^-1，VB₆ 0.5mg·L^-1，甘氨酸2mg·L^-1，肌醇100mg·L^-1。

表1水曲柳休眠芽萌发激素组合

培养基编号	TDZ(mg·L<sup>-1</sup>)
		WY1	0.4
WY2	0.6
		WY3	0.8

表2水曲柳休眠芽萌发的情况

表3水曲柳离体芽伸长的情况

培养基	接种丛芽数	成活率(％)	苗高平均值
				A6	35	100	1.68
Z1	24	75	2.65

与现有技术相比，本发明通过快速打破水曲柳组培苗休眠芽并成功离体繁殖的方法，能在短时间内快速打破芽的休眠状态，并离体再生为水曲柳植株，并且此方法可以循环培养。该方法的建立一方面，可用于濒危植物水曲柳的保育，提高水曲柳的种群数量；其次，萌发与伸长循环培养，简单、可控、易操作，减少成本，易于工厂化可持续的循环培养生产。

以上所述仅是对本发明的较佳实施方式而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

Claims (2)

1.一种快速打破水曲柳组培苗休眠芽并成功离体繁殖的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)材料选择：选取带有休眠芽的组培苗，或者将组培苗分成带芽点的茎段；

(2)适合休眠芽萌发的光照条件：将步骤(1)中的材料接种到WYn固体或液体培养基中，光照或者黑暗培养，温度25℃，其中光照培养强度为0-80μmol·m^-2·s^-1，光照时间为0-14h/d，液体震荡转速为20-120r/min，培养1-2个继代；

(3)萌芽离体伸长培养：将步骤(2)中萌发的芽带少许茎段切下，接种于A6(WPM+0.01-3.0mg·L^-1 TDZ+0.1-4.0mg·L^-1 GA3+0.1-5.0mg·L^-1 BA+蔗糖10-30g·L^-1+琼脂5.6g·L^-1，pH5.8)或Z1(WPM+0.01-3.0mg·L^-1 TDZ+0.1-8.0mg·L^-1 BA+蔗糖10-30g·L^-1+琼脂5.6g·L^-1，pH5.8)培养基中，光照强度为10-80μmol·m^-2·s^-1，光照时间为14h/d，温度25℃，增殖伸长培养，1-3个继代，获得水曲柳植株；

(4)循环培养：获得的水曲柳植株继续繁殖可重复步骤(1)-(3)的操作。

2.根据权利要求1所述的一种快速打破水曲柳组培苗休眠芽并成功离体繁殖的方法，其特征在于：在所述步骤(2)中，所使用的WYn培养基为WPM+0.05-3.0mg·L^-1 TDZ，10-30g·L^-1蔗糖，pH为5.8，固体培养基中含有5.6-8.0g·L^-1琼脂。

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