CN112074298A - Langerin+细胞靶向 - Google Patents

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奥利弗·塞茨
冈纳·巴切姆
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Abstract

本发明涉及用于特异性分子靶向Langerin+细胞的介质在将靶向的运载物递送至Langerin+细胞中的用途，其中所述介质能够与Langerin+细胞特异性结合，所述介质包含(a)至少一种载体和(b)至少一种基于糖部分的缀合物，还涉及包含本发明介质的药物组合物和用途。

Description

Langerin+细胞靶向
技术领域
本发明涉及一种特异性分子靶向Langerin+细胞的介质(vehicle)将靶向的运载物(cargo)递送至Langerin+细胞中的用途，其中所述介质能够与Langerin+细胞特异性结合，所述介质包含(a)至少一种载体(carrier)和(b)至少一种基于糖部分的缀合物。本发明还涉及相应的药物和诊断组合物，以及包含本发明介质的用途和涉及所述介质的方法。
背景技术
皮肤是覆盖脊椎动物的软组织。在哺乳动物中，皮肤是皮肤系统(integumentarysystems)的器官，包含多层外胚层组织，包括：表皮，提供防水并起到抵抗感染的作用；真皮，是由成纤维细胞构成的细胞贫乏层，成纤维细胞产生含有蛋白聚糖以及缠绕的胶原纤维和弹性纤维的细胞外基质，这两层由基底膜隔开，基底膜是一种纤维片层，控制着细胞和分子在真皮和表皮之间的运输并为重塑或修复过程提供必要的因子。于是，皮肤与外界交接，并因此不仅暴露于物理应力而且还暴露于各种环境抗原，包括化学物质、细菌和病原体。
因此，皮肤免疫系统必须准备好检测并区分多种多样的抗原，并且必须能够诱导适当的反应，例如致耐受性或保护性免疫应答。为了履行该功能，皮肤含有代表免疫应答关键调节因子的树突细胞(DC)异质群体。树突细胞通常被定义为协调先天性和适应性免疫之间相互作用的抗原呈递(presenting)细胞群体，并且是唯一能够诱导初次免疫应答的细胞。因此，DC是免疫治疗策略中一个令人感兴趣的靶标。在人类中已经描述了几种DC类型，并可根据它们的组织分布进行分类。这些DC类型中的一些已被认识到它们通过MHC-1交叉呈递外源性肿瘤相关抗原以及有效触发初始CD8+T细胞的能力。皮肤树突细胞在防护主体抵抗病原体入侵方面发挥关键作用，而且限制了附带的组织损伤。此外，它们与外周耐受破坏有关，导致慢性免疫介导的炎性疾病，例如变应性接触性皮炎和银屑病(Clausen和Stoitzner，2015，Frontiers in Immunology，6，论文534)。
DC可以分为常规DC和浆细胞样DC(pDC)。健康的皮肤不含或含有很少的pDC，pDC只进入发炎的皮肤以通过I型干扰素促进伤口愈合或介导TLR7刺激后发生的促炎反应，例如在银屑病期间。在稳定状态下，驻留在皮肤中的常规DC通常不是无活性的，而是–作为未成熟的细胞–不断探测其环境的侵入病原体并持续抽查自身和环境抗原。成熟后，DC迁移至皮肤引流淋巴结，并与周围的角质形成细胞分离。在它们迁移到局部淋巴结的T细胞区域期间，细胞上调MHC/肽复合物的表面表达，以识别抗原特异性初始T细胞并与之相互作用。在遇到逃脱中枢耐受的潜在自身反应性T细胞或识别源自于无害外来抗原的肽的T细胞后，这些DC诱导T细胞无反应性或缺失T细胞耐受(deletional T cell tolerance)(致耐受功能)。
另外，在淋巴器官中DC的T细胞扫描期间，即在缺乏关联抗原的情况下，频繁的T细胞–DC接触诱导T细胞的基础活化水平，这是对随后在炎症期间遇到外来抗原作出快速响应所需的。病原体入侵与促炎信号一起通常会驱动皮肤树突细胞完全功能成熟。除体内稳态分化程序外，所述细胞现在还上调共刺激分子、特别是促炎细胞因子的表达。这些共同促进了初始的抗原特异性T细胞的克隆扩充，并指令T细胞获得专门为消除入侵病原体而定制的适当效应子功能(致敏功能)。因此，外周的未成熟DC具有前哨功能，并能够进行抗原捕获、抗原加工和肽-MHC结合。它们还具有迁移功能，并提供抗原向淋巴结转运。在那里，DC-T细胞相互作用引起高表面MHC I和II/肽复合物，这些复合物最终导致Th1/Th2/Th17指令、或T细胞缺失和无变应性、或细胞毒性T淋巴细胞(CTL，T杀伤细胞)活化。
根据目前的报道(Doebel等人，2017，Trends Immunol，38，11，817-828)，皮肤中的树突细胞群可以分为若干DC亚组。树突细胞可以是表皮朗格汉斯细胞(LC)和真皮DC。真皮DC构成Langerin+和Langerin-亚型，即在其表面上表达或不表达C型凝集素Langerin(也称为CD207)的细胞。Langerin+真皮DC根据CD103、即整联蛋白αE(ITGAE)的表达，进一步分为CD103+和CD103-群(Yamazaki和Morita，2013，Frontiers in Immunology，4，论文151)。进一步分成亚组将DC定义为Langerin+CD11blow、Langerin-CD11b-和Langerin-CD11b+群体(Yamazaki和Morita，2013，Frontiers in Immunology，4，论文151)。
已知Langerin参与病原体相关和自身相关聚糖两者以及肝素样寡糖的Ca2+依赖性识别(Munoz-Gracia等人，J.Am.Chem.Soc.2015，137，12，4100-10)。而且，Langerin与聚糖、例如包括硫酸角质素在内的半乳糖-6-硫酸化寡糖结合(Tateno等人，Journal ofBiological Chemistry，2010，283，9，6390-6400)。由于Langerin表现出的表达谱高度局限于主要在皮肤中的特定DC亚型，它代表了疫苗开发或建立新型免疫疗法的诱人靶标。
因此，皮肤是疫苗或其它免疫疗法的特别吸引人的进入点，这是因为驻留在最上层中的Langerin表达DC使得能够局部应用具有潜在全身性反应的疫苗或药物且无需使用针头。可能会遵循的策略包括：提供癌症疫苗，针对病毒或细菌感染的预防性疫苗，针对变态反应的免疫疗法，治疗诸如狼疮等自身免疫性疾病，或在皮肤移植的情形下使用再生方法。
然而，由于C型凝集素的碳水化合物结合位点是高度溶剂暴露且亲水的，很难特异性靶向Langerin+DC。因此，与单糖和寡糖的相互作用通常以毫摩尔范围内的低亲和力为特征。此外，由于单个C型凝集素结合若干单糖或寡糖且反之亦然，识别过程非常杂乱。在这种情形下，Aretz等人在2014年指出，对21种X射线结构进行基于结构的计算机分析确证了将C型凝集素归类为不可成药的(undruggable)或挑战性的靶标。对C型凝集素仅鉴定出与碳水化合物结合位点相邻的可成药的二级结合口袋的有限治疗相关性(Aretz等人，2014，FrontImmunol，5，论文323)。另一方面，存在基于离体方法的成功途径，所述离体方法中从患者分离出祖树突细胞、离体分化并随后负载SPIO粒子(Verdijk等人，2006，Int.J.Cancer，120，978-984)。然而，由于特别是细胞缺乏从注射部位迁移到靶组织中并且细胞分化差，这种计划遭受到高成本和低功效。其它替代方法基于抗体的使用。例如，在Flacher等人，2010，Journal of Investigative Dermatology，130，755-762中，描述了在表皮朗格汉斯细胞中从Langerin靶向抗体捕获呈递的抗原的方法。然而，胞吞后抗体本身不会从受体中溶解出来，因此可能限制所述细胞的吸收能力。而且，由于所述抗体的高亲和力，它也可能与表达该受体非常低的细胞结合。
因此，需要一种方法，其允许有效靶向特别是皮肤中的Langerin+树突状细胞，并进一步提供有效且可靠的物质例如抗原进入细胞和在细胞中后续加工。
发明目的和内容
本发明解决了这些需求，并提供了一种用于特异性分子靶向Langerin+细胞的介质在将靶向的运载物递送至Langerin+细胞中的用途，其中所述介质能够与Langerin+细胞特异性结合，所述介质包含(a)至少一种载体和(b)至少一种通式(I)的缀合物
Figure GDA0002759246180000041
其中
(i)R独立地选自：
取代或未取代的烷基、烯基、炔基、环烷基、C1-C8烷基环烷基、芳基、C1-C8烷基芳基、杂芳基、C1-C8烷基杂芳基、联芳基和C1-C8烷基联芳基；
其中取代基独立地选自：
--N(Ra)(Rb)，-ORa，-SRa，-C(O)Ra，-C(O)ORa，-C(O)N(Ra)(Rb)，-N(Ra)C(O)Rb，-N(Ra)S(O)2Rb，-OS(O)2Ra，卤素，-NO2，-CN，-NC，-N3，-NCO，-OCN，-NCS，-SCN，取代或未取代的烷基、烯基、炔基、芳基和杂芳基；
其中Ra和Rb独立地选自：氢，取代或未取代的C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基、C3-6环烷基、芳基-C1-5烷基、杂芳基-C1-5烷基、芳基、杂芳基；
(ii)R’独立地选自：
-ORa和-NHS(O)2Ra，
其中Ra如上定义；并且其中
(iii)A-D-B-L是接头基团，其将式(I)的葡萄糖衍生物与所述载体或与所述载体的一部分共价结合。
发明人惊奇地发现，如上所述的介质与Langerin+细胞特异性结合并有效递送运载物、即不同大小和性质的物质进入Langerin+细胞，所述细胞进而可在其表面上呈递内化的物质，例如抗原。Langerin特别适合于受体介导的摄取粒子进入内体区室，这由于通过靶向的细胞表面上的MHC I分子交叉呈递抗原而启动适合于癌症和抗病毒治疗的CD8+T细胞免疫应答。本发明的主要挑战实际上是开发适合结合C型凝集素Langerin的配体结构。实际上，迄今为止，据Ernst和Magnani，2009，Nat Rev Drug Disc，8(8)，661-77中对碳水化合物结合蛋白的一般性报道，对朗格汉斯细胞特异性标志物Langerin——它是一种糖结合蛋白——的结合位点的寻址失败，主要是由于复杂的结构和药物样化合物的低可及性。正确选择结合口袋和在所述细胞的内体区室中释放运载物的相关机制是成功的关键因素。发明人还发现，当运载物在所述细胞中的酸度和钙浓度的影响下被释放时，受体可以有利地将更多的粒子带入细胞中。本发明提供的Langerin配体，作为上述介质的一部分，从合理的配体设计中显露出来，满足耐久性、可扩展性、合成可及性、对靶受体的足够的亲和力和特异性，以及足够的亲水性以避免与所述载体不必要的相互作用，例如表面聚集。使用计算机辅助方法以及基于片段的药物设计的创新方法来得到本文所述的配体结构。
在进入Langerin+细胞的运载物递送方法中使用上述有利的配体首次允许采用靶向的经皮和皮内剂型，这显著增加患者的依从性(由于无针应用性)并同时允许更便宜的疫苗。通过特异性靶向特定的树突细胞，现在有可能在体内对所引入的运载物、例如作为治疗性或预防性疫苗发动免疫应答，或降低免疫应答，例如由于诱导外周或中枢耐受。另一个有利的应用是直接调节如在一些自身免疫性疾病中和在朗格汉斯细胞组织细胞增多症、即朗格汉斯细胞癌变中出现的失调的朗格汉斯细胞功能。因此，迄今为止造成问题的皮肤环境，通常包含若干个竞争性的细胞群，其复杂性经常降低疫苗接种方法的功效，因为例如活性成分未能到达预定的树突状细胞并甚至可能因无意包含在免疫细胞中而产生不想要的副作用，但现已成为免疫学和医学操作的一流且非常有吸引力的领域。
另外，由于本发明的多用途的运载物-载体概念，其基于包含创新性配体的缀合物和载体的偶联来实施，使得将多种多样类别的不同物质(运载物)引入Langerin+细胞成为可能。因此，不仅可以将如现有技术所述的与抗体偶联的蛋白质引入所述细胞，而且还可以将诸如核酸例如DNA或RNA、糖基化元件、刺激物、独立肽或任何低分子化合物的物质引入细胞。这使得大大增加在细胞和免疫调节以及引发免疫应答方面的可变性。此外，它是唯一允许同时递送不同分子并由此可调节适应性免疫系统的不同分支、即抗体和细胞毒性T淋巴细胞的系统。
而且，本发明的运载物-载体概念要求介质(配体-缀合物加上载体)和运载物的高度灵活性和适应性。这导致在产品开发期间快速且成本有效的适应和优化选项。其它系统、诸如基于抗体的系统不太灵活，并且由于开发和生产时间长，产生了高昂的成本。因此，靶向递送与皮肤施用相结合，不仅通过减少药物负荷增加了效率和安全性，而且还可以实现更好的配量和避免全身性药物施用。此外，本发明的主题允许提供治疗选项而不会诱导不利的抗体应答。本发明所设想的佐剂和抗原的共同施用也允许避免全身性激活免疫系统。而且，本发明允许针对相同或不同靶标的不同运载物的组合，这可以通过不同途径放大免疫应答的调节。
在本发明的一个优选实施方案中，如上文定义的本发明的介质包含通式(I)，其中R’是-OH、-OCH3、-OCH2CH3或-NHS(O)2Ra。
在另一个优选实施方案中，如上描述的所述介质包含通式(I)，其中R’是-OH或-NHS(O)2Ra。
在一个进一步的优选实施方案中，如上描述的所述介质包含通式(I)，其中R’是–OH、-NHS(O)2CH3或N-甲苯磺酰基。
在又一个优选实施方案中，如上描述的所述介质包含通式(I)，其中R’是-OH。
在一个更进一步的优选实施方案中，如上描述的所述介质包含所述通式(I)，其中R独立地选自：
取代或未取代的烷基、环烷基、C1-C8烷基环烷基、芳基、C1-C8烷基芳基、杂芳基、C1-C8烷基杂芳基、联芳基和C1-C8烷基联芳基。
在另一个优选实施方案中，如上描述的所述介质包含通式(I)，其中R独立地选自：
取代或未取代的C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C1-C3烷基C3-C6环烷基、C6-C14芳基、C1-C3烷基C6-C14芳基、杂芳基、C1-C3烷基杂芳基、联芳基和C1-C3烷基联芳基。
在一个特别优选的实施方案中，如上描述的所述介质包含通式(I)，其中R独立地选自：
取代或未取代的环己基、苯基、苄基、联苯基、吡啶基和噁唑基。
在又一个优选实施方案中，如上描述的所述介质包含通式(I)，其中R是取代或未取代的苯基。
在一个特别优选的实施方案中，如上描述的所述介质包含通式(I)，其中R的取代基独立地选自：
-N(Ra)(Rb)，-ORa，-SRa，-C(O)Ra，-C(O)ORa，-C(O)N(Ra)(Rb)，-N(Ra)C(O)Rb，-N(Ra)S(O)2Rb，-OS(O)2Ra，卤素，-NO2，-CN，-NC，-N3，-NCO，-OCN，-NCS，-SCN，取代或未取代的烷基、烯基、炔基、芳基和杂芳基，
其中Ra和Rb独立地选自氢和C1-2烷基。
在另一个优选实施方案中，如上描述的所述介质包含通式(I)，其中R的取代基独立地选自：
-NH2，-OH，-OCH3，-C(O)CH3，-NHC(O)CH3，-F，-Cl，-Br，-NO2，-CN，C1-C4烷基和苯基。
在一个进一步的优选实施方案中，如上描述的所述介质包含所述通式(I)，其中所述苯基是单取代的、二取代的或三取代的，并且所述苯基的取代基独立地选自：
-NH2，-OH，-OCH3，-C(O)CH3，C(O)NH2，-C(O)NHCH3，-CH2OH-NHC(O)CH3，-F，-Cl，-Br，-NO2，-CN，C1-C4烷基，萘基和苯基。
在另一个优选实施方案中，如上描述的所述介质包含通式(I)，其中所述苯基在对位单取代，并且所述苯基的取代基独立地选自：
-NHC(O)CH3，-CN，-CH3和苯基。
在又一个优选实施方案中，如上所述的缀合物是下面式(I-1)或式(I-2)的缀合物：
Figure GDA0002759246180000071
在一个更进一步的优选实施方案中，如上所述的缀合物是下面式(I-3)至式(I-15)中任一个的缀合物：
Figure GDA0002759246180000072
Figure GDA0002759246180000081
Figure GDA0002759246180000091
在一个特别优选的实施方案中，如上提到的所述A-D-B-L接头基团是由间隔基A-D-B和连接葡萄糖衍生物与载体的接头L组成的基团。特别优选所述接头L包含合成聚合物或天然聚合物中的一种或多种，或这些聚合物的一种或多种单个单元，或其组合。
根据本发明的其它优选实施方案，如上提到的所述合成聚合物选自：饱和和不饱和烃聚合物；聚胺；聚酰胺；聚酯；聚醚，聚乙二醇，聚丙二醇；嵌段共聚物，以及泊洛沙姆。
根据本发明的另一组优选实施方案，如上提到的所述天然聚合物选自碳水化合物、修饰的碳水化合物、肽、修饰的肽、脂质和修饰的脂质。
在一个特别优选的实施方案中，如上所述的本发明的介质包含通式(I)，其中
D是与通式(D-1)的A和B连接的间隔基，
A-(CH2)c-(CH2-O)c1-(CH2-CH2-O)c2-(CH2)c3-B (D-1)，
其中D通过B与接头L连接，其中B选自：
-O-，-S-，-C(Rc1)(Rc2)-，-S-S-，-N(Rc1)-，-C(O)-，-C(Rc1)＝N-，-N＝N-，-OC(O)-，-C(O)O-，-C(O)N(Rc1)-，-N(Rc1)C(O)-，-N(Rc1)C(O)N(Rc2)-，-N(Rc1)C(S)N(Rc2)-，-N(Rc1)C(O)O-，-OC(O)N(Rc1)-，-环己烯-和-三唑-；
其中Rc1和Rc2独立地选自：氢，取代或未取代的烷基、烯基、环烷基、C1-C8烷基环烷基、芳基、C1-C8烷基芳基、杂芳基和C1-C8烷基杂芳基；
D通过A与葡萄糖衍生物连接，其中A选自：-O CH2-，-S-，-NH-，-NHC(O)-，-OC(O)-，-环己烯-和-三唑-；并且
c是选自0至20的整数，c1是选自0至20的整数，以及c2是选自0至20的整数，c3是选自1至20的整数，如果A是-CH2-，则c3是选自0至20的整数。
在一个进一步的优选实施方案中，如上描述的所述介质包含通式(I)，其中接头L是下面通式(L-1)的接头
Figure GDA0002759246180000101
其中
U1是通过B与间隔基D连接的基团，其中U1选自-CH2-、-CH＝CH-或-C≡C-；
Z1是将所述接头与所述载体结合的部分，选自：-O-，-S-，-N(Rd)-，-C(Rd)(Re)-，-RdC＝CRe-，-C(O)-，-C(O)O-,-OC(O)-，-C(O)S-，-C(O)N(Rd)-，-N(Rd)C(O)-，-N(Rd)C(O)N(Re)-，-N(Rd)C(S)N(Re)-，-N(Rd)C(O)O-，-OC(O)N(Rd)-，-环己烯-，-三唑-，-NHS(O)2-，-S(O)2-，-OP(O)(H)O-，或-OP(O)(OH)O；
其中Rd和Re独立地选自：氢，取代或未取代的C1-32烷基、C2-32烯基、C3-8环烷基、芳基、C1-C8烷基芳基、杂芳基、C1-C8烷基杂芳基；并且
d1至d5各自是0至50的整数，d6是1至50的整数。
在一个更进一步的优选实施方案中，如上提到的所述A-D-B-L接头基团是主链中所含的碳原子、氮原子和氧原子总数为至少4的分子链。
在本发明的一个进一步实施方案中，如上提到的所述A-D-B-L接头基团是主链中所含的碳原子、氮原子和氧原子总数在4个原子至600个原子之间的分子链。
在又一个优选实施方案中，所述A-D-B-L接头基团是主链的长度在约0.4nm至约400nm之间的分子链。
在一个进一步的优选实施方案中，如上文描述的所述介质包含至少一种载体，其中所述至少一种载体是软粒子。
在另一个优选实施方案中，所述软粒子选自脂质体、noisome、胶束、sequessomeTM和传递体(transferosome)，其中所述缀合物通过Z1直接与所述软粒子的一部分结合，其中所述软粒子的一部分是：脂质，修饰的脂质例如磷脂、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油酰基-3-磷酸乙醇胺(DSPE)，膜脂质，或修饰的磷脂酰胆碱。
在一个进一步的实施方案中，所述软粒子可以是含有一种或多种类型脂质的软粒子，例如脂质体。在一个实施方案中，所述缀合物可以与所述软粒子的一部分结合，所述部分例如形成脂质体的一部分的任何类型的脂质。
在另一个实施方案中，与缀合物结合的脂质和未与缀合物结合的脂质的比率为约1:15、1:20、1:25、1:50、1:100、1:150、1:200，优选1:20。
在一个特别优选的实施方案中，如上文定义的本发明的所述缀合物与软粒子载体的一部分结合，从而产生下式(II)：
Figure GDA0002759246180000111
其中n是0至150的整数。
在一个进一步的优选实施方案中，所述至少一种载体选自纳米粒子、肽、蛋白质、毒素、树枝状聚合物、富勒烯和碳纳米管，其中所述缀合物通过Z1直接与所述载体结合，或者其中所述缀合物通过Z1与所述载体另外的间隔元件结合。
在另一个优选实施方案中，所述另外的间隔元件是天然聚合物或合成聚合物，例如，如上文定义的。
在又一个优选实施方案中，所述脂质体是双层磷脂脂质体。在一个特别优选的实施方案中，所述脂质体的尺寸为30nm至250nm。
在一个进一步的优选实施方案中，所述脂质体包含附加组分或与附加组分缔合。特别优选所述附加组分是胆固醇。在某些实施方案中，所述附加组分、例如胆固醇的量可以变化，优选量为约20mol％至50mol％。更优选地，所述附加组分的量为约40mol％。
在一个进一步的优选实施方案中，如上所提到的所述纳米粒子是金纳米粒子、银纳米粒子或铁纳米粒子。特别优选所述纳米粒子具有5nm至1000nm的尺寸。
在一个更进一步的优选实施方案中，所述载体包含运载物或与运载物缔合。
在一个特别优选的实施方案中，所述运载物位于载体内和/或与载体的外部联接和/或整合在载体的单层或双层结构中。
在又一个优选实施方案中，如上所提到的所述的特异性分子靶向包括所述缀合物和存在于Langerin+细胞上的受体之间的相互作用。
在一个特别优选的实施方案中，存在于树突细胞上的所述受体是C型凝集素受体(CLR)Langerin(CD207)。
在一个优选实施方案中，所述介质与树突细胞的所述特异性结合是基于在基于细胞的测定中以比对照高至少2倍、4倍、8倍或16倍的特异性与C型凝集素受体(CLR)Langerin(CD207)结合，所述基于细胞的测定包括在相同条件下将脂质体引入呈递重组Langerin的Raji B细胞、呈递重组DC-SIGN的Raji B细胞(对照1)和不呈递C型凝集素受体的Raji野生型B细胞(WT，对照2)。
在一个进一步的优选实施方案中，通过动态光散射(DLS)测量，所述介质的平均尺寸为2nm至1000nm。
在另一个方面，本发明涉及一种组合物将靶向的运载物递送至Langerin+细胞中的用途，所述组合物包含至少一种如上定义的特异性分子靶向Langerin+细胞的介质，所述介质包含如本文定义的运载物或与所述运载物缔合，以及添加剂。
在一个优选实施方案中，所述添加剂是二价离子、佐剂、或促进与C型凝集素受体(CLR)Langerin结合的因子。特别优选所述二价离子是Ca2+或Zn2+。
在另一个优选实施方案中，如上提到的所述组合物还包含溶剂或溶剂与其它化合物的组合。溶剂的优选示例是H2O、蔗糖水溶液、磷酸盐缓冲盐水、tricine缓冲液、HEPES缓冲液。在特定的实施方案中，溶剂与其它化合物的组合是前面提到的任何溶剂与DMSO的组合。在一个具体实施方案中，DMSO的浓度为10％。
在又一个优选实施方案中，所述组合物包含约1mol％至10mol％、优选约4mol％至6mol％、更优选4.75mol％至5mol％的量的如上定义的介质。
在一个进一步的方面，本发明涉及一种用于将靶向的运载物递送至Langerin+细胞中的方法，所述方法包括使如上定义的包含如本文定义的运载物或与所述运载物缔合的用于特异性分子靶向Langerin+细胞的介质、或如上定义的组合物与Langerin+树突细胞接触。
在一个优选实施方案中，所述运载物选自小分子、肽、蛋白质、细胞毒性物质、核酸、色素、染料、金属、放射性核素、病毒、修饰的病毒、病毒载体(viral vector)、接种物、质粒和/或多组分系统。所述多组分系统优选是包含不同组分的用于基因组编辑的系统。特别优选所述基因组编辑系统是CRISPR/Cas系统。
在如上所述的用途或方法的另一个优选实施方案中，所述运载物是药物活性化合物或免疫活性化合物，其(i)能够在体内引起免疫反应，(ii)是免疫调节剂，(iii)是免疫耐受诱导剂或(iv)是细胞功能的抑制剂，例如凋亡抑制剂。
在如上所述的用途或方法的一个进一步的优选实施方案中，所述运载物包含以下、基本由以下组成或由以下组成：(i)癌症抗原或表位，或包含癌症抗原或表位，(ii)自身免疫性疾病抗原或表位，或包含自身免疫性疾病抗原或表位，(iii)细菌抗原或包含细菌抗原或表位，(iv)病毒抗原或包含病毒抗原或表位，(v)寄生虫抗原或包含寄生虫抗原或表位，或(vi)变应原、或变应原的表位、或者包含变应原或变应原的表位。
在另一个方面，本发明涉及一种药物组合物，其包含如上定义的介质、或如上定义的组合物，其中所述载体包含药物活性运载物或与所述运载物缔合，以及任选的药学上可接受的载体物质或药物佐剂。
在一个优选实施方案中，所述药物组合物适合于口服、静脉内、局部、角膜、鼻、皮下、皮内、经皮施用、适合于疫苗接种或适合于经毛囊施用。
在另一个优选实施方案中，所述药物组合物作为贴剂、作为液体、乳膏、软膏、糊剂、凝胶、洗剂、胶带、薄膜、舌下剂、颊含剂、片剂、喷雾剂、栓剂、疫苗或以微针的形式提供。特别优选的贴剂形式是纳米贴剂或水凝胶贴剂。
在一个更进一步的优选实施方案中，所述药物组合物通过医用装置例如针头、疫苗接种枪、膏药或吸入器施用。
在一个特别优选的实施方案中，所述药物组合物用于治疗或预防癌症、自身免疫性疾病、细菌感染、病毒感染、或移植物抗宿主病、局部或全身性炎症、变态反应、或用于减敏。
在一个进一步的方面，本发明涉及一种诊断组合物，其包含如上定义的介质、或如上定义的组合物，其中所述载体包含药物活性运载物或与所述运载物缔合，以及任选的药学上可接受的载体物质或药物佐剂。
在一个优选实施方案中，所述诊断组合物用于诊断、检测、监测或预后癌症、自身免疫性疾病、细菌感染、病毒感染、寄生虫感染或移植物抗宿主病、局部或全身性炎症、或变态反应。
在一个进一步的方面，本发明涉及一种鉴定用于疾病的Langerin+树突细胞靶向疗法的合适剂量的方法，所述方法包括：(a)使Langerin+细胞群体与能够被引入所述细胞的化合物接触，(b)确定所述化合物参入的细胞的数量；(c)通过优选在1-3天时间后比较化合物参入的细胞的数量和起始群体，任选通过另外将化合物参入的细胞的数量或它们的状态与观察到的文献结果相关联，来确定所述化合物的合适剂量。
在另一个方面，本发明涉及一种医用试剂盒，其包含至少一种选自如上定义的介质和/或如上定义的组合物的元件，其中所述载体包含药物活性运载物或与所述运载物缔合，以及任选的带有说明书的印刷品。
在一个更进一步的方面，本发明涉及一种疫苗，其包含如上定义的介质或如上定义的组合物，其中所述载体包含接种物运载物或与接种物运载物缔合。
在一个优选实施方案中，所述疫苗用于治疗或预防癌症、自身免疫性疾病、细菌感染、病毒感染、寄生虫感染或移植物抗宿主病。
在一个进一步的方面，本发明涉及在对象中诱导对抗癌症、细菌感染、病毒感染、寄生虫感染的免疫应答的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗有效量的如上定义的介质，其中所述载体包含药物活性运载物或与所述运载物缔合，如上定义的组合物，其中所述载体包含药物活性运载物或与所述运载物缔合，如上定义的药物组合物，或如上定义的疫苗。
在最后的方面，本发明涉及一种治疗或预防癌症、自身免疫性疾病、细菌感染、病毒感染、寄生虫感染或移植物抗宿主病、局部或全身性炎症、变态反应、或用于减敏的方法，所述方法包括向对象施用治疗有效量的如上定义的介质，其中所述载体包含药物活性运载物或与所述运载物缔合，如上定义的组合物，其中所述载体包含药物活性运载物或与所述运载物缔合，如上定义的药物组合物，或如上定义的疫苗。
在一个优选实施方案中，所述施用是口服、角膜、鼻、静脉、局部、皮下、皮内、经皮施用、疫苗接种或经毛囊施用。
因此，需要一种方法，其允许有效靶向特别是皮肤中的Langerin+树突细胞，并进一步提供有效且可靠的物质例如抗原进入细胞和在细胞中的后续加工。
附图说明
图1显示通过CLR特异性抗体检测的Hek293细胞质膜处稳定的人Langerin表达。同种型染色(灰色)用作阴性对照。将Langerin染色的荧光强度(深灰色)与野生型细胞的本底荧光(浅灰色)进行比较，并绘制成直方图。
图2显示了通过CLR特异性抗体检测的Raji细胞质膜处稳定的受体表达。同种型染色用作阴性对照。将荧光强度与野生型细胞的本底荧光进行比较，并绘制成直方图。
图3显示了FITC-BSA包封并递送至Langerin表达细胞。图3(A)显示了尺寸排阻和超速离心法从包封的抗原中去除游离抗原的结果。用酶标仪(plate reader)测量FITC-BSA荧光。它还显示了在基于细胞的测定中所利用的FITC-BSA包封的脂质体。将脂质体在37℃下温育2小时，并通过流式细胞术测量FITC和Alexa647的MFI值(图3(B))。图3(C)示出了在不同的纯化方法之后如何通过DLS测量脂质体的质量。分析了尺寸和ζ电势(ZP)。图3(D)显示了FITC包封的脂质体，其与Langerin+Hek293细胞一起在37℃下温育6小时。用DAPI对细胞核染色，并通过显微术分析细胞。
图4显示了通过尺寸排阻或超速离心纯化的FITC-BSA包封的脂质体。纯化的脂质体随后在基于细胞的测定中测试。16μM脂质体与hLangerin+Raji细胞一起在37℃下温育2小时。通过流式细胞术分析细胞的FITC染色。MFI值经过基线校正。
图5报道了用测试蛋白FITC-BSA优化蛋白包封。图5(A)中用于使脂质薄膜再水合的初始FITC-BSA浓度和图5(B)中再水合的脂质膜的初始脂质体浓度发生变化，以检测优化的包封率。在图5(C)中，提供了质量报告，包括尺寸和ζ电位(ZP)，通过DLS对它们进行分析。超速离心后用酶标仪计算包封率。计算每1mM脂质体包封的FITC-BSA抗原(AG)。
图6显示了FITC-BSA包封的脂质体的剂量依赖性内化和动力学速率。图6(A)中显示了FITC-BSA包封的脂质体的剂量依赖性内化。Alexa647共配制的脂质体染料与FITC-BSA的荧光素信号相比较。图6(B)中显示了FITC-BSA包封脂质体的动力学研究。Alexa647共配制的脂质体染料与FITC-BSA的荧光素信号相比较。
图7描绘了免疫活性蛋白EBNA和免疫无活性对照蛋白PCNA的表达和包封。图7(A)中显示了His-tag纯化的PCNA和EBNA蛋白的FPLC色谱图。图7(B)中描绘了PCNA和EBNA纯化的蛋白的SDS-PAGE凝胶以及加载对照、流通(flow through)对照和洗涤对照。蛋白尺寸用蛋白梯确定。图7(C)中提供了通过DLS分析的配制的脂质体的质量报告，包括尺寸和ζ电位(ZP)。超速离心后用酶标仪计算包封率。计算每1mM脂质体包封的抗原(AG)。
图8描绘了PCL和EBNA通过靶向Langerin的脂质体递送至LC。包封FITC-PCNA和-EBNA的脂质体与表皮细胞悬液一起于37℃温育。脂质体温育后，用朗格汉斯细胞标志物包括CD45、HLA-DR、CD1a和Langerin染色细胞。此外，用活力染料(viability dye)eFluor 780染色细胞以鉴定活/死细胞(L/D)。通过流式细胞术分析表皮细胞悬液，并评价朗格汉斯细胞的脂质体和FITC染色。
图9显示了人Langerin靶向配体对CLR表达细胞的脂质体特异性。图9(A)显示，为了脂质体结合，将16μM非官能化和官能化的脂质体与稳定表达的Raji细胞在4℃温育1小时。洗涤后，通过流式细胞术直接分析细胞。用共配制的Alexa647染料分析脂质体结合。显示了一个代表性实验的MFI值，并通过t检验将值与本底信号比较(****p<0.0001，n＝3)。在图9(B)中，与Langerin+和DC-SIGN+细胞的脂质体结合与10mM EDTA或50μg/ml甘露聚糖竞争。绘制了一个代表性示例的MFI值(***p<0.001，****p<0.0001，n＝3，t-检验，两个代表性实验之一)。
图10显示了脂质体内化进入Langerin+Hek293细胞的显微术图像。将裸露的、Langerin靶向的和甘露糖缀合的脂质体与Langerin+Hek293细胞在37℃下温育2小时。细胞核用DAPI染色，细胞膜用亲脂性染料DiO染色。拍摄与Langerin靶向脂质体一起温育的Langerin+细胞的Z-stack图，显示不同焦点高度的细胞层。
图11描绘了Langerin靶向脂质体的结合和内化动力学。Langerin靶向脂质体在图11(A)中的结合和在图11(B)中的内化分别在4℃或37℃下的各种温育期后进行分析。图11(C)显示了与Langerin+细胞在37℃下温育24小时的各种浓度的Langerin靶向脂质体。
图12显示了通过显微术测量的脂质体内化动力学。Langerin靶向脂质体与hLangerin+和野生型Hek293细胞温育不同时间点。使用针对Alexa647的高PMT电压和低PMT电压来检测早期温育点的非常敏感的事件以及晚期温育点的强荧光信号。
图13描绘了用GlcNTosyl官能化的脂质体靶向人Langerin表达型Raji细胞。所述靶向配体的配体摩尔比随脂质体而不同，将16μM脂质体在4℃下温育1小时。用相同的门控策略分析细胞，并在GraphPad Prism中以线性拟合绘制hLangerin+和野生型Raji细胞的荧光信号。
图14显示了含有不同配体摩尔比的Langerin靶向脂质体的结合和内化动力学。Langerin靶向脂质体在图14(A)中的结合和在图14(B)中的内化分别在4℃或37℃下的各种温育期后进行分析。图14(C)显示了各种浓度的Langerin靶向脂质体与Langerin+细胞在37℃下温育24小时。
图15显示了脂质体沿路进入内体区室。在图15(A)中，人Langerin表达型Hek293细胞与16μM靶向脂质体在37℃下温育2小时。温育后，用内体标志物包括Rab5、Rab11、EEA1和Lamp-1对细胞免疫荧光染色。然后用Alexa488缀合的第二抗体标记第一抗体。用DAPI染色细胞核，并通过显微术分析细胞。图15(B)显示了靶向脂质体与不同内体区室的共定位之间的相关性，通过Pearson R值表示。
图16显示了脂质体在早期时间点内化进入内体区室。用YFP-Rab9瞬时转染COS-7细胞。添加靶向脂质体并在37℃下温育不同时间段。温育后，将细胞固定，用第一抗EEA1抗体(兔，克隆C45B10)和Rab5(抗兔，克隆C8B1)(Cell Signaling Technology)针对EEA进行免疫荧光染色，用第一抗GFP抗体针对Rab9进行免疫荧光染色。使用Alexa488缀合的抗兔抗体进行二次染色。另外，通过DAPI染色细胞核。
图17描绘了官能化脂质体的时间依赖性细胞毒性研究。在图17(A)中，示例性地显示了针对未处理、DMSO处理和脂质体处理的细胞的门控策略。细胞在37℃下温育72小时。温育72小时后，将DMSO处理的细胞与50％DMSO一起温育3分钟。在FSC-A/SSC-A图中将活细胞和死细胞与细胞碎片进行区分。在FSC-A/FSC-H图中分辨出双重峰。然后在x轴上显示膜联蛋白-V-FITC染色和y轴上显示7-AAD染色的点图中分析单细胞，以确定早期和晚期凋亡效应。未处理的细胞用作阴性对照，DMSO处理的细胞代表阳性对照。在图17(B)中，分析每个象限的几个温育时间点的亲本频率(FoP)，并绘制成分组柱状图。在图17(C)中，分析了与Langerin+细胞一起温育的靶向脂质体和裸露脂质体的A647 MFI，以检测脂质体内化。
图18显示了Langerin靶向脂质体的剂量依赖性细胞毒性研究。在图18(A)中，示例性地显示了针对未处理、DMSO处理和脂质体处理的细胞的门控策略。细胞在37℃下温育72小时。温育24小时后，将DMSO处理的细胞与50％DMSO一起温育3分钟。在FSC-A/SSC-A图中将活细胞和死细胞与细胞碎片进行区分。在FSC-A/FSC-H图中分辨出双重峰。然后在x轴上显示膜联蛋白-V-FITC染色和y轴上显示7-AAD染色的点图中分析单细胞，以确定早期和晚期凋亡效应。未处理的细胞用作阴性对照，DMSO处理的细胞代表阳性对照。在图18(B)中，分析了最高为1mM的几种脂质体浓度。确定每个象限的亲本频率(FoP)，绘制成分组柱状图。在图18(C)中，分析了与Langerin+细胞一起温育的靶向脂质体和裸露脂质体的A647 MFI，以检测脂质体内化。
图19显示了对于相关Langerin多态性的脂质体活性。在图19(A)中，测试裸露脂质体和靶向脂质体与Raji wt细胞、表达wt人Langerin+的Raji细胞、N288D突变体、K313I突变体或N288D/K313I双重突变体的结合。将16μM脂质体在4℃下温育1小时。结合通过A647共配制的染料的MFI分析。数据相对wt Langerin+细胞归一化(***p<0.001，****p<0.0001，n＝3，t-检验，两个代表性实验之一)。图19(B)用PE缀合的抗人Langerin抗体(克隆DCGM4)测试Raji表达细胞的细胞外受体表达。MFI相对wt Langerin表达归一化(**p<0.01，***p<0.001，n＝3，t-检验，两个代表性实验之一)。图19(C)通过计算脂质体结合(A)与抗体染色(B)的倍数绘制相对脂质体结合图(***p<0.001，****p<0.0001，n＝3，t-检验；#不包括wtRaji细胞的数据，两个代表性实验之一)。图19(D)除脂质体结合外，还在37℃下追踪24小时的脂质体内化。直接绘制共配制的A647染料的MFI。
图20显示了通过MALDI-TOF对靶向配体负载的GFP的定量。
图21显示了缀合蛋白对比FITC-BSA包封的脂质体的结合和内在化。在图21(A)中，用Raji和Langerin+Raji细胞通过流式细胞术剂量依赖地测量在4℃和37℃下对官能化GFP的结合和摄取。在图21(B)中，GFP和脂质体与Langerin+Raji细胞一起温育各种时间点。在此，利用包封FITC-BSA的脂质体来比较FITC荧光与GFP荧光。
图22描绘了与甘露聚糖的结合竞争。在图22(A)中配体官能化的脂质体或GFP的结合与甘露聚糖竞争。将配体载体与Langerin+Raji细胞在37℃下温育4小时。在37℃下直接添加甘露聚糖以竞争结合和内化，或在4小时温育步骤后(在4℃洗涤后)添加甘露聚糖以去除细胞外结合的载体。(三次中的一个代表性实验，n＝3)。在图22(B)中将官能化的脂质体或GFP与Langerin+Raji细胞在37℃下温育30分钟。洗涤后，添加不同时间期的甘露聚糖或DPBS(带有Ca2+/Mg2+)。(四次中的一个代表性实验，n＝3)。
图23描绘了负载靶向配体的PMMA珠的流式细胞术分析显示与人Langerin表达型THP-1细胞的特异性结合。
图24显示了在表皮细胞悬液中靶向原代朗格汉斯细胞。在图24(A)中，从人皮肤样品制备表皮细胞悬液。随后将细胞与浓度为16μM的脂质体一起在37℃下温育1小时。作为对照，将10mM EDTA添加到细胞培养基中。脂质体温育后，用朗格汉斯细胞标志物包括CD45、HLA-DR、CD1a和Langerin染色细胞。此外，用活力染料eFluor 780染色细胞以鉴定活/死细胞(L/D)。通过流式细胞术分析表皮细胞悬液，并评价朗格汉斯细胞的脂质体染色。图24(B)：基于(A)的门控策略，分析了不同细胞亚组的裸露脂质体和靶向脂质体的MFI，所述细胞亚组包括CD45-，CD1a-、HLR-DR-，和CD1a+、HLR-DR+表达细胞。图24(C)：为了分析脂质体内化，在温育步骤之后或期间添加了EDTA。温育后添加的EDTA除去了细胞外结合的脂质体，因此反映了脂质体内化。而在温育步骤期间添加的EDTA防止脂质体结合并充当对照。为了防止受体内化，将细胞在4℃下温育。在图24(D)中，表皮细胞悬液用FITC缀合的抗CD1a抗体染色，并与靶向脂质体在37℃温育1小时。随后通过显微术分析细胞。
图25显示了通过Langerin靶向配体对朗格汉斯细胞的脂质体特异性。从人皮肤样品制备全皮肤细胞悬液。随后将皮肤细胞与浓度为16μM的脂质体在37℃下温育1小时。脂质体温育后，用朗格汉斯细胞标志物包括CD45、HLA-DR、CD1a和Langerin染色细胞。此外，用鉴定活/死细胞(L/D)的活力染料eFluor 780和用染色单核细胞和巨噬细胞的CD14抗体染色细胞。通过流式细胞术分析全皮肤细胞悬液，并评价各种细胞亚组的脂质体染色。
图26示意性地描绘了一种分子，其中缀合物的尾部区域(疏水部分)嵌入脂质双层结构中，而头部区域位于载体的外部，因此能够与受体相互作用。
图27展示了肝素启发的(heparin-inspired)针对人Langerin的拟糖靶向配体的设计。在图27(A)中，肝素衍生的单糖GlcNS被鉴定为拟糖配体设计的有利支架。GlcNS类似物的设计导致发现了拟糖靶向配体15。15在C1的β取向上带有乙氨基接头，用于与所述递送平台缀合。在整个研究过程中，20充当基于Man的参考分子。图27(B)：根据GlcNAc(PDB代码：4N32)的结合模式，假设C2中的小芳族取代基通过与K299和K313形成阳离子-π相互作用或与F315和P310形成π-π和H-π相互作用来增加亲和力。受体表面根据其亲脂性(亲脂：深灰色，亲水：浅灰色)形成对比度。图27(C)：19F R2滤波的NMR实验揭示，模型配体16的亲和力(Ki＝0.24±0.03mM)比基于Man的参考分子21(Ki＝10±1mM)增加了42倍。另外，16对DC-SIGN表现出令人鼓舞的特异性(Ki,DC-SIGN＝15±3mM)。图27(D)：在分析共振的15N HSQC NMR试验中，以快(KD,快＝0.23±0.07mM)和慢(KD,慢＝0.3±0.1mM)交换方案验证了16对Langerin的亲和力。
图28显示了拟糖靶向配体的结合模式分析。图28(A)和(B)：15N HSQC NMR实验揭示了对16的化学位移扰动(CSP)模式。滴定后，观察到快交换共振例如I250和E285以及包括Y251在内的慢交换共振。图28(C)：据对E285和K299观察的CSP所示，在Langerin与GlcNAc(PDB代码：4N32)复合物的X-射线结构上CSP作图证实了Ca2+依赖性结合模式。与用21滴定相比，Y251、I250和T314表现出相对CSP增加，而对K313则观察到降低。总体而言，表现出CSP增加的大多数残基可能与无法赋值的N307和F315有关。图28(D)：STD NMR实验有助于进一步验证16与Langerin之间形成的相互作用。在饱和时间tsat为0.4s时记录STD NMR谱，并放大8倍。由累积曲线(build-up curve)确定的表位提示由苯基取代基形成的强相互作用。相比之下，对乙酰化乙氨基接头观察到相对STD’0值低，符合溶剂暴露取向。图28(E)：将16对接到碳水化合物结合位点中以使来自15N HSQC和STD NMR试验的观察结果合理化。选择的对接位姿(docking pose)预测在苯基环和F315之间形成π-π相互作用以及在磺酰胺基团和N307之间形成氢键。接头显示高溶剂暴露。受体表面根据其亲脂性(亲脂：深灰色，亲水：浅灰色)形成对比度。
图29显示了所选化合物对DC-SIGN的构效关系和特异性。
图30显示了对硫酸化GlcNAc衍生物的Ki确定。通过19F R2-滤波的NMR对肝素衍生的GlcNAc衍生物进行Ki确定，揭示了硫酸化模式对单糖亲和力的影响。获得的KI值在图39中给出。
图31显示了对GlcNS类似物1至5的Ki确定。竞争性结合实验用于确定GlcNS类似物文库的亲和力。获得的KI值在图39中给出。
图32显示了对Man类似物21的KD确定。图32(A)和(B)：15N HSQC NMR实验用于验证对2获得的Ki值。在参考光谱中检测到的指定共振被突出显示(灰色)。图32(C)：选择表现出快化学交换并且CSP大于0.06ppm的指定共振用于确定KD值。获得的KD值在图29中给出。
图33显示了对GlcNS类似物2的KD确定。图33(A)和(B)：15N HSQC NMR实验用于验证对2获得的Ki值。在参考光谱中检测到的指定共振被突出显示(灰色)。图33(C)：选择表现出快化学交换并且CSP大于0.04ppm的指定共振用于确定KD值。图33(D)：另外，包括K299和T314在内的一组残基表现出慢交换现象。对于这些残基，利用与Langerin的游离态和结合态相对应的共振积分Vf和Vb来确定KD值。获得的KD值在图29中给出。
图34显示了对GlcNS类似物2、16和Man类似物21的15N HSQC NMR结合模式分析。图34(A)至(C)：据对E285和K2999,10观察的CSP所示，在Langerin(PDB代码：4N32或35PF)的X-射线结构上CSP值作图证实了2和16的Ca2+依赖性结合模式。
此外，对在识别Man或21时也受影响的观察N297，A300和S302残基，观察了CSP。相比之下，与21相比，Y251和I250表现出CSP值显著增加，同时对K313观察到相对降低。这种降低伴随着近端T314的CSP值相对增加。值得注意的是，显示CSP值显著增加的残基可能主要与未赋值的F315和N307有关。这对表现出相对增加较小的W252和W306的也适用。因此，观察到的CSP模式可能是由2或16与F315而不是K313之间形成的相互作用引起的。与Man和21相似，在C型凝集素样结构域折叠的远处区域也观察到CSP，特别是在短环区域的K257和G259。这可能表明以前报道的变构网络的调节。图33(D)：用16和21进行滴定的比较揭示了与碳水化合物结合位点相关的残基(例如E285或W252)的CSP轨迹各异，而位于C型凝集素样折叠的远处区域的残基例如如K257的轨迹是保守的。
图35显示了GlcNS类似物16的STD NMR累积曲线。将方程式5针对STD值拟合以计算用于确定16的结合表位的STD’0值。
图36显示了Man类似物21的STD NMR表位作图。图36(A)：STD NMR实验用于研究21与Langerin的相互作用。在饱和时间tsat为0.4s时记录STD NMR谱，并放大8倍。图36(B)：从累积曲线确定21的表位，并提示乙酰化乙氨基接头的溶剂暴露取向(也参见图37)。
图37显示了Man类似物21的STD NMR累积曲线。将方程式5针对STD值拟合以计算用于确定21的结合表位的STD’0值。
图38显示了GlcNS类似物16的分子对接。图38(A)：定义了一个药效团模型以指导16在Langerin的碳水化合物结合位点(PDB代码：4N32)的初始放置以及在基于力场的对接位姿精化中约束Glc支架的取向。显示的所有特征都需要在指示的球体内的氧原子。图38(B)：十个生成的对接位姿中有四个类似于所描绘的16的构象。选择的对接位姿预测在苯基环和F315之间形成π-π相互作用以及在磺酰胺基团和N307之间形成氢键。乙酰化的乙氨基接头显示出高溶剂暴露性。因此，该对接位姿与15N HSQC和STD NMR实验一致。图38(C)：所描绘的16的替代构象代表十个生成的对接位姿中的三个。选择的对接位姿预测在苯基环和F313之间形成阳离子-π相互作用以及在磺酰胺和E293之间形成氢键。乙酰化的乙氨基接头显示出高溶剂暴露。然而，该对接位姿与15N HSQC NMR结果不太一致，特别是对K313的CSP值相对降低。所述分子对接研究提供了16的三个额外的独特对接位姿，所述位姿由于磺酰胺接头的不利二面角而被排除在外。受体表面根据其亲脂性(亲脂：深灰色，亲水：浅灰色)形成对比度。
图39显示了一系列靶向配体、GlcN在2’位的类似物和硫酸化单糖的构效关系。
具体实施方式
尽管将就特定实施方案来描述本发明，但是这种描述不应以限制性意义解释。在下面，给出了对于理解本发明重要的定义。
在用于本说明书和所附权利要求书中时，没有数量指示的单数指称物也包括相应的复数，除非上下文另有明确规定。
在本发明的情形下，术语“约”和“大约”表示本领域技术人员将理解为仍然确保所讨论特征的技术效果的准确度区间。该术语通常指示与所指示的数值偏差±20％，优选±15％，更优选±10％，更加优选±5％。
应理解，术语“包含”不是限制性的。为了本发明的目的，术语“由...组成”或“基本由...组成”被认为是术语“包含”的优选实施方案。如果在下文中将组定义为包含至少一定数量的实施方案，则这意味着也包括优选仅由这些实施方案组成的组。
此外，说明书或权利要求书中的术语“(i)”“(ii)”“(iii)”或“(a)”“(b)”“(c)”“(d)”或“第一”“第二”“第三”等，用于区分相似的要素，而不一定用于描述顺序上或时间上的次序。应理解，如此使用的术语在适当的情况下是可互换的，并且本文描述的本发明实施方案能够以本文描述或说明之外的其它顺序来操作。在所述术语与方法或使用的步骤有关，则步骤之间没有时间或时间间隔的连贯性，即除非另有说明，否则所述步骤可同时进行，或者在这样的步骤之间可以有几秒钟、几分钟、几小时、几天、几周等时间间隔。
应当理解，本发明不限于本文描述的特定方法、方案、试剂等，因为这些可以变化。还应理解，本文中使用的术语只是为了描述特定实施方案的目的，而不旨在限制本发明的范围，本发明的范围将仅受所附权利要求的限制。除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语的含义与本领域普通技术人员通常理解的相同。
如上所述，本发明在一个方面涉及一种用于特异性分子靶向Langerin+细胞的介质在将靶向的运载物递送至Langerin+细胞中的用途，其中所述介质能够与Langerin+细胞特异性结合，所述介质包含(a)至少一种载体和(b)至少一种通式(I)的缀合物
Figure GDA0002759246180000221
其中
(i)R独立地选自：
取代或未取代的烷基、烯基、炔基、环烷基、C1-C8烷基环烷基、芳基、C1-C8烷基芳基、杂芳基、C1-C8烷基杂芳基、联芳基和C1-C8烷基联芳基；
其中取代基独立地选自：
--N(Ra)(Rb)，-ORa，-SRa，-C(O)Ra，-C(O)ORa，-C(O)N(Ra)(Rb)，-N(Ra)C(O)Rb，-N(Ra)S(O)2Rb，-OS(O)2Ra，卤素，-NO2，-CN，-NC，-N3，-NCO，-OCN，-NCS，-SCN，取代或未取代的烷基、烯基、炔基、芳基和杂芳基；
其中Ra和Rb独立地选自：氢，取代或未取代的C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基、C3-6环烷基、芳基-C1-5烷基、杂芳基-C1-5烷基、芳基、杂芳基；
(ii)R’独立地选自：
-ORa和-NHS(O)2Ra，
其中Ra如上定义；并且其中
(iii)A-D-B-L是接头基团，将式(I)的葡萄糖衍生物与所述载体或与所述载体的一部分共价结合。
如本文所述的用于特异性分子靶向Langerin+细胞的介质在将靶向的运载物靶向递送至Langerin+细胞中的用途可以是体内用途，例如在治疗或诊断情形下，或体外或离体用途。
如本文所用的术语“缀合物”涉及作为Langerin的配体起作用的如式(I)中所示的葡萄糖衍生物与A-D-B-L形式的接头基团的组合，其中元件A、D和B涉及或包含间隔基功能性，这将在下文进一步详述，并且其中元件L涉及接头元件，这也将在下文中更详细地解释。
因此，本发明的“缀合物”是包含式(I)-配体的葡萄糖衍生物、A-B-D-L接头基团和载体的“介质”的一部分，其中所述载体能够携带或转运运载物。
如本文所用的术语“配体”是指与受体蛋白结合的分子、肽或蛋白质，其通过影响受体蛋白的三维形状取向来改变化学构象。所述结合通过分子间力例如离子键、氢键和范德华力发生。如本发明的介质中包含的配体是Langerin的配体，也称为“葡萄糖衍生物”，其中“Langerin”是同型三聚体II型跨膜受体和位于朗格汉斯细胞表面的C型凝集素受体的亚型，也可以称为“CD207”。如本文所用的Langerin的序列由具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的野生型表示，或由具有SEQ ID NO：2的核苷酸序列的核酸编码。本发明进一步设想了其同源变体，例如与SEQ ID NO：1或2的序列具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或99.5％同源性的氨基酸序列或核苷酸序列变体。进一步设想了Langerin的天然存在的SNP形式，例如，SNP形式V278A(rs741326，NCBI SNP数据库)，其具有由SEQ ID NO：3表示的氨基酸序列，所述氨基酸序列由具有SEQ ID NO：4的核苷酸序列的核酸编码。含有V278A SNP的Langerin的流行率为49.9％，并显示出与A278相似的糖结合(Ward等人，2006.J Biol Chem，281：15450-6)。进一步的信息可得自NCBI SNP数据库或合适的文献来源例如Feinberg等人，2013，J.Biol Chem.27，288，52，36762-71。本发明进一步设想了其同源变体，例如与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4的序列具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或99.5％同源性的氨基酸序列或核苷酸序列变体。还设想了另外的SNP变体，例如N288D(rs13383830，NCBI SNP数据库)，其具有由SEQ ID NO：5表示的氨基酸序列，所述氨基酸序列由具有SEQ ID NO：6的核苷酸序列的核酸编码；K313I(rs57302492，NCBI SNP数据库)，其具有由SEQ ID NO：7表示的氨基酸序列，所述氨基酸序列由具有SEQID NO：8的核苷酸序列的核酸编码；以及N288D/K313I，其具有由SEQ ID NO：9表示的氨基酸序列，所述氨基酸序列由具有SEQ ID NO：10的核苷酸序列的核酸编码。本发明进一步设想了其同源变体，例如与SEQ ID NO：5至SEQ ID NO：10中任一个的序列具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或99.5％同源性的氨基酸序列或核苷酸序列变体。还包括Langerin的密码子优化变体。这些变体可改造成设想的表达情形，例如可以针对细菌菌株例如大肠杆菌菌株、针对哺乳动物细胞等提供密码子优化，这将是技术人员所知的。在一个具体的实施方案中，Langerin的密码子优化序列由SEQ ID NO：29的核苷酸序列表示，其在C-端含有StreptagII和TEV位点，可用于在大肠杆菌中表达。
在具体的实施方案中，“Langerin”也可以是源自于非人类哺乳动物例如小鼠、猴子、牛、猪等的分子。在一个特定实施方案中，本发明由此设想了具有由SEQ ID NO：13表示的氨基酸序列的小鼠Langerin变体的用途，所述氨基酸序列由具有SEQ ID NO：14的核苷酸序列的核酸编码。本发明进一步设想了其同源变体，例如与SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14的序列具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或99.5％同源性的氨基酸序列或核苷酸序列变体。
因此，如果指的是“Langerin+”，则预期存在上文所定义的Langerin受体。如本文所用的术语“Langerin+细胞”是指在其表面展现特定的CLR Langerin的细胞，优选树状细胞(DC)，例如朗格汉斯细胞。在某些实施方案中，所述细胞也可以是具有不同背景的细胞。
已经发现，如上定义的聚糖-Langerin相互作用主要局限于单个单糖并受Ca2+离子与两个邻近的平伏羟基基团配位的支配。这些羟基基团是单糖、Ca2+离子和包括E285、E293、N297和N307在内的受体残基之间形成的扩展氢键网络的一部分。此外，已发现N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)的平伏的乙酰胺基基团通过结构H2O分子与K299以及甲基基团与P310的弱疏水接触而相互作用。而且，已经进行了通过SAR对葡糖胺-2-硫酸盐(GlcNS)类似物的详细分析，表明引入苯基环导致与K299、P310或F315的芳族相互作用，致使亲和力增加。进一步的设计方法显示出有利的相互作用，这在本文实施例部分中详细描述。通过形成β-葡糖苷在Glc支架的C1中引入接头获得了有效的靶向配体。由于这些结果，所述介质可包含GlcNS-结构，在所述GlcNS的C1位含有接头结构、在C2位含有硫酸盐的几个取代基、在C3位和C4位含有平伏的羟基基团，以及在C6位含有羟基基团或磺酸或糖醛酸。还设想了其它官能团。
如本文所用的术语“特异性分子靶向”包括如上文定义的配体作为本文定义的缀合物的一部分与存在于如本文定义的Langerin+细胞上的Langerin受体之间的相互作用。在一个优选实施方案中，所述特异性分子靶向包括如上文定义的配体作为如本文定义的介质的一部分与存在于如本文定义的Langerin+细胞上的Langerin受体之间的相互作用。在一个进一步的实施方案中，所述的特异性分子靶向包括所述缀合物或介质与存在于Langerin+细胞上的受体之间的相互作用。
如本文所用的术语“特异性分子靶向Langerin+细胞的介质”因此涉及一种能够对Langerin+细胞特异性分子靶向的介质。
如上所提到的这种特异性靶向是如本文定义的介质与树突细胞、特别是表达Langerin的树突细胞的特异性结合。所述特异性结合发生在所述介质、即所述介质的配体部分与细胞表面的Langerin受体之间。在具体的实施方案中，这种结合显示特异性在基于细胞的测定中比对照高出至少2倍，所述基于细胞的测定包括在相同条件下将脂质体引入呈递重组Langerin的Raji B细胞、呈递重组DC-SIGN的Raji B细胞(对照1)和不呈递C型凝集素受体的Raji野生型B细胞(WT，对照2)中。在其它更优选的实施方案中，在基于细胞的测定中特异性比对照高出4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍或12倍，所述基于细胞的测定包括在相同条件下将脂质体引入呈递重组Langerin的Raji B细胞、呈递重组DC-SIGN的Raji B细胞(对照1)和不呈递C型凝集素受体的Raji野生型B细胞(WT，对照2)中。在特别优选的实施方案中，在基于细胞的测定中特异性比对照高出16倍，所述基于细胞的测定包括在相同条件下将脂质体引入呈递重组Langerin的Raji B细胞、呈递重组DC-SIGN的Raji B细胞(对照1)和不呈递C型凝集素受体的Raji野生型B细胞(WT，对照2)中。术语“DC-SIGN”涉及另一种树突细胞表达受体，其具有SEQ ID NO：11的氨基酸序列或由具有SEQ ID NO：12的核苷酸序列的核酸编码。本发明进一步设想了其同源变体，例如与SEQ ID NO：11或SEQ IDNO：12的序列具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或99.5％同源性的氨基酸序列或核苷酸序列变体。还包括DC-SIGN的密码子优化变体。这些变体可改造成设想的表达情形，例如可以针对细菌菌株例如大肠杆菌菌株、针对哺乳动物细胞等提供密码子优化，这将是技术人员所知的。在一个具体实施方案中，DC-SIGN的密码子优化序列由SEQ ID NO：52的核苷酸序列表示，其在C-端含有StreptagII和TEV位点，可用于在大肠杆菌中表达。在具体的实施方案中，“DC-SIGN”也可以是源自于非人类哺乳动物例如小鼠、猴子、牛、猪等的分子。
为了确定如上所述的特异性而进行的测定优选地包括实施例10中提到的步骤。
在本发明的上下文中，可以使用另一种Langerin相关蛋白，例如用于如对DC-SIGN所描述的检测格式(见上文)。这样的Langerin相关蛋白的优选示例是Dectin。特别优选Dection是小鼠Dectin变体，或mDectin。术语“mDectin”涉及C型凝集素结构域家族7成员A，其具有SEQ ID NO：15的氨基酸序列或由具有SEQ ID NO：16的核苷酸序列的核酸编码。本发明进一步设想了其同源变体，例如与SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16的序列具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或99.5％同源性的氨基酸序列或核苷酸序列变体。在具体的实施方案中，“Dectin”也可以是源自于人类、或其它非人类哺乳动物例如猴子、牛、猪等的分子。
如本文所用的术语“靶向运载物递送”涉及将运载物、例如如下文定义的运载物运输到被靶向的细胞，例如如本文定义的Langerin+细胞，优选在其表面显示Langerin的细胞。所述运输可包括将运载物引入所述细胞中，或者可包括在附近、例如在所述细胞的表面处卸载运载物。所述运载物递送在任何情况下都可能涉及如本文定义的配体与其关联受体、即如本文提到的Langerin的相互作用。所述运载物递送可依赖所使用的载体、特别是如下文定义的载体，和/或根据所述载体进行调节。某些载体可能需要将运载物引入细胞，而其它载体可用于在细胞表面或细胞附近卸载运载物。术语“递送“可包括运载物的卸载过程，但也可以包括载体和运载物的键合，即使在配体已经与其靶标、即Langerin结合之后。在某些实施方案中，递送可包括将载体释放到初级内体区室或次级内体区室或溶酶体中以进一步加工运载物。例如，通过所述内体区室的酸化，通过所述受体/配体相互作用的辅因子例如Ca2+的富集或耗尽、所述受体、靶向配体或载体的酶促消化，可触发这种释放。进一步设想了光诱导的药物释放，其例如可以使用AuNP-开关从热敏感性AuNP脂质体中释放。在一个替代实施方案中，所述递送可基于热敏感性脂质体或热响应性磁性脂质体。例如，这些脂质体可设计成将磁性靶向和热响应性控制释放的特点相结合，以进行高热触发的局部药物递送。更多细节例如可源自Dai等人，2017，J Microencapsul.34(4):408-415或Kneidl等人，2014，Int J Nanomedicine，9：4387–4398。
如本文所用，术语“烷基”是指直链或支链烃基团。具有指定碳原子数的烃(例如，“C1-C8”烷基是指具有1至8个碳原子的烷基基团)。当未指定碳原子数时，所述烷基基团具有1至100个碳原子。烷基基团的示例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、叔丁基和正戊基。烷基基团可任选被一个或多个取代基取代。
术语“烯基”是指含有2至100个碳原子和至少一个碳-碳双键的不饱和烃链，其可以是直链或支链。烯基基团可任选被一个或多个取代基取代。
术语“炔基”是指含有2至100个碳原子和至少一个碳-碳三键的不饱和烃链，其可以是直链或支链。炔基基团可任选被一个或多个取代基取代。
“取代的”基团是指该基团的任何模式的任何取代。该基团可任选被一个或多个取代基取代，其中所述取代基可以是相同类型或不同类型的。取代基可选自：-N(Ra)(Rb)，-ORa，-SRa,-C(O)Ra，-C(O)ORa，-C(O)N(Ra)(Rb)，-N(Ra)C(O)Rb，-N(Ra)S(O)2Rb，-OS(O)2Ra，卤素，-NO2，-CN，-NC，-N3，-NCO，-OCN，-NCS，-SCN，取代或未取代的烷基、烯基、炔基、芳基和杂芳基。而术语“未取代的”基团是指基团，其为烃基团。
如本文所用，术语“卤素”“hal”或“卤代”是指F、Cl、Br或I。
如本文所用的术语“芳基烷基”是指含有1至100个碳原子的饱和或不饱和烃链，其可以是直链或支链，并可含有碳-碳三键和/或sp2杂化的双键碳。所述芳基和/或烷基基团可任选被一个或多个取代基取代。烯基基团和炔基基团的sp2或sp碳分别可任选是所述烯基或炔基基团的连接点。
术语“环烷基”是指烃3-8元单环或7-14元双环环系或具有至少一个饱和环或具有至少一个非芳族环的超过15个环成员的更大环系，其中非芳族环可具有一定不饱和度。环烷基基团可任选被一个或多个取代基取代。在一个实施方案中，环烷基基团的每个环的0、1、2、3或4个原子可被取代基取代。环烷基基团的代表性示例包括环丙基、环戊基、环己基、环丁基、环庚基、环戊烯基、环戊二烯基、环己烯基、环己二烯基等。
术语“芳基”是指烃单环、双环或三环芳族环系。芳基基团可任选被一个或多个取代基取代。在一个实施方案中，芳基基团的每个环的0、1、2、3、4、5或6个原子可被取代基取代。芳基基团的示例包括苯基、萘基、蒽基、芴基、茚基、薁基等。
术语“联芳基”是指一种含有子结构的芳族环系，所述子结构是两个芳族环或芳基基团在通过单键接合情况下的组装体。所述芳基基团可任选被一个或多个取代基取代。联芳基基团的示例包括联苯基、联萘基等。
术语“杂芳基”是指含有至少一个杂原子的单环、双环或三环芳族环系，其具有碳原子(也称为环成员)和独立地选自N、O、P或S的杂原子环成员，并通过从母核环系的环原子上除去一个碳原子衍生而来。杂芳基基团的示例包括呋喃、噻吩、吡咯、噻唑、噁唑、吡啶、吡嗪等。
如本文所用的术语“烷基环烷基”“烷基芳基”“烷基联芳基”和“烷基杂芳基”是指含有1至8个碳原子的饱和或不饱和烃链，其可以是直链或支链的并可含有碳-碳三键和/或与环烷基、芳基、联芳基或杂芳基键合的sp2双键杂化碳。所述不同的环状结构如上定义。所述环烷基、芳基、联芳基或杂芳基和/或烷基基团可任选被一个或多个取代基取代。烯基基团和炔基基团的sp2或sp碳分别可任选是所述烯基或炔基基团的连接点。
在优选的实施方案中，残基R独立地选自：取代或未取代的烷基、烯基、炔基、环烷基、C1-C8烷基环烷基、芳基、C1-C8烷基芳基、杂芳基、C1-C8烷基杂芳基、联芳基和C1-C8烷基联芳基。在另一个实施方案中，残基R独立地选自：取代或未取代的烷基、环烷基、C1-C8烷基环烷基、芳基、C1-C8烷基芳基、杂芳基、C1-C8烷基杂芳基、联芳基和C1-C8烷基联芳基。在一个更优选的实施方案中，残基R独立地选自：取代或未取代的C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C1-C3烷基C3-C6环烷基、C6-C14芳基、C1-C3烷基C6-C14芳基、杂芳基、C1-C3烷基杂芳基、联芳基和C1-C3烷基联芳基。在一个更优选的实施方案中，残基R独立地选自：取代或未取代的环己基、苯基、苄基、联苯基、吡啶基或噁唑基。在另一个优选实施方案中，残基R是取代或未取代的苯基。
残基R的取代基可以是任何不阻碍配体与Langerin结合的合适的取代基。而且，所述取代基可以是一个或多个相同类型或不同类型的取代基。所述R的取代基可具有任何取代模式。在一个实施方案中，残基R的取代基独立地选自：-N(Ra)(Rb)，-ORa，-SRa，-C(O)Ra，-C(O)ORa，-C(O)N(Ra)(Rb)，-N(Ra)C(O)Rb，-N(Ra)S(O)2Rb，-OS(O)2Ra，卤素，-NO2，-CN，-NC，-N3，-NCO，-OCN，-NCS，-SCN，取代或未取代的烷基、烯基、炔基、芳基和杂芳基。Ra和Rb可独立地选自：氢，取代或未取代的C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基、C3-6环烷基、芳基-C1-5烷基、杂芳基-C1-5烷基、芳基、杂芳基。在一个优选实施方案中，Ra和Rb可独立地选自：氢、甲基和乙基。
更优选地，残基R的取代基为独立地选自：NH2，-OH，-OCH3，-C(O)CH3，-NHC(O)CH3，-F，-Cl，-Br，-NO2，-CN，C1-C4烷基，以及苯基、联苯基和萘基。在一个优选实施方案中，残基R是取代的苯基残基。该苯基残基可被5个取代基取代。更优选地，所述苯基残基可以是单取代的、二取代的或三取代的。在一个最优选的实施方案中，残基R是单取代的苯基残基，其中所述取代基选自：-NH2，-OH，-OCH3，-C(O)CH3，C(O)NH2，-C(O)NHCH3，-CH2OH-NHC(O)CH3，-F，-Cl，-Br，-NO2，-CN，C1-C4烷基，萘基和苯基。在一个进一步的优选实施方案中，取代基在配体的对位。在一个进一步的优选实施方案中，所述对位的取代基和所述苯基的取代基独立地选自：-NHC(O)CH3，-CN，-CH3，-F，-C(O)NH2，-NH2，-C(O)NHCH3，-CH2OH和苯基。在一个进一步的优选实施方案中，取代基在配体的间位。
在另一个实施方案中，R’可独立地选自-ORa和-NHS(O)2Ra，其中Ra如上文的定义。在一个优选实施方案中，R’可选自-OH、-OCH3、-OCH2CH3或-NHS(O)2Ra，其中Ra如上文的定义。在一个更优选的实施方案中，-OH或-NHS(O)2Ra，其中Ra如上文的定义。在一个更优选的实施方案中，R’是–OH、-NHS(O)2CH3或N-甲苯磺酰基。在最优选的实施方案中，R’是–OH。
在又一个优选实施方案中，如上所述的缀合物是下面式(I-1)至式(I-2)的缀合物：
Figure GDA0002759246180000291
在一个更进一步的优选实施方案中，如上所述的缀合物是下面式(I-3)至式(I-15)中任一个的缀合物：
Figure GDA0002759246180000301
Figure GDA0002759246180000311
词语“A-D-B-L接头基团”“A-D-B-L”或“接头基团”是指由间隔基A-D-B和接头L组成的基团。该基团将葡萄糖衍生配体与载体连接。在一个典型的实施方案中，如上所述的通式(I)的接头L在一个末端通过间隔基A-D-B与如上定义的包含式(I)的葡萄糖衍生物的Langerin配体结构结合。间隔基A-D-B与所述葡萄糖衍生物的C1位共价结合。还设想所述间隔基A-D-B与所述葡萄糖衍生物的C6位共价结合。
在某些实施方案中，配体和载体之间的A-D-B-L接头基团是分子链。在一个优选实施方案中，所述主链可具有至少4个包含在所述主链中的碳原子、氮原子和氧原子总数，优选4个原子至600个原子之间，更优选15个原子至400个原子之间，更加优选25个原子至200个原子之间，例如25、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190和200个原子。在另一个实施方案中，所述接头的主链的长度可以为约0.4nm至约400nm，并更优选约0.6nm和100nm之间，例如0.6nm、0.8nm、1nm、2nm、4nm、8nm、10nm、20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm和100nm。可通过分析离心分离测量或SAXS测量，例如如Fuji等人，ACS研讨会系列(ACS Symposium Series)，2017，1271，“两亲性分子自组装在分子水平的控制：针对递送应用具有调谐的物理化学性质的超分子组装(Control ofAmphiphile Self-Assembling at the Molecular Level:Supra-Molecular Assemblieswith Tuned Physicochemical Properties for Delivery Applications)”，第5章，第115-129页中所述，测量所述接头的尺寸或长度。可通过合适的测量技术，例如如Needham和Kim，2000，Colloids and Surfaces B:Biointerfaces，18，3-4，183-195或Stepniwieski等人，2011，Langmuir，27(12)，7788-7798中的讨论，来测量平均链长。
本文所用的术语“接头L”或“L”还指可用于直接或间接例如通过间隔基A-D-B将如上文所定义的本发明的Langerin配体与载体连接的化合物。所提供的连键可通过任何合适的化学连接、优选通过共价键来传达。
在一个优选实施方案中，所述接头L可包含一种或多种合成聚合物或天然聚合物或那些聚合物的一种或多种单个单元或其组合。本发明的接头优选是生物相容的和/或可生物降解的。在某些实施方案中，所述接头可以是合成的水溶性聚合物，其在水中溶解、分散或溶胀，从而以胶凝、增稠或乳化/稳定化的形式更改水性体系的物理性质。在一个优选实施方案中，所述合成聚合物可以是饱和或不饱和烃聚合物；聚胺；聚酰胺；聚酯；聚醚，例如聚乙二醇、聚丙二醇；嵌段共聚物或泊洛沙姆。在特别优选的实施方案中，所述接头是聚乙二醇。在相应的具体实施方案中，所述聚乙二醇接头的长度可以为约0-150个、更优选1-100个、更加优选3-50个(–CH2–CH2–O–)重复单元。合适的聚合物的其它示例是聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯基吡咯烷酮-乙酸乙烯酯共聚物、聚乙烯醇、聚苯乙烯、聚丙烯酸、聚酰基酰胺、N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺和聚噁唑啉。
在一个优选实施方案中，可能是合适的接头的天然聚合物选自碳水化合物、修饰的碳水化合物、肽、修饰的肽、脂质和修饰的脂质。
如本文所用的术语“碳水化合物”是指任何天然或合成的碳水化合物。该术语可进一步包含丙糖、丁糖、戊糖、己糖和庚糖。碳水化合物可以是醛糖或酮糖。碳水化合物可以是D型或L型。碳水化合物可包含一种或多种单糖或二糖。所述碳水化合物可形成包含3个至9个单糖的寡糖。所述碳水化合物也可以是含有多于9个单糖的多糖。术语“单糖”包括但不限于苏糖、核酮糖、葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖、核糖、阿拉伯糖和甘露糖。二糖、寡糖和多糖中所含的单糖可彼此以任何构型连接。术语“二糖”包括但不限于蔗糖、乳糖和麦芽糖。术语“寡糖”包括但不限于麦芽糊精和纤维糊精。术语“多糖”包括但不限于淀粉、纤维素和甲壳素。天然碳水化合物包括天然单糖。合成碳水化合物可包括D-和L-、修饰的、合成的、不常见的单糖和单糖衍生物。“单糖衍生物”，也被称为“修饰的碳水化合物”，包括通过母本单糖的共价连接、例如通过烷基化、乙酰化、磷酸化等而具有取代或修饰的单糖。在“单糖衍生物”的定义内还包括例如具有取代的连键的单糖的一种或多种类似物，以及本领域已知的其它修饰。优选的碳水化合物是甘露糖、葡萄糖、岩藻糖或木糖。在某些实施方案中，也可以使用肌醇。
如本文所用的术语“脂质”涉及任何天然或合成脂质。它可相应地包括脂肪酸和它们的衍生物，包括甘油三酯、甘油二酯、甘油一酯以及磷脂、甘油脂、甘油磷脂、鞘脂、糖脂、聚酮、固醇脂和孕烯醇酮脂，包括DSPE(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油酰基-3-磷酸乙醇胺)、DPPC(1,2-二棕榈酰基-sn-甘油酰基-3-磷酸胆碱)、DPPE(1,2-二棕榈酰基-sn-甘油酰基-3-磷酸乙醇胺)、DMPC(1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油酰基-3-磷酸胆碱)、DSPC(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油酰基-3-磷酸胆碱)、膜脂和磷脂酰胆碱及其修饰形式。优选的脂质是DPPC(1,2-二棕榈酰基-sn-甘油酰基-3-磷酸胆碱)、DPPE(1,2-二棕榈酰基-sn-甘油酰基-3-磷酸乙醇胺)、DMPC(1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油酰基-3-磷酸胆碱)、DSPC(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油酰基-3-磷酸胆碱)或DSPE(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)。术语“修饰脂质”是具有一种或多种修饰的脂质。这样的脂质的修饰可包括乙酰化、糖基化、烷基化，与螯合剂或进一步的功能化例如提供pH敏感性、添加碳氢酸、生物素、胺、硫代乙醇(thioethanl)、叠氮化物基团等结合。所述脂质还可以与柔性、弹性和/或渗透性增强剂结合。更多细节是技术人员所知的或者可以从合适的文献来源例如Benson，2017，Methods Mol.Biol.，1522：107-117，Sala等人，2018，Int J.Pharm.535Molecular Cell Biology，201(1-2)，1-17或Harayama和Riezman，Nature Reviews，2018 8，19，281–296获得。
如本文所用的术语“肽”涉及包含多于2个氨基酸的任何类型的氨基酸序列或其功能衍生物。此外，肽可以与其它化学部分或官能团结合，或者可以是合成肽。天然肽通常包含天然氨基酸。合成肽可包含D-和L-、修饰的、合成的或非天然存在的氨基酸和氨基酸衍生物。天然肽包含天然氨基酸。合成肽可包含D-和L-、修饰的、合成的、不常见的氨基酸和氨基酸衍生物。“氨基酸衍生物”包括通过母本氨基酸的共价连接、例如通过烷基化、糖基化、乙酰化、磷酸化等而具有取代或修饰的氨基酸。在“氨基酸衍生物”的定义内还包括例如具有取代的连键的氨基酸的一种或多种类似物，以及本领域已知的其它修饰。除非上下文另有说明，否则“天然氨基酸”是指精氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、赖氨酸、甘氨酸、丙氨酸、组氨酸、丝氨酸、脯氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、异亮氨酸和缬氨酸。本发明的优选的肽可以是寡聚-L-谷氨酸或寡聚-L-赖氨酸。其它优选的肽可以是通过用短的N-末端二-L-甘氨酸接头插入例如序列VLTTGLPALISWIKRKRQQ(SEQ ID NO:81)与基于脂质的载体连接的两亲性肽。肽可以有别于多。“多肽”的长度可以例如超过20个至50个氨基酸。在某些实施方案中，接头也可以是多肽接头。如本文所用的术语“蛋白质”涉及一种或多种多肽的排列。因此，蛋白质可以包含一个多肽或由一个多肽组成，因此与多肽同义。在其它实施方案中，蛋白质可包含2个或更多个多肽，所述多肽可以在蛋白质形式中组织成更高级结构的单位或亚单位。
水溶性的并且在本发明的情形下可适合用作接头的天然聚合物的其它示例是果胶、壳聚糖衍生物、黄原胶、壳聚糖衍生物、葡聚糖、纤维素醚、透明质酸、酪蛋白、角叉菜胶、淀粉和淀粉衍生物等。
在某些实施方案中，接头可以仅仅是共价键。在这样的情景下，载体结构可直接与间隔基A-D-B结合。
在一个优选实施方案中，所述接头L是下面通式(L-1)的接头。
Figure GDA0002759246180000341
其中
U1是通过B与间隔基D连接的基团，其中U1选自-CH2-、-CH＝CH-或-C≡C-；U1也可以是单键；优选U1是-CH2-或共价键；
Z1是将接头与载体结合的部分，选自：-O-，-S-，-N(Rd)-，-C(Rd)(Re)-，-RdC＝CRe-，-C(O)-，-C(O)O-,-OC(O)-，-C(O)S-，-C(O)N(Rd)-，-N(Rd)C(O)-，-N(Rd)C(O)N(Re)-，-N(Rd)C(S)N(Re)-，-N(Rd)C(O)O-，-OC(O)N(Rd)-，-环己烯-，-三唑-，-NHS(O)2-，-S(O)2-，-OP(O)(H)O-，或-OP(O)(OH)O；Z1也可以是单键；优选Z1是共价键、酰胺或羰基基团；
其中Rd和Re独立地选自：氢，取代或未取代的C1-32烷基、C2-32烯基、C3-8环烷基、芳基、C1-C8烷基芳基、杂芳基、C1-C8烷基杂芳基；以及
d1至d5各自是0至100的整数，优选0至50的整数，例如0、1、2、3、4、6、8、10、12、15、20、25、30、35、40、45或50；d6是0至100的整数，优选1至50的整数，例如1、2、3、4、6、8、10、12、15、20、25、30、35、40、45或50。
如下面更详细描述，可以使用具有与配体结合的反应位点的接头L单元的一部分来制备载体或配体。为了合成所述缀合物，所述接头可作为双官能配体或双官能单元提供。接头L单元可相应地具有反应位点，所述反应位点具有与配体单元或载体单元上存在的亲电子基团反应的亲核基团。或者，所述配体单元或载体单元可相应地具有反应位点，所述反应位点具有与所述接头L单元上存在的亲电子基团反应的亲核基团。配体单元或载体单元上的亲电子基团提供了与接头单元连接的便捷位点，或者，接头L单元上的亲电子基团提供了与配体单元或载体单元连接的便捷位点。配体或接头单元上有用的亲电子基团包括但不限于醛和酮羰基基团。接头单元的亲核基团的杂原子可与配体上的亲电子基团反应并与该配体形成共价键。或者，配体单元的亲核基团的杂原子可与接头上的亲电子基团反应并与该接头形成共价键。接头单元或配体单元上有用的亲核基团包括但不限于酰肼、肟、氨基、肼、缩氨硫脲、羧酸肼和芳基酰肼。在某些实施方案中，可以使用双官能接头，其带有一个OH基团或其可以是例如通用亲核体，以及一个另外的官能团。第二官能团可以是带有正交保护基团或与糖基化反应和整体脱保护方法相容的官能团的任何亲核体。双官能元件随后可通过OH基团与单糖的异头中心(anomeric center)反应。随后，将所述单糖和所述第二官能团去保护。然后可以将产物与相应的PEG化脂质缀合。
如本文所用的术语“间隔基”是指将接头与如上文定义的本发明的葡萄糖衍生物配体共价连接的任何结构。在一个优选实施方案中，所述间隔基基团A-D-B包含D作为与通式(D-1)的A和B连接的间隔基
A-(CH2)c-(CH2-O)c1-(CH2-CH2-O)c2-(CH2)c3-B (D-1)，
其中
D通过B与接头L连接，其中B选自：
-O-，-S-，-C(Rc1)(Rc2)-，-S-S-，-N(Rc1)-，-C(O)-，-C(Rc1)＝N-，-N＝N-，-OC(O)-，-C(O)O-，-C(O)N(Rc1)-，-N(Rc1)C(O)-，-N(Rc1)C(O)N(Rc2)-，-N(Rc1)C(S)N(Rc2)-，-N(Rc1)C(O)O-，-OC(O)N(Rc1)-，-环己烯-和-三唑-；B也可以是单键；优选B是共价键、酰胺或羰基基团；
其中Rc1和Rc2独立地选自：氢，取代或未取代的烷基、烯基、环烷基、C1-C8烷基环烷基、芳基、C1-C8烷基芳基、杂芳基和C1-C8烷基杂芳基；优选Rc1和Rc2独立地选自氢和甲基；
D通过A与葡萄糖衍生物连接，其中A选自-O-、-CH2-、-S-、-NH-、-NHC(O)-、-OC(O)-、-环己烯-和-三唑-；A也可以是单键；优选A是共价键、酰胺或羰基基团；
c是选自0至20的整数，优选c是0、1、2或3；c1是选自0至20的整数，优选c1是0、1、2或3；以及c2是选自0至20的整数，优选c2是0、1、2或3；c3是选自1至20的整数，优选c3是1、2或3；如果A是-CH2-，c3是选自0至20的整数。间隔基基团D可以是单键、一个或多个甲二醇基团、一个或多个乙二醇基团或烃或其混合物。所述间隔基更优选是选自单键、-CH2-、-CH2-CH2-或-CH2-CH2-O-的基团。A和B因此可通过单键连接。
如本文所用的术语“载体”是指能够携带运载物到细胞或细胞群的任何结构。所述运载物可相应地与所述载体缔合、即结合，或可被载体包含、包容或包括在内。在特别优选的实施方案中，所述载体也可以在所缔合的配体即在上文定义的缀合物或介质与被靶向的细胞相互作用之前，有利地能够将所运输的运载物引入所述细胞中。在具体的实施方案中，所述载体可包含一种或多种类型的运载物。这些运载物可以相同或不同的方式与所述载体连接。例如，一种运载物类型可以与载体结合，例如在外部结合，并且所述载体可包容或包含不同的运载物类型。
根据本发明的某些实施方案，所述载体可按1:1的比率，即一个载体与一个缀合物结合，来与如本文定义的缀合物连接或缔合。在一个进一步的实施方案中，所述载体可与多于一个缀合物结合。在一个特定实施方案中，所述载体与少于10个缀合物结合。在一个更优选的实施方案中，所述载体可与少于100个缀合物结合。在另一个优选实施方案中，所述载体可与少于200个缀合物结合。在进一步的实施方案中，载体与缀合物之间的比率可以是可变的，例如，针对载体形式、目标运载物、次要结合意图等进行调节。例如，载体和缀合物之间的比率可以为1:2、1:3、1:4、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:50、1:60、1:70、1:80、1:90、1:100或所提到的比率之间的任何比率(整数值)。在其它替代实施方案中，也可以提供一种缀合物与多于一种载体的比率。因此，载体和缀合物之间的比率可以为2:1、3:1、4:1、5:1、10:1、15:1、20:1、25:1、30:1或更高或者所提到的比率之间的任何比率。
在具体的实施方案中，所述载体可以是软粒子。本文所用的术语“软粒子”是指弹性的、可变形的并且通常可生物可降解的或非生物持久的粒子。软粒子的优选示例是脂质体、niosome、胶束、sequessomesTM和传递体。如上定义的软粒子可包含不同类型的成分例如脂质或由不同类型的成分例如脂质组成。例如，软粒子可包含一种或多种类型的磷脂；另外，软颗粒可包含可以例如对稳定性、刚性、结合能力、细胞穿透能力、二次靶向能力等有影响的其它组分。组分的一个示例是胆固醇，它通常降低双层结构的流动性并增加脂质体的稳定性。在一个特别优选的实施方案中，所述软粒子是脂质体。特别优选所述粒子包含57％DSPC、38％胆固醇和5％DSPE-PEG。
“脂质体”是具有至少一个例如如上文定义的脂质双层的球形囊泡。脂质体可包含磷脂，例如磷脂酰胆碱，或包括其它脂质，例如磷脂酰乙醇胺。脂质体可以多层囊泡(MLV)的形式即包含若干个层状相脂质双层提供，以小的单层脂质体囊泡(SUV)即包含一个脂质双层提供，或以大的单层囊泡(LUV)提供。脂质体通常具有被疏水膜包围的水溶液核心。因此，溶解在核心中的疏水化合物不能通过所述双层，除非例如通过引入孔隙打开所述双层，或除非所述双层与另一个双层结构例如细胞膜融合，从而将脂质体内容物传递到第二双层的核心、例如细胞中。进而，疏水性化合物通常与脂质双层缔合，并由此可以装载到所述脂质体区室中。或者，可通过引发内吞或吞噬事件将脂质体递送至细胞。脂质体可具有不同的尺寸，这很大程度上取决于脂质的性质、层状结构以及脂质双层中其它因素例如胆固醇的存在。例如，脂质体的尺寸可介于几纳米至多达2000nm之间。脂质体的尺寸可通过技术人员已知的任何合适的测定法来测量，优选用动态光散射(DLS)来测量。
在一个特别优选的实施方案中，脂质体是双层磷脂脂质体。本发明设想所述双层磷脂脂质体的尺寸在10nm至500nm之间。脂质体的尺寸可以是例如10nm、20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、120nm、140nm、150nm、160nm、180nm、200nm、220nm、240nm、250nm、260nm、280nm、300nm、350nm、400nm、450nm或500nm。优选地，所述尺寸在30nm和250nm之间，例如40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、120nm、140nm、150nm、160nm、180nm、200nm、220nm、240nm或250nm。还设想了在提到的尺寸之间的其它尺寸。
发现大约140nm的优选的脂质体尺寸提供了在几个月中可再现的脂质体稳定性。
包括双层磷脂脂质体在内的脂质体可含有一种或多种附加组分。这些附加组分的一个示例是胆固醇。在一个优选实施方案中，脂质体中包含的胆固醇的量优选可以为约20mol％至50mol％，例如，量约20mol％、25mol％、30mol％、35mol％、40mol％、45mol％或50mol％，或在所提到的值之间的任何合适的值。更优选地，它的存在量可以为约40％。
脂质体还可以优选由磷脂、更优选由磷脂酰胆碱构成，但是也可以包括其它脂质，例如卵磷脂酰乙醇胺，只要它们与脂质双层结构相容即可。特别设想的磷脂示例包括：POPC(1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)，DPPG(1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3[磷酸-rac-(1-甘油)，DSPC(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)，DOPC(1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)，DSPE(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)，DMPC(1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)，DPPC(1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)，DMPE(1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)，DPPE(1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)，DMPA·Na(1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸盐(钠盐))，DPPA·Na(1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸盐(钠盐))，DOPA·Na(1,2-二油酰基-sn-甘油-3[磷酸-rac-(1-甘油)(钠盐)，)DMPG·Na(1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3[磷酸-rac-(1-甘油)(钠盐))，DPPG·Na(1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3[磷酸-rac-(1-甘油)(钠盐))，DMPS·Na(1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸丝氨酸(钠盐))，DPPS·Na(1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸丝氨酸(钠盐))，和DOPS·Na(1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸丝氨酸(钠盐))。
如本文所用的术语“niosome”是指基于非离子表面活性剂的囊泡。通常，noisome由烷基或二烷基聚甘油醚类的非离子表面活性剂和胆固醇以随后在水性介质中水合而形成。Niosome在结构上与具有双层的脂质体相似，但由于其组成而更稳定。它们是小的单层囊泡(SUV，尺寸＝0.025-0.05μm)、多层囊泡(MLV，尺寸＝>0.05μm)和大的单层囊泡(LUV，尺寸＝>0.10μm)。用于制备niosome的表面活性剂的示例包括脱水山梨糖醇单硬脂酸酯(Span-60)、聚氧乙烯烷基醚和Span40(C16 G2)。
如本发明的情形中所用的“胶束”是指分散在液体中的表面活性剂分子例如磷脂、嵌段共聚物或三嵌段共聚物的聚集体。水溶液中的典型胶束形成聚集体，其亲水性头部区域与周围的溶剂接触，疏水性单尾区域隔离在胶束中心。因此，胶束具有单层结构。胶束在超过临界胶束浓度时形成并通常显示直径在1nm至100nm之间。聚合的胶束一般更稳定，并且通常单分散，直径在20nm到50nm之间。更多细节可从合适的文献来源例如Soussan等人，2009，Angew Chem Int Ed Engl.48(2)，274-88中获得。除这些正胶束外，还有另一种成型不同的反胶束，其中亲水性头部基团位于胶束的中心，尾部向外伸展。胶束的形状和尺寸取决于其表面活性剂分子的分子几何形状和溶液条件，例如表面活性剂或聚合物浓度、温度、pH和离子强度。设想的表面活性剂的示例包括阳离子表面活性剂，例如DeTAB、DTAB、TTAB或CTAB；阴离子表面活性剂，例如SDS或SDC；两性离子表面活性剂，例如SB-14或CHAPS；或非离子表面活性剂，例如NOG、Tween 20、Tween 80或Triton X。由于它们的稳定性增加，聚合胶束是本发明的优选实施方案。根据特别优选的实施方案，聚合胶束包含基于聚氧化乙烯或可生物降解的碳水化合物和甘油的聚合物，其可用于亲水部分。疏水部分可优选由基于可生物降解的乳酸酯的聚合物构成。在另一个优选实施方案中，提供了由pH敏感性嵌段共聚物构成的胶束。这样的胶束可通过包含碱性或酸性官能团而生成，其可以有利地改变聚合物的溶解度，并因此改变胶束在变化的pH值下的稳定性。
如本文所用的术语“sequessomes”TM涉及由磷脂和表面活性剂分子排列成双层制成的超易变形的亲水性球体。包含表面活性剂软化了双层膜，使sequessome囊泡柔性而且稳定，允许它们完整无缺地通过皮肤并深度渗透到体内，而无需注射或皮肤渗透增强剂。例如，更多细节可以从例如Benson，2017，Methods Mol.Biol.，1522:107-117，或Sala等人，2018，Int J.Pharm.535(1-2)，1-17获得。
如本文所用的术语“传递体”涉及由至少一种两亲分子(amphipath)构成的载体聚集体，其在水性溶剂中自组装成脂质双层，所述脂质双层封闭成简单的脂质囊泡。通常，所述两亲分子是磷脂酰胆碱。通过添加至少一种双层软化组分，例如生物相容性表面活性剂或两亲药物，可增加脂质双层的柔性和渗透性。由此产生的传递体针对柔性和渗透性进行优化，因此可以通过将各双层组分的局部浓度针对所述双层处承受的局部应力进行调节，从而轻松并且快速地使其形状适应环境条件。所述传递体通常与更常规的囊泡或脂质体不同，主要因为它的更柔软、更易变形、且更好地可调节的人工膜。所述传递体通常还具有增加的亲和力来结合和保留水。不希望受理论束缚，假定超易变形和高度亲水的囊泡，例如传递体，倾向于避免脱水，这可能涉及与正向渗透有关的运输过程。有利地，在开放的生物表面、特别是皮肤上施用的传递体倾向于穿透其屏障并迁移到富含水的更深层中以确保足够的水合。屏障渗透可涉及可逆的双层变形，但决不会危害囊泡完整性或使潜在的水合亲和力和梯度保持不受损伤的屏障特性。更多细节可由例如获得Benson，2017，MethodsMol.Biol.，1522：107-117，或Sala等人，2018，Int J.Pharm.535(1-2)，1-17。
在本发明的某些实施方案中，软粒子的一部分，例如相互作用部分或化合物通过共价键或通过选自下组的部分，例如通过如上定义的Z1，与如上定义的缀合物的接头基团A-D-B-L直接结合，其中所述组为：
-O-，-S-，-N(Rd)-，-C(Rd)(Re)-，-RdC＝CRe-，-C(O)-，-C(O)O-,-OC(O)-，-C(O)S-，-C(O)N(Rd)-，-N(Rd)C(O)-，-N(Rd)C(O)N(Re)-，-N(Rd)C(S)N(Re)-，-N(Rd)C(O)O-，-OC(O)N(Rd)-，-环己烯-，-三唑-，-NHS(O)2-，-S(O)2-，-OP(O)(H)O-，或-OP(O)(OH)O-；
其中Rd和Re独立地选自：氢，取代或未取代的C1-32烷基、C2-32烯基、C3-8环烷基、芳基、C1-C8烷基芳基、杂芳基、C1-C8烷基杂芳基。
术语“软粒子的一部分”是指软粒子、例如脂质体的典型成分，例如脂质、修饰脂质、磷脂、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSPE)、膜脂、或修饰的磷脂酰胆碱、或胆固醇，其通过A-D-B-L接头基团与如本文定义的Langerin配体共价连接。在某些实施方案中，包含Langerin配体和A-D-B-L接头基团的缀合物可包含疏水区，在本文中也称为“尾部区域”，以及也包含Langerin配体的亲水区，也称为“头部区域”。在具体的实施方案中，所述缀合物的尾部区域可嵌入脂质双层结构中，而头部区域位于载体的外部，因此能够与受体相互作用。图26中示意性地描绘了这种嵌入的示例，该图显示了缀合物的尾部区域插入脂质双层结构中，该脂质双层结构属于软粒子载体，例如脂质体。在优选的实施方案中，缀合物的头部区域包含在配体和脂质之间的柔性接头，因此允许与关联受体相互作用。在具体实施方案中，该接头的长度可适于维持配体和软粒子例如脂质体表面之间的最小距离。本发明还设想在如上提到的这样的脂质双层或脂质体中存在多于一种缀合物。所述双层中缀合物的量及其距离可以调节，例如与Langerin+细胞表面上关联受体的量和频率相关地调节。在一个实施方案中，缀合物可以与所述软粒子的一部分、例如脂质物种或胆固醇结合，形成脂质体、胶束或类似结构的一部分。在另一个实施方案中，与缀合物结合的脂质和未与缀合物合的脂质的比率为约1:15、1:20、1:25、1:50、1:100、1:150、1:200，优选1:20。在进一步的具体实施方案中，与脂质结合的缀合物的数量也可按每nm2脂质双层面积存在的缀合物的数量来确定。在优选的实施方案中，该数量要适合脂质体周长的尺寸。例如，对于周长为160nm的脂质体，可存在约0.05至0.075个缀合物/nm2的数量。在一个非常具体的实施方案中，可存在约0.67个缀合物/nm2的数量。
在一个优选实施方案中，所述缀合物与软粒子载体的一部分结合，由此产生下式(II-a)：
Figure GDA0002759246180000411
其中p和q各自独立地是6至30之间的整数；更优选p和q各自独立地是8至28之间的整数，更加优选p和q各自独立地是9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27和28；N是0至150的整数，优选10至100的整数，更优选为20至75的整数。在一个更优选的实施方案中，n是20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、75。在最优选的实施方案中，n是45。
在一个更优选的实施方案中，所述缀合物与软粒子载体的一部分结合，由此产生下式(II)：
Figure GDA0002759246180000412
其中乙二醇单元的平均数n为0至150的整数，优选约20至110的整数，更优选约40至70的整数。
在一个更优选的实施方案中，n是约40、50、55、60或70。在最优选的实施方案中，n是约59。在具体实施方案中，使用PEG接头。特别优选的是3-(N-琥珀酰亚胺基氧基戊二酰基)氨基丙基，聚乙二醇-氨甲酰基二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺。所述PEG接头可以具有任何合适的重量。例如，重量可以在约1500Da至10 000Da之间，例如1500Da、2000Da、2500Da、3000Da、3200Da、3500Da、4000Da、4500Da、5000Da、6000Da、7000Da、8000Da、9000Da或10000Da或所提到的值之间的任何值。还设想了约2000Da至5000Da的范围。特别优选使用分子量为2000Da的PEG接头。
在进一步的优选实施方案中，所述载体可具有固体结构，为纳米粒子、肽、蛋白质、毒素、树枝状聚合物、富勒烯或碳纳米管。所述缀合物可以通过共价键与载体直接结合，或通过
选自下组中的部分：-O-，-S-，-N(Rd)-，-C(Rd)(Re)-，-RdC＝CRe-，-C(O)-，-C(O)O-,-OC(O)-，-C(O)S-，-C(O)N(Rd)-，-N(Rd)C(O)-，-N(Rd)C(O)N(Re)-，-N(Rd)C(S)N(Re)-，-N(Rd)C(O)O-，-OC(O)N(Rd)-，-环己烯-，-三唑-，-NHS(O)2-，-S(O)2-，-OP(O)(H)O-，或-OP(O)(OH)O-；
其中Rd和Re独立地选自：氢，取代或未取代的C1-32烷基、C2-32烯基、C3-8环烷基、芳基、C1-C8烷基芳基、杂芳基、C1-C8烷基杂芳基；
例如，通过如上定义的Z1，与载体直接结合。在一个进一步的实施方案中，所述缀合物可另外通过其它间隔元件与载体结合。
如本文所用的术语“间隔元件”是指任何合适的基团或者天然聚合物或合成聚合物。特别优选地，所述天然聚合物或合成聚合物是如上定义的天然聚合物或合成聚合物。
如本文所用的术语“纳米粒子”涉及尺寸在1nm和1000nm之间、优选5nm和1000nm之间的粒子，通常具有周围界面间层。纳米粒子在其运输和性质方面基本上表现为一个整体单元。粒子以及因此它们的表面于是可以是对称的、小球状的、基本上小球状的或球形的，或是不规则的、不对称的形状或形态。粒度(以及因此表面的尺寸)可以变化。优选的是纳米级至几百纳米范围内的粒子和粒子表面。特别优选的是约1nm至700nm的纳米粒子。特别优选的是直径可以为约10nm至600nm的的纳米粒子，例如，直径为10nm、15nm、20nm、25nm、30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、120nm、150nm、170nm、200nm、220nm、250nm、270nm、300nm、320nm、350nm、370nm、400nm、420nm、450nm、470nm、500nm、520nm、550nm、570nm、600nm、620nm或其间的任何值。更加优选直径为约500nm的纳米粒子。纳米粒子可由本领域技术人员已知的任何合适的材料构成，例如它们可包含无机或有机材料、或由所述材料组成、或基本上由所述材料组成。通常，它们可包含金属或金属合金或有机材料、或由所述材料组成、或基本上由所述材料组成，或包含碳水化合物元件、或由其组成、或基本上由其组成。设想的材料的示例还包括琼脂糖、聚苯乙烯、胶乳、聚乙烯醇、二氧化硅和铁磁金属、合金或组合材料。还设想的纳米粒子材料的示例包括金、银、硅、氧化铈、铁、二氧化钛、氧化锌、粘土、氧化铝、氧化铜、金属碳化物、金属氮化物例如氮化铝或氮化硅、铝或铜。
通常，纳米粒子的表面或表面包覆层的离子电荷决定了它们的许多物理和化学性质，包括稳定性、溶解性和靶向性。对于目前预见的生物学应用，设想所述包覆层提供高水溶性并防止纳米粒子聚集。在细胞表面上，高度带电的包覆层通常促进非特异性结合，而与末端羟基或甲氧基基团连接的聚乙二醇可抵制非特异性相互作用。
在某些实施方案中，纳米粒子可包含一个或多个表面层。例如，设想存在第一层或壳结构。还设想了多层或网状结构。这样的结构可例如包含PEG、生物素和链霉亲和素作为结构组分。所述壳结构可包含本发明的缀合物，或另外包含其它亲和性分子，例如抗体、各种受体的配体、蛋白相互作用子、凝集素等。在进一步的具体实施方案中，链霉亲和素的多价通常导致纳米粒子表面上的非亲和间隔分子网。围绕相互作用或靶向分子、例如本发明的缀合物的这种网状结构，或如上所述的另外的亲和性分子，可以减少或完全消除或避免分子或实体与相互作用或靶向分子或亲和性分子或与其附近分子的非特异性结合。
在进一步的实施方案中，纳米粒子可以由可生物降解结构构成或具有可生物降解结构。如本文所用的术语“可生物降解的”是指纳米粒子可以通过在细胞内或细胞周围、即细胞外部发生的自然过程而分解或崩解。因此，可生物降解的纳米粒子可具有增强的生物相容性、对运载物例如核酸、蛋白质或小分子药物的良好包封能力。可生物降解的纳米粒子可以由多种材料例如蛋白质、多糖和合成的可生物降解聚合物来制备。基础聚合物的选择基于各种设计和最终应用标准。它取决于许多因素，例如期望的纳米粒子的尺寸、要包封在聚合物中的运载物的性质(水溶性，稳定性等)、表面特性和功能性、生物降解性和生物相容性的程度，以及最终产品的运载物释放规律。取决于对制备纳米粒子的期望标准的选择，用于生产生物可降解纳米粒子的方法可包括预成型聚合物的分散、单体的聚合和用于亲水性聚合物的离子凝胶化方法。特别优选使用聚乳酸(PLA)、聚-D-L-乙交酯(PLG)、聚-ε-己内酯(PCL)、聚-D-L-丙交酯-共-乙交酯(PLGA)和聚氰基丙烯酸酯(PCA)、壳聚糖、明胶、聚烷基氰基丙烯酸酯(PAC)。可生物降解的纳米粒子的最优选变体是PLGA纳米粒子。例如，纳米粒子或存在于纳米粒子表面上的聚合结构可被诸如脂肪酶、酯酶、alcalase、羟化酶、双加氧酶等的酶降解。
在本发明的进一步的具体实施方案中，所述纳米粒子载体可以与细胞穿透剂缔合或提供细胞穿透剂。这样的试剂可以是例如，聚Arg肽TAT，穿膜肽，聚精氨酸或聚赖氨酸肽，包含阳离子核定位信号序列的肽，与支架连接的阳离子部分，例如肽、低聚氨基甲酸酯、loligome或PNA低聚物。更多细节可以从合适的文献来源例如Fillon等人，2005J.Am.Chem.Soc，127，11798-11803中获得。
在具体的实施方案中，纳米颗粒还可以与生物分子连接，这些生物分子将纳米粒子引导到体内的特定部位、细胞内的特定细胞器、或引导纳米粒子专门跟踪单个蛋白质或RNA分子在活细胞中的运动。除了如本文定义的缀合物之外，这样的亲和性分子可包括适体或肽。这些亲和性分子通常与纳米粒子或与其表面上的层共价连接。优选所述缀合物或亲和性分子以每纳米粒子可控的数量存在。包含多于一个本发明的缀合物、带有多个靶向基团的多价纳米粒子，可以使受体簇集，这可激活某些细胞信号传导途径并提供更强的锚定。带有单个结合位点或单个缀合物的单价纳米粒子倾向于避免簇集。在优选的实施方案中，提供了多价纳米粒子。可针对纳米粒子的尺寸调节缀合物/纳米粒子的量。例如，在本发明的上下文中，可使用2:100或5:100缀合物/纳米粒子的比率。
本发明的缀合物和纳米粒子之间的连键可以任何合适的形式提供。例如，可通过纳米粒子和生物分子之间的分子间引力例如共价键合、吸附如化学吸附及非共价相互作用来实现连键。在某些实施方案中，所述连键可以是脂质体整合到双层结构、例如细胞的双层结构中。在进一步的实施方案中，可通过与细胞上的受体结构共价连接的配体来实现连键。还设想了穿透细胞或被吸附到细胞上的纳米粒子。特别优选通过内体途径利用脂质体的摄取。不希望受理论束缚，假定递送的脂质体将在内体区室中释放。随后可通过脂肪酶来提供运载物本身从脂质体双层的释放，脂肪酶被认为破坏次级内体或溶酶体区室中的脂质体。优选运载物的释放在初级内体中进行。可影响运载物释放的其它因素是pH，在某些实施方案中，可影响或改变pH来控制所述运载物释放。本发明还设想了通过脂质体的脂质双层的浓度和/或组成来适应内体形态。
本发明所设想的纳米粒子将用作运载物运输的载体。因此，纳米粒子与如本文所述的一种或多种运载物分子连接，所述运载物分子通常提供在所述粒子的表面上。这些运载物分子也可以任何合适的形态例如通过分子间吸引力、共价键、吸附例如化学吸附及非共价相互作用与所述纳米粒子连接。可鉴于纳米粒子的尺寸、其材料、其形态以及运载物的尺寸和/或形态来调节每纳米粒子的运载物的量。通常，可给出1纳米粒子:1-1000运载物实体的比率。
在进一步的实施方案中，所述可被提供为磁性纳米粒子，例如超顺磁性粒子。因此，优选的材料是磁性或铁磁性金属、合金或组合物。这样的粒子特别可用于磁共振成像技术的情形中。特别优选所述纳米粒子是金纳米粒子、银纳米粒子或铁纳米粒子。
所述纳米粒子可提供为胶体或包含在胶体内。如本文所用的术语“胶体”涉及胶体系统，其中多分子粒子分散在介质中，至少一个维度在1nm和1μm之间。或者，在所述系统中，在1nm和1μm之间的距离处可发现不连续性。通常，胶体是固体粒子、例如本文定义的纳米粒子分散在液体介质中的混合物。该术语通常适用于粒子大于原子尺寸但小到足以表现出布朗运动的情况，粒径通常在纳米到微米的范围内。
如本文所用的术语“肽载体”或“蛋白质载体”涉及如上文定义的肽或蛋白质结构，其履行作为载体的作用。照此，肽或蛋白质本身可以与一个或多个不同的分子连接。这样的连接是例如通过氨基酸的侧链与另一分子共价结合。或者，可通过非共价结合例如分子间引力、化学吸附、静电引力等将肽或蛋白质与其它元件连接。在进一步的具体实施方案中，肽或蛋白质载体本身可具有一种或多种附加功能。通常，所述肽或蛋白质载体可具有抗原功能或具有疫苗功能，例如呈递病原体例如细菌、病毒、真核寄生虫或癌症抗原或变应原的暴露或表面蛋白。
如本文在载体的情形下所用的术语“毒素载体”或“毒素”涉及有毒化合物，其提供至少两种功能(a)毒害、干扰、杀死或损伤生物元件，例如细胞或组织，以及(b)运输运载物，例如如本文定义的运载物。要当做运载物，可将毒素例如通过共价或非共价与所述运载物例如抗原、小分子等连接。优化了所述结合，以使引起杀死、损伤或中毒功能的结构域不会受到阻碍或受到不利影响。在本发明的情形中使用的毒素的示例是小分子、肽或蛋白质。这些化合物可以与生物大分子例如酶或细胞受体相互作用。毒素的毒性可以有很大变化，从通常的轻微毒性例如蜂毒素到肉毒毒素情况下的严重毒性。本发明的优选的毒素载体是霍乱毒素、大肠杆菌肠毒素、百日咳毒素、肉毒毒素、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)C2毒素、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)iota毒素或链球菌溶血素O。
所述载体还可以是树枝状聚合物。如本文所用的术语“树枝状聚合物”涉及具有树状结构的重复分支分子。树枝状聚合物通常以结构完美为特征，并包含单分散性和对称球形的化合物。树枝状聚合物通常被认为具有三个主要部分：核、内壳和外壳。例如，可以将树枝状聚合物设计成在这些部分的每一个中具有不同的功能，来控制性质例如溶解性、热稳定性和用于特定应用的化合物的连接。树枝状聚合物可以由其甲基基团被树枝状结构取代的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚苯乙烯、聚乙炔、聚苯撑、聚噻吩、聚芴、聚(苯乙烯)、聚(苯乙炔)、聚硅氧烷、聚氧杂降冰片烯、寡聚螺缩酮、聚甘油或聚(乙烯亚胺)(PEI)主链构成。特别优选的是PMMA树枝状聚合物。所生成的聚合物在厚度和电荷以及范围从低分子量到高分子量结构的重量方面可以不同。所述树枝状聚合物可以与要运输的运载物元件连接或包含所述运载物元件。例如，可通过与运载物例如抗原、小分子等的共价或非共价结合来连接所述运载物。所述结合可基于酯、酰胺、三唑、胺或醚的形成。
在进一步的实施方案中，所述载体可以是富勒烯。如本文所用的术语“富勒烯”涉及以中空球、椭球体或管或任何其它合适的中空形状的形式的碳分子。富勒烯的一种亚型是Buckminsterfullerene或巴克球，它像足球，包含五边形和六边形环。在具体的实施方案中，富勒烯可包含C69、C79、C76、C82、C84、C86、C88、C90、C92、C94、C96、C98或C100结构。本发明也设想的另一替代方案是硼基富勒烯，例如具有B80结构。还设想了杂富勒烯，其在一些位置包含例如杂原子，例如硼、氮、氧或磷原子。在进一步的实施方案中，富勒烯可作为金属富勒烯提供，例如作为掺杂有Sc、Y、La、镧系或锕系金属或金属氧化物的石墨棒。还设想了三金属氮化物模板化的金属富勒烯、簇富勒烯或trimetaspheres，后者含有与三个金属离子键合的中心氮原子(氮化物)。在典型的实施方案中，可将富勒烯功能化或衍生化以增加富勒烯在有机介质或水性介质中的溶解性，例如通过氮杂次甲基鎓内盐的环丙酮化(cycloproponation)、多羟基化或环加成。在一个具体实施方案中，可以用自由基衍生富勒烯，这允许清除活性氧，并使富勒烯成为高活性抗氧化剂。在另一个实施方案中，富勒烯可以非共价缔合地运输运载物。一种可能性是运载物例如蛋白质、抗体、核酸等通过超分子相互作用、或疏水相互作用、静电相互作用等与富勒烯表面缔合。在核酸运载物运输的情况下，所述载体优选是正-四(哌嗪并)富勒烯环氧化物衍生物，或环丙烷化的C60富勒烯，例如具有中性、阳离子或阴离子官能团。在进一步的实施方案中，可以提供富勒烯-免疫缀合物，其中，例如，在富勒烯和例如富勒烯之间存在二硫键。在这种情形下，优选使用C60丙二酰二丝氨醇酰胺(malonodiserinolamide)富勒烯衍生物，它可以允许抗体或蛋白质和富勒烯之间非共价的自发结合。在进一步的优选实施方案中，富勒烯可用于构型和衍生化，其允许聚集成基于富勒烯的胶束、囊泡或脂质体样结构。这些结构可在其疏水性核心中包含任何合适的药物分子。在又一组实施方案中，运载物可以与富勒烯载体共价连接。这通常可以在富勒烯和存在于富勒烯表面上的运载物分子之间提供额外的接头元件。这尤其允许延缓运载物释放。还设想了可以通过形成三唑连键与其它实体连接的糖基富勒烯(glycofullerenes)。更多细节将是技术人员已知的，或可从合适的文献来源例如Bolskar，2016，《纳米技术全书》(Encyclopedia of Nanotechnology)，Springer，或
Figure GDA0002759246180000471
等人，2016，Nature Chemistry，8，50–57获得。
在进一步的实施方案中，所述载体可具有碳纳米管的形态。如本文所用的术语“碳纳米管”涉及具有圆柱形纳米结构的碳的同素异形体。这些圆柱形碳分子通常具有不同寻常的性质，其可用于运载物运输和递送活动。碳纳米管通常显示出很高的强度和刚度。它们通常以高达132,000,000:1的长径比构建。碳纳米管通常还具有高热导率。它们通常具有长而中空的结构并且例如通过一个碳原子厚的碳片层、通常称为石墨烯形成壁。这些片层通常以特定的和离散的角度卷起，并且卷角和半径的组合可决定纳米管在强度、刚度等方面的性质。纳米管通常分为单壁纳米管(SWNT)和多壁纳米管(MWNT)，二者都是本发明所设想的。纳米管可进一步列成绳状结构，假定通过范德华力将其结合在一起。
通常认为碳纳米管属于富勒烯结构家族。在本发明的某些实施方案中，碳纳米管可以如上文在富勒烯的情形中所述进行修饰。特别优选的是碳纳米管和核酸、蛋白质和肽之间的连键。还设想了通过游离羧酸进行修饰，游离羧酸可通过形成酯或胺连键与其它实体连接。
在某些实施方案中，如上文定义的载体可以在有或没有运载物下使用。在使用没有运载物的载体的情况下，它本身可以提供如本文所述的功能性。在进一步的实施方案中，所述载体包含运载物或与运载物缔合。运载物与载体连接的形式可取决于载体的形式/性质以及运载物的形式/性质。在一些情况下，可以设想共价连键，而在其它情况下，可以使用静电连键。在另一些实施方案中，所述缔合可以基于运载物元件嵌入脂质体或类似结构中。例如，运载物可位于载体内和/或与载体外部连接和/或整合到载体的单层或双层结构中，所述载体例如如上提到的脂质体。
如本文所用的术语“运载物”是指任何合适的物质、化合物或元件，其位于如上定义的载体内和/或与载体的外部例如表面连接或缔合和/或整合到载体的单层或双层结构中，例如在载体是包含膜或双层例如脂质体的实体并且应运输到细胞、特定的细胞区室例如内体的内部、或运输到细胞表面或周围的情况下。优选将运载物卸载到细胞的内部。在医疗情形下，优选运载物对细胞、包含所述细胞的组织或包含所述细胞的生物体提供或介导有益的效果。这样的有益效果的示例是在递送到细胞或细胞内之后的治疗活性/能力、诊断活性/能力。这可以在体内进行，但在某些实施方案中也可离体、例如在体外环境中进行，通常选择之后再引入生物体中，例如通过重新植入细胞。“治疗活性”可包括治疗、改善和/或预防/避免疾病或医疗状况。术语“诊断活动”可以包括对病理/医疗状况的可视化、检测、辨别和/或鉴定并归结临床表象的偏差。
优选地，运载物涉及但不限于小分子、肽、蛋白质、细胞毒性物质、核酸、着色剂、色素、染料、金属、放射性核素、病毒、修饰病毒、病毒载体、接种物、质粒和/或多组分体系。
在本文的上下文中本文所用的“肽”或“蛋白质”是如上文定义的肽或上文定义的蛋白质。优选这样的肽或蛋白质对于运载物要运去的细胞或包含所述细胞的生物体履行功能。这样的功能可以是治疗或诊断功能。所述肽或蛋白质可源自于任何合适的类别。例如，它可以是抗原性元件、抗体、酶、变应原、毒素、催化实体、受体等。在具体的实施方案中，作为本发明的运载物的一部分的蛋白质可选自：治疗蛋白，自杀蛋白，肿瘤抑制蛋白，转录因子，激酶抑制剂，激酶，调节蛋白，凋亡蛋白，抗凋亡蛋白，微生物抗原，病毒抗原，细菌抗原，寄生虫抗原，细胞抗原，癌症抗原，分化因子，永生化因子，蛋白质/肽毒素，酶，肽/蛋白质激素，肽/蛋白质粘附分子，受体分子，肽抑制剂，或肽/蛋白质抗衰老剂。
如本文中在运载物的情形下所用的术语“治疗蛋白”涉及本领域技术人员已知的对动物体、特别是对人体具有治疗效果的任何蛋白。通常，该术语涉及治疗酶。这样的酶的示例包括：可用于治疗溶酶体葡萄糖脑苷脂酶缺乏症(戈谢病(Gaucher's disease))的阿糖脑苷酶，可用于治疗粘多糖贮积症I的α-L-艾杜糖苷酶，或可用于治疗严重的合并免疫缺陷综合征的腺苷脱氨酶。
如本文中在运载物的情形下所用的术语“自杀蛋白”涉及由于该蛋白的作用、通常是由于在相应底物存在下的酶促反应导致细胞破坏的任何蛋白。这样的蛋白的示例是核苷激酶，例如HSV-1TK，或Dm-dNK的多底物脱氧核糖核苷激酶。
如本文中在运载物的情形下所用的术语“肿瘤抑制蛋白”涉及保护细胞以免走上癌症之路的任何蛋白。优选地，该术语涉及本领域技术人员已知的任何这样的蛋白。更优选地，该术语涉及Rb蛋白、p53肿瘤抑制剂、APC和CD95。
如本文中在运载物的情形下所用的术语“转录因子”涉及如下所述的任何蛋白，其使用DNA结合域与DNA的特定部分结合并且是本领域技术人员已知的控制遗传信息从DNA到RNA转录的系统的一部分。优选地，该术语涉及TFIAA、TFIIB、TFIID、TFIIE、TFIIF、TFIIH和TATA结合蛋白(TBP)。
如本文中在运载物的情形下所用的术语“激酶抑制剂”涉及是一种特异性阻断蛋白激酶作用的酶抑制剂的任何蛋白。优选地，该术语涉及Erbitux(西妥昔单抗)和赫赛汀。本发明当然还设想了使用非蛋白激酶抑制剂，其可以是例如如本文定义的小有机分子。
如本文中在运载物的情形下所用的术语“激酶”涉及将磷酸基团从高能供体分子例如ATP转移到特定靶分子的任何蛋白。优选地，该术语涉及酪氨酸激酶或MAP激酶、MEK1、或MEK2。
如本文中在运载物的情形下所用的术语“凋亡蛋白”涉及导致多细胞生物体中程序性细胞死亡的任何蛋白。更优选地，该术语涉及促凋亡蛋白BAX、BID、BAK或BAD。
如本文中在运载物的情形下所用的术语“抗凋亡蛋白”涉及阻止多细胞生物体中程序性细胞死亡的任何蛋白。优选地，该术语涉及抗凋亡蛋白样Bcl-XI、Bcl-2以及Bcl-2家族的其它成员。
在运载物分子的情形下术语“微生物抗原”“病毒抗原”“细菌抗原”“寄生虫抗原”和“细胞抗原”分别涉及能够刺激源自于微生物、病毒、细菌、寄生虫或细胞的免疫应答的免疫原，特别是如下文所定义。
如本文中在运载物的情形下所用的“分化因子”涉及在发育中起主要功能并导致组织、特定细胞的细胞群分化的任何因子。优选地，该术语涉及生长分化因子(GDF)，如GDF1、GDF2、GDF3、GDF5、GDF6、GDF8、GDF9、GDF10、GDF11和GDF15。
如本文中在运载物的情形下所用的术语“永生化因子”涉及导致细胞死亡率不随日历年龄变化而持续增加的任何因子。优选地，该术语涉及本领域技术人员已知的任何这样的因子。更优选地，该术语涉及端粒酶或大T抗原。
如本文中在运载物的情形下所用的术语“肽/蛋白质激素”是指作为信使通过血液将信号从一个细胞(或细胞群)携带到另一个细胞(或细胞群)的任何化合物。更优选地，该术语涉及前列腺素、5-羟色胺、组胺、缓激肽、胰激肽和胃肠道激素、释放激素、垂体激素、胰岛素、血管加压素(ADH)、胰高血糖素、脑啡肽、降钙素、皮质类固醇、促肾上腺皮质激素释放激素(CGR)、P物质、GRP、MSH和神经介质。
如本文中在运载物的情形下所用的术语“肽/蛋白质粘附分子”涉及细胞表面上参与细胞粘附过程中与其它细胞或与细胞外基质(ECM)结合的肽或蛋白质。优选地，该术语涉及本领域技术人员已知的任何这样的分子。更优选地，该术语涉及IgSF CAM，如NCAM、ICAM-1、VCAM-1、PECAM-1、L1、CHL1、MAG、整联蛋白或选择蛋白。
如本文中在运载物的情形下所用的术语“受体分子”涉及在细胞膜上或在细胞质或细胞核内的与配体结合并通常转导信号的蛋白。优选地，该术语涉及代谢型受体、G蛋白偶联受体、毒蕈碱型乙酰胆碱受体、腺苷受体、肾上腺素受体、GABA受体、血管紧张素受体、大麻素受体、缩胆囊素受体、多巴胺受体、胰高血糖素受体、代谢型谷氨酸受体、组胺受体、嗅觉受体、阿片受体、趋化因子受体、钙敏感受体、生长抑素受体、5-羟色胺受体或分泌素受体。
如本文中在运载物的情形下所用的术语“肽抑制剂”涉及对生理功能、优选对蛋白质功能如酶促功能具有抑制效应的肽。
如本文中在运载物的情形下所用的术语“蛋白质/肽抗衰老剂”涉及任何防止、减缓或逆转衰老效应的化合物。优选地，该术语涉及人生长激素(HGH)。
如本文所用的术语“细胞毒性物质”通常涉及对活细胞、特别是对高等真核细胞、更具体是对哺乳动物或人类细胞有毒的任何化合物。由于细胞毒性物质的作用，细胞可能经历坏死、细胞会停止生长活动或分裂、或细胞可经历凋亡程序。典型地，经历坏死的细胞表现出快速肿胀、失去膜完整性、新陈代谢降低并将内容物释放到环境中。相形之下，凋亡的特征是某些细胞学和分子事件，包括细胞折射率的变化、细胞质收缩、核浓缩和DNA裂解成规则大小的片段。细胞毒性可根据适当的测定法来测量，例如通过测量细胞膜完整性。在癌症治疗的情况下，细胞毒性物质可以是化疗化合物。或者，细胞毒性物质也可以是传达抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的抗体，其中细胞被与抗体结合的淋巴细胞杀死。细胞毒性淋巴细胞的示例包括细胞毒性T细胞和自然杀伤细胞。
如本文中在运载物的情形下所用的术语“化疗化合物”涉及用于癌细胞的治疗性治疗的几种不同功能类别的化合物。这些化合物可以是例如烷基化剂、蒽环类、细胞骨架破坏剂(紫杉烷)、埃博霉素、组蛋白脱乙酰基酶抑制剂、拓扑异构酶I和II的抑制剂、激酶抑制剂、核苷酸类似物或前体类似物、肽类抗生素、铂基药剂、类视黄醇、长春花生物碱及其衍生物。本文设想的烷基化剂的示例是环磷酰胺，其是在含有低水平的ALDH(醛脱氢酶)的细胞中、例如在肝、肠、骨髓干细胞中形成的磷酰胺氮芥代谢物。所述代谢物通常在鸟嘌呤N-7位处交联DNA，这被认为导致细胞凋亡。一个进一步的示例是二氯甲基二乙胺，其通常在鸟嘌呤N-7位处交联DNA并由此阻止细胞复制，导致细胞凋亡。另一个示例是苯丁酸氮芥，其促进核酸烷基化并交联DNA，导致细胞周期停滞。该化合物可以被经常在癌症组织中过表达的人谷胱甘肽转移酶Pi(GST P1-1)解毒。进一步的示例是亚硝基脲，其是亲脂性DNA烷基化剂，因此可以穿过血脑屏障。还设想了替莫唑胺，其促进DNA在O-6/n-7位处的鸟嘌呤的烷基化/甲基化。它还可以作为咪唑四嗪衍生物形式的前药使用。编码为O-6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶的O-6-烷基鸟嘌呤DNA烷基转移酶可防止细胞损伤。本文中设想的蒽环类的示例包括柔红霉素、阿霉素、表柔比星、伊达比星、米托蒽醌、匹克蒽醌、洛索蒽醌、莎巴比星(阿霉素的二糖类似物)和戊柔比星(阿霉素的半合成类似物)。这些化合物通常充当DNA嵌入剂，从而抑制例如拓扑异构酶II。本文中设想的细胞骨架破坏剂(紫杉烷)的示例包括紫杉醇、多西他赛、abraxane和泰素帝。这些化合物通常靶向微管蛋白，特别是是通过αβ-微管蛋白异二聚体亚基结合，导致有丝分裂纺锤体组装、染色体分离和细胞分裂的缺陷。本文中设想的埃博霉素的示例包括埃博霉素A至F。另外的实例是伊沙匹隆，帕土匹隆和优替德隆(utidelone)。这些化合物导致微管蛋白干扰。它们具有比紫杉醇样化合物更好的水溶性，这可导致功效增加。本文中设想的组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的示例包括伏立诺他和罗米地辛。这些化合物通常与合锌依赖性活性位点结合，并起到锌离子的螯合剂的作用，导致乙酰化蛋白质、特别是组蛋白的蓄积。本文设想的拓扑异构酶I抑制剂的示例包括依立替康。依立替康与拓扑异构酶I结合并形成三元DNA复合物，其阻止DNA重新连接并造成DNA损伤。进一步的示例包括拓扑替康、Silatecan、考司替康(cositecan)、依喜替康、勒托替康、吉马替康、贝洛替康和鲁比替康(rubitecan)，它们是喜树碱的半合成衍生物。本文中设想的拓扑异构酶II抑制剂的示例包括依托泊苷，它与DNA和拓扑异构酶II形成三元复合物，防止DNA重新连接。还设想了替尼泊苷，其稳定拓扑异构酶II-DNA中间体并诱导双链DNA断裂。另一个示例是他氟泊苷(tafluposide)。本文中设想的激酶抑制剂的示例包括硼替佐米，其是蛋白酶体抑制剂，其中它的硼原子结合26S蛋白酶体的催化位点。进一步的示例包括厄洛替尼和吉非替尼，它们通过与ATP结合位点可逆结合而抑制EGFR酪氨酸激酶，从而阻止信号级联。进一步设想了维罗非尼，如果B-Raf具有V600E突变，则维罗非尼导致B-Raf/MEK/ERK途径中断。还考虑了伊马替尼，它是许多酪氨酸激酶的抑制剂。它通常占据TK活性位点来降低bcr-abl活性，例如在abl与bcr发生融合的慢性骨髓性白血病中。进一步设想了维莫德吉，它是一种平滑受体(smoothened receptor)的环巴胺竞争性拮抗剂(SMO，hedgehog信号传导通路的一部分)。它可以特异性地用于基底细胞癌。本文中设想的核苷酸类似物或前体类似物的示例包括：阿扎胞苷(是核苷胞苷的类似物，在低浓度下引起低甲基化并在高浓度下可导致细胞毒性)，硫唑嘌呤(抑制嘌呤合成)，卡培他滨，阿糖胞苷(使胞嘧啶碱基与阿拉伯糖联合，是一种抗代谢剂；它通过被人胞嘧啶脱氧核糖并入DNA而起作用，通常诱导细胞死亡)，多西氟啶(卡培他滨的代谢产物)，氟尿嘧啶(是胸苷酸合酶抑制剂，阻断嘧啶胸苷的合成)，吉西他滨(通常作为胞苷整合在DNA链中，导致不可修复的错误和细胞死亡)，羟基脲(通过清除酪氨酸自由基而是核糖核苷酸还原酶的抑制剂，并通常减少脱氧核糖核苷酸的产生)，巯基嘌呤(抑制黄嘌呤氧化酶)，甲氨蝶呤(抑制DNA、RNA、胸苷酸和蛋白质的合成)和硫鸟嘌呤(是鸟嘌呤的类似物，导致鸟苷酸合成的抑制)。本文中设想的肽类抗生素的示例包括博来霉素(产生诱导DNA链断裂)和放线菌素(在转录起始复合物处结合DNA，从而阻止RNA延长)。本文中设想的铂基药剂的示例包括卡铂、顺铂(其通过结合和交联DNA来干扰DNA复制)和奥沙利铂(其通过结合和交联DNA来干扰DNA复制)。本文中设想的类视黄醇的示例包括维甲酸(已显示出迫使急性早幼粒细胞白血病细胞分化并停止增殖)，阿利维甲酸(alitretinoin)(被认为是类视黄醇受体的内源性配体)和贝沙罗汀(其激活类视黄醇X受体并诱导细胞分化和凋亡)。本文中设想的长春花生物碱及其衍生物的示例包括长春碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨，它们被认为是微管抑制剂。
在一个进一步的实施方案中，本发明特别设想使用α-鹅膏毒环肽及其类似物或衍生物作为有毒物质。这些化合物通常抑制RNA聚合酶II和III。在具体的实施方案中，α-鹅膏毒环肽及其类似物或衍生物可以与蛋白质或肽连接，并以这种形式作为运载物运输到期望的终点，即细胞或组织。
根据其作用方式，以上表征的有毒物质可用于细胞内或细胞外施用。因此，它们可以被提供在如本文定义的细胞内递送运载物或如本文定义的细胞外递送运载物的载体系统中。
如本文中在运载物的情形下所用的术语“小分子”涉及在治疗上有用并优选包括药物或其它生物、治疗或诊断活性剂的分子，例如有机分子，其作用是确保细胞正确运行，或可诱导例如细胞凋亡或细胞裂解的分子，其中死亡的细胞例如癌细胞或异常细胞的死亡是期望的，或诱导免疫反应的分子，或标记功能性的分子。所述小分子通常具有小于900Da的低分子量。通常，分子量约900Da或更小的小分子被假定为能够跨细胞膜快速扩散。因此，可以将小分子作为运载物提供以便细胞内和/或细胞外递送。在某些实施方案中，小分子可能在水性液体例如血清和盐水中的溶解性差。因此，根据本发明，治疗功效受其低溶解度限制的化合物可以施用更大的剂量，并且由于较高的细胞摄取水平，以摩尔为基准可更有效。同样，所述化合物在低或很低浓度下可能已经有效。因此，通过根据本发明将这些化合物作为运载物特异性地靶向特定细胞，避免了全身性而非特异性的施用，从而允许降低待施用的化合物的总量。本发明设想作为运载物运输的小分子的示例是例如抗菌剂、抗真菌剂、抗病毒剂、抗增殖剂、细胞抑制剂、免疫抑制剂、组胺受体拮抗剂、维生素、止痛剂、抗肿瘤剂、抗炎剂、治疗性有机分子、抑制剂，例如诸如激酶抑制剂等的酶抑制剂。本文中设想的抗菌剂的示例包括氨基糖苷类例如新霉素或庆大霉素、多粘菌素、氯霉素、杆菌肽、弗氏菌丝素、恩诺沙星、马波沙星、咪康唑、磺胺嘧啶银、聚维酮碘、氯己定和乙酸。本文中设想的抗真菌剂的示例包括多烯抗真菌剂类例如两性霉素B、杀念菌素或哈霉素(hamycin)等；咪唑类例如联苯苄唑、布康唑或克霉唑等；三唑类例如阿巴康唑(albaconazole)、艾氟康唑或epoxiconazole等；噻唑类例如阿巴芬净；烯丙胺类，和棘白菌素类。本文中设想的抗病毒剂的示例包括金刚烷胺、金刚乙胺、普可那利(pleconaril)、阿昔洛韦(aciclovier)、齐多夫定、拉米夫定(一种逆转录抑制剂)和利福平(一种组装抑制剂)。本文中设想的细胞抑制剂的示例包括烷基化剂，例如如上文定义的；抗代谢物例如甲氨蝶呤、硫唑嘌呤、巯基嘌呤或氟尿嘧啶，如上文定义的。本文中设想的免疫抑制剂的示例包括糖皮质激素例如泼尼松、地塞米松、氢化可的松；细胞抑制剂；抗体；作用于抑免蛋白的药物例如环孢菌素、他克莫司、西罗莫司或依维莫司；以及干扰素、阿片类药物、TNFα结合蛋白、霉酚酸酯、芬戈莫德和多球壳菌素。本文中设想的组胺受体拮抗剂的示例包括西咪替丁、雷尼替丁、法莫替丁和zizatidine。本文中设想的止痛剂的示例包括扑热息痛、非那西丁、阿司匹林、布洛芬、萘普生和阿片样物质例如吗啡。本文中设想的抗肿瘤剂的示例包括核苷类似物、抗叶酸物、拓扑异构酶I抑制剂、蒽环类、鬼臼毒素、紫杉烷、长春花生物碱、烷基化剂、铂化合物、酪氨酸激酶抑制剂、mTOR抑制剂、类视黄醇、免疫调节剂和组蛋白脱乙酰酶抑制剂，例如如上文定义的。本文中设想的抗炎剂的示例包括抗白介素抗体、消退素、糖皮质激素、蛋白酶抑制剂、他汀类、组蛋白脱乙酰基酶抑制剂、前列腺素激动剂、磷酸二酯酶-4抑制剂、过氧化物酶体增殖物激活剂受体激动剂、补体系统抑制剂、抗凝剂和溶栓剂。
如本文中在运载物的情形中所用的术语“核酸”是指本领域技术人员已知的任何核酸，例如多核苷酸，如DNA、RNA、单链DNA、cDNA或其衍生物。优选地，该术语是指由DNA和RNA及其类似物形成的寡核苷酸和多核苷酸，其具有为了与互补靶标杂交而设计的选定序列，例如用于单链或双链靶标、或用于表达核酸转录物的反义序列或由该序列编码的蛋白质。DNA可以按例如A-DNA、B-DNA或Z-DNA的形式提供。类似物包括带电荷并优选不带电荷的主链类似物，例如膦酸酯，膦酸甲酯，氨基磷酸酯，优选N-3'或N-5'硫代磷酸酯，不带电荷的基于吗啉的聚合物，PNA或CNA，HNA，LNA或ANA。这样的分子可用于各种治疗方案，包括例如酶替代疗法、基因疗法或反义疗法。RNA可以是例如p-RNA、即吡喃糖苷-RNA的形式，或结构修饰形式，如发夹RNA或茎环RNA。此外，该术语是指反义RNA。由核酸编码的蛋白质、RNA或核糖体可在细胞中表现不足(under-represented)、没有功能或不存在，而由核酸编码的反义RNA可使得分子的不良功能消除。术语“PNA”涉及肽核酸，即类似于DNA或RNA的人工合成聚合物，其用于生物学研究和医学治疗，但不是已知天然存在的。PNA主链通常由通过肽键连接的重复N-(2-氨基乙基)-甘氨酸单元构成。各种嘌呤和嘧啶碱基通过亚甲基羰基键与主链连接。PNA通常像肽一样描绘，N末端在第一(左侧)位，C末端在右侧。术语“CNA”涉及氨基环己基乙烷酸核酸。此外，该术语涉及环戊烷核酸，即包含例如2'-脱氧卡巴鸟苷的核酸分子。术语“HNA”涉及己糖醇核酸，即。由标准核碱基和磷酸化的1,5-失水己糖醇主链装配的DNA类似物。术语“LNA”涉及锁定核酸。通常，锁定核酸是一种修饰的并因此难接近的RNA核苷酸。LNA核苷酸的核糖部分可以用连接2'碳和4'碳的额外桥连基修饰。这样的桥连基将核糖锁定在3'-内型结构构象。所述锁定核糖构象增强了碱基堆积和主链预组织。这可以显著增加热稳定性，即寡核苷酸的解链温度。术语“ANA”涉及阿拉伯糖核酸或其衍生物。在本发明的情形中优选的ANA衍生物是2'-脱氧-2'-氟-β-D-阿拉伯糖核苷(2'F-ANA)。在一个进一步的优选实施方案中，核酸分子可包含单链DNA、RNA、PNA、CNA、HNA、LNA和ANA中任何一种的组合。在本发明的具体实施方案中，如上文定义的核酸编码目的蛋白或肽，例如治疗性蛋白或免疫活性蛋白，或可诊断性检测的蛋白，例如生物发光蛋白，即旨在递送给靶细胞、即Langerin+细胞的蛋白或肽。在优选的实施方案中，这样的蛋白可以是如下文定义的癌症抗原或毒性蛋白等。因此，所述核酸提供了允许在细胞的环境中下表达编码蛋白的元件，例如与基因可操作连接的启动子、终止子，或允许整合到细胞基因组中的元件，或允许在细胞核中永久性或暂时性存在、例如作为染色体外实体的元件。例如，所述核酸可以按如下文定义的质粒形式提供。
如本文在运载物的情形下所用的术语“着色剂”涉及至少提供对生物元件例如细胞或组织进行着色或染色的功能的任何合适的分子着色剂。着色剂可以与如本文定义的载体结构、例如纳米粒子连接。着色剂可以例如通过共价或非共价结合与所述载体连接，或作为运载物例如在脂质体载体中运输，或与其它运载物例如抗原、小分子等连接。所述结合可以被优化，使得导致着色或染色功能的生色团不会受到阻碍或受到负面影响。通常，取决于所涉及的介质，着色剂可以充当颜料或染料。优选所述着色剂是染料。
如本文在运载物的情形下所用的术语“颜料”涉及由于波长选择性吸收而改变反射或透射光的颜色的任何材料。这种物理过程不同于的荧光、磷光和材料发射光的其它形式发光。颜料通常不溶于水。在一个示例中，颜料可以是无机物质。或者，颜料也可以是有机性质的。通常，颜料可不溶于水性液体。在具体的实施方案中，颜料的尺寸可大于1μm。合适的颜料的示例是基于血红素或卟啉的，例如叶绿素、胆红素、血蓝蛋白、血红蛋白、肌红蛋白、类胡萝卜素、血色素、胡萝卜素例如α和β胡萝卜素、番茄红素或视紫红质、叶黄素例如角黄素、玉米黄素或叶黄素、植物光敏素、藻胆蛋白、多烯烯醇化物、黑色素、尿色素、类黄酮。
如本文在运载物的情形下所用的术语“染料”是指一种有色物质，其吸收一些特定波长的可见光，通常在水溶液中应用。在一个典型的示例中，染料是不溶于水的小分子。合适的染料的示例是吖啶染料、蒽醌染料、芳基甲烷染料例如二芳基甲烷染料、三芳基甲烷染料、偶氮染料、重氮染料、基于硝基官能团的硝基染料、基于亚硝基官能团的亚硝基染料、酞菁染料、醌-亚胺染料例如二氨吖嗪染料或番红染料、吲达胺、吲哚酚染料、oxazone染料、噻嗪染料、噻唑染料、呫吨染料、芴染料、派洛宁染料、荧光酮染料、或罗丹明染料。特别优选的是荧光素、罗丹明、藻红蛋白、荧光胺和视紫红质。
在某些实施方案中，本发明还设想使用其它提供颜色的化合物(例如作为待运输到细胞/进入细胞的运载物)，例如，化学发光化合物例如鲁米诺、咪唑，生物发光蛋白例如萤光素、萤光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、mCherry、mOrange、TagBFP、Cerulean、Citrine、mTurquoise、红色荧光蛋白(RFP)、黄色荧光蛋白(YFP)及其衍生物，例如EGFP、ECFP、BFP、EBFP、EBFP2或BFP。可在本发明的上下文中使用的其它提供颜色的化合物包括6-FAM、HEX、TET、ROX、Cy2、Cy3、Cy5、Cy7、德州红(Texas Red)或罗丹明(Rhodamine)、PerCP、太平洋蓝(Pacific Blue)、APC、Alexa 405、430、488、546、559、594、633、660、674、680、700、瀑布蓝(Cascade Blue)、TAMRA、Dabcyl、黑洞淬灭剂(Black Hole Quencher)、BHQ-1或BHQ-2。
在某些实施方案中，该术语还扩展到显像剂。这样的显像剂的示例是诊断显像剂或造影剂。例如，设想近红外剂和光声剂，例如用于体内应用的。
如本文在运载物的情形下所用的术语“金属”是指本领域技术人员已知的任何金属。优选地，该术语涉及金、铂、锇、银、铁、镧系金属或锕系金属。在一个进一步的实施方案中，该术语还涉及放射性金属。
如本文在运载物的情形下所用的术语“放射性核素”是指放放射性核素或放射性同位素，其为过量的核能，使其不稳定。放射性核素可以是α发射性的放射性核素、β发射性的放射性核素或俄歇电子发射性的放射性核素。合适的放射性核素的示例是3H、14C、32P、33P、35S、125I、11C、13N、15O、18F、64Cu、67Cu、89Sr、99Tc、99mTc、153Sm,123I、125I、129I、131I、77Br、82Rb、68Ga或18F、90Y、177Lu、166Ho、186Re、188Re、149Pm、199Au和105Rh。所述放射性核素还可以配制成合适的组合物或与其他分子或载体连接。
如本文在运载物的情形下所用的术语“病毒”涉及本领域技术人员已知的任何类型的病毒。优选地，病毒是选自腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、单纯性病毒、慢病毒和逆转录病毒。在特别优选的实施方案中，该术语涉及能够引起免疫应答的病毒，例如以疫苗形式的病毒。
如本文在运载物的情形下所用的术语“修饰的病毒”涉及与野生型病毒相比已被改变的病毒分子。如本领域技术人员所知，这样的修饰可优选导致病毒活力降低或影响病毒的结合或相互作用能力。修饰的病毒的典型示例是如疫苗中提供的减毒病毒。
如本文在运载物的情形下所用的术语“病毒载体”是指来源于病毒的遗传元件，其以最大程度减小运用它们的风险的方式被修饰。优选地，该术语涉及本领域技术人员已知的任何这样的元件。通常，在病毒载体中删除了病毒基因组中对于病毒复制至关重要的一部分。优选地，这样的病毒可有效感染细胞，但是一旦感染发生，就需要辅助病毒来提供缺失的蛋白以产生新的病毒体。此外，病毒载体通常显示出低毒性，遗传稳定且不会重排其基因组。更优选地，该术语涉及源自于腺病毒、腺相关病毒或逆转录病毒的以上定义的病毒遗传元件。在特别优选的实施方案中，病毒载体是用于疫苗的病毒载体。这样的载体一般认为是安全的，并通常显示出相关功能的减弱和去除。这样的病毒载体的合适示例是牛痘病毒、禽痘病毒、麻疹病毒、腺病毒、ALVAC、MVA、痘病毒。特别优选的是MVA(修饰的安卡拉牛痘病毒)。
如本文在运载物的情形下所用的术语“接种物”是指提供针对特定疾病的获得性免疫的化合物或组合物。接种物可以是例如类似于致病元件、但是经减毒或以被杀伤或非感染性的形式提供的作用剂。还包含微生物毒素或其部分、表面元件例如存在于致病元件表面的蛋白或糖蛋白或糖分子。此外，所述接种物可以包含或可以是导致病因的元件的抗原或抗原表位，例如如本文定义的癌症抗原、如本文定义的细菌抗原、如本文定义的病毒抗原、如本文定义的自身免疫性疾病抗原、或如本文定义的变应原。所述接种物还可以蛋白或肽的形式、或作为有表达能力的核酸、或作为技术人员已知的任何其他合适的化合物来提供。还可以设想使用多于一种接种物的适当组合、多于一种类型的接种物的组合，例如蛋白质和核酸。所述接种物还可与合适的附加因素例如以佐剂的形式组合，或与合适的载体一起配制。
如本文在运载物的情形下所用的术语“质粒”是指与染色体DNA分离并能够自主复制的任何染色体外DNA分子。优选地，该术语涉及本领域技术人员已知的任何这样的分子。更优选地，该术语涉及能够在真核细胞中自主复制并编码目的多肽的DNA分子，所述目的多肽例如治疗性蛋白或免疫活性蛋白，或可诊断性检测的蛋白，例如生物发光蛋白如GFP或类似的荧光蛋白，例如如本文所提到的。
如本文所用的“多组分系统”可以指包含多于一个组分的任何组分系统或试剂盒。这样的2、3、4、5或更多个组分可以是不同的运载物类型，例如不同的蛋白质、不同的核酸等，或这样的不同运载物类型的混合物，例如蛋白质和核酸等。在进一步的特别优选的实施方案中，所述系统包含通常一起操作或需要某种方法方能起作用或实现某个目标的组分。这样的组分的示例是基因组编辑所必需的组分，包括特殊蛋白质例如核酸酶、RNA元件、DNA插入片段或其他类型的核酸。这样的基因组编辑方法可以是例如CRISPR/Cas系统、基于TALEN的系统、基于锌指核酸酶(ZFN)的系统、基于大范围核酸酶的系统、基于Cre或FLP重组酶和lox r FRT位点的系统。例如，所述多组分体系可以已表达的或即时使用的组分形式提供。或者，可以编码的组分的形式提供所述系统，例如提供在质粒或转录物上，需要细胞机制来表达并由此提供其操作所需的元件。本发明具体设想了使用基于DRACO的系统，即基于双链RNA激活的半胱天冬酶寡聚化蛋白(caspase oligomerizers)的系统。特别优选的是使用CRISPR(成簇的规则间隔的短回文重复序列)/Cas系统。CRISPR/Cas可用于减少特定基因(或基因群或相似基因)的表达或编辑基因组序列。这通常通过表达除CRISPR基因或核酸酶之外的单链RNA来实现。该技术通常依赖于CRISPR基因例如Cas9或除RNA指导序列外的其它类似基因的表达(参见，例如，Cong等人2013，Science，339，6121，819–823)。因此，可以使用适当的侧翼RNA指导序列的表达将双链切割靶向特定序列，所述侧翼RNA指导序列可作为多组分系统的一个组分提供，例如与Cas9或类似的功能一起提供。另外，CRISPR/Cas系统可用于切割mRNA，从而减少表达。在一个优选实施方案中，可包括RNA指导序列和CRISPR基因表达(例如Cas9)作为表达构建体的一部分。所述CRISPR/Cas系统因此可包含将作为运载物提供的必要的核酸和酶组分。
术语“基于TALEN的系统”涉及TALEN的使用，即转录激活因子样效应物核酸酶(Transcription Activator-Like Effector Nuclease)，是一种人工限制性酶，通过将TAL效应物DNA结合结构域与DNA切割结构域融合而产生。TAL效应物是通常由黄单孢菌属细菌或相关物种分泌的蛋白质，或由该蛋白质衍生并经过修饰的蛋白质。TAL效应物的DNA结合结构域可包含例如约33-34个氨基酸序列的高度保守序列，除了第12个氨基酸和第13个氨基酸是高度可变的(重复可变双残基(Repeat Variable Diresidue)或RVD)之外，通常显示与特异性核苷酸识别强相关。TALEN DNA切割结构域可源自于合适的核酸酶。例如，来自FokI核酸内切酶或来自FokI核酸内切酶变体的DNA切割结构域可用于构建杂种核酸酶。由于FokI结构域的独特性，TALEN可优选作为单独的实体提供，其作为二聚体起作用。TALEN或TALEN组分可优选被工程化或修饰以便靶向任何期望的DNA序列。这样的工程化可根据适当的方法来进行，所述方法例如Zhang等人，Nature Biotechnology，1–6(2011)，或Reyon等人，Nature Biotechnology，30，460–465(2012)。基于TALEN的系统可相应地包含必要的核酸例如作为基因组插入片段或引导序列以及要作为运载物提供的酶组分。
如本文所用的术语“基于锌指核酸酶(ZFN)的系统”是指人工限制性酶的系统，其通常通过将锌指DNA结合结构域与DNA切割结构域融合而产生。锌指结构域可优选被工程化或修饰以便靶向任何期望的DNA序列。这样的工程化方法将是技术人员已知的或可从合适的文献来源例如Bae等人，2003，Nat Biotechnol，21，275-80；Wright等人，2006，NatureProtocols，1，1637-1652.)获得。通常，来自II型限制性核酸内切酶、例如来自FokI的非特异性切割结构域，可用作ZFN中的切割结构域。由于该切割结构域二聚化以切割DNA，通常需要一对ZFN靶向非回文DNA位点。本发明设想的ZFN还可以包含所述非特异性切割结构域与各锌指结构域的C-末端的融合。例如，为了允许两个切割结构域二聚化并切割DNA，通常需要两个单个ZFN来结合DNA的以特定距离提供C-端的相反链。应当理解，锌指结构域和切割结构域之间的接头序列可能需要每个结合位点的5'末端分开约5至7bp。本发明设想了任何合适的ZNF形式或变体，例如经典的FokI融合，或FokI的优化版本，以及具有修饰的二聚化界面、改进的结合功能的酶或能够提供异二聚体物种的变体。基于锌指核酸酶(ZFN)的系统可相应地包含必要的核酸，例如作为基因组插入片段或引导序列，以及要作为运载物提供的酶组分。
术语“基于大范围核酸酶的系统”涉及使用脱氧核糖核酸内切酶的系统，其通常具有以约12个至40个核苷酸的双链DNA序列形式的识别位点。大范围核酸酶通常作为分子DNA剪刀起作用，其提供了以序列特异性方式消除或修饰序列的可能性。合适的大范围核酸酶的示例包括内含子核酸内切酶和内含肽核酸内切酶。大范围核酸酶的识别序列可通过基因工程或蛋白质工程进行修饰，以靶向任何目标DNA序列。为了提供序列特异性，可通过在氨基酸序列中引入变异、然后选择功能蛋白来修饰现有大范围核酸酶的特异性。或者，可将来自不同酶的蛋白结构域与所述核酸酶融合，从而产生嵌合大范围核酸酶。这样的嵌合大范围核酸酶可具有例如新的识别位点，其由大范围核酸酶的半位点和蛋白质的半位点构成。在进一步的实施方案中，这两种方法可以组合使用，即修饰大范围核酸酶的结合序列并与来自不同酶的蛋白结构域融合。更多细节，特别是关于工程改造大范围核酸酶的可能性，可从合适的文献来源例如Gao等人，2010，The Plant Journal for Cell and MolecularBiology，61，176–87中获得。基于大范围核酸酶的系统可相应地包含必要的核酸，例如作为基因组插入片段或引导序列，以及要作为运载物提供的酶组分。
如本文所用的术语“Cre-lox系统”涉及Cre重组酶及其相应的识别位点(lox位点)的组合。或者，所述系统可由FLP重组酶及其相应的识别位点(FRT位点)构成。通过以同向重复的方式提供识别位点，可以实现重复序列之间的序列的删除。同样，通过提供其它取向或多于两个识别位点，进一步的重排模式可变得可能，例如序列的倒置。更多细节可从Ryder等人，2004，Genetics，167，797–813或Ito等人，1997，Development，771，761–771中获得。
在进一步的优选实施方案中，运载物可以是药物活性或免疫活性化合物。如本文所用的术语“药物活性化合物”涉及技术人员已知的任何合适的物质、药剂、药物、细胞组分、组织或活性药物成分(API)。这些化合物可包含如上定义的治疗性蛋白、如上定义的放射性核素、如上定义的细胞毒性物质、如上定义的小分子、如上定义的肽或蛋白抑制剂。在一个特别优选的实施方案中，所述药物活性化合物是细胞功能的抑制剂。如本文所用的术语“细胞功能抑制剂”涉及对生理功能、优选对蛋白功能如酶促功能具有抑制效应的任何有机分子、肽或多肽。与不存在抑制剂的情况下的酶活性相比，抑制可以是例如降低酶的活性。在一些实施方案中，术语“抑制”因此是指酶活性的降低至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约25％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、或至少约95％。在其它实施方案中，“抑制”是指酶活性降低约5％至约25％、约25％至约50％、约50％至约75％、或约75％至100％。还设想了酶活性降低约95％至100％，例如活性降低95％、96％、97％、98％、99％或100％。本领域技术人员将认识到，这样的降低可使用技术人员已知的任何合适的方法或测定法来测量。
这样的抑制剂的示例是蛋白酶抑制剂例如利托那韦、HIV蛋白酶抑制剂替拉那韦、或西地那非。还特别优选凋亡抑制剂。凋亡抑制剂的示例包括Bcl-2家族的蛋白，例如Bcl-2、Bcl-XL或Bcl-w。其它示例包括crmA(细胞毒素反应调节因子A)，其可用于抑制半胱天冬酶1、6和8。也考虑了使用IAP(凋亡蛋白抑制剂)，包括Cp-IAP、Op-IAP、XIAP、cIAP1、C-IAP2、NAIP、Livin和存活蛋白。
如本文所用的术语“免疫活性化合物”涉及能够在体内引起免疫反应的任何化合物。在进一步的实施方案中，它或者可能能够免疫调节。还设想了所述免疫活性化合物是免疫耐受诱导剂。
如本文所用的术语“能够在体内引起免疫反应的化合物”涉及被动物、优选哺乳动物、最优选人类的免疫系统的元件识别并导致先天免疫系统或适应性免疫系统激活的任何物质或物质的部分。
先天免疫系统的典型组分是补体系统或自然杀伤细胞。补体系统包含能够通过抗体破坏病原体的20多种蛋白的级联。通常通过补体与已附着于病原体的抗体结合或补体蛋白与外来因素、例如细菌或病毒表面上的碳水化合物结合来激活应答。补体系统还包含能够破坏外来因素例如细胞、寄生虫或其部分(例如卵)、细菌或病毒的蛋白酶。补体激活的进一步结果是产生吸引更多免疫细胞的信号肽。天然杀伤(NK)细胞是通常消灭受损的宿主细胞、例如癌细胞或病毒感染的细胞的淋巴细胞。假定这些细胞显示没有被免疫系统自我识别，于是可被NK细胞靶向。这样的细胞，例如被病毒感染的细胞，在其表面上可显示出MHC I细胞数量减少，这显然被NK细胞察觉。NK细胞可以在所有初次和二次免疫区室以及粘膜组织中找到。它们还可产生促炎性细胞因子，例如干扰素-γ。在特别优选的实施方案中，可以激活NK细胞来消灭癌细胞。它们可有利地用于与其它免疫细胞例如DC、NKT细胞或T细胞进行通讯，这可以导致癌症的适应性免疫反应。不希望受理论束缚，据认为，NK细胞和DC是密切通信的。DC介导的NK细胞激活通常有助于发展有效的先天免疫，而被激活的NK细胞又为DC激活、成熟和细胞因子产生提供信号，从而促进适应性免疫。提供DC源性的外泌体(Dex)或激活DC特别可以导致NK细胞的激活，从而允许消灭有病的细胞、特别是癌细胞。更多细节将是技术人员已知的，或者可从合适的文献来源例如Lion等人，2012，The Oncologist，17，1256-1270获得。通常，Langerin+细胞抑制NK细胞融合。根据本发明的具体实施方案，Langerin+细胞的激活，例如通过将合适的运载物递送到允许这样的激活的细胞，可用于激活NK细胞和/或有助于所述激活。
另一方面，适应性免疫系统主要基于特殊白细胞、即淋巴细胞、亦即B细胞和T细胞的活性。B细胞通常参与体液免疫应答，而T细胞则参与细胞介导的免疫应答。B和T细胞都包含T细胞受体(TCR)分子，该分子识别正被加工的特定靶标并随后呈递在可由所有宿主细胞提供或表达的MHC分子上。所述T细胞可分化为细胞毒性T细胞(CTL)，也称为CD8+T细胞或杀伤性T细胞和辅助性T细胞，以及调节性T细胞。细胞内的抗原通常与I类MHC分子结合，并由I类MHC分子带到所述细胞的表面，在那里它们可被T细胞识别。如果TCR对该抗原具有特异性，则它与I类MHC分子和所述抗原的复合物结合，并且T细胞消灭该呈递细胞。MHC I分子可存在于所有有核细胞的表面上。I类MHC分子通常结合主要由蛋白酶体降解胞质蛋白而产生的肽。MHC I:肽复合物随后经由内质网插入细胞的外质膜。所述表位肽结合在所述I类MHC分子的细胞外部分上。因此，认为I类MHC的功能主要是向细胞毒性T细胞(CTL)展示细胞内蛋白。另外，I类MHC也可以通过交叉呈递来呈递由外源蛋白产生的肽，这是某些抗原呈递细胞、例如DC吸收、加工MHC I类分子并将其呈递给细胞毒性CD8+T细胞的能力。该过程的结果是交叉引发，它描述了刺激初始细胞毒性CD8+T细胞刺激成为激活的细胞毒性CD8+T细胞。该过程可引出抵抗肿瘤和病毒的免疫。交叉呈递也可有利地用于诱导细胞毒性免疫，例如，通过用蛋白抗原进行疫苗接种，例如本文所述的肿瘤疫苗接种。MHC I分子通常结合长度为8-10个氨基酸的肽。
另一方面，辅助性T细胞(也称为CD4+T细胞)和调节性T细胞(也称为Treg细胞或抑制性T细胞)识别与II类MHC分子偶联的抗原。MHC II分子通常仅见于抗原呈递细胞(APC)，例如树突细胞、单核吞噬细胞、胸腺上皮细胞或B细胞。MHC II类分子的负载通常发生在溶酶体区室中。例如，胞外蛋白可在溶酶体中被内吞、消化，并且表位肽片段可以与MHC II分子结合。通常，MHC II分子呈递的抗原的长度在约15个至24个氨基酸之间。
根据本发明，任何上述活性均可通过合适的化合物例如抗原或表位来引发。抗原的长度、其细胞区室的存在等可调节在MHC I或MHC II分子上的呈递，从而也调节免疫系统的某些分支的激活。对于癌症和病毒疗法，特别优选的是引发先天性和适应性免疫系统的密切相互作用，例如通过激活DC来引发。更多细节可从合适的文献来源例如Ortner等人，Oncoimmunology，2017，6，2，e1260215；Watt等人，2008，J Immunol.，181，8，5323-30或Walzer等人，2005，Blood，106，7，2252-8中获得。
如本文所用的术语“能够免疫调节的化合物”涉及传达免疫系统的管理性调节的任何物质或物质的一部分。因此，可根据治疗目标诱导、放大、减弱或防止免疫应答。因此，免疫调节可以是例如激活(例如以激活式免疫疗法的形式)、引发或放大免疫应答、或者可以是抑制(例如以抑制式免疫疗法的形式)。
能够激活免疫调节的化合物的示例包括刺激因子，例如粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、细胞因子、白介素、趋化因子、免疫调节性酰亚胺药物(IMiD)、合成的胞嘧啶磷酸-鸟苷(CpG)寡脱氧核苷酸或葡聚糖、或免疫增强乳膏例如咪喹莫特。合适的白介素的优选示例是IL-2、IL-7和IL-12。细胞因子的优选示例是干扰素和G-CSF。合适的趋化因子的优选示例是CCL3、CCL26和CXCL7。合适的IMiD的优选示例是沙利度胺及其类似物，例如来那度胺、泊马度胺和阿普斯特。
能够抑制性免疫调节的化合物的示例包括免疫抑制药物，例如糖皮质激素、细胞抑制剂、抗体、在抑免蛋白中起作用的化合物。合适的糖皮质激素的优选示例是泼尼松、地塞米松和氢化可的松。糖皮质激素通常抑制细胞介导的免疫，例如通过抑制编码细胞因子IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8和TNF-α的基因，其中减少细胞因子产生导致减少T细胞增殖。糖皮质激素也可以抑制体液免疫，例如通过使B细胞表达较少量的IL-2和IL-2受体，从而减少B细胞克隆扩增和抗体合成。合适的细胞抑制剂的优选示例是烷基化剂，例如，氮芥类例如环磷酰胺、亚硝基脲、铂化合物。其他示例包括抗代谢物，例如，叶酸类似物例如甲氨蝶呤、嘌呤类似物例如azathriopine或巯基嘌呤、嘧啶类似物例如氟尿嘧啶。另一组合适的示例是细胞毒性抗生素，例如放线菌素、蒽环类、丝裂霉素C、博来霉素或光神霉素。合适的抗体的优选示例包括异源多克隆抗体，例如，从用人胸腺细胞或淋巴细胞免疫接种的动物例如马的血清中获得的。本发明所设想的多克隆抗体制剂的示例包括Atgam和thymoglobuline。还设想了针对CD25和CD3的单克隆抗体。作用于抑免蛋白的合适化合物的优选示例是环孢菌素、他克莫司、西罗莫司和依维莫司。能够抑制性免疫调节的其它化合物是芬戈莫德、多球壳菌素、霉酚酸酯、TNF-α结合分子例如英夫利昔单抗、依那西普或阿达木单抗的细胞穿透变体。特别设想的具体示例包括环孢菌素(与淋巴细胞的胞质蛋白亲环蛋白结合，从而抑制钙依赖磷酸酶)、他克莫司(细胞内钙依赖磷酸酶抑制剂)、西罗莫司和依维莫司(通过与胞质FK结合蛋白12结合经由mTOR抑制IL-2产生，从而阻断T细胞和B细胞的激活)、芬戈莫德(导致鞘氨醇-1-磷酸受体的内化和使淋巴细胞隔离在淋巴结中)、多球壳菌素和霉酚酸酯(提供对肌苷单磷酸脱氢酶的选择性抑制并导致抑制鸟苷的生物合成，从而抑制B淋巴细胞和T淋巴细胞的增殖)。
如本文所用的术语“免疫耐受诱导剂”涉及能够诱导免疫系统对通常具有在生物体中引发免疫应答的能力的物质或组织的无应答状态的化合物。免疫耐受可以是中枢耐受或外周耐受。中枢耐受通常在胸腺或骨髓中诱导，而外周耐受在淋巴结中诱导。在本发明的情形下，优选诱导中枢耐受。外周耐受则被认为负责预防免疫系统对各种环境实体例如变应原或肠微生物的过度反应性。耐受系统功能异常通常导致自身免疫性疾病，例如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、1型糖尿病、自身免疫性多内分泌综合征1型(APS-1)、免疫失调、多内分泌病或肠病，并推测造成哮喘、变态反应和炎性肠病。耐受系统也对移植和同种异体移植物至关重要。此外，变态反应和过敏性反应通常被假定为是免疫系统的误导或过度反应，这可能是由于外周耐受机制的破坏或欠发达所致。通常，粘膜表面处的Treg细胞、TR1和Th3细胞抑制介导变态反应的2型CD4辅助细胞、肥大细胞和嗜酸性粒细胞。Treg细胞或它们在粘膜中的定位的缺陷可能在变态反应中起作用。树突细胞(DC)被假定为是外周耐受的重要参与者。DC广泛存在于周围非淋巴组织例如皮肤以及不同分化谱系和成熟度的各种亚组的淋巴组织、特别是Langerin+细胞中。在稳定状态下，即在非炎性状态下，大多数树突细胞保持未成熟，而在可提供共刺激的弱抗原刺激和抗原呈递后，未成熟树突细胞通常诱导初始T细胞的克隆缺失和失活，同时诱导并扩增具有免疫抑制能力的各种调节性T细胞。因此，未成熟的树突细胞被假定为通过诱导与控制T细胞功能的调节机制有关的免疫耐受而在维持免疫稳态中发挥作用。采用至少包括IL-10和TGF-β的细胞因子可产生致耐受性DC。此外，触发CD80high、CD86high、CD40high和CD83low的表面表达可用于诱导耐受。还设想了使用IL-10产生促进剂，例如地塞米松。在一个进一步的实施方案中，可通过使用5-氨基乙酰丙酸(ALA)或其衍生物，以及使用柠檬酸亚铁钠(SFC)来实现诱导免疫耐受。更多细节可从合适的文献来源例如US 9 399 029中获得。特别优选在如本文所述的Langerin+细胞中或针对所述Langerin+细胞，以及在涉及Langerin+细胞的医学状况的情形下，使用免疫耐受诱导化合物。
在本发明的一个进一步的优选实施方案中，如上文提到的运载物包含以下、基本由以下组成或由以下组成：(i)癌症抗原或表位，或包含癌症抗原或表位，(ii)自身免疫性疾病抗原或表位，或包含自身免疫性疾病抗原或表位，(iii)细菌抗原或包含细菌抗原或表位，(iv)病毒抗原或包含病毒抗原或表位，(v)寄生虫抗原或包含寄生虫抗原或表位，或(vi)变应原、或变应原的表位、或包含变应原或变应原的表位。
本文所用的术语“癌症抗原”涉及在肿瘤细胞中产生的抗原物质。因此，该术语通常也可包括如上文提到的细胞抗原。这些抗原物质也可以替代地称为“肿瘤抗原”。这些抗原通常在宿主中触发免疫应答。不希望受理论束缚，目前认为，机体中的正常蛋白(即宿主自身产生的蛋白)由于免疫系统的自我耐受而不具有抗原性，在这种概念中，自反应性淋巴细胞在它们发育为完全免疫活性细胞之前就被删除了。未暴露于免疫系统的其它蛋白质可触发免疫应答。这可包括与免疫系统隔离的蛋白、正常以很少的量产生的蛋白(但是，例如，在癌细胞中的产量高得多)、或通常仅在细胞/生物体发育的某些阶段产生的蛋白、或由于存在突变而改变其结构或功能的蛋白。因此，癌症抗原可以分为不同的类群，例如，作为突变的癌基因和抑癌基因的产物，其它突变基因的产物例如(i)过表达或异常表达的细胞蛋白、(ii)致癌病毒产生的癌症抗原、(iii)癌胚抗原、(iv)改变的细胞表面糖脂和糖蛋白，以及(v)细胞类型特异性分化抗原。在进一步的具体实施方案中，所述抗原可以是肿瘤特异性抗原，它是通过编码某种蛋白的基因的突变而产生的抗原，该蛋白的异常产生是癌症或肿瘤的原因。这样的肿瘤特异性抗原的设想示例是异常形式的p53或ras。或者，如果突变与肿瘤发展无关，但导致产生与癌细胞相关的异常蛋白，则将其视为肿瘤相关抗原(TAA)。该抗原类群也被设想为是本发明的运载物的一部分。TAA类群通常分为共有TAA和独特TAA的类群。在共有TAA之中的是几类癌症共有的抗原，而独特TAA被认为是由致癌物包含的随机体细胞点突变产生的，因此构成了由各个肿瘤独特表达的新抗原。这样的独特TAA的存在可有利地用于制备特异性抗原运载物，例如以疫苗的形式，所述抗原运载物基于通过下一代测序方法获得的个人基因组序列，提供有关患者突变组(mutanome)的信息并可能提供与癌症有关的独特突变肽的信息，当其作为抗原呈递时可用于引发抗肿瘤T细胞。
本发明优选设想使用一种或多种以下癌症抗原：MAGE-A1，NY-ESO-1，SSX-2，Gp-100，Melan-A/Mart-1，酪氨酸酶，PSA，乳腺珠蛋白-A，URLC10，GAA，OFA，cyclin B1/WT-1/CEF，VEGFR1，VEGFR2，TTK，MUC1-KLH，HER2，HPV16 E7，HPV16/18，CEA，KOC1，SL-701，WT1，p53，存活蛋白，端粒酶，GSK2302025A，MAGE-3.1，OVA BiP，CO16，DEPDC1，MPHOSPH1，ONT-10，GD2L和GD3L，TF，rsPSMA，MUC-2，PAP；KLH，STF-II，G17DT，ICT-107，LMP2A，NA17-A，NA17.A2，IMA901，hTERT，酪氨酸酶相关肽2(TRP2)，PANVAC，EBNA1/LMP2，TRICOM 5T4，MPHOSPH1，和DEPDC1。此外，本发明还涉及以上提到的抗原的任何组合，及其衍生物或修饰形式，或由其衍生的同源蛋白质/肽序列。还设想了使用可能在将来发现和描述的另外的癌症抗原。还设想了使用技术人员已知的任何其它合适的抗原。更多细节可从Tagliamonte等人，2014，HumVaccin Immunother，10(11)，3332–3346中获得。如本文所用的术语“癌症表位”是指存在于癌症抗原、例如上文定义的癌症抗原中的MHC I或MHC II类的特异性表位。在具体的实施方案中，癌症表位的使用可以与接受者的HLA等位基因背景的其它表征相结合。
特别优选使用癌症抗原NY-ESO-1、URLC10、G17DT、MART-1；NA17-A；gp100；hTERT、PAP、MPHOSPH1、DEPDC1、HPV16/18或STF-II，或这些抗原上存在的表位。
如本文所用的术语“自身免疫性疾病抗原”涉及导致不适当的免疫应答的抗原物质，所述免疫应答攻击自身组织或无害的环境组分。因此，在大多数情况下，自身免疫性疾病通常是由对正常身体部分的异常免疫应答引起的疾病，其中可涉及几乎所有身体部分。该疾病涉及在免疫系统中变得有功能的自我反应性细胞库的出现或存在，即在这些情况下，在胸腺内当胸腺细胞发育成成熟的免疫细胞时，防止通过负选择过程产生自我反应性T细胞的机制失败。该疾病涉及自身抗体以及自身反应性淋巴细胞、例如自我反应性T细胞的存在。该疾病可局限于某些器官或涉及不同位置的特定组织。在本发明的情形下使用自身免疫性疾病抗原涉及诱导对所述抗原、例如如上所述的抗原的免疫耐受。在本发明的具体实施方案中，迁移性未成熟的Langerin+细胞可用于诱导免疫耐受。特别是，如果DC没有被激活，则如上所提到的呈递随后可以对所述抗原产生免疫耐受效应。因此，本发明设想，自身免疫性疾病抗原的治疗包括抗原的胞质递送，从而导致其随后呈递给效应免疫细胞，并且明确缺乏可导致DC激活、例如通过佐剂激活的组分。不希望受理论束缚，据认为，抗原呈递给DC，例如通过胞质递送，将导致所述抗原的基于MHC I的呈递。如果DC没有被激活，那么这样的呈递随后可对所述抗原产生免疫耐受效应。因此，本发明设想对自身免疫性疾病抗原的治疗包括抗原的胞质提供并且明确不存在可导致DC激活的组分例如佐剂。
可向其以运载物的形式提供抗原的自身免疫性疾病包括，例如，抗磷脂综合征(aPL综合征)、天疱疮、多发性硬化症(MS)、重症肌无力、Grave's病、Goodpasture综合征、显微血管炎、肉芽肿病伴多血管炎、系统性自身免疫性风湿病(SARD)、混合性结缔组织病、系统性红斑狼疮、
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综合征、系统性硬化/CREST综合征、多发性肌炎/皮肌炎、自身免疫性甲状腺病、乳糜泻、自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、ANCA相关疾病、抗磷脂综合征/血栓栓塞综合征、抗GBM病、糖尿病、恶性贫血、或克罗恩病(Crohn’s Disease)。合适的抗原将是技术人员已知的或可从文献来源例如Wang等人，Nucleic Acids Research，2017，45，D1，D769–D776获得。在特定的实施方案中，本发明设想使用相应的抗原，例如，用于aPL综合征的β2-GP1，用于天疱疮的Dsg3，用于多发性硬化症的MBP、PLP和/或MOG-1，用于重症肌无力的ACh受体，用于Grave's病的TSH受体，用于Goodpasture综合征的IV型胶原蛋白，用于微观血管炎的p-ANCA，用于肉芽肿病伴多血管炎的c-ANCA，用于系统性自身免疫性风湿病(SARD)的DFS70或晶状体上皮衍生生长因子/转录共激活因子p75(LEDGF/p75)，用于混合性结缔组织病的U1-snRNP 68/70、U1-snRNP A、U1-snRNP C或U-snRNP B/B'，用于系统性红斑狼疮的Sm、RNP/Sm、SmD、SmD1、SmD2、SmD或核糖体磷蛋白P0，用于
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综合征的Ro/SS-A或La/SS-B，用于系统性硬化/CREST综合征的着丝粒蛋白B(CENP-B)、着丝粒蛋白A(CENP-A)、DNA拓扑异构酶I(Scl-70)，Histidyl-tRNA synthetase(Jo-1)，Threonyl-tRNAsynthetase(PL-7)，用于多发性肌炎/皮肌炎的丙氨酰-tRNA合成酶(PL-12)、甘氨酰-tRNA合成酶(EJ)或SRP54，用于自身免疫性甲状腺病的甲状腺过氧化物酶(TPO；同义词：MSA)、甲状腺球蛋白，用于乳糜泻的组织转谷氨酰胺酶(tTG；同义词TGase-2或麦醇溶蛋白，用于自身免疫性肝炎的细胞色素p450 2D6、亚胺甲基转移酶环脱酰胺酶(FTCD)，用于原发性胆汁性肝硬化的M2、支链2-氧代酸脱氢酶复合物(BCOADC)、OGDC-E2、或PDC-E2，用于ANCA相关疾病的髓过氧化物酶(MPO)或蛋白酶3(PR3)，用于抗磷脂综合征/血栓栓塞综合征的β2-糖蛋白1(β2-GP1)，以前称为载脂蛋白H(Apo H)，用于抗GBM病的肾小球基底膜(GBM)，用于糖尿病的谷氨酸脱羧酶(GAD65)，用于恶性贫血的内在因子，或用于克罗恩病的糖蛋白2(GP2)。还设想了存在于抗原上的自身免疫性疾病表位，优选如上所定义的。如本文所用的术语“自身免疫性疾病表位”涉及如上文所定义的自身免疫性疾病抗原中存在的MHC I或MHC II类的特异性表位。在具体的实施方案中，自身免疫性疾病表位的使用可以与接受者的HLA等位基因背景的其它表征相结合。
如本文所用的术语“细菌抗原”涉及由细菌产生或呈递的抗原物质。细菌抗原可以例如由蛋白质和多糖、或脂质携带。它们可以包括细菌的外壳、荚膜、细胞壁、鞭毛、菌毛或毒素。通常，这样的物质在细菌表面展示。在许多情况下，荚膜多糖和/或脂多糖形式的碳水化合物是细菌表面上的主要组分，因此可被视为抗原结构。还设想了由相应地提供相关的抗原或表位的肽或蛋白质来模拟这样的多糖和/或脂多糖。本发明设想了技术人员已知的任何合适的细菌抗原。优选所述细菌抗原或细菌表位为、包含或源自于破伤风类毒素、白喉类毒素、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)多糖或非细胞形式的百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)。例如，细菌抗原或表位是源自于CRM、破伤风类毒素、白喉类毒素、脑膜炎奈瑟氏球菌外膜复合物或流感嗜血杆菌蛋白D中存在的抗原的T细胞表位。进一步的示例和细节可以从合适的文献来源例如Detmer和Glenting，2006，Microbial CellFactories，5，23中获得。
如本文所用的术语“病毒抗原”涉及由病毒产生的抗原物质。病毒抗原通常是蛋白质或肽元件，其通常由病毒基因组编码。它可以呈递在病毒表面上，例如作为外壳或包膜或其一部分，或是病毒核心或其他病毒结构的组成部分，其可以例如在病毒在细胞内部崩解后由细胞呈递。病毒抗原的示例包括病毒结构元件例如衣壳蛋白、基质蛋白、包膜蛋白等，以及非结构蛋白例如穴蛋白、移动蛋白、NS蛋白例如NS2、NSP1等，或由病毒编码的酶活性例如整合酶、逆转录酶、神经氨酸苷酶、酯酶等。优选的抗原源自于甲型肝炎病毒(热全病毒灭活)、乙型肝炎和人乳头瘤病毒(HPV)。特别优选的是HepB表面抗原。还设想使用病毒表位。如本文所用的术语“病毒表位”涉及如上文所定义的病毒抗原中存在的MHC I或MHC II类的特异性表位。在具体的实施方案中，病毒表位的使用可以与接受者的HLA等位基因背景的其它表征相结合。更多信息可以从合适的互联网资源例如https://www.who.int/immunization/diseases/en/(最后一次访问在2018年12月4日)中获得。
如本文所用的术语“寄生虫抗原”涉及由寄生虫产生或呈递在寄生虫上的抗原物质。术语“寄生虫”涉及哺乳动物的寄生虫，优选人类的寄生虫。寄生虫通常属于原生动物或后生动物。主要的寄生类群是寄生原生动物和寄生蠕虫。原生动物是单细胞真核生物。寄生原生动物根据其运动工具和生殖方式通常分为四个类群：鞭毛虫、阿米巴、孢子虫和纤毛虫。在鞭毛虫类群中有肠鞭毛虫和泌尿生殖鞭毛虫，例如贾第鞭毛虫(Giardia)和毛滴虫(Trichomonas)，以及血液和组织鞭毛虫例如锥虫(Trypanosoma)和利什曼虫(Leishmania)。阿米巴的示例包括内阿米巴(Entamoeba)、纳氏虫(Naegleria)和棘阿米巴(Acanthamoeba)。孢子虫的类群通常经历有性和无性生殖阶段交替的复杂生命周期，并包括隐孢子虫(Cryptosporidium)、环孢子虫(Cyclospora)和弓形虫以及疟疾寄生虫、即疟原虫(Plasmodium)物种。该孢子虫通常是细胞内寄生虫。纤毛虫是带有纤毛的复杂原生动物。这一类群的示例是结肠小袋纤毛虫(Balantidium coli)，一种人和猪的肠纤毛虫。寄生蠕虫通常属于线虫和扁蠕虫。扁蠕虫的示例包括吸虫例如肝片吸虫(Fasciola hepatica)，或多节绦虫例如绦虫(Taenia)。还设想了血吸虫或丝虫寄生虫，例如班氏吴策线虫(Wuchereria bancrofti)或旋盘尾丝虫(Onchocerca volvulus)。本发明设想了任何以上提到的寄生虫或本领域技术人员已知的任何其他合适的寄生虫的抗原。在具体的实施方案中，所述抗原可存在于以某些生命周期形态中，例如存在于卵上。特别优选的是使用疟疾抗原，例如疟原虫在其一种生命周期形态期间显示的蛋白质结构，例如富含半胱氨酸的保护性抗原(CyRPA)，它是包括网状细胞结合样同源蛋白5(RH5)和RH5相互作用蛋白(Ripr)在内的三元复合物的关键性组分。如本文所用的术语“寄生虫表位”涉及如上文所定义的寄生虫抗原中存在的MHC I或MHC II类的特异性表位。在具体的实施方案中，寄生虫表位的使用可以与接受者的HLA等位基因背景的其它表征相结合。更多信息可从合适的文献来源例如Tarleton，2005，Cellular Microbiology，7，10，1379-1386或Higashi，1988，Ann RevPublic Health，9，483-501中获得。
如本文所用的术语“过敏原”涉及能够通过免疫球蛋白E(IgE)应答刺激特应性个体中的I型过敏性反应的抗原物质。因此，过敏原是一种产生异常剧烈的免疫应答的抗原类型，其中免疫系统防卫机体对抗感知的威胁，该威胁原本将对身体无害。在本发明的上下文中，变应原主要被理解为包含蛋白质或肽。过敏原可见于各种来源，包括尘螨排泄物、花粉或宠物皮屑。它们也可见于诸如花生、坚果、海鲜或贝类的食品。变应原蛋白的名录，其通过引用并入本文，可在SDAP(变应原蛋白结构数据库)中找到，SDAP可在http://fermi.utmb.edu找到。本发明设想了在所述数据库中提到的所有变应原。还设想了技术人员已知的任何其它变应原。如本文所用的术语“变应原的表位”涉及如上文定义的变应原中存在的MHC I或MHC II类的特异性表位。在具体的实施方案中，变应原表位的使用可以与接受者的HLA等位基因背景的其它表征相结合。进一步的信息将是技术人员已知的，或者可以从合适的文献来源中获得，所述文献来源例如“科学小组就委员会关于评价变应原性食物以备标记目的的要求对饮食产品、营养和变态反应的意见(Opinion of the ScientificPanel on Dietetic Products,Nutrition and Allergies on a request from theCommission relating to the evaluation of allergenic foods for labellingpurposes)”，发表于The EFSA Journal，2004，32，1-197。
在本发明的一个进一步的实施方案中，所述介质的平均尺寸可以从约1nm至2000nm，优选从约1nm至1000nm。本文所用的“介质的大小”涉及本文定义的缀合物和本文定义的未负载或空载的载体的组合，或涉及如本文定义的缀合物和如本文定义的包含运载物或与运载物缔合的载体的组合。所述介质的尺寸很大程度上取决于所述载体的性质和形式，例如脂质体或纳米粒子或蛋白质等。因此，它可以在1nm至100nm的范围内，或在约100nm至250nm的范围内，或在250nm至1000nm的范围内，或在1000nm至2000nm的范围内。所述介质的尺寸有利地适于为该介质计划的用途、和/或所述介质中包含的载体的形式和性质。例如，所述介质可以在纳米级范围内使用，从而允许被各种细胞类型有效摄取并在靶位点选择性药物蓄积。在这方面的更多信息对于技术人员是已知的，或者可以从合适的文献来源例如Desai等人，1997，Pharm Res.14,1568–73或Panyam和Labhasetwar，2003，Adv DrugDel Rev.55:329–347中获得。在进一步的实施方案中，设想了介质的尺寸适合于血流的尺度。因此，所述介质的尺寸可小于5μm，这允许避免聚集的形成并降低发生栓塞的风险。在一个优选实施方案中，可优选在水溶液中测量介质的尺寸。
平均介质长度可相应地通过动态光散射(DLS)来测量。DLS技术是用于确定悬液中的小粒子或溶液中的聚合物的尺寸分布轮廓的物理方法。在DLS的范围内，通常通过强度或光子自相关函数来分析时间波动。在时域分析中，所述自相关函数(ACF)通常从零延迟时间开始衰减，并由于较小粒子引起的较快的动力学导致散射强度迹线的较快去相关。已经表明，强度ACF是功率谱的傅立叶变换，因此DLS测量在谱域中可同样好地进行。更多细节将是技术人员已知的，或者可从合适的文献来源例如Stetefeld等人，2016，BiophysicalReviews，8，4，409–427中获得。
在另一个方面，本发明涉及一种组合物，其包含至少一种如上定义的用于特异性分子靶向Langerin+细胞的的本发明介质，所述介质包含如上定义的运载物或与所述运载物缔合以靶向递送运载物至Langerin+中。在一个优选实施方案中，所述组合物还包含添加剂。如本文所用的术语“添加剂”涉及促进以下功能的任何物质：(i)如本文定义的配体和靶细胞之间的相互作用，(ii)如本文定义的将运载物送入靶细胞中或送到靶细胞，(iii)在货架期、储存和/或使用期间稳定所述介质，或(iv)有助于促进与诱导在靶细胞中的活动相关的后续步骤，例如介质或运载物的内体逃逸或核易位以及更具体地在Langerin+细胞中的抗原加工和呈递。
设想的合适添加剂的示例包括二价离子。优选的二价离子是Ca2+或Zn2+。已知Langerin是二价离子依赖性凝集素，特别是Ca2+依赖性凝集素，其中二价离子的存在会影响配体和其关联受体Langerin之间的相互作用。进一步假设，诸如EDTA或EGTA之类的螯合剂的存在将进一步导致Langerin的功能丧失，这例如可从Valladeau，2000，Immunity，12(1)，71-81获悉。因此，本发明特别设想了在本发明的组合物中不存在螯合剂例如EDTA。在具体的实施方案中，钙离子、即Ca2+的浓度可在4μM至1mM例如4-40μM、40μM至500μM、500μM至1mM的范围内或所提到的之间的任何值。在其它具体实施方案中，锌离子、即Zn2+的浓度可在4μM至1mM例如4-40μM、40μM至500μM、500μM至1mM的范围内或所提到的之间的任何值。在具体的实施方案中，可根据本发明的组合物的应用部位来调节添加剂的使用。因此，仅在没有给出天然Ca2+提供的情况下才可以设想使用Ca2+离子。不希望受理论的束缚，认为人类表皮中Ca2 +的浓度为约1-2mM，这被进一步假定为使所有Langerin饱和并使它们发挥功能。在Ca2+浓度偏离上述典型状态的患者或情况下，特别优选使用如上所述的添加剂。
合适的添加剂的一个进一步的示例是佐剂。如在如上定义的组合物的情形下中使用的术语“佐剂”通常涉及修改其它作用剂的效应的免疫剂，所述效应特别是包含如上提到的运载物或与所述运载物缔合的介质的效应，更具体而言是如上所提到的运载物实体的效应。佐剂可以具有例如对免疫引发性运载物的加强效应。佐剂还可以具有为DC或Langerin+细胞定制的选择性效应。特别优选使用诱导DC的成熟和/或DC从皮肤向淋巴结迁移的佐剂，通常导致T细胞激活。优选的佐剂的示例包括免疫活性化合物例如氢氧化铝、石蜡油、MF59、AS03、MPL、QS21、AS04、AS01、AS02、IC31、CpG-寡核苷酸、ISCOMATRIX或病毒体、不完全弗氏佐剂、KLH或BCG。
合适的添加剂的另一个示例是促进所述介质上的配体与Langerin结合的因子。这样的促进因子例如可以是蛋白质功能的变构激活物，例如小分子，如Aretz等人，2018，Am.Chem.Soc.，140，44，14915–14925中所述的分子，或抗体或适配体。所述促进因子也可以是允许碳水化合物结合更紧密结合的金属。
在优选的实施方案中，本发明的组合物以液体形式提供。例如，这可以包括液体溶液、乳液或悬液。在进一步的实施方案中，所述组合物可包含溶剂例如H2O、蔗糖水溶液、缓冲液例如磷酸盐缓冲盐水、Tricine缓冲液或HEPES缓冲液。进一步设想的是前述的水性体系和添加剂的组合，例如任何前述的和二甲基亚砜(DMSO)的组合。DMSO可使用任何合适的量或浓度，最高约15vol％，例如浓度为约5vol％、7vol％、8vol％、9vol％、10vol％、12vol％或15vol％。诸如Tween或TritonX的表面活性剂也可以充当添加剂，并可在本发明的情形中使用。
在又一个优选实施方案中，本发明的组合物包含任何合适的量的如上定义的介质，即包括运载物在内。该量可根据载体的形式或类型例如脂质体、纳米粒子、蛋白质等进行调节。此外，可根据要结合的受体的数量以及靶细胞的位置来调节介质的量；例如皮肤或其它组织可能需要不同量的介质。优选提供的介质的量为约0.5mol％至30mol％，更优选约1mol％至10mol％的量，更加优选约4mol％至6mol％的量，最优选约4.75mol％至5mol％的量。在典型的实施方案中，以上提到的值适用于脂质体，例如如上文定义的脂质体。其它可选择的载体的量可以变化，并且可根据技术人员已知的适当计算进行调适。
在进一步的具体实施方案中，本发明的组合物包含任何合适的密度的如上定义的介质，即包括运载物在内。所述密度可根据载体的形式或类型例如脂质体、纳米粒子、蛋白质等进行调节。此外，可根据要结合的受体的数量以及靶细胞的位置来调节介质的密度；例如皮肤或其它组织可能需要不同的介质密度。优选对于直径约160nm的载体，提供的介质的密度为约0.05至约0.08个介质/nm2，更优选密度约0.065个介质/nm2，例如约0.067个介质/nm2。还设想了其它合适的密度值，其可以鉴于载体、例如脂质体的尺寸或直径来确定。进一步设想了调节密度以使两个介质之间的距离大约为4.4nm。根据一个具体实施方案，合适的介质密度的计算可以基于约26μM的脂质浓度值和约75μM的平均脂质体浓度。这些值可取决于脂质体类型、载体尺寸、直径或类型、介质形式和尺寸等而变化和/或调适。关于本发明的载体中介质密度的计算和调适的更多细节可以从合适的文献来源例如Güven等人，2009，Journal of Liposome Research，19，2，148-154或《酶学方法》(Methods of Enzymology)，第391卷，2005，脂质体(Liposomes)，E部分，第13章，使用脂质体将杀菌剂递送至细菌生物膜(Use of Liposomes to deliver Bactericides to bacterial biofilms)，21页中获得。
在一个进一步的方面，本发明涉及一种靶向运载物递送进入Langerin+细胞中的方法，所述方法包括使如上定义的特异性分子靶向Langerin+细胞的介质或上述组合物与树突细胞接触。在具体的实施方案中，所述载体以未负载或空载状态提供，或者所述载体包含或与上文定义的运载物或与所述运载物缔合。所述方法可以例如包括以下步骤：提供合适的形式或构造的介质，将所述介质定位在靶细胞附近或促进所述介质进入靶细胞，以及使配体与靶细胞处的关联受体(Langerin)接触。可适合用于改善或促进所述靶向运载物递送的因素是如本文所述的Ca2+的浓度和存在。此外，温度可以设置在合适的范围内，例如允许胞吞运载物的任何温度或温度范围，例如4℃至37℃。在一个优选实施方案中，所述方法可按照实施例7中提到的步骤进行。
在另一个方面，本发明涉及一种药物组合物，其包含如上定义的介质或如上定义的组合物，其中所述载体包含药物活性运载物或与所述运载物缔合，所述运载物例如如上定义的。特别优选所述药物组合物包含如上定义的介质，其中所述载体包含选自以下任何一种的运载物或与所述运载物缔合：小分子，肽，蛋白质，细胞毒性物质，核酸，金属，放射性核素，病毒，修饰病毒，病毒载体，接种物，质粒，多组分系统，药物活性化合物例如细胞功能抑制剂，例如凋亡抑制剂，免疫活性化合物，包括能够在体内引起免疫反应的化合物，免疫调节剂，及免疫耐受诱导剂，或癌症抗原或表位或包含癌症抗原或表位的化合物，自身免疫性疾病抗原或表位或包含自身免疫性疾病抗原或表位的化合物，细菌抗原或包含细菌抗原或表位的化合物，病毒抗原或包含病毒抗原或表位的化合物，寄生虫抗原或包含寄生虫抗原或表位的化合物，或变应原，或变应原的表位，或包含变应原或变应原的表位的化合物。还设想了基因治疗或分子编辑方法所必需的一种或多种成分或组分，例如本文所述的CRISPR/Cas或TALEN组分。进一步优选所有提到的元件对应于上文在运载物的情形下所定义的那些元件，包括所提到的元件的另外的示例。还设想了上述运载物的组合，例如蛋白质和核酸，或者病毒或病毒载体和蛋白质，或者小分子和核酸或蛋白质等。特别优选的是佐剂和抗原的组合，例如如上文定义的，或RNA-蛋白质复合物等，例如如本文定义的用于基因治疗或分子编辑方法的。
任选地，即在某些实施方案中，如上定义的药物组合物包含药学上可接受的载体或药物佐剂。术语“药学上可接受的”是指经监管机构或其它公认的药典批准用于动物、更特别是人类的。术语“载体”是指与运载物或治疗剂一起施用的稀释剂、赋形剂或药物介质。这样的载体是药学上可接受的，即在所使用的剂量和浓度下对接受者无毒。它优选是等渗的、低渗的或弱高渗的，并具有相对低、例如由蔗糖溶液提供的的离子强度。这样的药物载体可以是无菌液体，例如水和油，包括石油、动物、植物合成来源的油，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。盐水溶液和葡萄糖水溶液和甘油溶液也可用作液体载体。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、钠离子、脱脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等。如果需要，所述组合物也可含有少量的润湿或乳化剂、或pH缓冲剂。这些组合物可以采取例如溶液、悬液、乳液、粉末、缓释制剂等形式。合适的药物载体的示例描述于例如E.W.M Martin的“雷明顿药物科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)”中。可充当药物载体的物质的一些其它示例是，例如：糖，例如葡萄糖和蔗糖；淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；粉状黄芪胶(tragancanth)；麦芽；明胶；滑石粉；硬脂酸；硬脂酸镁；硫酸钙；碳酸钙；植物油，例如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，例如丙二醇、甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；琼脂；藻酸；无热原水；等渗盐水；酸果蔓提取物和磷酸盐缓冲溶液；脱脂奶粉；以及用于药物制剂的其它无毒相容性物质，例如维生素C、雌激素和紫锥菊。也可以存在润湿剂和润滑剂例如十二烷基硫酸钠，以及着色剂、调味剂、润滑剂、赋形剂、压片剂、稳定剂、抗氧化剂和防腐剂。在某些实施方案中，所述药物组合物的成分可以包封的形式施用，例如，作为纤维素包封，在胶质中、用聚酰胺、蜡基质或用环糊精包封。
通常，所述成分可单独供应，或以单位剂型混合在一起供应，例如，作为在指出活性剂的量的密闭容器例如安瓿或小袋中的干燥冻干粉或无水浓缩物。
在一个具体实施方案中，所述药物组合物按照常规程序配制成适于静脉内施用给人类的药物组合物。通常，用于静脉内施用的组合物是在无菌等渗水性缓冲液中的溶液。必要时，所述组合物也可以包括增溶剂和局部麻醉剂例如利诺卡因以缓解注射部位的疼痛。在所述组合物将通过输注施用的情况下，它可以用含有无菌药用级水或盐水的输液瓶分配。在通过注射来施用所述组合物的情况下，可以提供无菌注射用水或盐水的安瓿，以便所述成分可以在施用前混合。
如本文所用的术语“药物佐剂”涉及附加成分例如氯喹，质子极性化合物例如丙二醇、聚乙二醇、甘油、EtOH、1-甲基L-2-吡咯烷酮或其衍生物，或非质子极性化合物例如二甲基亚砜(DMSO)、二乙基亚砜、二正丙基亚砜、二甲基砜、环丁砜、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、四甲基脲、乙腈或它们的衍生物。药物佐剂还可以是表面活性剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、缓冲剂、稳定剂或等张剂中的一种或多种。此外，佐剂可促进所述介质/配体与Langerin的结合。本发明还设想了技术人员已知的任何合适的药物佐剂。在有关pH限制的条件下添加以上提到的化合物。
本发明的药物组合物还可包含防腐剂。本发明的某些组合物的防腐剂包括但不限于：对羟基苯甲酸丁酯；对羟基苯甲酸乙酯；咪唑烷基脲；对羟基苯甲酸甲酯；O-苯基苯酚；对羟基苯甲酸丙酯；季铵盐-14；季铵盐-15；脱氢乙酸钠；吡啶硫酮锌等。防腐剂以有效防止或延缓微生物生长的量使用。通常，防腐剂的使用量为总组成的约0.1重量％至约1重量％，优选约0.1％至约0.8％，最优选约0.1％至约0.5％。
本发明的组合物可施用于对象或患者。术语“对象”或“患者”是指哺乳动物。如本文所用的“哺乳动物”旨在具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义。优选的哺乳动物是灵长类动物、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、大鼠、小鼠等。在特别优选的实施方案中，对象是人。
术语“施用”是指通过任何合适的途径施用治疗有效剂量的前述药物组合物。“治疗有效量”是指产生其在患者中施用的目标效应的剂量。精确的剂量将取决于治疗的目的，并且本领域技术人员使用已知的技术将可确定。如本领域已知和本文所述的，可能需要针对全身与局部递送、年龄、体重、总体健康、性别、饮食、施用时间、药物相互作用和病情严重性进行调节，并且本领域技术人员用常规实验将可确定所述调节。优选局限性施用，更优选局部、特别是在皮肤上或通过皮肤施用。
所述药物组合物可用于人类治疗和兽医治疗，优选用于人类治疗。如本文所述，本文所述的与具有期望治疗活性的运载物缔合的介质可以在生理上可接受的载体中施用于患者。根据给药方式的不同，这些元件可以用以下讨论的各种方式来配制。制剂中与具有期望治疗活性的运载物缔合的本文所述的介质的浓度可从约0.00001-100wt％不等。例如，所述制剂可提供的介质的量为约0.5mol％至30mol％，更优选约1mol％至10mol％的量，更加优选约4mol％至6mol％的量，最优选约4.75mol％至5mol％的量。在典型的实施方案中，以上提到的值适用于脂质体，例如如上文定义的脂质体。其它可选择的载体的量可以变化，并且可根据技术人员已知的适当计算进行调适。
还设想了包含适当密度的介质的制剂。因此，在进一步的具体实施方案中，本发明的药物组合物可包含任何适当密度的如上定义的介质，即包括运载物，所述密度可根据载体的形式或类型例如脂质体、纳米粒子、蛋白质等进行调节。此外，可根据要结合的受体的数量以及靶细胞的位置来调节介质的密度；例如皮肤或其它组织可能需要不同的介质密度。优选对于直径约160nm的载体，提供的介质的密度为约0.05至约0.08个介质/nm2，更优选密度约0.065个介质/nm2，例如约0.067个介质/nm2。还设想了其它合适的密度值，其可以鉴于载体、例如脂质体的尺寸或直径来确定。进一步设想了调节密度以使两个介质之间的距离大约为4.4nm。根据一个具体实施方案，合适的介质密度的计算可以基于约26μM的脂质浓度值和约75μM的平均脂质体浓度。这些值可取决于脂质体类型、运载体尺寸、直径或类型、介质形式和尺寸等而变化和/或调适。关于本发明的载体中介质密度的计算和调适的更多细节可以从合适的文献来源例如《酶学方法》(Methods of Enzymology)，第391卷，2005，脂质体(Liposomes)，E部分，第13章，使用脂质体将杀菌剂递送至细菌生物膜(Use ofLiposomes to deliver Bactericides to bacterial biofilms)，21页中获得。
本发明的药物组合物的化合物浓度可针对计划的剂量方案、计划的使用持续时间、组合物的所有成分的确切量和比率以及技术人员已知的其他因素和参数进一步调节。
本文所述的与本发明的具有期望治疗活性的运载物缔合的介质可单独施用或与其它治疗组合施用。设想了联合治疗用于癌症免疫疗法，例如通过共同施用使用检查点抑制剂例如抗CTLA-4和抗PD1抗体，用于化疗，例如通过共同施用烷基化剂或DNA和RNA聚合酶抑制剂，用于抗病毒疗法，例如通过共同施用进入抑制剂、蛋白酶抑制剂或DNA和RNA聚合酶抑制剂，以及用于自身免疫性疾病疗法，例如通过共同施用糖皮质激素或抑免蛋白抑制剂。
所述药物组合物的施用可以各种方式进行。所述施用可以是例如口服、静脉内、局部、角膜、鼻、皮下、皮内或经皮施用。在进一步的实施方案中，施用是为了疫苗接种或为了经毛囊施用。
此外，替代的施用途径包括但不限于眼内或肿瘤内施用或通过胸骨内注射。
在进一步的实施方案中，施用可以使用特殊的医用装置例如针头、疫苗接种枪、膏药/敷料、或吸入器进行，这将在下面详细说明。
本发明集中关注疫苗接种方法。术语“疫苗接种”一般而言涉及施用抗原材料(例如作为疫苗)来刺激个体的免疫系统。因此，如本文定义的药物组合物可作为疫苗施用。疫苗可以是(i)灭活疫苗，(ii)减毒疫苗，(iii)亚单位疫苗或(iv)DNA疫苗。术语“灭活疫苗”是指包含感染物粒子的疫苗或组合物，所述污染物粒子在培养中生长并随后被杀死或破坏，优选通过加热或甲醛杀死或破坏。这样的感染物粒子，例如病毒，通常不能复制，但是某些蛋白质、例如衣壳蛋白足够完整以被免疫系统识别并激发应答。术语“减毒疫苗”是指包含低毒力的活感染物粒子的疫苗或组合物。通常，减毒的活感染物粒子可以增殖，但很慢。这些疫苗可通过技术人员已知的任何合适的方法来生产，正常是通过生长会选择低毒力菌株的污染物组织培养物，或通过在毒力所需的基因中的诱变或定向缺失。术语“亚单位疫苗”是指包含抗原的疫苗或组合物，将其提供给免疫系统而不引入完整或不完整的感染物粒子。亚单位疫苗可通过本领域技术人员已知的任何合适的方法来生产。通常，所述生产可涉及分离特异性蛋白质或蛋白质部分或糖结构并将它们作为疫苗或疫苗组合物施用。所述亚单位策略还可用于呈递合适的癌症抗原。术语“DNA疫苗”涉及由感染因子的DNA创建或编码相应的结构组件的DNA组合物，其通常被插入细胞，例如人类或动物细胞，并在其中表达。DNA疫苗因此可编码如上定义的任何抗原或表位。
本发明的疫苗可以通过任何合适的方法施用于对象或个体，优选通过使用常规注射器或基因枪或疫苗接种枪、例如
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基因递送系统进行注射。将DNA递送到表皮的细胞中是特别优选的，因为这种施用方式提供了通向皮肤相关的淋巴样细胞的通路，并在接受者中提供了DNA的瞬时存在。核酸和/或蛋白质/肽均可通过皮下、表皮、皮内、粘膜内例如鼻、直肠和阴道、腹膜内、静脉内、口服或肌肉进行注射。其它施用方式包括口服和肺部施用、栓剂、无针注射、经皮和透皮应用。如果将固体用作疫苗制剂的助剂，则例如施用疫苗成分与助剂的吸附物或悬浮混合物。在特殊的实施方案中，疫苗分别作为在水性溶剂中的溶液或液体疫苗施用。优选施用是表皮、皮内或粘膜内施用。
在一个特别优选的实施方案中，通过毛囊进行施用。该方法基于发现毛皮脂单位(由毛囊和皮脂腺组成)在药物被动输送到皮肤中可发挥作用。为了到达表皮并从皮肤出来进入循环，所述药物组合物还必须穿透围绕毛干的角质形成细胞层。通过使用粒子例如聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)纳米粒子，所述药物组合物可以保留在毛囊中，从而允许在皮肤中的药物灌注。也可以使用贮库效应。任选地，可使用佐剂双-(3’,5’)-环二聚一磷酸腺苷。
进一步设想的施用途径包括离子电渗疗法、微针、激光和喷射式注射器。
微针通常被认为是经皮贴剂的一部分，其被放置在皮肤上以将所述药物组合物或其一部分递送给皮肤上并穿过皮肤。微针通常比人的头发小，由金属、硅或可生物降解的聚合物构成。通常，微针以阵列的形式提供。微针的使用有利地是实际上是无痛的。微针方法的一个优选实施方案是纳米贴剂。
本文所用的术语“纳米贴剂”涉及数以千计被疫苗包被的微突起的阵列，当用施涂器装置施涂时，其会刺入皮肤的外层。纳米贴剂的微突起的尖端通常包被有包括本发明的组合物的疫苗材料，并将该材料直接释放到皮肤表面正下方的大量免疫细胞中。这项技术的核心元件是纳米贴剂阵列本身，其通常由1cm2的正方形硅与其表面上的～20,000个微突起组成。所述纳米贴剂阵列穿透保护性外皮层(角质层)，并利用具有优化的间距和长度的微突起，将免疫激活材料靶向皮肤最外层正下方的富含免疫细胞的层。
另一个优选的施用途径是局部途径。当期望的治疗涉及通过局部施用容易达到的区域或器官时，本发明的药物组合物的局部施用是有用的。对于局部应用，例如对皮肤、粘膜的局部应用，所述药物组合物优选配制成水凝胶贴剂、液体、乳膏、软膏、糊剂、凝胶、洗剂、胶带、薄膜、舌下剂、颊含剂、片剂、喷雾剂或栓剂。
如本文所用的术语“水凝胶贴剂”涉及由敷有先进粘合水凝胶层的透气无纺布构成的贴剂，所述粘合水凝胶通常由透明膜覆盖物保护。水凝胶是不溶于水的聚合物链网络，有时作为胶体凝胶存在，其中水是分散介质。水凝胶是超吸收性的天然或合成聚合物，由于其大量的含水量，具有类似于天然组织的柔性度。根据某些实施方案，所述水贴剂包含适量的本发明的组合物。
合适的糊剂包括本文所述的介质，所述介质与悬浮在载体中的本发明的具有期望治疗活性的运载物缔合。这样的载体包括但不限于凡士林(petroleum)、软白石蜡、黄凡士林和甘油。
所述药物组合物也可以用合适的软膏配制，所述软膏包含悬浮或溶解在载体中的活性组分这样的载体包括但不限于以下的一种或多种：甘油，矿物油，液体油，液体凡士林(liquid petroleum)，白凡士林(white petroleum)，黄凡士林，丙二醇，醇类，甘油三酯，脂肪酸酯例如鲸蜡酯，聚氧乙烯聚氧丙烯化合物，蜡例如白蜡和黄蜂蜡，脂肪酸醇例如鲸蜡醇、硬脂醇和鲸蜡基硬脂醇，脂肪酸例如硬脂酸，硬脂酸鲸蜡酯，羊毛脂，氢氧化镁，高岭土，以及水。
或者，所述药物组合物也可以用包含悬浮或溶解在载体中的活性组分的合适洗剂或乳膏配制。这样的载体包括但不限于以下的一种或多种：矿物油例如石蜡，植物油例如蓖麻油、蓖麻籽油和氢化蓖麻油，脱水山梨糖醇单硬脂酸酯，聚山梨酯，脂肪酸酯例如鲸蜡酯，蜡，脂肪酸醇例如鲸蜡醇，硬脂醇，2-辛基十二烷醇，苄醇，醇，甘油三酸酯和水。
所述药物组合物也可以配制成用于经皮应用的胶带或粘合剂。所述胶带通常作为贴剂粘在皮肤上，并包含通常以延迟释放形式的活性组分设想了所述粘合剂是压敏粘合剂，其中渗透促进剂即表面活性剂、脂肪酸、萜烯和溶剂可被引入到该经皮制剂中。压敏粘合剂通常作为高度粘稠和粘性液体开始，并在其整个应用寿命周期中保持相同的形式。另外，也可以使用橡胶基压敏粘合剂，其除了作为增粘剂和稳定剂的油、树脂和抗氧化剂外，还包含天然或合成橡胶。还设想了由丙烯酸酯、甲基丙烯酸、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、N-烷氧基烷基丙烯酰胺或N-烷基丙烯酰胺在添加或不添加增粘剂下制成的基于丙烯酸的压敏粘合剂，或主要从树胶和树脂制备基于有机硅的压敏粘合剂。所述树脂是硅酸或聚硅酸水溶胶与三甲基氯硅烷反应的最终产物。
“舌下施用”涉及药理学施用途径，通过该途径，物质透过舌下的组织扩散到血液中。当物质与舌头下方的粘膜接触时，它被吸收。由于上皮之下的结缔组织有大量毛细血管，物质然后扩散到毛细血管中并进入静脉循环。用于舌下施用的典型施用形式包括舌下片剂、舌下条、舌下滴剂、舌下喷雾剂、锭剂等。
与舌下施用类似，颊含施用是指一种局部施用途径，通过该途径，在颊区域(内颊中)持有或施加的药物会通过口腔粘膜扩散并直接进入血流或被组织中存在的Langerin阳性抗原呈递细胞吸收。与口服施用相比，颊含施用被认为提供了更好的生物利用度和更快的起效，因为药物不通过消化系统，从而避免了首过代谢。为本发明设想的现代颊含施用方法包括复合材料，例如基于纳米纤维的粘膜粘附膜。这些材料通常由粘膜粘合剂层——能够实现载体的控释的储层组成。优选所述材料包含基于脂质的纳米粒子和保护性背衬层。进一步设想了使用渗透促进剂例如表面活性剂、脂肪酸以及阳离子和阴离子氨基酸可有利地增加颊含生物利用度。更多细节可从合适的文献来源例如Morales等人，2017，Curr OpinPharmacol，36，22-28中获得。
或者，所述药物组合物也可以用包含悬浮或溶解在载体中的活性组分的合适凝胶来配制。这样的载体包括但不限于以下的一种或多种：水，甘油，丙二醇，液体石蜡，聚乙烯，脂肪油，纤维素衍生物，膨润土和胶体二氧化硅。
本发明的制剂一般可包含按照常例用于这样的制剂中的其它助剂，例如防腐剂、香料、消泡剂、染料、颜料、增稠剂、表面活性物质、乳化剂、润肤剂、整理剂、脂肪、油、蜡、或美容或皮肤病学制剂的其它惯常成分，例如醇、多元醇、聚合物、泡沫稳定剂、助溶剂、电解质、有机酸、有机溶剂或有机硅衍生物。
本发明的药物组合物可包含润肤剂。润肤剂可按有效防止或缓解干燥的量使用。有用的润肤剂包括但不限于：烃油和蜡；硅油；甘油三酸酯；乙酰甘油酯；乙氧基化甘油酯；烷基酯；烯基酯；脂肪酸；脂肪醇；脂肪醇醚；醚酯；羊毛脂和衍生物；多羟基醇(多元醇)和聚醚衍生物；多羟基醇(多元醇)酯；蜡酯；蜂蜡衍生物；植物蜡；磷脂；固醇；和酰胺。
因此，例如，典型的润肤剂包括矿物油，尤其是粘度在50SUS至500SUS范围内的矿物油，羊毛脂油，貂油，椰子油，可可脂，橄榄油，杏仁油，澳洲坚果油，芦荟提取物，荷荷巴油，红花油，玉米油，液体羊毛脂，棉籽油，花生油，purcellin油，过氢角鲨烯(角鲨烯)，蓖麻油，聚丁烯，无味矿物油精，甜杏仁油，鳄梨油，红厚壳(calophyllum)油，蓖麻油，乙酸维生素E，橄榄油，矿物油精，鲸蜡硬脂醇(主要由鲸蜡醇和硬脂醇组成的脂肪醇混合物)，亚麻酸醇，油醇，辛基十二烷醇，谷物胚芽油例如小麦胚芽辛酸鲸蜡硬脂酯(鲸蜡硬脂醇和2-乙基己酸的酯)，棕榈酸鲸蜡基酯，己二酸二异丙酯，棕榈酸异丙酯，棕榈酸辛酯，肉豆蔻酸异丙酯，肉豆蔻酸丁酯，硬脂酸甘油酯，硬脂酸十六烷基酯，硬脂酸异鲸蜡酯，硬脂酸辛酯，辛基羟基硬脂酸酯，丙二醇硬脂酸酯，硬脂酸丁酯，油酸癸酯，油酸甘油酯，甘油乙酰酯，(C12-C15)醇的辛酸酯和苯甲酸酯，醇和多元醇例如二醇和甘油的辛酸酯和癸酸酯，以及醇和多元醇的蓖麻油酸酯例如己二酸异丙酯、月桂酸己酯、十二烷酸辛酯，聚二甲基硅氧烷共聚多元醇，聚二甲基硅氧烷醇，羊毛脂，羊毛脂醇，羊毛脂蜡，氢化羊毛脂，羟基化羊毛脂，乙酰化羊毛脂，矿脂，羊毛酸异丙酯，肉豆蔻酸鲸蜡酯，肉豆蔻酸甘油酯，肉豆蔻酸肉豆蔻酯，乳酸肉豆蔻酯，鲸蜡醇，异硬脂醇，硬脂醇，和羊毛酸异鲸蜡酯等。
此外，本发明的药物组合物也可包含乳化剂。乳化剂优选以有效提供组合物成分均匀掺合的量使用。有用的乳化剂包括(i)阴离子物质，例如脂肪酸皂，例如硬脂酸钾、硬脂酸钠、硬脂酸铵和硬脂酸三乙醇胺；含有脂肪酸皂的多元醇脂肪酸单酯，例如含有钾或钠盐的单硬脂酸甘油酯；硫酸酯(钠盐)，例如，月桂基5硫酸钠和十六烷基硫酸钠；以及含硫酸酯的多元醇脂肪酸单酯，例如含有月桂基硫酸钠的单硬脂酸甘油酯；(ii)阳离子物质，例如N(硬脂酰基colamino甲酰基甲基)吡啶鎓(N(stearoyl colamino formylmethyl)pyridium)；N-大豆基-N-乙基吗啉氮鎓乙基硫酸盐；烷基二甲基苄基氯化铵；二异丁基苯氧基乙氧基乙基二甲基苄基氯化铵(diisobutylphenoxytheoxyethyl dimethyl benzylammonium chloride)；和鲸蜡基氯化吡啶鎓；和(iii)非离子物质，例如聚氧乙烯脂肪醇醚，例如单硬脂酸酯；聚氧乙烯月桂醇；聚氧丙烯脂肪醇醚，例如丙氧基化油醇；聚氧乙烯脂肪酸酯，例如聚氧乙烯硬脂酸酯；聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯，例如聚氧乙烯山梨糖醇单硬脂酸酯；山梨聚糖脂肪酸酯，例如山梨聚糖；聚氧乙二醇脂肪酸酯，例如聚氧乙二醇单硬脂酸酯；和多元醇脂肪酸酯，例如单硬脂酸甘油酯和丙二醇单硬脂酸酯；以及乙氧基化羊毛脂衍生物，例如乙氧基化羊毛脂、乙氧基化羊毛脂醇和乙氧基化胆固醇。
本发明的药物组合物也可包含表面活性剂。合适的表面活性剂可包括，例如，通常被归类为清洁剂、乳化剂、泡沫促进剂、水溶助长剂、增溶剂、悬浮剂和非表面活性剂的那些表面活性剂(促进固体在液体中的分散)。
表面活性剂通常分为两性、阴离子、阳离子和非离子表面活性剂。两性表面活性剂包括酰基氨基酸和衍生物以及N-烷基氨基酸。阴离子表面活性剂包括：酰基氨基酸和盐，例如酰基谷氨酸盐、酰基肽、酰基肌氨酸盐和酰基牛磺酸盐；羧酸和盐，例如链烷酸、酯羧酸和醚羧酸；磺酸和盐，例如酰基羟乙磺酸盐、烷芳基磺酸盐、烷基磺酸盐和磺基琥珀酸盐；硫酸酯，例如烷基醚硫酸酯和烷基硫酸酯。阳离子表面活性剂包括：烷基胺，烷基咪唑啉，乙氧基化胺和季铵盐(例如，烷基苄基二甲基铵盐、烷基甜菜碱、杂环铵盐和四烷基铵盐)。以及非离子表面活性剂包括：醇，例如含8个至18个碳原子的伯醇；烷醇酰胺，例如烷醇胺衍生的酰胺和乙氧基化酰胺；氧化胺；酯，例如乙氧基化羧酸、乙氧基化甘油酯、乙二醇酯和衍生物、单甘油酯、聚甘油酯、多元醇酯和醚，山梨聚糖/山梨醇酯和磷酸的三酯；以及醚例如乙氧基化醇、乙氧基化羊毛脂、乙氧基化聚硅氧烷和丙氧基化聚氧乙烯醚。
在药物组合物作为薄膜提供的情况下，它可包含成膜剂。本发明使用的合适的成膜剂保持组合物光滑和均匀，并且包括但不限于：丙烯酰胺/丙烯酸钠共聚物；丙烯酸铵共聚物；秘鲁香脂；纤维素胶；乙烯/马来酸酐共聚物；羟乙基纤维素；羟丙基纤维素；聚丙烯酰胺；聚乙烯；聚乙烯醇；pvm/MA共聚物(聚乙烯基甲醚/马来酸酐)；PVP(聚乙烯吡咯烷酮)；马来酸酐共聚物，例如可得自Gulf Science and Technology的PA-18；PVP/十六烯共聚物，例如可得自GAF Corporation的Ganex V-216；丙烯酸丙烯酸酯共聚物；等等。
通常，成膜剂的使用量可以为总组成的约0.1重量％至约10重量％，优选约1％至约8％，最优选约0.1DEG/O至约5％。保湿剂也可以有效量使用，包括：果糖；葡萄糖；谷氨酸；甘油；蜂蜜；麦芽糖醇；甲基葡糖聚醚-10；甲基葡糖聚醚-20；丙二醇；乳酸钠；蔗糖等。
在本发明的一个进一步的实施方案中，所述药物组合物可通过吸入施用。因此，所述药物制剂可以是喷雾剂的形式，例如泵喷雾或气雾剂。通常，本发明的气雾剂包含药剂或药物组合物、一种或多种氯氟烃推进剂以及表面活性剂或溶剂，例如乙醇。例如，可以使用气雾剂推进剂如推进剂11和/或推进剂114和/或推进剂12。本发明的用于气雾剂的其它合适的推进剂是丙烷、丁烷、戊烷等。与常规的氯氟烃相比，可以使用并且被认为臭氧消耗效果最小的另外的推进剂包括碳氟化合物和含氢的氯氟烃。例如EP 0372777中公开了用于药用气雾剂制剂的其它气雾剂。通常，可以在制剂中添加少量的一种或多种佐剂，例如醇、烷烃、二甲醚、表面活性剂(包括氟化和非氟化表面活性剂、羧酸、聚乙氧基化物等)和常规的氯氟烃推进剂。
进一步优选的是将1,1,1,2-四氟乙烷与极性大于1,1,1,2-四氟乙烷的助溶剂(例如醇或低级烷烃)和表面活性剂组合使用，以实现药物组合物粉末的稳定制剂。另外，表面活性剂可用作气雾剂制剂的重要组分，以减少药物组合物的聚集并润滑例如分散器具的阀，如果根据本发明的一个进一步优选的实施方案采用所述阀的话，由此确保了阀致动的一致再现性和所分配剂量的准确性。通常，本发明的药物组合物可以在分散在1,1,1,2-四氟乙烷中之前预先包被表面活性剂。
在本发明的一个进一步的优选实施方案中，药物气雾剂制剂可以用本领域技术人员已知的任何合适的设备设备分散，优选通过计量吸入器(MDI)、喷雾器、Rotahaler或自动吸入器设备进行分散。
口服递送可通过使如本文定义的组合物与能够承受动物肠中消化酶降解的载体复合而进行。这类载体的示例包括塑性胶囊或片剂，例如本领域已知的那些。
合适的栓剂可包含如本文定义的组合物加之胶体二氧化硅，以及包括甘油三酸酯的油脂性基质。
可任选采用测定法，例如，如可从已知和合格的文献来源获得的测定法，以帮助鉴定本发明药物组合物的成分的最佳比率和/或剂量范围。用于制剂中的如上文定义的药物组合物的精确剂量和成分之间的比率也将取决于施用途径、疾病或病症的确切类型，并应根据执业医师的判断和每个患者的情况来决定。有效剂量或成分比可从体外或(动物)模型试验系统获得的剂量-反应曲线推断。
通常情况下，主治医师和临床因素可决定给药方案。如医学领域中公知的，任何一位患者的剂量取决于许多因素，包括患者的身材、体表面积、年龄、待施用的特定化合物、性别、施用的时间和途径、总体健康以及同时施用的其它药物。典型的剂量可以例如在0.001mg至1000mg的范围内；然而，也设想了低于或高于该示例性范围的剂量，尤其是考虑到前述因素。
在一个优选实施方案中，如上文定义的药物组合物用于治疗或预防疾病或病理状况。
如本文所用的“疾病”或“病理学状况”是将从用如上定义的药物组合物、特别是用其中所述载体包含运载物、优选如本文定义的运载物或与所述运载物缔合的介质治疗中受益的任何状况。
除非上下文中另有说明，否则术语“治疗”是指治疗性和/或预防性措施，以防止疾病或病理状况的爆发或复发，其中目的是抑制或减慢(减轻)不希望的生理状况。出于本发明的目的，有益或期望的临床结果包括但不限于，减轻症状、减轻疾病程度、稳定(即，不加重)疾病状态、延迟或减缓疾病进展、改善或缓解疾病状态，以及消退(无论是部分还是全部)，无论是可检测的还是不可检测的。治疗也可以意指与如果不接受治疗时的预期生存相比延长生存。需要治疗的那些包括已经患有所述状况或病症的那些以及易患所述状况或病症的那些。在具体的实施方案中，所述治疗可进一步涉及单次施用如上定义的药物组合物，或多次施用。可针对患者的性别或体重、疾病、所使用的药物组合物、患者的总体健康状态等来调节相应的施用方案。例如，施用方案可以考虑每12h、每24h、每28h、每72h、每96h、每周一次、每两周一次、每三周一次、每月一次施用等。还设想了在施用阶段之间的暂停或中断。这些方案当然可以由执业医师根据患者对治疗的反应和/或疾病或病理状况的过程来调节或改变。
在本发明的一个特别优选的实施方案中，如上文定义的药物组合物用于治疗或预防癌症。如本文所用的术语“癌症”涉及导致癌性或恶性肿瘤形成和生长的病理过程，所述癌性或恶性肿瘤即通过细胞增殖而生长的异常组织，经常比正常细胞生长更快，并在引发新生体的刺激停止后继续生长。恶性肿瘤通常显示出部分或完全缺乏与正常组织的结构组织和功能协调并且大多侵入周围组织，转移到若干部位，并且除非经过适当治疗，否则很可能在试图切除后复发并导致患者死亡。因此，该术语也包括转移瘤的存在和发展。如本文所用的术语“赘生物”用于描述所有癌性疾病状态，并且涵盖或包涵与恶性血源性、腹水性和实体肿瘤相关的病理过程。代表性的癌症包括，例如，胃癌、结肠癌、直肠癌、肝癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、宫颈癌、子宫体癌、卵巢癌、前列腺癌、包括转移性前列腺癌、睾丸癌、膀胱癌、肾癌、脑癌/CNS癌、头颈癌、喉癌、霍奇金氏病、非霍奇金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、白血病、黑素瘤皮肤癌、非黑素瘤皮肤癌、急性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、尤文氏肉瘤、小细胞肺癌、绒毛膜癌、横纹肌肉瘤、威尔姆斯瘤(Wilms'tumor)、神经母细胞瘤、毛细胞白血病、口腔癌/咽癌、食管癌、喉头癌、肾癌和淋巴瘤。还设想了本领域技术人员已知或可从合适文献来源例如Pavlopoulou等人，2015，Oncol Rep.，33，1，3–18中获得的更多癌症形式。
在某些实施方案中，癌症可以是难治性癌症。如果对象已经接受了手术作为癌症治疗，则癌症可被假定为残留存在。还设想了转移性癌症形式，例如上述癌症形式的转移性形式。
可优选通过使用如上所述的肿瘤相关抗原或癌症抗原或癌症表位以如上所述的运载物形式提供给Langerin+DC来治疗以上提到的癌症形式。这些抗原或其表位随后由Langerin+细胞加工并呈递给其它免疫细胞，并激活这些免疫细胞导致免疫应答，例如通过针对显示所述抗原或表位的实体例如细胞的CTL或抗体。这些免疫细胞的激活又取决于Langerin+DC的成熟和激活，而后者可通过共同施用适当的佐剂来实现。这样的佐剂的非限制性示例是TLR或Rig-1样受体(RLR)激动剂。
还设想了提供不同的抗原和/或不同的表位，例如源自于不同癌症形式，或源自于可在同一癌细胞上或同一肿瘤中存在的不同蛋白质或糖蛋白。这些抗原或表位可例如以多抗原融合蛋白或多表位蛋白(例如，包含2、3、4、5、6、7、8或更多个表位)提供，或作为在运载物负载中堆积在一起的单个抗原/表位单元提供。例如，可以混合不同的抗原，然后将其配制在载体、例如如本文定义的脂质体中。还优选在运载物负载内使用不同分子形式的肿瘤抗原/表位。例如，它可作为蛋白质/肽、或作为核酸提供。
在一个进一步的特别优选的实施方案中，术语“癌症”还涉及朗格汉斯细胞组织细胞增多症(LCH)，朗格汉斯细胞发生癌变。朗格汉斯细胞组织细胞增多症是一种涉及朗格汉斯细胞克隆增殖的罕见疾病。临床上，其表现范围从孤立的骨病变到多系统疾病。朗格汉斯细胞组织细胞增多症是一组被称为组织细胞增多症的临床综合征的一部分，所述组织细胞增多症以组织细胞(即激活的树突状细胞和巨噬细胞)的异常增殖为特征。这种癌症形式涉及白血病和淋巴瘤。该疾病通常表现在Langerin+细胞上，即在表面上表达Langerin的细胞。不希望受理论束缚，认为过度活跃的ERK可以驱动LCH发病机制。进一步认为，BRAF-V600E因其存在于骨髓中的造血细胞中而参与高风险LCH。例如，这可以通过LCH发病机制的误导骨髓DC模型来解释，在该模型中，发生病理性ERK激活的细胞分化状态决定了LCH的临床程度。可能有助于发病机制的其它因素是炎性浸润。因此，LCH被假定为是骨髓增生性肿瘤或炎性髓样瘤变。可优选使用细胞毒性物质、小分子、放射性核素或蛋白质来治疗LCH，例如使用合适的抗体，例如针对细胞表面上存在的表面标志物或蛋白质的抗体，更具体地，如上所述的抗-Langerin抗体和/或多组分系统，它们以如上所述的运载物形式提供给Langerin+细胞。在LCH治疗的情形下使用的合适的抗体包括例如基于发现BRAF V600E的针对BRAF V600E的抗体。还设想了如本领域技术人员已知的，在LCH的情形下针对其它突变的抗体。
在本发明的一个进一步特别优选的实施方案中，如上文定义的药物组合物用于治疗或预防自身免疫性疾病。如本文所用的术语“自身免疫性疾病”涉及如上文定义的攻击自身组织或无害环境组分的不适当的免疫应答。本发明设想的并且可以用所述药物组合物治疗的自身免疫性疾病的示例包括，抗磷脂综合征(aPL综合征)，天疱疮，多发性硬化症(MS)，重症肌无力，Grave's病，Goodpasture综合征，显微血管炎，肉芽肿病伴多血管炎，系统性自身免疫性风湿病(SARD)，混合性结缔组织病，系统性红斑狼疮，
Figure GDA0002759246180000851
综合征，系统性硬化/CREST综合征，多发性肌炎/皮肌炎，自身免疫性甲状腺病，乳糜泻，自身免疫性肝炎，原发性胆汁性肝硬化，ANCA相关疾病，抗磷脂综合征/血栓栓塞综合征，抗GBM病，糖尿病，恶性贫血，白癜风或克罗恩病。如上所述的自身免疫性疾病的治疗基于使用如上所述的自身免疫性疾病抗原或自身免疫性疾病表位，其以如上文所述的运载物形式提供给Langerin+DC。特别是，在不存在共刺激信号，即没有共同递送佐剂的情况下，已知Langerin+DC诱导调节性T细胞的扩增和CTL的抗原特异性缺失，即抗原特异性耐受。因此，在该治疗方案的情形下，如上所述的自身免疫性疾病抗原或自身免疫性疾病表位优选在没有共同递送任何佐剂的情况下提供。进一步优选，导致通过技术人员已知的任何合适的手段抑制的Langerin+DC激活的任何共刺激信号。
在本发明的又一个特别优选的实施方案中，如上文定义的药物组合物用于治疗或预防细菌感染。术语“细菌感染”涉及患者、特别是人类被病原细菌或在生物体中不希望存在的细菌、例如细菌菌群或生物群系的一部分感染。优选的示例包括细胞内细菌感染，例如由诸如嗜衣体(chlamydophila)、埃利希氏体(Ehrlichia)、立克次氏体(Rickettsia)、沙门氏菌(Salmonella)、奈瑟氏菌(Neisseria)、布鲁氏菌(Brucella)、分枝杆菌(Mycobacterium)、诺卡氏菌(Nocardia)、李斯特菌(Listeria)、弗朗西斯氏菌(Francisella)、军团杆菌(Legionella)或耶尔森氏菌(Yersinia)等细菌传送的细菌传染。设想用本发明的药物组合物治疗其感染的病原菌的其它示例包括下列细菌属：芽孢杆菌(Bacillus)，巴尔通体(Bartonella)，博德特氏菌(Bordetella)，疏螺旋体(Borrelia)，弯曲杆菌(Campylobacter)，衣原体(Chlamydia)，梭菌(Clostridium)，棒状杆菌(Corynebacterium)，肠球菌(Enterococcus)，埃希氏菌(Escherichia)，嗜血杆菌(Haemophilus)，螺杆菌(Helicobacter)，钩端螺旋体(Leptospira)，支原体(Mycoplasma)，假单胞菌(Pseudomonas)，志贺氏菌(Shigella)，葡萄球菌(Staphylococcus)，链球菌(Streptococcus)，密螺旋体(Treponema)，脲原体(Ureaplasma)，和弧菌(Vibrio)。在具体的实施方案中，待治疗的细菌感染可以是被以下物种中的一种或多种感染：炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)，蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)，汉氏巴尔通体(Bartonellahenselae)，五日热巴通体(Bartonella quintana)，百日咳博德特氏菌(Bordetellapertussis)，伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)，伽氏疏螺旋体(Borrelia garinii)，阿氏疏螺旋体(Borrelia afzelii)，回归热疏螺旋体(Borrelia recurrentis)，流产布鲁氏菌(Brucella abortus)，犬布鲁氏菌(Brucella canis)，羊布鲁氏菌(Brucellamelitensis)，猪布鲁氏菌(Brucella suis)，空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)，肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)，沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)，鹦鹉热衣原体(Chlamydophila psittaci)，肉毒梭菌(Clostridium botulinum)，艰难梭菌(Clostridiumdifficile)，产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)，破伤风梭菌(Clostridiumtetani)，白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)，粪肠球菌(Enterococcusfaecium)，屎肠球菌(Enterococcus faecium)，大肠杆菌(Escherichia coli)，土拉热弗朗西丝氏菌(Francisella tularensis)，流感嗜血杆菌(流感嗜血杆菌)，幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)，肺炎军团菌(Legionella pneumophila)，问号状钩端螺旋体(Leptospira interrogans)，圣地罗西钩端螺旋体(Leptospira santarosai)，韦氏钩端螺旋体(Leptospira weilii)，野口钩螺旋体(Leptospira noguchii)，单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes)，麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)，结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)，溃疡分枝杆菌(Mycobacterium ulcerans)，肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)，淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)，脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，立氏立克次体(Rickettsia rickettsii)，伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)，宋内氏志贺氏菌(Shigella sonnei)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)，腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)，无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)，肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)，化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)，苍白密螺旋体(Treponema pallidum)，解脲脲原体(Ureaplasma urealyticum)，霍乱弧菌(Vibriocholerae)，鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)，小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersiniaenterocolitica)和假结核耶尔森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis)。特别优选的是治疗脑膜炎奈瑟氏球菌、白喉棒状杆菌、百日咳博德特氏菌或破伤风梭菌的感染。
在细菌感染的情形下，术语“治疗”包括以下任何一项或全部：抑制细菌生长、引起感染性疾病的病原体的增殖或复制，以及改善感染性疾病的一种或多种症状。如上提到的细菌的感染优选可通过使用细菌抗原或细菌表位来治疗，所述细菌抗原或细菌表位如本文所述或技术人员例如从合适的文献来源如Detmer和Glenting，2006，Microbial CellFactories，5，23中已知的，将其以如上所述的运载物的形式提供给Langerin+DC。这些抗原或其表位随后由Langerin+细胞加工并呈递给其它免疫细胞，并激活这些免疫细胞导致免疫应答，例如通过对抗显示所述抗原或表位的实体例如细菌或其部分的CTL或抗体。还设想了提供不同的抗原和/或不同的表位，例如源自于不同细菌的，或源自于可在同一细菌上存在的不同蛋白质或糖蛋白的。这些抗原或表位可例如以多抗原融合蛋白或多表位蛋白(例如，包含2、3、4、5、6、7、8或更多个表位)提供，或作为在运载物负载中堆积在一起的单个抗原/表位单元提供。还优选在运载物负载内使用不同分子形式的细菌抗原/表位。例如，它可作为蛋白质/肽、或作为寡糖或作为核酸提供。还优选细菌抗原/表位，如果提供了几种的话，以抗原或表位的组合或作为抗原/表位的混合物提供，例如当配制或产生脂质体时。
在本发明的另一个特别优选的实施方案中，如上文定义的药物组合物用于治疗或预防病毒感染。如本文所用的术语“病毒感染”是指由病原性病毒或感染性病毒粒子(病毒体)引起的感染和/或疾病。设想用本发明的药物组合物治疗的病原性病毒或病毒体的示例包括以下类群的病毒：腺病毒科(Adenoviridae)，小RNA病毒科(Picornaviridae)，疱疹病毒科(Herpesviridae)，嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)，黄病毒科(Flaviviridae)，逆转录病毒科(Retroviridae)，正粘病毒科(Orthomyxoviridae)，副粘病毒科(Paramyxoviridae)，乳头瘤病毒科(Papillomaviridae)，弹状病毒科(Rhabdoviridae)，披膜病毒科(Togaviridae)。在具体的实施方案中，待治疗的病毒感染可以是被以下一种或多种病毒类型感染：腺病毒，柯萨奇病毒，Epstein-Barr病毒，甲型肝炎病毒，乙型肝炎病毒，丙型肝炎病毒，1型单纯疱疹病毒，2型单纯疱疹病毒，巨细胞病毒，8型人疱疹病毒，HIV，流感病毒，麻疹病毒，腮腺炎病毒，人乳头瘤病毒，副流感病毒，脊髓灰质炎病毒，狂犬病病毒，呼吸道合胞病毒，风疹病毒，水痘-带状疱疹病毒。特别优选的是治疗人乳头瘤病毒、甲型肝炎病毒和乙型肝炎病毒的感染。
在病毒感染的情形下，术语“治疗”包括以下任何一项或全部：抑制病毒的生长、引起感染性疾病的病原体的增殖或复制，以及改善感染性疾病的一种或多种症状。如上提到的病毒或病毒体的感染优选可通过使用病毒抗原或病毒表位来治疗，所述病毒抗原或病毒表位如本文所述、或是技术人员例如从合适的文献来源如Ansari等人，2010，NucleicAcids Res，38，D847-D853或从互联网资源例如https://www.who.int/immunization/diseases/en/(最后一次访问在2018年12月4日)中已知的，将其以如上所述的运载物的形式提供给Langerin+DC。这些抗原或其表位随后由Langerin+细胞加工并呈递给其它免疫细胞，并激活这些免疫细胞导致免疫应答，例如通过对抗显示所述抗原或表位的实体例如病毒或其部分的CTL或抗体。还设想了提供不同的抗原和/或不同的表位，例如源自于不同病毒的，或源自于可在同一细菌之上或之内存在的不同蛋白质或糖蛋白的。这些抗原或表位可例如以多抗原融合蛋白或多表位蛋白(例如，包含2、3、4、5、6、7、8或更多个表位)提供，或作为在运载物负载中堆积在一起的单个抗原/表位单元提供。例如，可以混合不同的抗原，随后将其配制在载体、例如如本文定义的脂质体中。还优选在运载物负载内使用不同分子形式的病毒抗原/表位。例如，它可作为蛋白质/肽、或作为寡糖或作为核酸提供。
在本发明的又一个特别优选的实施方案中，如上文定义的药物组合物用于治疗或预防寄生虫感染。术语“寄生虫感染”涉及患者、特别是人类被寄生虫感染。这样的感染可能但不一定导致寄生性病，即由寄生虫引起或传播的感染性疾病。因此，本发明不仅设想治疗寄生虫病本身，而且设想治疗可能不会导致疾病的寄生虫的感染。这样的感染仍可被认为对患者的健康产生问题，例如由于寄生虫使用能量或食物资源、疲劳、由于例如发觉被感染引起的精神问题。而且，从流行病学的角度来看，治疗这样的感染是有利的，因为由此可防止进一步的异化。如上所述，要治疗其感染的寄生虫是哺乳动物、特别是人类的寄生虫。所述寄生虫通常属于原生动物或后生动物类群。设想用本发明的药物组合物治疗其感染的寄生虫的示例包括鞭毛虫、阿米巴、孢子虫和纤毛虫，以及扁蠕虫。在具体的实施方案中，待治疗的寄生虫感染可以是以下一种或多种属或种的感染：贾第鞭毛虫，毛滴虫，锥虫，利什曼原虫，内阿米巴，纳氏虫，棘阿米巴，隐孢子虫，环孢子虫，弓形虫，疟原虫，结肠小袋纤毛虫(Balantidium coli)，肝片吸虫(Fasciola hepatica)，绦虫(Taenia)，裂体吸虫(Schistosoma)，班氏吴策线虫(Wuchereria bancrofti)和旋盘尾丝虫(Onchocercavolvulus)。特别优选的是用疟原虫治疗感染。
在病毒感染的情形下，术语“治疗”包括以下任何一项或全部：抑制寄生虫的生长、引起感染性疾病的病原体的增殖或复制，以及改善寄生虫感染的一种或多种症状。如上提到的寄生虫的感染优选可通过使用寄生虫抗原或寄生虫表位来治疗，所述寄生虫抗原或寄生虫表位如本文所述，或是技术人员例如从合适的文献来源如Ansari等人，2010，NucleicAcids Res，38，D847-D853、Tarleton，2005，Cellular Microbiology，7，10，1379-1386或Higashi，1988，Ann Rev Public Health，9，483-501中已知的，将其以如上文所述的运载物的形式提供给Langerin+DC。这些抗原或其表位随后由Langerin+细胞加工并呈递给其它免疫细胞，并激活这些免疫细胞导致免疫应答，例如通过对抗显示所述抗原或表位的实体例如病毒或其部分的CTL或抗体。还设想了提供不同的抗原和/或不同的表位，例如源自于不同寄生虫，或源自于可在同一寄生虫之上或之内存在的不同蛋白质或糖蛋白。这些抗原或表位可例如以多抗原融合蛋白或多表位蛋白(例如，包含2、3、4、5、6、7、8或更多个表位)提供，或作为在运载物负载中堆积在一起的单个抗原/表位单元提供。例如，可以混合不同的抗原，随后将其配制在载体、例如如本文定义的脂质体中。还优选在运载物负载内使用不同分子形式的寄生虫抗原/表位。例如，它可作为蛋白质/肽、或作为寡糖或作为核酸提供。
在本发明的又一个特别优选的实施方案中，如上文定义的药物组合物用于治疗或预防移植物抗宿主病。如本文所用的术语“移植物抗宿主病”涉及接受来自遗传不同的人的移植组织后的医学并发症。移植物抗宿主病通常与干细胞移植有关，例如伴随髓移植发生的那些。移植物抗宿主病也可适用于其他形式的移植组织，例如实体器官移植。不希望受理论束缚，假定该疾病是由以下事实引起的：残留在捐献组织(移植物)内的供者免疫系统白细胞将受者(宿主)识别为异物(非自身)。然后，存在于移植组织内的白细胞通常攻击受者的身体细胞，从而导致移植物抗宿主病。移植物抗宿主病不同于移植排斥，移植排斥是在移植受者的免疫系统排斥移植的组织时发生的；另一方面，移植物抗宿主病是在供者免疫系统的白细胞排斥受者时发生的。如果使用的血液制品未经辐照或未经批准的减病原体系统处理，则输血后也可发生移植物抗宿主病。本发明设想了给所述捐赠组织(移植物)的宿主提供捐赠组织中包含MHC抗原，例如移植物或该组织的供者的抗原。该抗原可以有利地通过作为如本文定义的合适载体中的运载物提供给Langerin+DC细胞。此步骤之后通常可以继以MHC特异性调节性T细胞的扩增和激活，从而导致CTL的抗原特异性缺失，即在没有共刺激性信号、例如没有佐剂的共同递送下的抗原特异性耐受。因此，在该治疗方案的情形下，优选在没有共同递送任何佐剂的情况下提供如上所述的抗原或自身免疫性疾病表位。还优选导致被技术人员已知的任何合适的手段抑制的Langerin+DC细胞的激活的任何共刺激信号。更多细节可从合适的文献来源例如Sela等人，2011，J.Exp.Med.，208，12，2489-2496中获得。
在一个进一步的实施方案中，本发明进一步设想了抑制捐赠组织(移植物)的供者的免疫反应，例如离体。因此，本发明涉及例如皮肤移植的用途，其中将供者移植物中的LC特异性离体杀死。更多细节可从例如下列文献中获得：Zell等人，2008，Journal ofInvestigative Dermatology，128，8，1874，Obhrai等人，2008，Journal of InvestigativeDermatology，128，8，1950-1955；Molinero等人，2007，American Journal ofTransplantation，8，1；Adhikary等人，2018，Transplantation，102，S235或Yamano等人，2011，Blood，117，2640-2648。
另外，在本发明的特别优选的实施方案中，如上文定义的药物组合物用于治疗或预防局部或全身性炎症。如本文所用的术语“炎症”涉及身体组织对破坏性或有害的刺激例如病原体、受损的细胞或刺激物的复杂生物反应。炎症是涉及免疫细胞、血管和分子介质的保护性反应。炎症的功能是为了消除细胞损伤的初始原因、清除从原始伤害和炎性过程中损伤的坏死细胞和组织、并启动组织修复。炎症是一种普遍的反应，因此被认为是一种先天免疫机制。炎症的过程是由受累组织中已经存在的驻留免疫细胞引发的，所述免疫细胞特别是驻留巨噬细胞、树突细胞、组织细胞(朗格汉斯细胞)、库普弗细胞(Kupffer cells)和肥大细胞。这些细胞具有被称为模式识别受体(PRR)的表面受体，该受体识别两个亚类的分子：病原体相关的分子模式(PAMP)和损伤相关的分子模式(DAMP)。PAMP是与各种病原体有关、但与宿主分子有区别的化合物。DAMP是与宿主相关损伤和细胞受损有关的化合物。在感染、烧伤或其它损伤开始时，这些细胞经历激活(PRR之一识别PAMP或DAMP)并释放造成炎症临床征象的炎性介质。血管舒张及其导致的血流增加引起发红和热度增加。血管通透性增加导致血浆蛋白和流体渗渗出进入组织，本身表现为肿胀。释放的介质中有一些例如缓激肽增加对疼痛的敏感性。所述介质分子也改变血管，使白细胞，主要是嗜中性粒细胞和巨噬细胞，从血管外迁移到组织中。中性粒细胞沿局部细胞产生的趋化梯度迁移，以到达损伤部位。功能丧失可能是对疼痛作出反应的神经反射的结果。
当炎症制服宿主、即成为“全身性炎症”时，则产生全身性炎症反应综合征。当它是由于感染引起时，该综合征被认为是脓毒症。伴随广泛感染可发生血管扩张和器官功能障碍，可能导致感染性休克和死亡。与此相反，“局部炎症”局限于第一有害刺激、损伤或损害的位置或组织区域。不希望受理论束缚，目前认为，朗格汉斯细胞调整调节性T细胞，调节性T细胞又可以终止炎性反应，例如如Sharabi等人，2018，Nature Reviews Drug Discovery，17，823–844中所述。进一步假设朗格汉斯细胞可以通过Treg诱导抗炎反应的事实，这可从合适的文献来源例如Stary等人，2011，J Immunol，186,1，103-112中获得。设想的治疗方法涉及通过本发明的介质向Langerin+细胞提供合适的化合物例如糖皮质激素，所述化合物可包含在如本文定义的载体中。因此可引发抗炎反应。更多信息可从Bartneck等人，2014，Nanomedicine,10，6，1209-20中获得。
在本发明的一个进一步特别优选的实施方案中，如上文定义的药物组合物用于治疗或预防变态反应。如本文所用的术语“变态反应”涉及由免疫系统对来自环境的在正常情况下、即在健康对象中很少或没有问题的刺激的过敏性所引起的病理状况。因此，变态反应是是一种产生异常剧烈的免疫应答的状况，其中免疫系统防卫机体对抗感知的威胁，而该威胁原本对身体无害。潜在机制被假定为涉及免疫球蛋白E抗体(IgE)与变应原、例如如上文定义的变应原结合以及与肥大细胞或嗜碱性粒细胞上的受体结合，在此IgE触发炎性化学物质例如组胺的释放。
在本发明的一个进一步特别优选的实施方案中，如上文定义的药物组合物用于减敏。术语“减敏”，也称为脱敏或去敏，是一种以药物治疗形式对抗某些类型变态反应的变应原免疫疗法，它依靠施用剂量递增的变应原以驱动免疫应答从产生IgE朝向诱导调节性T细胞反应，从而促进变应原特异性耐受。本发明通过在不存在佐剂的情况下将变应原选择性地递送给Langerin+DC、特别是朗格汉斯细胞，可用来以更高的效率直接诱导调节性T细胞应答。
本发明进一步设想了与在其表面上表达Langerin的细胞、特别是DC直接或间接相关的任何其它疾病或医学状况的治疗。特别是，可包含如上文定义的载体中或与之所述载体缔合的运载物可以是活性药物或免疫化合物，其例如能够在体内引起免疫反应，其作为免疫调节剂、作为免疫耐受诱导剂或作为细胞功能抑制剂例如凋亡抑制剂起作用。而且，递送到Langerin+细胞中的活性药物或免疫学化合物可在所述递送后允许特异性激活或抑制免疫系统，优选通过DC的典型途径。免疫系统的这种激活或调节可能可用于体内治疗或预防疾病。因此，待治疗的疾病可能未发展或已存在于待治疗的对象中。
在另一个方面，本发明涉及一种诊断组合物，其包含如上定义的介质或如上定义的组合物，其中所述载体包含适合诊断的运载物或与所述运载物缔合。如本文所用的术语“适合诊断的运载物”涉及选自以下任何一项的运载物实体：小分子，肽，蛋白质，核酸，金属，放射性核素，毒素，染料，和颜料。优选所有提到的元件对应于上文在运载物的情形下所定义的那些元件，包括所提到的元件的另外的示例。特别优选的是染料，其可用于在不同情形、例如皮肤或淋巴组织中靶向和可视化Langerin+细胞。还设想了以上提到是运载物的组合，例如蛋白质和核酸，或蛋白质和染料，或小分子和染料等。在进一步的优选实施方案中，所提到的载体可包含适合诊断的运载物例如染料或与所述运载物缔合，并同时与适合治疗的运载物例如如本文定义的小分子等缔合。适合诊断的运载物的存在可相应地用于检测和/或计数适合治疗的运载物的递送。所述诊断组合物还可以包含如上文在药物组合物的情形下定义的药学上可接受载体，或如上文在药物组合物的情形下定义的药物佐剂。
在具体的实施方案中，如本文定义的诊断组合物可用于直接诊断朗格汉斯细胞相关疾病，例如LC-组织细胞增多症，其中所述诊断组合物可包含疾病特异性标志物/生物标志物或包含允许检测LC组织细胞增多症的合适组分。
在进一步的实施方案中，如本文所述的诊断组合物可用于预后和/或预测用途。例如，所述诊断组合物可用于评估朗格汉斯细胞激活水平和/或疾病特异性抗原或变应原的交叉呈递水平的变化，例如，在治疗之前、期间或之后，优选直接在治疗之后。这样的用途特别设想了包含用于激活信号的标志物例如RNA、肽或蛋白质水平标志物的诊断组合物。这些标志物可通过如本文定义的介质和载体递送或与如本文定义的其它组分例如本文定义的药物活性化合物一起共递送至靶细胞，即Langerin+细胞。
因此，在一个优选实施方案中，可以使用所述系统共同递送用于激活信号(关于RNA、肽/蛋白质水平)的标记标记物，如上定义的诊断组合物是用于检测或监测治疗方法和/或基于如本文定义的药物组合物的所述治疗方法对抗癌症、自身免疫性疾病、细菌感染、病毒感染或移植物抗宿主病、局部或全身性炎症或变态反应的功效。
在一个进一步的方面，本发明涉及一种鉴定用于疾病的Langerin+树突细胞靶向疗法的合适剂量的方法，所述方法包括：(a)使Langerin+细胞群体与能够被引入所述细胞的化合物接触，(b)确定所述化合物参入的细胞的数量；(c)通过比较化合物参入的细胞的数量和起始群体，来确定所述化合物的合适剂量。如本文所用的术语“树突细胞靶向疗法”涉及如本文所述的药物组合物的用途。优选地，该术语涉及药物组合物的治疗形式或用途，所述药物组合物涉及如本文定义的介质，更优选包含如本文定义的运载物，通过作为如本文定义的缀合物的一部分的配体，与关联受体Langerin的相互作用。因此，所述疾病可以是上文提到的任何疾病，例如癌症，或细菌、病毒、寄生虫感染，变态反应等。“使Langerin+细胞群体与化合物接触”的步骤是指使所述化合物与所述细胞接触或达到所述细胞附近或递送至所述细胞，优选通过如上定义的介质。这些细胞要么源自于体外细胞培养，要么是从患者皮肤中获得的离体细胞。特别优选确定或知道所使用的细胞的数量。因此可在封闭环境、例如反应室等中提供这些细胞。所述化合物是“能够被引入细胞的化合物”，这意味着所述化合物可以被Langerin+细胞内化，例如通过胞吞。这样的方法可以，例如，包括体外步骤，其中对LC染色，或者其中进行流式细胞术分析。所述化合物的引入可优选通过Langerin+细胞的胞吞进行。
例如，在一个具体实施方案中，所述方法可作为体外方法实施，其中可以用本发明的组合物，例如包含染料的，来标记Langerin+细胞。进一步设想使用流式细胞术来分离标记的和未标记的细胞。还设想作为体内方法或作为体外/离体联合方法实施。在具体的实施方案中，所述化合物可以是如上文定义的运载物，优选染料或颜料，更优选是Alexa Fluor647。
如所述方法的步骤b)中所用的“确定所述化合物参入的细胞的数量”的步骤涉及任何合适的分析过程，所述分析过程允许将所述化合物参入的细胞与未参入的细胞区分开。优选地，该过程是荧光检测过程，其鉴定参入了染料或颜料的那些细胞与未参入的那些细胞。更优选地，它是基于使用Alexa Fluor 647的过程。因此，可以通过对那些显示例如荧光信号或染色的细胞进行计数，并从原始提供的细胞数、即所述测定中使用的细胞总数中扣除该数量，由此得出非荧光或未染色细胞的数量，从而确定化合物已参入的细胞与所述化合物未参入的细胞的数量。最后，可通过将化合物的使用量与化合物参入的细胞数量或百分比相关联，确定化合物的剂量，或照此类推的任何相似或可比化合物的剂量。因此，通过增加递送至细胞的化合物的量，可以增加化合物参入的细胞的百分比。在另外的实施方案中，也可以改变替代参数，例如添加剂的存在、化合物的制剂、二价离子的存在等。因此，根据某些实施方案，“合适的剂量”可以是50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％或超过90％的细胞百分比显示出化合物参入，例如按照上述步骤通过荧光进行。此外，所述方法可以如实施例、例如实施例10中所描述的进行。更多信息可从合适的文献来源例如Boyd和Jackson，2015，Cell Host&Microbe，17，301-307中获得。
在一个优选实施方案中，化合物参入与化合物未参入的细胞的比较可在1-3天时间后进行，例如在24h、30h、36h、40h、48h、55h、60h、65h或72h之后。
在一个进一步的实施方案中，可将化合物参入的细胞数量与观察到的文献结果或可从数据库或互联网存储库获得的结果进行比较。例如，可以将化合物的参入百分比、计算出的合适剂量等例如与数据库中同一测定或相似测定中其它化合物的数据进行比较。在某些实施方案中，所述数据库可以是用来自根据本发明的不同方法/不同化合物的信息开发的数据库。来自本发明之外的其它项目的信息也可用于这样的数据库。
在另一方面，本发明涉及一种医用试剂盒，其包含至少一种选自如上文定义的介质和/或如上文定义的组合物的元件，其中所述载体包含药学活性运载物或与所述运载物缔合。所述试剂盒可任选包含带有说明书的印刷品。术语“医用试剂盒”包括如上定义的任何药物组合物、医用装置、如上提到的治疗剂等。在进一步的具体实施方案中，所述医用试剂盒也可以是疫苗，诊断、预后或预测试剂盒，其包含用于进行疫苗接种、用于进行与Langerin有关的疾病例如本文定义的疾病的诊断、或关于这样的疾病的健康状况的预后或预测确定的合适成分。在进一步的实施方案中，医用试剂盒可包含包装中的任何医用装置。术语“医用装置”包括注射器、针头例如注射器的针头、疫苗枪、膏药、或吸入器，优选如上文定义的。本发明的介质或其组合物可以例如通过医用装置来施用。而且，所述介质或其组合物可以存储在所述医用装置中。术语“包装插页”或“带有说明书的印刷品”用于指惯常包含在治疗产品的商业包装中的说明书，所述说明书含有有关涉及使用这样的治疗产品的适应症、用途、剂量、用法、禁忌症和/或警告的信息。带有说明书的印刷品可以是医用试剂盒的一部分。
在又一方面，本发明涉及一种疫苗，其包含如上所定义的介质或如上所定义的组合物，其中所述载体包含接种物运载物、例如如上定义的接种物运载物或与所述接种物运载物缔合。
术语“疫苗”应被视为组合物，在优选的实施方案中，包括适用于对象的疫苗接种的如上定义的介质或组合物。上文已经在药物组合物的情形下描述了疫苗组合物。特别优选所述疫苗包含佐剂，特别是如上所述的免疫佐剂。疫苗可以例如包含治疗有效量的包含如上定义的运载物的介质。例如，在优选的实施方案中，所述疫苗可包含蛋白质和/或核酸作为免疫原性元件。
术语“疫苗接种”是指在对象中通过如上定义的癌症抗原引发对抗肿瘤的免疫应答、通过如上定义的细菌抗原引发对抗细菌感染的免疫应答、通过如上定义的病毒抗原引发对抗病毒感染的免疫应答、通过如上定义的寄生虫抗原引发对抗寄生虫感染的免疫应答，它包括向所述对象施用治疗有效量的包含如上定义的运载物的介质。优选地，本发明的介质的载体包含运载物，所述运载物是或包含如上定义的癌症抗原或表位、如上定义的细菌抗原或表位、如上定义的病毒抗原或表位、如上定义的寄生虫抗原或表位。还设想了用在如上定义的移植物抗宿主疾的情形下描述的实体进行疫苗接种。特别地，设想了将如本文定义的脂质体或纳米粒子载体用于疫苗接种目的。进一步优选的是，所述脂质体或纳米粒子载体包含如本文所述的肽或蛋白质抗原。所述肽或蛋白质抗原因此可包含在或封装在如本文所述的所述脂质体或纳米粒子载体中。所述载体的施用优选是如本文所述的皮内注射或如本文所述的经皮施用，优选通过微针贴剂施用。
在优选的实施方案中，所述疫苗可用于治疗或预防癌症、自身免疫性疾病、细菌感染、病毒感染、寄生虫感染或移植物抗宿主病。
所述免疫接种可以根据技术人员已知的任何方案或时间表进行，所述方案或时间表例如可从www.who.int/immunization/documents/en/(最后访问日期在2018年12月4日)或类似信息来源中获得。所述时间表可以例如包含若干剂疫苗组合物，所述疫苗组合物包含如上定义的介质或组合物。在本发明的一个实施方案中，将至少1剂所述疫苗组合物施用于对象。在另一个实施方案中，疫苗接种由1剂所述疫苗组合物组成。在另一个实施方案中，对象接受初始2剂疫苗接种，但没有接受所述疫苗组合物的进一步施用，或者在至少1个月或2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月或12个月或1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年等的预定时间段后接受进一步施用。施用若干剂、例如两剂或更多剂所述疫苗之间的间隔可在1周和约一年以上之间、或者在1个月和一年之间、或者在1个月至3个月之间进一步变化。
所述疫苗的施用可以根据任何合适的施用方案并以任何合适的途径进行，所述途径例如皮下、经皮、皮内、肌内、口服、通过角膜或鼻腔途径、静脉内、局部或通过毛囊等。特别优选使用经皮、皮内或皮下途径，例如作为皮内注射。如上所述，优选用针、微针、纳米贴剂、水凝胶贴剂、疫苗接种枪等进行应用。
类似地，在另一方面，本发明涉及在对象中诱导对抗癌症、细菌感染、病毒感染、寄生虫感染的免疫应答的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗有效量的如上定义的介质，其中所述载体包含如上定义的药学活性运载物或与所述运载物缔合，或如上定义的组合物，其中所述载体包含如上定义的药学活性运载物或与所述运载物缔合，如上定义的药物组合物，或如上定义的疫苗。所述方法主要包括以下步骤：向Langerin+细胞提供如本文提到的免疫活性化合物并从而导致所述Langerin+细胞参入所述化合物，对所述化合物进行加工并在所述细胞表面上展示它或它的一个或多个部分以诱导其它免疫细胞或免疫系统的反应，或以任何其他合适的方式通过Langerin+细胞引发免疫应答。在特别优选的实施方案中，该方法可包括如上文定义的疫苗接种步骤。特别是，可采用如所提到的疫苗接种方案和时间表。
术语“有效量”包括在所需剂量下和时间段内有效达到期望的结果的量。化合物的有效量可根据诸如对象的疾病状态、年龄和体重以及化合物在对象中引发期望的反应的能力等因素而变化。可以调节剂量方案以提供最佳治疗反应。有效量也是治疗有益效应超过所述抑制剂化合物的任何毒性或有害效应(例如副作用)的量。
术语“治疗有效量”是指所施用的化合物足以防止所治疗的状况或病症的一种或多种症状发展或在某种程度上减轻的量。
化合物的治疗有效量(即有效剂量)可鉴于患者的体重和技术人员已知的其他因素来确定。治疗有效量还可以按浓度定义，例如在pM或μM范围内。技术人员将领会，某些因素可能影响有效治疗对象所需的剂量，所述因素包括但不限于疾病或病症的严重程度、先前的治疗、对象的总体健康和/或年龄，以及存在的其他疾病。此外，用治疗有效量的化合物来治疗对象可包括单一治疗，或者优选地，可包括一系列治疗。在一个示例中，对象每天用化合物治疗一次或几次，为期约1周至50周之间，或任何其它合适的时间段。在另一个示例中，在慢性病情或疾患的情况下，可以每天治疗对象达两年或更长时间。还应领会，在特定治疗过程中可增加或减少用于治疗的化合物的有效剂量。
在又一个方面，本发明涉及一种治疗或预防癌症、自身免疫性疾病、细菌感染、病毒感染、寄生虫感染或移植物抗宿主病、局部或全身性炎症、或变态反应的方法，所述方法包括向对象施用治疗有效量的如上定义的介质，其中所述载体包含如上定义的药学活性运载物或与所述运载物缔合，或如上定义的组合物，其中所述载体包含如上定义的药学活性运载物或与所述运载物缔合，如上定义的药物组合物，或如上定义的疫苗。所述方法可以是如上文所述的任何合适的施用方案。在特别优选的实施方案中，用于所述方法的化合物是如上所述的药物组合物，或如上文所述的疫苗。在特别优选的实施方案中，所述治疗方法预期通过口服、角膜、鼻、静脉内、局部、皮下、表皮、皮内、经皮途径施用或疫苗接种或经毛囊施用。
所述介质、组合物、药物组合物或疫苗的施用可以与化疗剂联合，特别是如果抗癌治疗的话。合适的示例包括检查点抑制剂或CAR T细胞。化疗剂可优选是如上提到的任何细胞毒性物质。用化学治疗剂治疗优选以不同于目前描述的与DC的相互作用的另一种方式进行，即不通过Langerin+细胞。例如，化疗剂可以全身性方式或静脉内等施用。因此化疗剂可通过借化疗破坏癌细胞来支持对抗癌症的疫苗接种方法。例如，基于与化疗剂联合的方法可以基于全身性化疗，其能够调整残余肿瘤细胞的免疫表型，例如在已通过外科手术最佳减小肿瘤块后。另一种方法可通过上调肿瘤抗原本身或该抗原所结合的MHC I类分子的表达来增强肿瘤抗原呈递。此外，化疗可用于上调在肿瘤细胞表面表达的共刺激分子(例如B7-1)或下调在肿瘤细胞表面表达的共抑制分子(例如PD-L1/B7-H1或B7-H4)，从而增强效应T细胞活性的强度。在一个进一步的实施方案中，化疗可用于通过fas-、穿孔素-或粒酶B-依赖性机制使肿瘤细胞对T细胞介导的裂解更加敏感。
在另一方面，本发明涉及一种减敏的方法。因此，本发明设想给变应性患者提供抗原性变应原。该变应原可以有利地通过作为在如本文定义的合适载体中的运载物提供给Langerin+细胞。特别优选以多于一剂提供抗原性变应原。在治疗期间，可以增加剂数和/或变应原浓度。该提供步骤可重复一次或几次，之后通常继以抗原性变应原特异性调节T细胞的扩增和激活，这导致CTL的变应原特异性缺失，即在没有共刺激信号、例如没有佐剂共同递送情况下的变应原特异性耐受。在该治疗方案的情形下，在没有共同递送任何佐剂的情况下提供如上所述的变应原。还优选导致被技术人员已知的任何合适的手段抑制的Langerin+DC细胞的激活的任何共刺激信号。更多细节可从合适的文献来源例如Sela等人，2011，J.Exp.Med.，208，12，2489-2496中获得。
本发明在以下实施例中进一步描述，所述实施例无意于限制本发明的范围。
实施例
实施例1
Langerin-表达型Hek293细胞
将人胚胎肾细胞系Hek293维持在DMEM培养基中，所述培养基具有Glutamax并补充了10％FCS(Biochrom)和100U/ml青霉素-链霉素。将细胞培养至70％汇合，并每2-3天用胰蛋白酶传代培养。除非另有说明，所有培养基和补充物均购自Thermo Fisher Scientific。细胞在37℃和5％CO2的控制条件下生长。细胞用光学显微镜(IT40 5PH，VWR)监测并在陪替氏培养皿(Corning)中培养。用蛋白水解酶胰蛋白酶结合0.25％EDTA对细胞进行传代培养。在例行传代培养中，所有细胞均以500g离心3分钟(Heraeus Megafuge 8R，Thermo FisherScientific)。吸出上清液，将细胞重悬于新鲜的生长培养基中。作为质量控制，经常使用
Figure GDA0002759246180000981
支原体检测试剂盒(Lonza)对细胞进行无支原体污染测试。未检测到污染。用自动细胞计数器(Eve，Montreal Biotech)对细胞计数。为了冷冻保存细胞，将活细胞计数、离心、吸出并重悬于由90％生长培养基和10％DMSO组成的冻存培养基(细胞培养级，EuroClone)中。然后将冷冻小瓶转移到填充了异丙醇的冷冻小瓶容器(Mr.Frosty，Nalgene)中。将所述容器在-80℃下保存至少24小时，并将小瓶保存在液氮中以备长期保存。
人Langerin的cDNA ORF克隆购自sinobiological，根据制造商的说明，通过Gibson组装将该基因从pcDNA5/FRT/V5-His-TOPO TA载体(life technologies)克隆到RP172表达载体(K.J.Koymans等人，葡萄球菌超抗原样蛋白1和5(SSL1&amp；SSL5)通过MMP抑制作用限制嗜中性粒细胞趋化性和迁移(Staphylococcal Superantigen-Like Protein1and 5(SSL1&amp；SSL5)Limit Neutrophil Chemotaxis and Migration through MMP-Inhibition).International journal of molecular sciences17，2016)中。简而言之，使用Phusion高保真DNA聚合酶(NEB)通过PCR用目的载体(destination vector)的突出端扩增基因片段。对于所述PCR反应，制备由10μl Phusion HF缓冲液(NEB)、5μl的2mM dNTP(Carl Roth)、0.5μl Phusion聚合酶(NEB)和29μl H2O组成的主混合物(master mix)用于每次反应。每个反应添加0.5μl的50μM引物和2.5μl大约10ng/ml模板载体。通过PCR(Mastercycler nexus gradient，Eppendorf)将目的载体线性化。此时添加0.6μl DMSO(NEB)。通过琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行质量检查，并用nanodrop(ImplenNanophotometer)测量DNA浓度。
特别是，为了生成Langerin克隆、Langerin变体克隆和mLangerin克隆，以及为了生成DC-SIGN和mDectin克隆，使用以下引物序列和PCR条件：
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最后，通过Gibson组装来组装PCR产物。将等体积(2-10μl)的含有0.02–0.5pmol具有2-3个额外的插入片段的DNA片段的DNA和Gibson组装主混合物在50℃下温育20分钟。所述主混合物含有T5核酸外切酶、Phusion DNA聚合酶和Taq DNA连接酶，以产生单链DNA突出端、将核苷酸参入DNA缺口以及将互补DNA片段退火。Gibson组装后，添加1μl DpnI(NEB)以消化给定的克隆载体。然后将消化的PCR反应(1μl)通过在42℃下热冲击转化30秒，转化为10μl 5-α感受态大肠杆菌(NEB)。在冰上2-3分钟后，将200μl SOC培养基(含有20mM葡萄糖的SOB培养基，Carl Roth)添加到反应小瓶中，并在37℃下温育1小时。将大肠杆菌细胞平板接种在含有100μg/ml氨苄青霉素(Panreac AppliChem)的LB琼脂平板(Luria/Miller，CarlRoth)上，并于37℃温育过夜。为了分离DNA，按照制造商的说明使用MiniPrep试剂盒(GeneJET Plasmid Miniprep Kit，Thermo Fisher Scientific)。用nanodrop测量DNA浓度，并对质粒DNA进行测序。
使用脂质体多聚复合物转染(lipopolyplex transfection，LT)试剂Mirus LT1(Sopachem)在293T细胞中产生用于转导细胞系的慢病毒。使用该系统，将含有Langerin序列的RP172载体(BIC-PGK-Zeo-T2a-mAmetrine；EF1A)和含有所有三种必需质粒(pVSV-G、pMDL和pRSV)的包装混合物(packaging mix)引入293T细胞。用所述LT系统转染后，293T细胞产生3-4天的病毒，收获病毒并在-80℃下冷冻以杀死剩余的293T细胞。该上清液然后用于将Langerin/RP172转导到不同的细胞系中。
将含有慢病毒的上清液在33℃下与Raji细胞混合并在含有聚凝胺的完全培养基(Santa Cruz Biotechnology)中温和旋转离心。RP172载体(BIC-PGK-Zeo-T2a-mAmetrine；EF1A)包括博莱霉素抗性盒和荧光GFP衍生蛋白mAmetrine。在33℃下通过以1000*g旋转感染约90分钟来促进50000个Raji细胞的转导。2-3天后，将(部分)感染的细胞暴露于博莱霉素(Life technologies)压力下，以选择含有RP172的细胞。用含有300μg/ml博莱霉素的选择培养基(life technologies)进行为期两周的转导细胞选择。RP172的存在通过FACS(BDFACS canto II)测量的mAmetrine表达来评估。初始mAmetrine检查(在选择之前进行)至关重要，因为感染细胞的百分比估量慢病毒滴度。在所有的转导中，我们的目标是初始mAmetrin百分比为5-10％。
重组表达的受体用CLR特异性抗体检测。为了进行抗体染色，将50000个细胞用25μl含有1:100稀释的PE抗小鼠/人CD207(4C7，Biolegend)的培养基温育以对鼠Langerin染色、PE抗人CD209(9E9A8，Biolegend)对DC-SIGN染色、PE抗小鼠Dectin-1(bg1fpj，eBioscience)对mDectin-1细胞染色、或PE抗小鼠/IgG2a(RMG2a-62，Biolegend)或PE抗正常小鼠/IgG1(sc-2866，Santa CruzBiotechnology)用于同种型染色。为了染色人Langerin表达细胞的细胞表面表达，将50000个细胞与1:5稀释的CD207-PE缀合抗体(DCGM4，BeckmanCoulter)一起温育。在4℃下温育30分钟后，洗涤细胞，并用带有574/26滤光片的488激光器(Attune Nxt，life technologies)通过流式细胞术分析PE染色。图1显示了结果。
实施例2
CLR-表达型Raji细胞
来自造血来源的人Raji细胞系在含有10％FCS、100U/ml青霉素-链霉素和GlutaMax的RPMI基础培养基中生长。通过添加或替换完全生长培养基，将细胞维持在0.5-3Mio细胞/ml之间，并在与对Hek293提到的相同的条件下(见上文)生长、维持、监测和储存。DC-SIGN和小鼠Dectin-1的cDNA ORF克隆也从pcDNA5/FRT/V5-His-TOPO TA载体(lifetechnologies)转移到RP172载体(Koymans等人，2016，Int.J.Mol.Sci.，17，7，1072)中，以通过转导在Raji细胞中稳定表达。使用Gibson组装根据制造商的说明进行克隆化(参见上文)。用nanodrop测定DNA浓度，并对质粒DNA进行测序。同针对Hek293细胞所描述的，将人Langerin、DC-SIGN和小鼠Dectin-1转导到Raji细胞系中(参见实施例1)。用CLR特异性抗体检测重组表达受体，并使用流式细胞术测量(参见实施例1和图2)。综上所述，这些实验结果描述了在此使用的重组细胞系。
实施例3
靶向配体的合成
Figure GDA0002759246180001061
在0℃下将氨基葡萄糖盐酸盐(46.4mmol，10g)溶解在NaOH水溶液(1M，47mL)中。用5分钟滴加对茴香醛(47mmol，5.7mL)，并将反应在0℃下搅拌2小时，在此期间溶液固化。将结晶浆液抽滤，用H2O和少量Et2O洗涤，并在高真空下于45℃干燥，以97％产率获得1，为无色固体(45.34mmol，13.48g)。
Figure GDA0002759246180001062
将1(40.3mmol，11.98g)在氩气下溶解于吡啶(71mL)中并冷却至0℃。在搅拌下添加乙酸酐(36mL)，除去冷却浴，并让所述混合物在搅拌下回温至室温过夜。将所述混合物倒入冰水(240mL)中。抽滤所生成的沉淀物，用水(350mL)洗涤并在高真空下干燥，以87％产率获得2，为无色固体(35.15mmol，16.36g)。
Figure GDA0002759246180001071
将2(35.15mmol，16.36g)在烧杯中在沸腾的丙酮中(沸腾70mL)剧烈搅拌。迅速添加7.03mL(35mmol)的HCl水溶液(5M)。将立即固化的物块冷却至室温，随后抽滤，用冷Et2O洗涤并真空干燥。将所生成的固体(35.15mmol，11.67g)悬浮在180mL吡啶中，并在剧烈搅拌下冷却至0℃。立即向所述混合物添加2,2,2-三氯乙基氯甲酸酯(76mmol，10.4mL)，并搅拌3小时。添加30mL甲醇以淬灭过量的Troc-Cl，随后将混合物真空浓缩。添加250mL DCM，过滤出所生成的沉淀物，并将滤液真空浓缩。将残余物重新溶解在少量DCM中，并使用液相色谱纯化，以87％产率得到3，为无色固体(30.61mmol，16g)。
Figure GDA0002759246180001072
将3(13.32mmol，6.96g)和乙硫醇(18.64mmol，1.38mL)在氩气氛下溶解于35mL无水DCM中并冷却至0℃。用5分钟添加BF3·Et2O(18.64mmol，2.36mL)并将反应在0℃下搅拌40分钟，然后在室温下搅拌4小时。通过加入1.1mL NEt3淬灭反应，并将所述混合物真空浓缩。使用液相色谱法纯化，以83％产率得到4，为白色固体(11.05mmol，5.8g)。
Figure GDA0002759246180001073
将4(2.48mmol，1.30g)和2-羟乙基氨基甲酸苄酯(3.96mmol，790mg)在60mL无水DCM中的悬液在氩气氛下搅拌45分钟。添加二甲基(甲硫基)四氟硼酸锍(4.95mmol，1g)，并将所述反应留在室温下搅拌过夜。真空除去溶剂，并将残余物通过液相色谱纯化，以68％产率得到5，为白色固体(1.67mmol，1.1g)。
Figure GDA0002759246180001081
将5(0.76mmol，500mg)和新鲜活化的锌(6.46g，99mmol)在27mL乙酸中的悬液搅拌4小时。所述反应混合物经过硅藻土过滤，并在高真空下干燥过夜。然后将所生成的固体溶解于吡啶(12mL)中，并滴加对甲苯磺酰氯(1.52mmol，290mg；溶解于12mL吡啶中)。将反应混合物搅拌过夜。然后真空除去溶剂，并将残余物通过液相色谱纯化，以43％产率得到6，为白色粉末(209mg，0.33mmol)。
Figure GDA0002759246180001082
在氩气氛下向6(0.30mmol，190mg)在无水甲醇(8mL)中的溶液添加甲醇钠溶液(c＝0.5mM.149mmol 2.98mL)并搅拌2小时。真空除去溶剂。将所生成的白色粉末重新溶解于无水甲醇(30mL)中，添加30mg钯炭(10％)，并将所述反应混合物在氢气氛下搅拌过夜。通过硅藻土过滤出催化剂，并用甲醇洗涤。除去溶剂，残余物通过反相高效液相色谱纯化，以71％产率得到7，为白色固体(0.21mmol，80mg)。
实施例4
脂质缀合
通过NHS缀合将配体和染料与PEG-DSPE偶联。通过酰胺偶联将Alexa Fluor647NHS酯(A647，life technologies)与NH2-PEG-DSPE(PEG MW 2000，Sunbright)的伯胺缀合。将溶解在500μl DMSO中的脂质(1.024mg)在梨形烧瓶中搅拌，然后将溶解于500μl DMSO中的1mg染料(1.5当量)滴加到所述脂质中。将反应于室温下在黑暗中搅拌过夜。将DMSO冷冻干燥(Alpha 2-4LDplus，CHRIST)并将反应产物溶解于2-3ml pH为8.4的含0.1M碳酸氢钠(Sigma-Aldrich)的缓冲液中。通过用Slide-A-Lyzer盒(7MWCO，0.5-3ml，Thermo FisherScientific)首先针对500ml缓冲液透析数小时并伴两次缓冲液更换，以及过夜温育，然后在持久搅拌下再针对水进行三次至少1小时的透析，来去除未缀合的染料。通过冷冻干燥除去水，并将最终产物以8mg/ml的浓度溶解在DMSO中。拟糖Langerin配体、甘露糖以及甘露糖聚合物均含有末端伯胺，并按照对A647偶联所述通过酰胺偶联均等地与NHS-PEG-DSPE(PEGMW 2000，NOF Europe)偶联，不同之处在于将2mg配体溶解于900μl缓冲液并将0.125当量的脂质溶解于100μl DMF中。将脂质滴加到梨形烧瓶中，并真空除去DMF(Heidolph)。将最终产物溶解在DMSO-d6(Euriso-Top)中，并通过具有265次扫描的1H-质子NMR光谱(400MHz，Variant)来确定缀合效率。
实施例5
配制脂质体
通过水合膜挤出法(Chen等人，2010，Blood，115，23，4778-4786)制备靶向的裸PEG化脂质体。除非另有说明，脂质体以57:38:4.75:0.25的摩尔比含有DSPE:胆固醇:配体-PEG-DSPE/PEG-DSPE:染料-PEG-DSPE。如果脂质体包含少于4.75mol％的配体-缀合脂质，则用PEG-DSPE填充脂质体，以始终获得5％PEG化脂质的总摩尔比。将PEG化脂质以8mg/ml的浓度溶解于DMSO中，并保存在-20℃下供长期保存。DSPE(NOF Europe)和胆固醇(Sigma-Aldrich)始终是新鲜制备的，并分别以20mg/ml和10mg/ml的浓度溶解于氯仿中。将PEG化脂质添加至玻璃管中，并将DMSO冷冻干燥。接下来，添加DSPE和胆固醇，并真空去除氯仿过夜。如果没有另外说明，将干燥的脂质膜用1.6mM浓度的DPBS(不含钙和镁；lifetechnologies)水合。首先将含脂质的溶液涡旋，然后超声处理(Ultrabath1510，Branson)3秒钟，重复3次，并在之间存在短的时滞。重复该步骤，直到获得均匀的悬液。通过孔隙挤出(挤出机，Avanti Polar Lipids)以先用200nm的聚碳酸酯膜、再用100nm的聚碳酸酯膜(Avanti Polar Lipids)的30程来产生大的单层脂质体。脂质体浓度是指总脂质浓度。
实施例6
脂质体的表征
为了表征按照实施例4中所述程序制备的脂质体的粒度和稳定性，对稀脂质体溶液(在纯水中32μM)进行了动态光散射测量(Malvern Instruments Zetasizer)。表现出ζ电位在-35mV和-15mV之间以及平均粒度在100nm和200nm之间(强度％图)和多分散指数最高为0.3的脂质体被认为可以进一步使用。
实施例7
脂质体负载和纯化
设计了若干种蛋白质作为脂质体负载的运载物。在下文中，呈现了这些蛋白质的重组表达，并描述了其在脂质体中的负载。
将2mg牛血清白蛋白(BSA)(PAA)溶解在1ml HBSS缓冲液(life technologies)中，并转移到带有隔膜和搅拌棒的5ml梨形烧瓶中。将异硫氰酸荧光素(Thermo FisherScientific)溶解于DMSO(1mg/ml)，并以5μl一步步将200μl缓慢添加到BSA中。将烧瓶以铝箔覆盖，并在室温下搅拌过夜。通过添加终浓度50mM乙醇胺(Sigma-Aldrich)将反应淬灭，并在室温下搅拌1小时。通过用Slide-A-Lyzer盒(7MWCO，0.5-3ml，Thermo FisherScientific)针对HBS缓冲液(25mM HEPES，Carl Roth；150mM NaCl，Panreac AppliChem；pH7.5)进行透析来去除未缀合的荧光素。在搅拌1小时后和再次温育过夜后，两次更换缓冲液。FITC缀合蛋白质的蛋白质浓度用280nm处的吸光度进行测量，缀合效率用nanodrop(Implen Nanophotometer)在495nm处确定。蛋白质样品储存在4℃。
通过用含有FITC-BSA的DPBS将薄膜脂质水合，使脂质体负载FITC-BSA。FITC-BSA的浓度范围为1mg/ml至20mg/ml。超声处理和孔隙挤出后，通过超速离心或体积排阻纯化脂质体。为了通过超速离心去除游离蛋白质，将脂质体悬液转移到超速离心管(Thinwall，Ultra-ClearTM，4mL，Beckman coulter)中。将所述管填充DPBS以防止内爆。在超速离心机(Optima L-80 XP Ultracentrifuge，Beckman Coulter)中用SW 60 Ti转子(Beckmancoulter)在4℃下将脂质体以55000rpm超速离心1小时。除去上清液，并将沉淀团重悬于DPBS中。超速离心重复两次。用填充到色谱柱(Ecoo柱，1.5x30cm，BioRad)中的20ml琼脂糖CL凝胶过滤介质(CL-4B，交联，Sigma-Aldrich)进行通过尺寸排阻的纯化。在脂质体溶液加载到柱子上之前，用DPBS平衡柱子。收集1.5ml的级分直至脂质体和游离的FITC-BSA洗脱(10-15个级分)。分级后，用在0.1M NaOH中含0.5M NaCl的再生缓冲液对柱子进行再生，并用DPBS平衡直至pH呈中性，通过尺寸排阻分离接下来的脂质体溶液。用酶标仪(SpectraMaxM5，Molecular Devices)分析包封率，并基于标准曲线进行计算。脂质体浓度通过Alexa647装饰的脂质体(激发640，发射670)测量，FITC-BSA浓度通过(激发485，发射525)测量。计算每1mM总脂质浓度的包封率。
实施例8
脂质体表征
如前所述确定脂质体的分散性和稳定性(参见实施例4至实施例6)。
利用FITC-BSA显示蛋白质的包封和纯化方法。超速离心法后测量FITC-BSA总蛋白浓度。接下来，纯化的脂质体然后在基于细胞的测定中进行测试。将FITC-BSA包封脂质体与Langerin+Raji细胞在37℃温育2小时以诱导内化。通过流式细胞术同时测量单个细胞的A647和FITC荧光(参见图3)。如先前对于有或没有包封的FITC-BSA的靶向脂质体所示，检测Alexa647的荧光信号，但更重要的是，仅对FITC-BSA包封脂质体检测到FITC信号。FITC-BSA在包封脂质体靶向的细胞中显著增加，而裸FITC-BSA包封脂质体则未显示FITC信号。通过DLS分析超速离心过的脂质体的脂质体完整性(参见图3(C))。尺寸和ζ电位与未经处理的脂质体(参见实施例6和图5(C))或通过尺寸排阻纯化的脂质体相似，表明维持了结构完整性。接下来，将FITC-BSA包封脂质体与Langerin+Hek293细胞一起在37℃下温育6小时，随后在细胞核染色后通过显微术分析细胞(参见图3(D))。FITC-BSA与共配制的脂质体染料A647高度共定位，表明6小时后相似的内体区室。
为了排除在超速离心期间的高向心力使脂质体将其运载物释放到上清液中，导致包封率降低，在基于细胞的测定中比较了通过尺寸排阻和超速离心进行纯化的脂质体(参见图4)。与通过尺寸排阻纯化的脂质体相比，后者的FITC-BSA信号甚至更高，推断向心力对脂质体的完整性没有影响，并且它类似于最有效的纯化方法。因此，如果未另有说明，所有其它脂质体均通过超速离心进行纯化。
为了分析FITC-BSA的初始浓度对包封率的影响，将蛋白质浓度从20mg/ml到1mg/ml变化，并在基于细胞的测定中测试了包封脂质体(参见图5(A))。将荧光信号针对共配制的染料A647归一化。在20mg/ml FITC-BSA配制的脂质体下检测到最高的荧光信号。然而，荧光信号与用于配制脂质体的初始蛋白质浓度不相关。该结果表明，在1mg/ml和20mg/ml之间，包封率在相似的范围内并与初始蛋白质浓度无关。
此外，初始脂质体浓度不同。在基于细胞的测定中将10mM与1mM再水合脂质体进行了比较(参见图5)。脂质体用20mg/ml FITC-BSA再水合。与FITC-BSA包封脂质体一起温育的细胞的FITC荧光与10mM和1mM配制的脂质体非常相似，表明不同的脂质体浓度对包封率没有影响。通过DLS分析所有脂质体的大小和ζ电位(参见图5(C))。另外，FITC-BSA的包封率在超速离心后用酶标仪分析并针对1mM脂质体进行计算(图5(B))。还是，所有配制的脂质体的包封率在17μg至95μg/1mM脂质体的相似范围内，并且没有显示出包封率改善的趋势。
接下来，对包封脂质体进行剂量依赖性温育，并进行动力学研究以检测包封的FITC-BSA运载物和A647标记的递送介质之间的差异(参见图6)。用488nm激光器和574/26nm滤光片(Attune Nxt，life technologies)测量包封的FITC标记蛋白。这些研究证实了图14(B)和图14(C)的结果，再次显示用16μM脂质体在24小时后的内化不饱和，而更高浓度的脂质体内化在高于250μM脂质体时饱和。然而，更重要的是，FITC-BSA包封运载物和A647标记的脂质体显示出几乎相同的剂量依赖性内化速率和高度相关的内化动力学，表明该运载物和递送介质进入了相似的加工路径，如已在图3(D)中通过显微术所见的。
然后利用这些优化的包封方法配制含有免疫活性EBNA1蛋白的脂质体。选择EBNA(Epstein–Barr核抗原)作为模型肽。它是Epstein Barr病毒(EBV)的一种短免疫活性肽，EBV在成年人群中的流行率超过90％(参见Cohen，2000，N Engl J Med，343，7，481-492)。另外，管家肽PCNA(增殖细胞核抗原)与癌症进展有关，被认为促进免疫逃逸(Rosental等人，2011，J Immunol，187，11，5693-5702)。另外，管家肽PCNA(增殖细胞核抗原)与癌症进展有关，被认为促进免疫逃逸。因此，该肽被用作阴性对照。
实施例9
EBNA1和PNCA的细菌蛋白表达和纯化
EBNA1 BL21和PCNA BL21大肠杆菌细胞是使用的LC(参见Barwell等人，1995，JBiol Chem，270，35，20556-20559)。蛋白质与His标签和凝血酶识别位点融合。为了表达蛋白质，将细胞在250ml锥形瓶中的50ml具有200μg/ml氨苄青霉素的LB培养基(Luria/Miller，Carl Roth)中于37℃和300rpm(MaxQ 4000，Thermo Fisher Scientific)下培养过夜。第二天，将预培养物以3000g离心12分钟(Multifuge X3R Heraus，Thermo ScientificFisher)。将沉淀团重悬在新鲜的LB培养基中。为了接种500ml补充有200μg/ml氨苄青霉素的培养基，将20ml预培养物添加到2000ml锥形瓶中，并在37℃以300rpm的速率振荡。将所述培养物温育直至达到约0.8的光密度(600nm处的OD)值，用1mM IPTG诱导蛋白质表达，在30℃下表达过夜。第二天，将500ml细菌细胞悬液以4000g离心15分钟。弃去上清液，将沉淀团重悬于PBS中，转移至50ml试管中，再次离心，将最终的大肠杆菌沉淀团在-80℃冷冻或直接用于通过用His标签柱的亲和色谱进行蛋白质纯化(HisTrap HP，1 x 1ml；GEHealthcare)。
为了纯化重组表达的蛋白，每1g大肠杆菌沉淀团用5ml裂解缓冲液(50mM Na2PO4，Carl Roth；300mM NaCl，Panreac AppliChem；10mM咪唑，Carl Roth；pH 8)裂解大肠杆菌细胞。每1ml裂解物添加1mg溶菌酶(Fluka)，并将细胞在4℃温育30分钟。之后，将细胞以30％的振幅超声处理20秒3次，并在之间关闭10秒(Bransen，Digital Sonifier)。将裂解物以10000g离心15分钟，并用0.45μm膜滤器(Corning)过滤含有过表达蛋白的上清液，以除去细胞碎片。
重组表达的蛋白使用快速蛋白液相色谱(FPLC，MWD2.1L Azura，Knauer)通过his标签亲和色谱纯化。FPLC用结合缓冲液(A行：50mM Na2PO4，300mM NaCl，10mM咪唑，pH 8)、洗涤缓冲液(B行：50mM Na2PO4，300mM NaCl，20mM咪唑，pH 8)、蒸馏水(C行)和洗脱缓冲液(D行：50mM Na2PO4，300mM NaCl，250mM咪唑，pH 8)平衡。将过滤的含有过表达蛋白的上清液注入FPLC。将上清液用结合缓冲液以1ml/min的流速和1巴的最大压力加载到His-trap柱上20分钟。用UV检测器在280nm处测量蛋白质浓度。加载的柱子用洗涤缓冲液洗涤20分钟，然后通过施加从洗涤缓冲液到洗脱缓冲液的梯度来洗脱蛋白质10分钟。在小反应管中收集1ml的级分。再过5分钟，施加100％洗脱液以洗脱所有his捕获的蛋白质。在开始下一次运行之前，用结合缓冲液平衡柱子。收集带有his标签蛋白的级分并合并，以针对含有2mM CaCl2的HBS缓冲液(25mM HEPES，150mM NaCl，pH 7.5)来透析蛋白质(CelluTrans透析，CralRoth)。通过SDS-PAGE凝胶检查蛋白质质量，并通过nanodrop(Implen Nanophotometer)测量蛋白质浓度。
所述肽在大肠杆菌中过表达，结果示于图7。细胞裂解后，通过His标签亲和柱纯化His融合肽(参见图7(A))。然后应用SDS-PAGE确定肽的质量(参见图7(B))。使用加载、流通和洗涤级分来追踪肽的纯化。然后，将PCNA和EBNA肽进行FITC标记并包封在脂质体中。
如“脂质体负载和纯化”部分中所述来加载蛋白质，不同的是，将FITC缀合的EBNA蛋白用十倍体积的胰蛋白酶消化，通过尺寸排阻法纯化，并用超速离心进行浓缩。所有其它步骤按照方案。
通过DLS分析脂质体，并通过荧光酶标仪检测包封率(参见图7(C))。尺寸、ζ电位和包封率通常在以前的脂质体制剂的范围内(参见图5(C))。
接下来，将FITC-PCNA和FITC-EBNA抗原递送至LC。靶向LC的抗原包封脂质体分别用FITC-PCNA和FITC-EBNA染色56.9％和84.1％的LC，而裸脂质体未显示FITC荧光增加。这证明了通过包封脂质体的特异性抗原递送。
综上所述，包封在脂质体中的蛋白质可被特异性递送到Langerin阳性细胞。
实施例10
细胞脂质体结合和内化测定
通过在模型细胞系中表达几种具有重叠结合模式的CLR并分析脂质体结合来研究脂质体特异性。将50000个Raji细胞平板接种在100μl含有16μM脂质体的完全生长培养基中。为了测量脂质体结合，将所述板在4°下温育，而用37℃下温育来诱导诱导受体内化。孵育后，将细胞以500g离心3分钟，弃去上清液。将细胞重悬于100μl冰冷的培养基中，并通过流式细胞术用633nm激光器和570/20nm滤光片(BD FACSCanto II，BD Biosciences)或有670/14nm滤光片的654nm激光器(Attune Nxt，life technologies)检测共配制的Alexa647染料来进行分析。
如图9所呈现的，测试裸脂质体、GlcNTosyl脂质体和甘露糖缀合的脂质体对wt、Langerin+、小鼠Langerin+(mLangerin+)、DC-SIGN+和Dectin-1+(mDectin-1+)细胞的脂质体结合。在4℃与CLR表达细胞一起温育后，检测脂质体结合。共配制的A647脂质的荧光信号显示GlcNTosyl官能化脂质体与Langerin+Raji细胞显著结合。荧光信号增加了46倍，并对Langerin+细胞具有特异性。甘露糖官能化脂质体不能结合Langerin+细胞，但显著结合DC-SIGN+细胞，有12倍的荧光强度增加。各种具有官能化GlcNTosyl的脂质体制剂的脂质体结合一致地显示出与Langerin+细胞结合。使用昆布多糖、甘露聚糖和EDTA作为竞争剂进一步表征脂质体结合。与Langerin和DC-SIGN的主要结合位点结合的天然配体甘露聚糖完全消除了脂质体与这两种CLR的结合。EDTA部分抑制GlcNTosyl官能化脂质体的结合，并完全阻止甘露糖缀合的脂质体的脂质体结合(参见图9(B))。因此，肝素启发的基于拟糖的脂质体显示出以钙依赖的方式特异性结合人Langerin的主要结合位点。
实施例11
肝素启发的Langerin配体官能化脂质体的脂质体内化
到目前为止，已检测到了Langerin靶向脂质体与Langerin表达细胞的特异性结合。然而，为了递送免疫调节剂，脂质体需要被内化到细胞中；因此，对非官能化和官能化的脂质体进行了显微镜研究。激光扫描显微术(LSM)与荧光蛋白或合成荧光团相结合，能够检测粒子和细胞器的共定位。在24个培养孔板(Corning)中的盖玻片(Carl Roth)上培养细胞。在细胞接种之前，通过过夜温育使盖玻片包被聚-L-赖氨酸(Sigma Aldrich)。用DPBS洗涤盖玻片后，将200000wt或Langerin+Hek293细胞接种在500μl培养基中。将该24孔板在37℃和5％CO2下温育过夜。第二天，除非另有说明，在37℃下添加16μM脂质体1小时。脂质体温育后，将细胞用4％多聚甲醛(Roti-Histofix，Carl Roth)固定10分钟，并用10μM DiO(Thermo Fisher Scientific)染色细胞膜15分钟。为了染色细胞核，首先将细胞用0.1％皂苷(Sigma Aldrich)透化10分钟，然后用1μg/ml DAPI(Sigma Aldrich)染色5min。为了长期保存，使用封固溶液(Carl Roth)将盖玻片固定在显微镜载玻片(Carl Roth)上。通过显微术(共聚焦光片层显微镜DLS-DMi8，Leica)分析载玻片。通过扫描不同的细胞聚焦层来检测Langerin靶向脂质体的内化(参见图10)。尽管脂质体主要位于顶部区域，但中央和下部的细胞层也显示出A647荧光信号，确认了脂质体的内化。
接下来，用Langerin官能化脂质体的结合和内化动力学更详细地研究受体-配体相互作用。结合动力学揭示，脂质体对Langerin+细胞的粘附在4小时后饱和(参见图11(A))。相形之下，内在化动力学是在37℃下进行长达24小时(参见图11(B))。甚至在温育24小时后，A647荧光信号仍未饱和，这意味着对Langerin靶向脂质体的摄取高。然而，脂质体内化受到应用更高浓度的限制(参见图11(C))。
在图11(C)中先前研究中应用的浓度(16μM)用黑色箭头指示。浓度超过250μM时达到饱和。结合、摄取和浓度研究不是直接可比的，因为激光功率针对每种测量进行了调适。在所有实验中，均未观察到与Raji wt细胞的结合(黑色实线)。
为了可视化和验证高脂质体摄取率，进行了显微研究。将靶向脂质体与Langerin+Hek293细胞一起温育至多48小时的不同时间点(参见图12)。30分钟后，已经观察到脂质体内化。
24小时后，脂质体积聚得如此强烈，以致A647信号完全过饱和。因此，在右图中可以看到降低了PMT电压。Wt Hek293细胞显示，在48小时后即使在高PMT下也未检测到A647脂质的荧光信号。
综上所述，靶向脂质体与Langerin表达细胞系的特异性结合和摄取显示出剂量依赖性和时间依赖性。
实施例12
对模型细胞系的靶向递送：摩尔％配体密度
检测到荧光信号对配体摩尔比的依赖性，证明了靶向配体的浓度和对Langerin+细胞的结合效率之间的关系(参见图13)。
还以剂量依赖性和时间依赖性方式温育了具有不同摩尔比的脂质体制剂(参见图14)。
实施例13
通过Langerin靶向脂质体的脂质体路径和抗原递送
在MHCI或MHCII上抗原呈递的命运高度依赖于细胞内加工途径。因此，用内体标志物来分析脂质体的路径。用针对Rab5、Rab7、Rab11、EEA1和Lamp-1的免疫染色进行2小时脂质体温育后，通过显微术研究脂质体定位(参见图15)。在图15(A)中，通过将两个具有中等灰度强度的通道合并为一个明亮的灰度色调，可以看到共定位。由极为贴近或完全贴近的脂质体产生的大部分重叠荧光信号用次级内体/溶酶体标志物Lamp-1检测。
对于用初级内体标志物EEA1和Rab5以及用再循环标志物Rab11，与Lamp-1相比，检测到的共定位较少。总之，脂质体温育2小时后，大多数Langerin靶向介质位于次级内体和溶酶体中。然而，脂质体在2分钟和20分钟的较早时间点与初级内体标志物EEA1和Rab5共定位(参见图16)。
综上所述，这些数据表明靶向脂质体被摄取到Langerin阳性细胞系中，并沿着在初级内体中开始的内体区室中的细胞内路径(2-20分钟)，然后进入次级内体和溶酶体区室(60-120分钟)。
实施例14
肝素启发的Langerin靶向脂质体的体外细胞毒性
脂质体主要由磷脂和胆固醇组成。这些天然存在且生物相容的化合物揭示了脂质体在临床试验中非常安全(Immordino等人，2006，Int J Nanomedicine 1，3，297-315)。然而，较长的温育期和高浓度的官能化脂质体可能导致细胞毒性效应。为了排除由荧光染料和拟糖Langerin配体诱导的毒性，进行了毒性测定。为了分析脂质体诱导的细胞毒性效应，将细胞用膜联蛋白-V和7-AAD染色。为了分析早期和晚期凋亡，将10000个细胞在50μl中与各种浓度的脂质体温育24小时，或将16μM脂质体在37℃和5％CO2下温育各个时间点。作为阳性对照，将细胞用50％DMSO处理3分钟。未处理的细胞用作阴性对照。洗涤细胞，并将其重悬于25μl含有1:100稀释的膜联蛋白-V-FITC(Adipogen)的缓冲液(10mM HEPES，140mMNaCl，和2.5mM CaCl2，pH7.4)中。将细胞在室温下在黑暗中温育10分钟。洗涤后，将细胞重悬于100μl含有1μl 7-AAD溶液(Biolegend)的缓冲液中，并在室温下在黑暗中温育5-10分钟。通过流式细胞术直接测量细胞，无需任何进一步的洗涤步骤。膜联蛋白-V和7-AAD用488激光器激发，Alexa 647用654激光器激发。膜联蛋白-V用530/30滤光器检测，7-AAD用695/40滤光器检测，Alexa647用670/14滤光器(Attune Nxt，life technologies)检测。补偿光谱重叠。将Langerin靶向脂质体与细胞一起温育至多72小时的延长的时间段，随后分析细胞毒性(参见图17)。
早期凋亡效应用结合易位的磷脂酰丝氨酸的膜联蛋白-V染色来检测，而晚期凋亡细胞则用7-AAD染色，7-AAD是一种细胞不透性荧光嵌入剂，其与DNA缔合并发生光谱移动。然而7-AAD在死细胞中是可透过膜的。当在FSC-A/SSC-A图中对活细胞和死细胞进行门控时，省略了细胞碎片。双粘体辨别(doublet discrimination)后，通过将该图分成四个象限，在双变量直方图中分析单个细胞的膜联蛋白-V-FITC和7-AAD染色。未处理的、DMSO处理的和脂质体处理的细胞在图17(A)中示例性呈现。遵循相同的门控策略，从以不同时间段温育的样品中分析所有四个象限的亲本频率(FoP)。分组柱状图显示了双阴性细胞(活细胞)、膜联蛋白-V+细胞(早期凋亡细胞)和7-AAD以及双阳性细胞(晚期凋亡细胞)的FoP(参见图17(B))。未经处理的细胞代表阴性对照，显示超过90％的活细胞。另一方面，DMSO处理的细胞(50％DMSO处理3分钟)用作阳性对照，揭示了98％的死细胞。因此，对照样品代表功能测定。即使延长时间段，至多72小时，也没有显示出脂质体会诱导任何细胞毒性效应的指征。另外，通过分析共配制的A647脂质的荧光来跟踪脂质体内化(参见图17(C))。与之前的结果相似，晚于24小时未检测到脂质体内化的饱和(与图14比较)。然而，脂质体内化在48小时至72小时后饱和。值得注意的是，10000个细胞仅在50μl生长培养基中平板接种。
类似于动力学研究，进行了剂量依赖性毒性研究(参见图18)。门控策略和对照样品与之前的毒性研究相同(参见图17)。在此，将浓度在1μM至1mM之间的脂质体温育24小时。温育后，如前所述通过膜联蛋白-V和7-AAD染色分析毒性。即使在1mM的最高浓度下，脂质体中也没有显示出对Langerin+细胞的毒性效应(参见图18(B))。如前所述，对共配制的A647脂质检测到脂质体内化。如前所示，在浓度超过250μM时摄取饱和(参见图18(C)和图14(C))。
综上所述，靶向脂质体当以非常高的浓度使用24小时时，在较长时间段内没有显示任何毒性以及没有诱导细胞死亡。
实施例15
靶向递送到模型细胞系：SNP
诱变
通过体外定点诱变将N288D和K313I突变引入人Langerin的野生型(wt)DNA中。对于定点诱变，使用可商购的诱变试剂盒(QuikChange II XL Site-Directed MutagenesisKit，Agilent)。所有步骤均遵循制造商。简而言之，使用在线工具QuickChange PrimerDesign(Agilent)设计了定点突变PCR的引物。制备主混合物，每次突变反应转移48μl到PCR反应管中。每个突变反应添加1μl 10μM正向引物和1μl 10μM反向引物(也参见实施例1)。将反应混合物转移到热循环仪，并应用根据制造商的指导原则的PCR程序。PCR反应后，在37℃下添加1μl Dpn I 1小时，以消化亲本甲基化和半甲基化的DNA链。然后将消化的PCR反应物在5-α感受态大肠杆菌细胞(NEB)中转化、培养和收获。将细胞置于含有L-氨苄青霉素的琼脂板上，第二天每个克隆挑出2个至3个细菌菌落并进行培养以分离质粒(GeneJET PlasmidMiniprep Kit，Thermo Fisher Scientific)。用nanodrop(Implen Nanophotometer)测量DNA浓度，并对质粒DNA进行测序。为了引入第二个突变，用突变的质粒重复诱变。
评估与人Langerin的相关核苷酸多态性的脂质体结合
确定多态性残基对脂质体结合活性和内化到人Langerin表达细胞中的效应。将相关的单核苷酸多态性(SNP)引入Langerin的wt cDNA中。本文中提到的Wt Langerin含有V278A多态性并且在人类群体中的存在为49.9％(rs741326，国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)SNP数据库)。由于Langerin具有若干SNP变异，因此本研究的焦点放在了最重要的多态性上，即双重多态性N288D/K313I，它显示了对具有末端GlcNAc残基的聚糖的结合亲和力增强，而对先前研究中提出的6SO4-Gal聚糖的亲和力降低(J Biol Chem，288，52，36762-36771)。N288D/K313I突变体的杂合性为13.5％(分别为rs13383830和rs57302492，NCBI SNP数据库)。该双重多态性N288D和K313I在人类群体中总是一起出现。
将单突变体N288D和所述双突变体与Langerin的N-末端处的flag标签融合。首先，测试靶向脂质体和裸脂质体与wt Langerin+的脂质体结合，并与Langerin突变体N288D、K313I和双重突变体N288D/K313I进行比较(参见图19(A))。靶向脂质体与突变体K313I的结合在与wt Langerin相似的范围内。N288D和双重突变体N288D/K313I显示出明显增强的脂质体结合。值得注意的是那些也含有flag标签的突变体的增加的结合值之间的相关性。由于脂质体结合直接与Langerin的细胞表面表达有关，因此用抗人Langerin抗体检测细胞外受体表达。检测类似抗体染色，作为对靶向脂质体结合的观察(参见图19(B))。突变体K313I的归一化MFI值与wt Langerin的相当，而N288D和N288D/K313I突变体的MFI值显著提高。所述脂质体结合的唯一差异是，抗体染色揭示N288D突变体比双突变体的表达更高。因此，不同的受体表达影响脂质体对抗体染色的倍数变化(参见图19(C))。相对于受体表达，N288D突变体和双突变体显示出与靶向脂质体的结合强度显著增加。但是只有双突变体的倍数变化是wt Langerin的两倍以上，表明与靶向配体的亲和力改善。其次，研究了突变体对脂质体内化结局的效应。为此，将脂质体与突变体组合在37℃下温育不同的时间段，以诱导受体内化。与脂质体结合相反，受体内化24小时后，对K313I突变体和wt Langerin检测到最高的MFI值。在6小时时间点之前，wt Langerin和K313I突变体显示出与脂质体结合结果相似的较低的内化速率。然而，相对于wt Langerin，突变体的效应可忽略不计。因此，Langerin的天然存在的N288D/K313I多态性对脂质体吞没没有影响。
实施例16
直接修饰的蛋白靶向递送至模型细胞系
与蛋白质的氨基基团反应的反应性配体接头构建体的制备
Figure GDA0002759246180001191
在惰性气氛下，在17.4μL三甲胺存在下，将化合物7(0.87mg，2.3μmol)溶解于300μL DMSO和43μL吡啶中。添加8.63mg(22μmol)双(4-硝基苯基)己二酸酯(溶解于193μL DMSO中)，并将溶液搅拌3小时。随后通过冷冻干燥除去溶剂。残余物用甲苯洗涤，真空除去溶剂，得到化合物8。
配体修饰的绿色荧光蛋白(GFP)的制备
绿色荧光蛋白(GFP)用作蛋白质直接配体修饰的模型。GFP的氨基酸序列为：
MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKA(SEQ ID NO:82)
将1mg GFP在175μL PBS(pH 8)中的溶液添加到1.45mg(2.31μmol)反应性化合物8中(参见上面实施例16)，并在室温下搅拌23小时。将所述混合物用PBS(pH 7.4)稀释至2.5mL并离心。将上清液在4℃下针对PBS(pH 7.4)透析两次12小时，随后将溶液浓缩至1.06mg/mL修饰蛋白。
配体修饰的绿色荧光蛋白(GFP)的表征
为了估算按照实施例17中所述的程序获得的修饰的GFP上的配体总数，使用2,5-二羟基苯乙酮基质进行基质辅助的激光解吸/电离(Bruker MALDI-TOF Autoflex speed)测量。比较原始GFP和配体修饰的GFP的平均分子量，得到每个蛋白质分子平均约7个配体部分。
靶向递送至模型细胞系：蛋白质运载物摄取
然后在基于细胞的结合和内化测定中测试官能化的GFP。将GlcNTosyl官能化的GFP和未缀合的GFP分别与WT或hLangerin+Raji细胞在4℃和37℃下温育1小时或2小时(参见图21)。靶向GFP特异性结合Langerin表达细胞，并在高于1μg/ml的浓度下饱和(参见图21(A))。与WT Raji细胞一起温育的未缀合的GFP和靶向GFP没有显示出荧光信号增加。此外，在37℃下温育的靶向GFP也显示Langerin+细胞的荧光增加。与结合测定相比，GFP荧光略有升高，并且也在超过1μg/ml时饱和。
但是，与脂质体内化相反，GFP的摄取几乎不可见，表明内化速率受损或快速降解(参见图21(B))。
使用荧光显微术，在与Langerin+COS-7细胞一起温育后研究官能化的GFP和未缀合的GFP(参见图16)。与官能化的GFP一起温育的细胞显示出荧光信号增加，而未缀合的GFP不与Langerin+细胞结合。在37℃下温育仅5分钟后，官能化的GFP重新分布，并在60分钟后显得位于内体区室。在0分钟时间点的明显细胞膜染色在60分钟时间点被完全消除，提示GFP内化。而且，与甘露聚糖的结合和竞争研究证明官能化的GFP表现出结合亲和力增加(参见图22(A))。必须应用高达500μg/ml的甘露聚糖浓度方能竞争GlcNTosyl官能化GFP的结合，而相形之下，50μg/ml甘露聚糖就足以竞争官能化的脂质体。为了区分结合和内化，在4℃下温育4小时后添加甘露聚糖(参见图22(A))。脂质体和GFP都不能竞争，再次表明这两种载体都被内化。然而，当在37℃下经过更长的温育时间添加甘露聚糖时，与脂质体相比，GFP荧光强烈下降(参见图22(B))。与DPBS一起温育时，也可见信号减弱，但添加甘露聚糖增强该效应。
总之，与配体缀合的脂质体相比，与约7个配体缀合的官能化GFP表现出结合亲和力增加。然而，与GlcNTosyl装饰的脂质体相比，GFP内化大大受损。
实施例17
替代纳米粒子的靶向递送
配体修饰的PMMA珠的制备
将0.01mL羧化的聚(甲基丙烯酸甲酯)珠(0.5％储备液，直径130nm，PolyAn)溶解在200μL活化缓冲液中(MES 50mM pH＝5+0.001％tween)。添加12μL的1.5M 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺水溶液和12μL的0.3M N-羟基琥珀酰亚胺溶液，并剧烈搅拌1小时。随后将珠子用偶联缓冲液洗涤3次(HBS，pH＝7，5mM Ca2+)。添加2μL的10mM靶向配体水溶液，并在室温下搅拌过夜。将修饰的珠子用乙醇胺(在偶联缓冲液中1M，pH＝8+0.02％tween)洗涤两次，然后在4℃下用HBS缓冲液洗涤(pH＝7，5mM Ca2+，0.02％Tween)并保存。
配体修饰的PMMA珠与THP-1细胞的相互作用
将不同剂量(5、10、20μL)的配体修饰的PMMA珠溶液(c＝2.5 x 107珠子/mL(如实施例18所述制备)添加到50μL的THP-1细胞悬液(细胞计数为2 x 106细胞/ml)中。在冰上温育45分钟并避光后，将所述混合物离心，用120μL多聚甲醛水溶液(4％)固定，最后重悬于150μL培养基中。使用针对THP1细胞进行门控的荧光激活细胞分选(FACS)流式细胞术检测珠子的红色荧光，来分析珠子-细胞相互作用。
实施例18
靶向递送至原代朗格汉斯细胞
表皮细胞悬液中的脂质体递送
原代细胞是在研究变换成体内之前的优异模型。用解剖刀从健康供者的皮肤样品中去除皮下脂肪。将表皮细胞悬液在补充有1.5U/ml dispaseII(Roche)和0.1％胰蛋白酶(Sigma-Aldrich)的RPMI1640培养基(Lonza)中于4℃温育过夜。另一方面，通过在补充有10％FCS(Pan-Biotech)和1mg/ml胶原酶IV(Worthington Biochemical Corporation)的RPMI1640培养基中于37℃温育过夜，获得全皮肤细胞悬液。剥离的表皮或全皮肤通过100μm细胞滤网(Thermo Fisher Scientific)过滤，以获得单细胞悬液。将细胞悬液与16μM脂质体在含有1％BSA(Serva Electrophoresis GmbH)的HBSS缓冲液(Mg2+和Ca2+；BiochromGmbH)中于37℃温育1小时。为了动力学研究，将脂质体在37℃或4℃下温育各种时间段。添加10mM EDTA(Lonza)作为对照。在通过流式细胞术(FACS Canto II，BD Biosciences)分析细胞之前，将细胞用
Figure GDA0002759246180001221
780活力染料(eBioscience)和荧光染料缀合的抗体(CD1a，克隆：HI149；CD14，克隆：HCD14；HLA-DR，克隆：L243；CD45，克隆：HI30-Biolegend；Langerin，克隆：MB22-9F5-Miltenyi Biotec；同种型匹配的对照抗体)在4℃染色15分钟。为了进行共焦显微术，将表皮细胞悬液用FITC缀合的CD1a抗体(克隆：HI149；Biolegend)在4℃染色15分钟。在37℃下脂质体温育1小时后，通过显微术(Zeiss AxioObserver Z1)分析细胞。
为了利用原代细胞，从人皮肤样品制备表皮细胞悬液，并通过流式细胞术分析与朗格汉斯细胞的脂质体结合(参见图24(A))。通过CD45+、HLA-DR+和CD1a+表达鉴定朗格汉斯细胞。此外，活力染料(eFluor 780)区分死细胞(L/D)。活CD45+造血细胞含有94％HLA-DR+、CD1a+朗格汉斯细胞。
超过97％的表皮朗格汉斯细胞为Langerin阳性，并被脂质体上存在的A647共配制染料染色。与朗格汉斯细胞的脂质体结合对于靶向配体装饰的脂质体具有特异性，而Ca2+依赖性脂质体结合与10mM EDTA发生竞争。这些结果证实了在Langerin的CRD的主要结合位点处的特异性配体-受体相互作用。此外，脂质体染色对LC是特异性的，因为CD45-和CD45-、HLR-DR-细胞不能结合Langerin靶向脂质体(参见图24(B))。此外，EDTA阻止脂质体结合的事实使其成为理想的工具，用于在去除细胞外结合脂质体的温育步骤后通过添加EDTA来分析脂质体内化(参见图24(C))。温育步骤后添加EDTA不能抑制荧光信号，提示脂质体被内化，而直接添加到培养基中则完全抑制了脂质体的结合以及摄取。另外，在4℃温育脂质体以防止内化，即使当脂质体与细胞表面受体结合时也能防止内化。该步骤完全消除了荧光信号，确认了脂质体内化到LC中。通过显微术进一步验证脂质体的内化(参见图24(C))。在此，FITC缀合的CD1a抗体将表皮细胞悬液中的朗格汉斯细胞染色。仅在FITC标记的朗格汉斯细胞中检测到靶向脂质体。
全皮肤细胞悬液中的脂质体递送
已知LC是表皮中唯一的专业抗原呈递细胞。为了显示对LC的脂质体特异性超过其它树突状细胞系，从人皮肤样品中制备了全皮肤细胞悬液，并通过流式细胞术分析以检测脂质体染色(参见图25)。针对SSC-W绘制了朗格汉斯细胞不同细胞亚群的A647荧光图，针对细胞外Langerin表达绘制的LC的脂质体染色图。首先，CD45+、HLR-DR+、非自体荧光(AF)细胞中的18％细胞被鉴定为活CD1ahigh LCs，40％的细胞含有CD1a中间体(CD1ainter)表达，27％的细胞是CD1a-，其中8％是CD14+，这是单核细胞和巨噬细胞的标志物。在活的CD1ahigh LC群体中，超过96％的细胞显示Langerin表达，而89.9％的LC参入了靶向脂质体。CD1ainter细胞含有8.3％的Langerin+细胞，而4.9％的细胞被脂质体染料阳性染色。绝大多数脂质体染色均与Langerin表达有关，表明靶向脂质体与Langerin特异性结合。朗格汉斯细胞不同细胞亚群(包括CD45-细胞；CD45+、HLA-DR-细胞；CD45+、HLA-DR+、AF+细胞；CD45+、HLA-DR+、CD14+细胞；以及CD45+、HLA-DR+、CD1a-细胞)不能结合脂质体。然而，名为单核细胞和巨噬细胞的CD45+、HLA-DR+、CD1a-与裸脂质体和靶向脂质体的非特异性结合低于3％。但总的来说，裸脂质体既不结合LC，也不结合LC的不同细胞亚群。这些结果确认了我们先前使用表达Langerin的模型细胞系的研究。因此，靶向脂质体通过与Langerin的CRD的主要结合位点结合，以Ca2+依赖性方式被Langerin表达细胞特异性内化。
总而言之，靶向脂质体被特异性递送至表皮细胞悬液以及全皮肤细胞悬液中的Langerin阳性细胞。
实施例19
人Langerin配体的生物物理表征
受体表达和纯化
一般性说明.用于在大肠杆菌中表达Langerin和DC-SIGN的密码子优化基因分别购自GenScript和Life Technologies。除非另有说明，用于受体表达和纯化的所有生长培养基或化学品均购自Carl Roth。
SEQ ID NO:29呈现了用于在大肠杆菌中表达的Langerin的密码子优化基因序列，该序列在C端含有StreptagII和TEV位点。为了所述序列的大肠杆菌表达，使用了以下引物序列：
Figure GDA0002759246180001231
Figure GDA0002759246180001241
SEQ ID NO:52呈现了用于在大肠杆菌中表达的DC-SIGN的密码子优化基因序列，该序列在C端含有StreptagII和TEV位点。为了所述序列的大肠杆菌表达，使用了以下引物序列：
Figure GDA0002759246180001242
Figure GDA0002759246180001251
Langerin细胞外结构域.按以前的发表进行表达和纯化(Wamhoff，E.C.等人拟糖Langerin配体的(19)F Nmr指导设计((19)F Nmr-Guided Design of GlycomimeticLangerin Ligands).ACS Chem Biol，11，2407-13(2016))。简而言之，三聚体Langerin细胞外结构域(ECD)在大肠杆菌BL21*(DE3)(Invitrogen)中无法表达。酶促细胞裂解后，收获包涵体并随后溶解。离心样品，通过快速稀释将Langerin ECD重折叠过夜。接着，将样品透析过夜，离心并通过甘露聚糖-琼脂糖亲和色谱法(Sigma Aldrich)纯化。对于19F R2-过滤的NMR和脂质-酶联凝集素测定(Lipid-ELLA)实验，使用7kDa尺寸排阻脱盐柱(ThermoScientific)将缓冲液更换为有150mM NaCl和5mM CaCl2的25mM Tris，pH 7.8。对于STDNMR实验，将Langerin ECD样品用H2O透析至少五次，每次至少8小时。随后，通过冻干除去H2O，并将残余物存储在-80℃。在STD NMR实验之前，将Langerin ECD溶解在pH 7并且有100％D2O、150mM NaCl和5mM CaCl2的25mM Tris-d11(Eurisotope)中。通过紫外线光谱法确定Langerin ECD的浓度(A280，0.1％＝2.45)。通过SDS PAGE和DLS分析Langerin ECD样品的纯度和单分散性。
Langerin和DC-SIGN碳水化合物识别结构域.如以前发表的那样进行表达和纯化。简而言之，单体15N标记的Langerin和DC-SIGN碳水化合物识别结构域(CRD)在大肠杆菌BL21*(DE3)(Invitrogen)中无法表达。酶促细胞裂解后，收获包涵体并随后溶解。离心样品，通过快速稀释将DC-SIGN CRD重折叠过夜。接着，将样品透析过夜，离心并通过StrepTactin亲和色谱法(Iba)纯化。再经过一夜的透析步骤后，离心样品，并使用7kDa体积排阻脱盐柱(Thermo Scientific)，将缓冲液更换为有150mM NaCl并且pH 7.0的25mMHEPES，以备19F R2-过滤NMR和15N HSQC NMR试验。通过紫外光谱法确定Langerin和DC-SIGNCRD的浓度(A280，0.1％＝3.19和A280，0.1％＝2.98)。通过SDS PAGE和DLS分析了Langerin和DC-SIGN CRD样品的纯度和单分散性。
19FR2-过滤NMR
一般性说明.19F R2-过滤NMR试验在PremiumCompact 600MHz光谱仪(Agilent)上进行。在MestReNova中处理光谱，并用OriginPro(MestrelabResearch.Mestrenova.11.0.2.(2016)；OriginLab.Originpro.9.1.(2015))进行数据分析。关于Langerin ECD的实验是在50μM的受体浓度下在有10％D2O、150mM NaCl和5mM CaCl2的25mM Tris中在pH 7.8和25℃下进行的。关于DC-SIGN CRD的实验是在50μM的受体浓度下在有10％D2O、150mM NaCl和5mM CaCl2并且pH7.0的25mM HEPES中以及25℃下进行的。TFA以50μM的浓度用作内参比。使用以前发表的CPMG脉冲序列确定报道配体的表观弛豫率R2,obs(Wamhoff，E.C.等人拟糖Langerin配体的(19)F Nmr指导设计((19)F Nmr-Guided Designof Glycomimetic Langerin Ligands)ACS Chem Biol，11，2407-13(2016)，Carr，H.Y.&Purcell，E.M.核磁共振实验中扩散对自由进动的效应(Effects of Diffusion on FreePrecession in Nuclear Magnetic Resonance Experiments).Phys Rev，94，630-638(1954)；Meiboom，S.&Gill，D.测量核弛豫时间的改进自旋回波法(Modified Spin-EchoMethod for Measuring Nuclear Relaxation Times).Rev Sci Instrum 29，688-691(1958))。
用于DC-SIGN的测定法开发.遵循以前为Langerin发表的程序，开发了用于DC-SIGN的19F R2-过滤NMR报道分子置换测定(Wamhoff，E.C.等人拟糖Langerin配体的(19)FNmr指导设计((19)F Nmr-Guided Design of Glycomimetic Langerin Ligands).ACSChem Biol 11，2407-13(2016))。简而言之，在三个独立的滴定实验中，在五个浓度的报告配体24上确定KD值R2,b和结合态的弛豫率[L]T。通过连续稀释制备样品。添加10mM EDTA用于验证DC-SIGN与报道配体之间相互作用的Ca2+依赖性。为确保用于确定KD和KI的方程式的有效性，在受体存在下，在报道配体浓度为0.1mM下，通过19F NMR弛豫色散实验估算化学交换贡献R2,ex。
Ki确定.按照以前为Langerin发表的那样确定Ki值(Wamhoff，E.C.等人拟糖Langerin配体的(19)F NMR指导设计((19)F NMR-Guided Design of GlycomimeticLangerin Ligands).ACS Chem Biol 11，2407-13(2016))。简而言之，在五个竟争剂浓度[I]T下，以0.1mM的报道配体24的浓度进行滴定实验。通过连续稀释制备样品。对于酸GlcNS、GlcNAc-6-OS和GlcNS-6-OS，监测pH值，并在必要时其调节至7.8。
15N HSQC NMR
一般性说明.15N HSQC NMR试验在Ascend 700MHz光谱仪(Bruker)上进行(Bodenhausen，G.&Ruben，D.J.通过增强型异核光谱法进行自然丰度氮-15NMR(NaturalAbundance Nitrogen-15NMR by Enhanced Heteronuclear Spectroscopy).Chem PhysLett 69，185-189(1980))。光谱在NMRPipe中处理(Delaglio，F.等人Nmrpipe：基于Unix管道的多维光谱处理系统(Nmrpipe:A Multidimensional Spectral Processing SystemBased on Unix Pipes).J Biomol NMR 6，277-93(1995))。数据分析使用CCPN Analysis、MatLab和OriginPro进行(OriginLab.Originpro.9.1.(2015)；Vranken，W.F.等人NMR光谱的Ccpn数据模型：软件流水线的开发(The Ccpn Data Model for NMR Spectroscopy:Development of a Software Pipeline).Proteins，59，687-96(2005)；MathWorks.Matlab.9.0.Natick，U.S.A.(2016))。关于Langerin CRD的实验是在100μM的受体浓度下，在有10％D2O、150mM NaCl和5mM CaCl2的25mM HEPES中，在pH 7.8和25℃下进行的。DSS-d6以100μM的浓度用作内参比。光谱通过内部光谱仪参比进行参比。对3mm样品管中的150μL样品以128个增量且每增量32次扫描来采集光谱。将驰豫延迟d1设为1.4s并将采集时间tacq设为100ms。W5 Watergate脉冲序列用于溶剂抑制(Liu，M.等人改进的Watergate脉冲序列用于NMR光谱中的溶剂抑制(Improved Watergate Pulse Sequences for SolventSuppression in NMR Spectroscopy).J Magn Reson 132，125-129(1998))。所用的对于Langerin CRD的共振分配已在之前发表(Hanske，J.等人域内变构网络调整C型凝集素受体Langerin的钙亲和力(Intradomain Allosteric Network Modulates Calcium Affinityof the C-Type Lectin Receptor Langerin).J Am Chem Soc，138，12176-86(2016))。
KD确定.在滴定实验中在六种配体浓度[L]T下确定KD值。通过连续稀释制备样品。通过公式1计算用配体滴定后观察到的在快速或快速到中速交换状态下Langerin CRD共振的化学位移扰动CSP(Williamson，M.P.使用化学位移扰动表征配体结合(Using ChemicalShift Perturbation to Characterise Ligand Binding).Prog Nucl Magn ResonSpectrosc 73，1-16(2013))。
Figure GDA0002759246180001271
方程式1
先前在关于Langerin CRD的15N HSQC NMR实验中为了测量化学位移确定标准偏差σ为0.02ppm(Hanske，J.等人域内变构网络调整C型凝集素受体Langerin的钙亲和力(Intradomain Allosteric Network Modulates Calcium Affinity of the C-TypeLectin Receptor Langerin).J Am Chem Soc，138，12176-86(2016))。因此，仅选择了在最高配体浓度下显示出高于2σ阈值的CSP值的分配共振，以便通过方程式2在全局双参数拟合中确定KD值(Williamson，M.P.使用化学位移扰动表征配体结合(Using Chemical ShiftPerturbation to Characterise Ligand Binding).Prog Nucl Magn Reson Spectrosc，73，1-16(2013))。标准误差直接从拟合程序得出。另外，在以1H或15N尺度滴定时，显示谱线展宽Δv0.5大于10Hz的共振不考虑用于确定KD值。CSPmax表示在结合位点饱和后观察到的CSP值。
CSP＝CSPmaxpb
其中
Figure GDA0002759246180001281
方程式2
对于假定在滴定时处于慢交换状态的共振，KD值分别从对应于Langerin CRD的结合态和游离态的积分Vb和Vf得出。V值用于通过方程式3计算受体pb的结合分数。积分V通过N端K347的积分V归一化，并用于通过方程式3计算受体pb的结合分数。对于这些计算，仅考虑可以为其分配结合态的共振。显示低SNR或基线校正有问题的选定数据点作为异常值处理，不考虑用于确定pb值。接下来，将方程式3对平均pb值的单参数拟合用于确定KD值。
Figure GDA0002759246180001282
其中
Figure GDA0002759246180001283
方程式3
结合模式分析.基于共振分配，使用Matlab的Bioinformatics Toolbox通过取代B因子值，将在最大配体浓度[L]T下观察到的CSP值作图到Langerin CRD(PDB代码：4N32)的X射线结构上(Feinberg，H.等人人Langerin对于聚糖配体的变化特异性中的常见多态性(Common Polymorphisms in Human Langerin Change Specificity for GlycanLigands).J Biol Chem，288，36762-71(2013)；MathWorks.BioinformaticsToolbox.4.7.Natick，U.S.A.(2016))。得到的CSP模式在MOE中使用Langerin CRD的B链与GlcNAc的复合物进行可视化(ChemicalComputingGroup.Molecular OperatingEnviroment.2016.08.Montreal，Canada(2016))。使用MOE的Structure Preparation，然后用MOE的Protonate 3D模拟复合物的质子化状态和氢键网络，来维持模型质量。受体表面以Connolly图形(Connolly representation)进行可视化(Connolly，M.L.The MolecularSurface Package.J Mol Graph，11，139-41(1993))。
STD NMR
一般性说明.在PremiumCompact 600MHz光谱仪(Agilent)上进行STD NMR实验(Mayer，M.&Meyer，B.通过饱和转移差谱NMR光谱表征配体结合(Characterization ofLigand Binding by Saturation Transfer Difference NMR Spectroscopy).Angew ChemInt Ed，38，1784-1788(1999))。在MestReNova中处理光谱，并用OriginPro进行数据分析(Mestrelab Research.Mestrenova.11.0.2.(2016)：OriginLab.Originpro.9.1.(2015))。关于Langerin ECD的实验是在50μM的受体浓度下，在有100％D2O、150mM NaCl和5mM CaCl2的25mM Tris-d11(Eurisotope)中，在pH 7.8和25℃下进行的。在没有受体的情况下重复实验以排除由于配体的直接饱和而引起的STD效应。0.1mM的残存H2O或TSP-d6用作内参比。在5mm样品管中以500μL的样品体积记录光谱。饱和是在变化饱和时间tsat下通过一串50ms高斯脉冲实现的。共振辐照频率νsat设为0.0ppm，非共振辐照频率νref设为80.0ppm。采集时间tacq设为2.0s，DPFGSE脉冲序列用于溶剂抑制(Hwang，T.L.&Shaka，A.J.有效的水抑制-使用任意波形和脉冲场梯度进行激法塑型(Water Suppression That Works-ExcitationSculpting Using Arbitrary Wave-Forms and Pulsed-Field Gradients).J MagnReson，112，275-279(1995))。使用T1,rho滤波器以35ms的弛豫时间τ抑制受体共振。
表位作图.在500μM的浓度下确定16的结合表位。每个光谱记录512次扫描。弛豫延迟d1设为6s，并在从0.25到6.00s变化的5个不同饱和时间tsat下记录光谱。方程式4用于从相应的共振和非共振光谱导出每个分析的共振的STD效应STD(Mayer，M.&Meyer，B.通过饱和转移差谱NMR进行基团表位作图以鉴定与蛋白质受体直接接触的配体片段(GroupEpitope Mapping by Saturation Transfer Difference NMR to Identify Segments ofa Ligand in Direct Contact with a Protein Receptor).J Am Chem Soc，123，6108-17(2001))。I0表示非共振光谱中共振的积分，Isat表示共振光谱中共振的积分。
Figure GDA0002759246180001291
方程式4
表观饱和率ksat和最大STD效应STDmax是从方程式5以双参数拟合得出的(Angulo，J.&Nieto，P.M.Std-Nmr：应用于生物分子之间的瞬时相互作用——一种定量方法(Std-Nmr:Application to Transient Interactions between Biomolecules-a QuantitativeApproach).Eur Biophys J，40，1357-69(2011))。标准误差直接从该拟合程序得出。这些参数用于通过方程式6计算STD累积曲线STD’0的初始斜率。STD’0值归一化并作图到相应的配体结构上。对于表位作图，只考虑为其分离出至少一部分多重谱线的共振。
Figure GDA0002759246180001301
方程式5
STD′0＝STDmaxksat
方程式6
分子建模
一般性说明.在MOE(ChemicalComputingGroup.Molecular OperatingEnviroment.2016.08.Montreal，Canada(2016))中进行分子建模程序。注意与默认选项和参数的偏差。选择AMBER10:EHT力场来精化对接位姿和氢键网络，同时利用MMFF94x力场生成构象异构体(Case，D.A.，Darden，T.A.，Cheatham，T.E.，Simmerling，C.L.，Wang，J.，Duke，R.E.，Luo，R.，Crowley，M.，R.C.Walker，Zhang，W.，Merz，K.M.，B.Wang，Hayik，S.，Roitberg，A.，Seabra，G.，Kolossváry，I.，K.F.Wong，Paesani，F.，Vanicek，J.，X.Wu，Brozell，S.R.，Steinbrecher，T.，Gohlke，H.，Yang，L.，Tan，C.，Mongan，J.，Hornak，V.，Cui，G.，Mathews，D.H.，Seetin，M.G.，Sagui，C.，Babin，V.和P.A.Kollman.Amber.10.SanFrancisco，U.S.A.(2008)；Gerber，P.R.&Muller，K.Mab，a Generally ApplicableMolecular Force Field for Structure Modelling in Medicinal Chemistry.J ComputAided Mol Des，9，251-68(1995)；Halgren，T.A.Merck Molecular Force Field.I.Basis，Form，Scope，Parameterization，and Performance of Mmff94.J Comput Chem，17，490-519(1996))。受体表面以Connolly图形进行可视化(Connolly，M.L.The MolecularSurface Package.J Mol Graph，11，139-41(1993))。
药效团模型的开发和Langerin复合物的制备.进行了与GlcNAc的复合物中Langerin碳水化合物结合位点的结构比对(PDB代码：4N32)(Feinberg，H.等人人Langerin对于聚糖配体的变化特异性中的常见多态性(Common Polymorphisms in Human LangerinChange Specificity for Glycan Ligands).J Biol Chem，288，36762-71(2013))。基于该可视化，界定了具有Glc支架的O3、O4和O5特征的药效团模型。O3和O4的空间约束由半径r为
Figure GDA0002759246180001311
的球体界定，而O5的位置由半径r为
Figure GDA0002759246180001312
的球体约束。与GlcNAc复合的LangerinCRD的B链作为进行分子对接研究的结构基础。此外，对与Gal-6-OS的Langerin复合物观察的关于K313的另一种构象进行了建模，并包括在研究中(Feinberg，H.等人通过单个结合位点识别多种病原体和哺乳动物聚糖的Langerin的结构基础(Structural Basis forLangerin Recognition of Diverse Pathogen and Mammalian Glycans through aSingle Binding Site).J Mol Biol，405，1027-39(2011))。使用MOE的StructurePreparation来评价和维护整体模型质量和蛋白质几何形状。接下来，用MOE的Protonate3D模拟复合物的质子化状态和氢键网络，然后去除所有溶剂分子。
分子对接.利用MOE的Conformation Import生成了16的构象。基于药效团的放置方法用于生成我们使用LondonΔG函数评分的对接位姿。使用分子力学模拟对高分位姿进行精化，通过GBIV/WSAΔG函数进行再评分，使用药效基团模型过滤并写入输出数据库(Corbeil，C.R.，Williams，C.I.&Labute，P.由于数据集准备引起的对接成功率的变异性(Variability in Docking Success Rates Due to Dataset Preparation).J ComputAided Mol Des，26，775-86(2012))。碳水化合物结合位点的构象柔性是通过将B因子衍生的系链引入侧链原子而产生的。精化的对接位姿根据其GBIV/WSAΔG评分进行排名，并在进行的15N HSQC和STD NMR实验的情形下视觉评价。
实施例20
肝素衍生的单糖代表拟糖配体设计的有利支架
除了作为病原体识别受体的功能外，Langerin还与自身抗原例如包括肝素在内的糖胺聚糖相互作用(Munoz-Garcia，J.C.等人Langerin-肝素相互作用：通过NMR波谱和交联作图实验相结合揭示对于小和大配体的两个结合位点(Langerin-Heparin Interaction:Two Binding Sites for Small and Large Ligands as Revealed by a Combination ofNMR Spectroscopy and Cross-Linking Mapping Experiments).J Am Chem Soc，137，4100-10(2015)；Hanske，J.等人通过肝素寡糖不依赖于钙激活Langerin中的变构网络(Calcium-Independent Activation of an Allosteric Network in Langerin byHeparin Oligosaccharides).ChemBioChem，accepted(2017)；Zhao，J.等人糖胺聚糖和Langerin之间相互作用的动力学和结构研究(Kinetic and Structural Studies ofInteractions between Glycosaminoglycans and Langerin).Biochemistry(2016))。
这些线性多糖由二糖重复单元构成，所述二糖重复单元由半乳糖或糖醛酸和差异硫酸化的N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)组成。受到最近对肝素衍生的三糖报道的亲和力(KD＝0.49±0.05mM)比甘露糖(Man)二糖(KD＝约4mM)增加十倍的提示，采用配体观察的19F R2-过滤NMR实验来确定一组差异硫酸化的GlcNAc衍生物的Ki值(参见图27A)(Holla，A.&Skerra，A.比较分析揭示了树突细胞受体Dc-Sign和Langerin对聚糖的选择性识别(Comparative Analysis Reveals Selective Recognition of Glycans by theDendritic Cell Receptors Dc-Sign and Langerin).Protein Eng Des Sel，24，659-69(2011)；Munoz-Garcia，J.C.等人Langerin-肝素相互作用：通过NMR波谱和交联作图实验相结合揭示对于小和大配体的两个结合位点(Langerin-Heparin Interaction:Two BindingSites for Small and Large Ligands as Revealed by a Combination of NMRSpectroscopy and Cross-Linking Mapping Experiments).J Am Chem Soc，137，4100-10(2015)；Wamhoff，E.C.等人拟糖Langerin配体的(19)F NMR-指导设计((19)F NMR-GuidedDesign of Glycomimetic Langerin Ligands).ACS Chem Biol，11，2407-13(2016))。有趣的是，葡糖胺-2-硫酸盐(GlcNS)(Ki＝1.4±0.2mM)、N-乙酰基葡糖胺-6-硫酸盐(GlcNAc-6-OS)(KiI＝0.6±0.1mM)和葡糖胺-2-硫酸盐-6-硫酸盐(GlcNS-6-OS)(Ki＝0.28±0.06mM)的亲和力与对肝素衍生的寡糖和其它单糖包括Glc(Ki＝21±4mM)、GlcNAc(Ki＝4.1±0.7mM)和Man(Ki＝4.5±0.5mM)观察到的相当或更高(参见图30和图39)(Hanske，J.等人通过肝素寡糖不依赖于钙激活Langerin中的变构网络(Calcium-Independent Activation of anAllosteric Network in Langerin by Heparin Oligosaccharides).ChemBioChem，2017)。
GlcNS-6-OS，代表所鉴定的最强效的单糖，对C2和C6中的硫酸盐化表现出加和的结构-活性关系(SAR)。这种亲和力增加是基于先前通过X射线结晶学显示的与K299和K313形成盐桥之故(Porkolab，V.等人高度特异性拟糖配体的有理微分设计：靶向Dc-Sign并且不包括Langerin识别(Rational-Differential Design of Highly SpecificGlycomimetic Ligands:Targeting Dc-Sign and Excluding Langerin Recognition).ACS Chem Biol(2018))。与Langerin-GlcNAc复合物相比，GlcNS-6-OS表现出Glc支架取向改变(图27(B))(Feinberg，H.等人人Langerin对于聚糖配体的变化特异性中的常见多态性(Common Polymorphisms in Human Langerin Change Specificity for GlycanLigands).J Biol Chem，288，36762-71(2013))。另一方面，在GlcNAc上观察到的相比Glc的亲和力增加是与K299的H2O介导的氢键的结果。重要的是，通过用磺酰胺接头对硫酸酯基团进行生物电子等排取代(bioisosteric substitution)，可以将这些相互作用中的任何一个针对拟糖配体设计进行平衡。特别是，GlcNS类似物的合成代表了一种可行的片段生长方法，用于探索有利相互作用的碳水化合物结合位点(参见图27(A))。这些特性使硫酸化的GlcNAc衍生物成为设计拟糖Langerin配体的有利支架。
实施例21
小的芳族磺酰胺取代基使拟糖成为Langerin的强效靶向配体并提供针对DC-SIGN的特异性
假定对GlcNAc观察到了Glc支架取向的保守性，则推测C2中的小芳族取代基通过分别与K299和K313形成阳离子-π相互作用或与F315和P310形成π-π和H-π相互作用来增加亲和力(参见图27(B))。因此，制备了一组带有差异取代的苯基环的GlcNS类似物1至5，然后确定Ki值(参见图39)。观察到所有类似物的亲和力均比GlcNAc增加，2的亲和力增加了13倍(Ki＝0.32±0.05mM)，是最强效的组成员(参见图29、图31和图39)。该类似物在苯基环的对位带有甲基基团，该甲基基团对亲和力增加基本上没有贡献，如对1得到的KI值为例(KiI＝0.37±0.04mM)。
尽管其复杂性低，但2的亲和力优于先前用作与LC截然不同的DC亚群的靶向配体的聚糖的亲和力(Fehres，C.M.等人通过Langerin和Dc-Sign靶向进行交叉呈递需要聚糖修饰的抗原的不同制剂(Cross-Presentation through Langerin and Dc-Sign TargetingRequires Different Formulations of Glycan-Modified Antigens).J ControlRelease，203，67-76(2015))。在这里，血型抗原LeX(KD,DC-SIGN＝约1mM)被证明通过分离的皮肤DC促进脂质体的DC-SIGN依赖性内化，从而体外激活T细胞(Pederson，K.，Mitchell，D.A.&Prestegard，J.H.Dc-Sign–Lex复合物的结构表征(Structural Characterizationof the Dc-Sign–Lex Complex).Biochemistry，53，5700-5709(2014))。受到这些报告的鼓励，2通过在Glc支架的C1的β取向中引入乙氨基接头以产生靶向配体15(参见图27(A))，而向靶向递送应用进展。
在氨基基团的乙酰化后，获得模型配体16(图27(A))。16的Ki值确定(Ki＝0.24±0.03mM)揭示了比基于Man的参比分子21的亲和力(Ki＝10±1mM)增加了42倍(图27(A)和图27(C)和图29)。为了验证这些亲和力并扩大对识别过程的认识，进行了观察正交蛋白的15NHSQC NMR实验(图27(D)和图28(A)、图29和图32)。值得注意的是，在添加16后显示出化学位移扰动(CSP)的相当大一部分共振也表现出超过10Hz的谱线展宽Δν0.5，表明中间交换现象。因此，这些共振未考虑用于KD确定。同时，观察到与Y251、I253、N297和K299对应的一组共振的慢交换现象(图27(A))。快交换和慢交换峰的分析揭示亲和力比得上对16(KD,fast＝0.23±0.07mM，KD,slow＝0.3±0.1mM)以及21(KD＝12±1mM)获得的Ki值(图27(D)，图29，图32)。同样地，使用15N HSQC NMR验证2的亲和力(KD,fast＝0.46±0.04mM，KD,slow＝0.5±0.2mM)(图29和图33)。
接下来，针对DC-SIGN探索了靶向配体16的特异性(参见图27A)，因为这样的脱靶亲和力将意味着方法效率的降低以及潜在诱导不良效应。为此目的，将19F R2-过滤NMR报道分子置换测定转移到DC-SIGN()。16(Ki,DC-SIGN＝15±3mM)表现出对DC-SIGN的Ki值大大降低，相比之下对Langerin相当于63倍特异性(图27(C)和图29)。同时，21表现出对对DC-SIGN的特异性(Ki,DC-SIGN＝2.7±0.3mM)为Langerin的3.7-倍。对2(KiI,DC-SIGN＝17±1mM)和Man(Ki,DC-SIGN＝3.0±0.3mM)确定的亲和力进行比较，揭示了这些CLR对α-和β-糖苷的差异识别对特异性有贡献(图29)。
实施例22
从NMR和分子建模见解得出的结合模式分析：通过芳族磺酰胺取代基形成的π-π相互作用和氢键介导对Langerin的亲和力增加
为了研究模型配体16的结合方式(参见图27A)，将15N HSQC和STD NMR实验与分子对接研究相结合(图28(A)至图28(E))。在此，接头的取向对于评价结合模式与脂质体上靶向配体15的呈递的相容性特别重要。
16的滴定(参见图27(A))诱导了E285和K299的CSP，为拟糖的Glc支架的典范Ca2+依赖性结合模式提供了进一步的证据(图28(B)和图28(C))。这些观察蛋白质的NMR实验还揭示了在F315和N307附近的残基的强CSP。值得注意的是，这两个残基都无法分配，可能是由于它们与柔性长环缔合(Hanske，J.等人域内变构网络调整C型凝集素受体Langerin的钙亲和力(Intradomain Allosteric Network Modulates Calcium Affinity of the C-TypeLectin Receptor Langerin).J Am Chem Soc138，12176-86(2016)。与用图27(A)的Man类似物21进行滴定相比，该效应伴随着K313的CSP降低(图32和图34)。两种观察结果在用图27(A)的2进行滴定中是保守的，表明苯基环的取向朝向F315或K299而不是K313或P310(图33和图34)。有趣的是，诱导了远离碳水化合物结合的残基的额外CSP，提示参与Langerin调节Ca2+识别的变构网络的调整。
为了补充观察蛋白质的NMR实验和研究乙酰化乙氨基接头的取向，进行了16和21的STD NMR表位作图(参见图27(A))。16的结合表位受苯基环的一致高的STD效应支配，因此支持了一个模型，其中该取代基与Langerin表面之间形成了有利的二次相互作用(图28(D)和图35)。相比之下，乙酰化的乙氨基接头确实表现出一致低的STD效应，表明溶剂暴露取向并验证了针对GlcNS类似物开发的缀合策略。类似地，与Man支架相比，21的乙氨基接头的STD效应降低(图36和图37)。
最后，利用与GlcNAc的Langerin复合物的X射线结构进行了分子对接(参见图28(E)和图38)(Feinberg，H.等人人Langerin对于聚糖配体的变化特异性中的常见多态性(Common Polymorphisms in Human Langerin Change Specificity for GlycanLigands).J Biol Chem，288，36762-71(2013))。在NMR实验的情形下评估所产生的对接位姿，并选择代表性的位姿来可视化潜在的二次相互作用的形成。确实，苯环朝向F315的取向导致π-π相互作用的形成。该取向也与在磺酰胺接头和N307之间形成弱氢键相吻合。这两种相互作用都说明了对于与F315和N307有关的残基包括I250、Y251、N297和K299观察到的明显CSP值。此外，所述苯基环受到高STD效应，表明形成了二次相互作用并与Langerin表面高度接近。相反，在大多数对接位姿下，乙酰化的乙氨基接头表现出高溶剂暴露并且没有保守的二次相互作用。该观察结果符合低STD效应，因此验证了针对GlcNS类似物开发的缀合策略。总体而言，提出了16的结合模式，其显示了Glc支架的保守取向，与STD和15N HSQC NMR实验一致。可以通过在苯基取代基和F315之间形成π-π相互作用以及在磺酰胺接头和N297之间形成氢键来使亲和力增加合理化。
实施例23
基于脂质的板基酶联凝集素测定(ELLA)的应用
单糖类似物15或20(参见图27(A))分别用于合成糖脂22和23(参见图27(E))。在板基酶联凝集素测定(ELLA)中评价它们对Langerin的亲和力。虽然可以证明22的剂量依赖性相互作用，但对于23的固定化没有检测到相互作用。这验证了所确定的模型配体16(参见图27(A))的亲和力比基于Man的参比分子21增加。然后，制备了用Alexa Fluor(AF)647标记的、直径d为160±60nm的靶向脂质体，该脂质体4℃下保存在PBS中时在几个月内是稳定的。采用1H NMR实验来探查脂质体表面上靶向配体15的可及性。在此，观察到共振的两种状态，对应于与苯基环的H1’和H2’。两种状态均显示出线宽ν0.5小于30Hz，提示由于在扩展的聚乙二醇接头上呈递靶向配体引起的残余柔性。该替代状态可能对应于朝着脂质体内腔取向的靶向配体。综上所述，15可能在脂质体表面上有利地呈递以便能够与Langerin相互作用，进一步验证了所开发的缀合策略。
序列表
<110> 马克斯-普朗克科学促进协会；柏林洪堡大学
<120> Langerin+ 细胞靶向
<130> 33042WO
<160> 82
<170> PatentIn version 3.5
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Phe Ser Leu Ile Pro Lys Thr Trp Tyr Ser Ala Glu Gln Phe Cys Val
210 215 220
Ser Arg Asn Ser His Leu Thr Ser Val Thr Ser Glu Ser Glu Gln Glu
225 230 235 240
Phe Leu Tyr Lys Thr Ala Gly Gly Leu Ile Tyr Trp Ile Gly Leu Thr
245 250 255
Lys Ala Gly Met Glu Gly Asp Trp Ser Trp Val Asp Asp Thr Pro Phe
260 265 270
Asn Lys Val Gln Ser Ala Arg Phe Trp Ile Pro Gly Glu Pro Asn Asn
275 280 285
Ala Gly Asn Asn Glu His Cys Gly Asn Ile Lys Ala Pro Ser Leu Gln
290 295 300
Ala Trp Asn Asp Ala Pro Cys Asp Ile Thr Phe Leu Phe Ile Cys Lys
305 310 315 320
Arg Pro Tyr Val Pro Ser Glu Pro
325
<210> 8
<211> 987
<212> DNA
<213> 智人
<400> 8
atgactgtgg agaaggaggc ccctgatgcg cacttcactg tggacaaaca gaacatctcc 60
ctctggcccc gagagcctcc tcccaagtcc ggtccatctc tggtcccggg gaaaacaccc 120
acagtccgtg ctgcattaat ctgcctgacg ctggtcctgg tcgcctccgt cctgctgcag 180
gccgtccttt atccccggtt tatgggcacc atatcagatg taaagaccaa tgtccagttg 240
ctgaaaggtc gtgtggacaa catcagcacc ctggattctg aaattaaaaa gaatagtgac 300
ggcatggagg cagctggcgt tcagatccag atggtgaatg agagcctggg ttatgtgcgt 360
tctcagttcc tgaagttaaa aaccagtgtg gagaaggcca acgcacagat ccagatctta 420
acaagaagtt gggaagaagt cagtacctta aatgcccaaa tcccagagtt aaaaagtgat 480
ttggagaaag ccagtgcttt aaatacaaag atccgggcac tccagggcag cttggagaat 540
atgagcaagt tgctcaaacg acaaaatgat attctacagg tggtttctca aggctggaag 600
tacttcaagg ggaacttcta ttacttttct ctcattccaa agacctggta tagtgccgag 660
cagttctgtg tgtccaggaa ttcacacctg acctcggtga cctcagagag tgagcaggag 720
tttctgtata aaacagcggg gggactcatc tactggattg gcctgactaa agcagggatg 780
gaaggggact ggtcctgggt ggatgacacg ccattcaaca aggtccaaag tgcgaggttc 840
tggattccag gtgagcccaa caatgctggg aacaatgaac actgtggcaa tataaaggct 900
ccctcacttc aggcctggaa tgatgcccca tgtgacataa cgtttctttt catttgtaag 960
cgaccctatg tcccatcaga accgtga 987
<210> 9
<211> 328
<212> PRT
<213> 智人
<400> 9
Met Thr Val Glu Lys Glu Ala Pro Asp Ala His Phe Thr Val Asp Lys
1 5 10 15
Gln Asn Ile Ser Leu Trp Pro Arg Glu Pro Pro Pro Lys Ser Gly Pro
20 25 30
Ser Leu Val Pro Gly Lys Thr Pro Thr Val Arg Ala Ala Leu Ile Cys
35 40 45
Leu Thr Leu Val Leu Val Ala Ser Val Leu Leu Gln Ala Val Leu Tyr
50 55 60
Pro Arg Phe Met Gly Thr Ile Ser Asp Val Lys Thr Asn Val Gln Leu
65 70 75 80
Leu Lys Gly Arg Val Asp Asn Ile Ser Thr Leu Asp Ser Glu Ile Lys
85 90 95
Lys Asn Ser Asp Gly Met Glu Ala Ala Gly Val Gln Ile Gln Met Val
100 105 110
Asn Glu Ser Leu Gly Tyr Val Arg Ser Gln Phe Leu Lys Leu Lys Thr
115 120 125
Ser Val Glu Lys Ala Asn Ala Gln Ile Gln Ile Leu Thr Arg Ser Trp
130 135 140
Glu Glu Val Ser Thr Leu Asn Ala Gln Ile Pro Glu Leu Lys Ser Asp
145 150 155 160
Leu Glu Lys Ala Ser Ala Leu Asn Thr Lys Ile Arg Ala Leu Gln Gly
165 170 175
Ser Leu Glu Asn Met Ser Lys Leu Leu Lys Arg Gln Asn Asp Ile Leu
180 185 190
Gln Val Val Ser Gln Gly Trp Lys Tyr Phe Lys Gly Asn Phe Tyr Tyr
195 200 205
Phe Ser Leu Ile Pro Lys Thr Trp Tyr Ser Ala Glu Gln Phe Cys Val
210 215 220
Ser Arg Asn Ser His Leu Thr Ser Val Thr Ser Glu Ser Glu Gln Glu
225 230 235 240
Phe Leu Tyr Lys Thr Ala Gly Gly Leu Ile Tyr Trp Ile Gly Leu Thr
245 250 255
Lys Ala Gly Met Glu Gly Asp Trp Ser Trp Val Asp Asp Thr Pro Phe
260 265 270
Asn Lys Val Gln Ser Ala Arg Phe Trp Ile Pro Gly Glu Pro Asn Asp
275 280 285
Ala Gly Asn Asn Glu His Cys Gly Asn Ile Lys Ala Pro Ser Leu Gln
290 295 300
Ala Trp Asn Asp Ala Pro Cys Asp Ile Thr Phe Leu Phe Ile Cys Lys
305 310 315 320
Arg Pro Tyr Val Pro Ser Glu Pro
325
<210> 10
<211> 987
<212> DNA
<213> 智人
<400> 10
atgactgtgg agaaggaggc ccctgatgcg cacttcactg tggacaaaca gaacatctcc 60
ctctggcccc gagagcctcc tcccaagtcc ggtccatctc tggtcccggg gaaaacaccc 120
acagtccgtg ctgcattaat ctgcctgacg ctggtcctgg tcgcctccgt cctgctgcag 180
gccgtccttt atccccggtt tatgggcacc atatcagatg taaagaccaa tgtccagttg 240
ctgaaaggtc gtgtggacaa catcagcacc ctggattctg aaattaaaaa gaatagtgac 300
ggcatggagg cagctggcgt tcagatccag atggtgaatg agagcctggg ttatgtgcgt 360
tctcagttcc tgaagttaaa aaccagtgtg gagaaggcca acgcacagat ccagatctta 420
acaagaagtt gggaagaagt cagtacctta aatgcccaaa tcccagagtt aaaaagtgat 480
ttggagaaag ccagtgcttt aaatacaaag atccgggcac tccagggcag cttggagaat 540
atgagcaagt tgctcaaacg acaaaatgat attctacagg tggtttctca aggctggaag 600
tacttcaagg ggaacttcta ttacttttct ctcattccaa agacctggta tagtgccgag 660
cagttctgtg tgtccaggaa ttcacacctg acctcggtga cctcagagag tgagcaggag 720
tttctgtata aaacagcggg gggactcatc tactggattg gcctgactaa agcagggatg 780
gaaggggact ggtcctgggt ggatgacacg ccattcaaca aggtccaaag tgcgaggttc 840
tggattccag gtgagcccaa cgatgctggg aacaatgaac actgtggcaa tataaaggct 900
ccctcacttc aggcctggaa tgatgcccca tgtgacataa cgtttctttt catttgtaag 960
cgaccctatg tcccatcaga accgtga 987
<210> 11
<211> 404
<212> PRT
<213> 智人
<400> 11
Met Ser Asp Ser Lys Glu Pro Arg Leu Gln Gln Leu Gly Leu Leu Glu
1 5 10 15
Glu Glu Gln Leu Arg Gly Leu Gly Phe Arg Gln Thr Arg Gly Tyr Lys
20 25 30
Ser Leu Ala Gly Cys Leu Gly His Gly Pro Leu Val Leu Gln Leu Leu
35 40 45
Ser Phe Thr Leu Leu Ala Gly Leu Leu Val Gln Val Ser Lys Val Pro
50 55 60
Ser Ser Ile Ser Gln Glu Gln Ser Arg Gln Asp Ala Ile Tyr Gln Asn
65 70 75 80
Leu Thr Gln Leu Lys Ala Ala Val Gly Glu Leu Ser Glu Lys Ser Lys
85 90 95
Leu Gln Glu Ile Tyr Gln Glu Leu Thr Gln Leu Lys Ala Ala Val Gly
100 105 110
Glu Leu Pro Glu Lys Ser Lys Leu Gln Glu Ile Tyr Gln Glu Leu Thr
115 120 125
Arg Leu Lys Ala Ala Val Gly Glu Leu Pro Glu Lys Ser Lys Leu Gln
130 135 140
Glu Ile Tyr Gln Glu Leu Thr Trp Leu Lys Ala Ala Val Gly Glu Leu
145 150 155 160
Pro Glu Lys Ser Lys Met Gln Glu Ile Tyr Gln Glu Leu Thr Arg Leu
165 170 175
Lys Ala Ala Val Gly Glu Leu Pro Glu Lys Ser Lys Gln Gln Glu Ile
180 185 190
Tyr Gln Glu Leu Thr Arg Leu Lys Ala Ala Val Gly Glu Leu Pro Glu
195 200 205
Lys Ser Lys Gln Gln Glu Ile Tyr Gln Glu Leu Thr Arg Leu Lys Ala
210 215 220
Ala Val Gly Glu Leu Pro Glu Lys Ser Lys Gln Gln Glu Ile Tyr Gln
225 230 235 240
Glu Leu Thr Gln Leu Lys Ala Ala Val Glu Arg Leu Cys His Pro Cys
245 250 255
Pro Trp Glu Trp Thr Phe Phe Gln Gly Asn Cys Tyr Phe Met Ser Asn
260 265 270
Ser Gln Arg Asn Trp His Asp Ser Ile Thr Ala Cys Lys Glu Val Gly
275 280 285
Ala Gln Leu Val Val Ile Lys Ser Ala Glu Glu Gln Asn Phe Leu Gln
290 295 300
Leu Gln Ser Ser Arg Ser Asn Arg Phe Thr Trp Met Gly Leu Ser Asp
305 310 315 320
Leu Asn Gln Glu Gly Thr Trp Gln Trp Val Asp Gly Ser Pro Leu Leu
325 330 335
Pro Ser Phe Lys Gln Tyr Trp Asn Arg Gly Glu Pro Asn Asn Val Gly
340 345 350
Glu Glu Asp Cys Ala Glu Phe Ser Gly Asn Gly Trp Asn Asp Asp Lys
355 360 365
Cys Asn Leu Ala Lys Phe Trp Ile Cys Lys Lys Ser Ala Ala Ser Cys
370 375 380
Ser Arg Asp Glu Glu Gln Phe Leu Ser Pro Ala Pro Ala Thr Pro Asn
385 390 395 400
Pro Pro Pro Ala
<210> 12
<211> 1215
<212> DNA
<213> 智人
<400> 12
atgagtgact ccaaggaacc aagactgcag cagctgggcc tcctggagga ggaacagctg 60
agaggccttg gattccgaca gactcgagga tacaagagct tagcagggtg tcttggccat 120
ggtcccctgg tgctgcaact cctctccttc acgctcttgg ctgggctcct tgtccaagtg 180
tccaaggtcc ccagctccat aagtcaggaa caatccaggc aagacgcgat ctaccagaac 240
ctgacccagc ttaaagctgc agtgggtgag ctctcagaga aatccaagct gcaggagatc 300
taccaggagc tgacccagct gaaggctgca gtgggtgagc ttccagagaa atctaagctg 360
caggagatct accaggagct gacccggctg aaggctgcag tgggtgagct tccagagaaa 420
tctaagctgc aggagatcta ccaggagctg acctggctga aggctgcagt gggtgagctt 480
ccagagaaat ctaagatgca ggagatctac caggagctga ctcggctgaa ggctgcagtg 540
ggtgagcttc cagagaaatc taagcagcag gagatctacc aggagctgac ccggctgaag 600
gctgcagtgg gtgagcttcc agagaaatct aagcagcagg agatctacca ggagctgacc 660
cggctgaagg ctgcagtggg tgagcttcca gagaaatcta agcagcagga gatctaccag 720
gagctgaccc agctgaaggc tgcagtggaa cgcctgtgcc acccctgtcc ctgggaatgg 780
acattcttcc aaggaaactg ttacttcatg tctaactccc agcggaactg gcacgactcc 840
atcaccgcct gcaaagaagt gggggcccag ctcgtcgtaa tcaaaagtgc tgaggagcag 900
aacttcctac agctgcagtc ttccagaagt aaccgcttca cctggatggg actttcagat 960
ctaaatcagg aaggcacgtg gcaatgggtg gacggctcac ctctgttgcc cagcttcaag 1020
cagtattgga acagaggaga gcccaacaac gttggggagg aagactgcgc ggaatttagt 1080
ggcaatggct ggaacgacga caaatgtaat cttgccaaat tctggatctg caaaaagtcc 1140
gcagcctcct gctccaggga tgaagaacag tttctttctc cagcccctgc caccccaaac 1200
ccccctcctg cgtag 1215
<210> 13
<211> 331
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 13
Met Pro Glu Ala Glu Met Lys Glu Glu Ala Pro Glu Ala His Phe Thr
1 5 10 15
Val Asp Lys Gln Asn Ile Ser Leu Trp Pro Arg Glu Pro Pro Pro Lys
20 25 30
Gln Asp Leu Ser Pro Val Leu Arg Lys Pro Leu Cys Ile Cys Val Ala
35 40 45
Phe Thr Cys Leu Ala Leu Val Leu Val Thr Ser Ile Val Leu Gln Ala
50 55 60
Val Phe Tyr Pro Arg Leu Met Gly Lys Ile Leu Asp Val Lys Ser Asp
65 70 75 80
Ala Gln Met Leu Lys Gly Arg Val Asp Asn Ile Ser Thr Leu Gly Ser
85 90 95
Asp Leu Lys Thr Glu Arg Gly Arg Val Asp Asp Ala Glu Val Gln Met
100 105 110
Gln Ile Val Asn Thr Thr Leu Lys Arg Val Arg Ser Gln Ile Leu Ser
115 120 125
Leu Glu Thr Ser Met Lys Ile Ala Asn Asp Gln Leu Gln Ile Leu Thr
130 135 140
Met Ser Trp Gly Glu Val Asp Ser Leu Ser Ala Lys Ile Pro Glu Leu
145 150 155 160
Lys Arg Asp Leu Asp Lys Ala Ser Ala Leu Asn Thr Lys Val Gln Gly
165 170 175
Leu Gln Asn Ser Leu Glu Asn Val Asn Lys Leu Leu Lys Gln Gln Ser
180 185 190
Asp Ile Leu Glu Met Val Ala Arg Gly Trp Lys Tyr Phe Ser Gly Asn
195 200 205
Phe Tyr Tyr Phe Ser Arg Thr Pro Lys Thr Trp Tyr Ser Ala Glu Gln
210 215 220
Phe Cys Ile Ser Arg Lys Ala His Leu Thr Ser Val Ser Ser Glu Ser
225 230 235 240
Glu Gln Lys Phe Leu Tyr Lys Ala Ala Asp Gly Ile Pro His Trp Ile
245 250 255
Gly Leu Thr Lys Ala Gly Ser Glu Gly Asp Trp Tyr Trp Val Asp Gln
260 265 270
Thr Ser Phe Asn Lys Glu Gln Ser Arg Arg Phe Trp Ile Pro Gly Glu
275 280 285
Pro Asn Asn Ala Gly Asn Asn Glu His Cys Ala Asn Ile Arg Val Ser
290 295 300
Ala Leu Lys Cys Trp Asn Asp Gly Pro Cys Asp Asn Thr Phe Leu Phe
305 310 315 320
Ile Cys Lys Arg Pro Tyr Val Gln Thr Thr Glu
325 330
<210> 14
<211> 996
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 14
atgccagagg cagagatgaa ggaggaggct cccgaagcgc acttcacagt ggacaaacag 60
aacatctctc tctggcctcg agagcctcct cccaagcaag atctgtctcc agttctgagg 120
aaacctctct gtatctgcgt ggccttcacc tgcctggcat tggtgctggt cacctccatt 180
gtgcttcagg ctgttttcta tcctaggttg atgggcaaaa tattggatgt gaagagtgat 240
gcccagatgt tgaaaggtcg tgtggacaac atcagcaccc tgggttctga tcttaagact 300
gaaagaggtc gtgtggacga tgctgaggtt cagatgcaga tagtgaacac caccctcaag 360
agggtgcgtt ctcagatcct gtctttggaa accagcatga agatagccaa tgatcagctc 420
cagatattaa caatgagctg gggagaggtt gacagtctca gtgccaaaat cccagaactg 480
aaaagagatc tggataaagc cagcgccttg aacacaaagg tccaaggact acagaacagc 540
ttggagaatg tcaacaagct gctcaaacaa cagagtgaca ttctggagat ggtggctcga 600
ggctggaagt atttctcggg gaacttctat tacttttcac gcaccccaaa gacctggtac 660
agcgcagagc agttctgtat ttctagaaaa gctcacctga cctcagtgtc ctcagaatcg 720
gaacaaaagt ttctctacaa ggcagcagat ggaattccac actggattgg acttaccaaa 780
gcagggagcg aaggggactg gtactgggtg gaccagacat cattcaacaa ggagcaaagt 840
aggaggttct ggattccagg tgaacccaac aacgcaggga acaacgagca ctgtgccaat 900
atcagggtgt ctgccctgaa gtgctggaac gatggtccct gtgacaatac atttcttttc 960
atctgcaaga ggccctacgt ccaaacaact gaatga 996
<210> 15
<211> 244
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 15
Met Lys Tyr His Ser His Ile Glu Asn Leu Asp Glu Asp Gly Tyr Thr
1 5 10 15
Gln Leu Asp Phe Ser Thr Gln Asp Ile His Lys Arg Pro Arg Gly Ser
20 25 30
Glu Lys Gly Ser Arg Ala Pro Ser Ser Pro Trp Arg Pro Ile Ala Val
35 40 45
Gly Leu Gly Ile Leu Cys Phe Val Val Val Val Val Ala Ala Val Leu
50 55 60
Gly Ala Leu Ala Phe Trp Arg His Asn Ser Gly Arg Asn Pro Glu Glu
65 70 75 80
Lys Asp Asn Phe Leu Ser Arg Asn Lys Glu Asn His Lys Pro Thr Glu
85 90 95
Ser Ser Leu Asp Glu Lys Val Ala Pro Ser Lys Ala Ser Gln Thr Thr
100 105 110
Gly Gly Phe Ser Gln Ser Cys Leu Pro Asn Trp Ile Met His Gly Lys
115 120 125
Ser Cys Tyr Leu Phe Ser Phe Ser Gly Asn Ser Trp Tyr Gly Ser Lys
130 135 140
Arg His Cys Ser Gln Leu Gly Ala His Leu Leu Lys Ile Asp Asn Ser
145 150 155 160
Lys Glu Phe Glu Phe Ile Glu Ser Gln Thr Ser Ser His Arg Ile Asn
165 170 175
Ala Phe Trp Ile Gly Leu Ser Arg Asn Gln Ser Glu Gly Pro Trp Phe
180 185 190
Trp Glu Asp Gly Ser Ala Phe Phe Pro Asn Ser Phe Gln Val Arg Asn
195 200 205
Thr Val Pro Gln Glu Ser Leu Leu His Asn Cys Val Trp Ile His Gly
210 215 220
Ser Glu Val Tyr Asn Gln Ile Cys Asn Thr Ser Ser Tyr Ser Ile Cys
225 230 235 240
Glu Lys Glu Leu
<210> 16
<211> 735
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 16
atgaaatatc actctcatat agagaatctg gatgaagatg gatatactca attagacttc 60
agcactcaag acatccataa aaggcccagg ggatcagaga aaggaagccg ggctccatct 120
tcaccttgga ggcccattgc agtgggttta ggaatcctgt gctttgtggt agtagtggtt 180
gctgcagtgc tgggtgccct agcattttgg cgacacaatt cagggagaaa tccagaggag 240
aaagacaact tcctatcaag aaataaagag aaccacaagc ccacagaatc atctttagat 300
gagaaggtgg ctccctccaa ggcatcccaa actacaggag gtttttctca gtcttgcctt 360
cctaattgga tcatgcatgg gaagagctgt tacctattta gcttctcagg aaattcctgg 420
tatggaagta agagacactg ctcccagcta ggtgctcatc tactgaagat agacaactca 480
aaagaatttg agttcattga aagccaaaca tcgtctcacc gtattaatgc attttggata 540
ggcctttccc gcaatcagag tgaagggcca tggttctggg aggatggatc agcattcttc 600
cccaactcgt ttcaagtcag aaatacagtt ccccaggaaa gcttactgca caattgtgta 660
tggattcatg gatcagaggt ctacaaccaa atctgcaata cttcttcata cagtatctgt 720
gagaaggaac tgtaa 735
<210> 17
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hLangerin 正向引物
<400> 17
ctggctagcg tttaaactta agcatgactg tggagaagga ggcc 44
<210> 18
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hLangerin 反向引物
<400> 18
ctagactcga gcggcctcac ggttctgatg ggac 34
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 骨架质粒正向引物
<400> 19
gcttaagttt aaacgctagc c 21
<210> 20
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 骨架质粒反向引物
<400> 20
ggccgctcga gtctagag 18
<210> 21
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hLangerin pcDNA 5 正向引物
<400> 21
ctggctagcg tttaaactta agcatgactg tggagaagga ggcc 44
<210> 22
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hLangerin pcDNA 5 反向引物
<400> 22
gtgatggtga tgatgactca cggttctgat gggac 35
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 骨架质粒 pcDNA5 正向引物
<400> 23
gcttaagttt aaacgctagc c 21
<210> 24
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 骨架质粒 pcDNA5 反向引物
<400> 24
gtcatcatca ccatcacc 18
<210> 25
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hLangerin RP172 正向引物
<400> 25
ctggctagcg tttaaactta ag 22
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hLangerin RP172 反向引物
<400> 26
caatggtgat ggtgatgatg 20
<210> 27
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 骨架质粒 RP172 正向
<400> 27
gagctagcag tattaattaa ccaccctggc tagcgtttaa acttaag 47
<210> 28
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 骨架质粒 RP172 反向
<400> 28
gtaccggtta ggatgcatgc caatggtgat ggtgatgatg 40
<210> 29
<211> 855
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 含StreptagII和TEV的Langerin的密码子优化序列
<400> 29
atggcacgct tcatgggcac gattagcgat gttaaaacca atgttcaact gctgaaaggc 60
cgtgtggaca atatctcgac cctggatagt gaaattaaga aaaacagcga tggcatggaa 120
gcggccggtg tccagatcca aatggtgaat gaatcactgg gttatgtccg ttcgcagttt 180
ctgaaactga aaaccagtgt tgaaaaagca aacgctcaga ttcaaatcct gacccgctca 240
tgggaagaag tgtcgacgct gaatgcccag attccggaac tgaaaagcga tctggaaaaa 300
gcgtctgccc tgaacacgaa aatccgtgca ctgcagggca gcctggaaaa catgtctaaa 360
ctgctgaaac gccaaaatga cattctgcag gtggttagcc aaggctggaa atacttcaag 420
ggtaacttct actacttcag tctgatcccg aaaacctggt actccgccga acagttttgc 480
gtgagtcgta actcccatct gaccagcgtt acgagcgaat ctgaacaaga atttctgtat 540
aaaaccgctg gcggtctgat ttactggatc ggtctgacga aagcgggcat ggagggtgat 600
tggtcatggg ttgatgacac cccgtttaat aaagtccagt cggcgcgttt ctggattccg 660
ggcgaaccga acaatgccgg taacaatgaa cactgtggca acatcaaagc accgagcctg 720
caggcatgga atgatgctcc gtgcgacaaa acgtttctgt tcatttgtaa acgcccgtac 780
gttccgtctg aaccgggatc cgaaaatctg tacttccaag gttcggcgtg gtcccatccg 840
cagtttgaaa aataa 855
<210> 30
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 截短的Langerin细胞外结构域(ECD)正向引物
<400> 30
ggtggtcata tggcctcgac gctgaatgcc cagattccgg 40
<210> 31
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 截短的Langerin细胞外结构域(ECD)反向引物
<400> 31
accaccaagc ttttattttt caaactgcgg atg 33
<210> 32
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Langerin碳水化合物识别结构域(CRD)正向引物
<400> 32
ggtggtcata tggcccaggt ggttagccaa ggctggaaat ac 42
<210> 33
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Langerin碳水化合物识别结构域(CRD)反向引物
<400> 33
accaccaagc ttttattttt caaactgcgg atg 33
<210> 34
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hLangerin骨架SNP正向
<400> 34
gagctagcag tattaattaa ccaccatgac tgtggagaag gag 43
<210> 35
<211> 92
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hLangerin-FLAG骨架SNP反向
<400> 35
acgtttcttt tcatttgtaa gcgaccctat gtcccatcag aaccggacta caaagacgat 60
gacgacaagt gagcatgcat cctaaccggt ac 92
<210> 36
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> N288D 正向引物
<400> 36
ccaggtgagc ccaacgatgc tgggaacaat gaacactg 38
<210> 37
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> N288D 反向引物
<400> 37
cattgttccc agcatcgttg ggctcacctg gaatccag 38
<210> 38
<211> 93
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> K313I 反向引物
<400> 38
gtaccggtta ggatgcatgc tcacggttct gatgggacat agggtcgctt acaaatgaaa 60
agaaacgtta tgtcacatgg ggcatcattc cag 93
<210> 39
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> K313 正向引物
<400> 39
gagctagcag tattaattaa ccaccatgac tgtggagaag gag 43
<210> 40
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DC-SIGN 正向引物
<400> 40
ctggctagcg tttaaactta agcatgagtg actccaagga accaag 46
<210> 41
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DC-SIGN 反向引物
<400> 41
ctagactcga gcggccctac gcaggagggg g 31
<210> 42
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DC-SIGN 骨架质粒正向引物
<400> 42
gcttaagttt aaacgctagc c 21
<210> 43
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DC-SIGN 骨架质粒反向引物
<400> 43
ggccgctcga gtctagag 18
<210> 44
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DC-SIGN pcDNA5 正向引物
<400> 44
ctggctagcg tttaaactta agcatgagtg actccaagga accaag 46
<210> 45
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DC-SIGN pcDNA5 反向引物
<400> 45
gtgatggtga tgatgaccta cgcaggaggg gggtt 35
<210> 46
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DC-SIGN pcDNA5 骨架质粒正向引物
<400> 46
gcttaagttt aaacgctagc c 21
<210> 47
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DC-SIGN pcDNA5 骨架质粒反向引物
<400> 47
gtcatcatca ccatcacc 18
<210> 48
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DC-SIGN RP172 正向引物
<400> 48
ctggctagcg tttaaactta ag 22
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DC-SIGN RP172 反向引物
<400> 49
caatggtgat ggtgatgatg 20
<210> 50
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DC-SIGN RP172 骨架质粒正向引物
<400> 50
gagctagcag tattaattaa ccaccctggc tagcgtttaa acttaag 47
<210> 51
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DC-SIGN RP172 骨架质粒反向引物
<400> 51
gtaccggtta ggatgcatgc caatggtgat ggtgatgatg 40
<210> 52
<211> 1331
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 含StreptagII和TEV位点的DC-SIGN的密码子优化序列
<400> 52
gaattcgtac aagaaagctg ggtctagatg agcgatagca aagaaccgcg tctgcaacag 60
ctgggcctgc tggaagagga acagctgcgt ggtctgggtt ttcgtcagac ccgtggttat 120
aaaagcctgg caggttgtct gggtcatggt ccgctggttc tgcaactgct gagctttacc 180
ctgctggcag gtctgctggt tcaggttagc aaagttccga gcagcattag ccaagaacag 240
agccgtcagg atgcaattta tcagaatctg acacagctga aagcagcagt tggtgaactg 300
agcgaaaaaa gcaaactgca agaaatctat caagagctga cccaactgaa agctgccgtg 360
ggcgaactgc cggaaaaatc aaaactgcaa gagatttacc aagaactgac acgtctgaaa 420
gctgcggtag gtgagctgcc tgagaaaagt aaactgcaag agatctatca agaactgacg 480
tggctgaaag ccgctgtcgg agaactgcca gagaaaagca aaatgcaaga aatttaccaa 540
gagctgactc gcctgaaagc agctgttggg gagctgccgg aaaaaagcaa acaacaagag 600
atttatcaag agctgacccg tctgaaagcc gcagtcggcg aactgcctga aaaatctaaa 660
caacaagaaa tctaccaaga actgacgcgt ctgaaagcag ccgttggaga actgccagaa 720
aaaagtaaac agcaagagat ctaccaagag ctgactcagc tgaaagccgc agttgaacgt 780
ctgtgtcatc cgtgtccgtg ggaatggacc ttttttcagg gtaattgcta tttcatgagc 840
aatagccagc gtaattggca tgatagcatt accgcatgta aagaagttgg cgcacagctg 900
gttgtgatta aaagcgcaga agaacagaat ttcctgcaac tgcaaagcag tcgtagcaat 960
cgttttacct ggatgggtct gagcgatctg aatcaagagg gcacctggca gtgggttgat 1020
ggtagtccgc tgctgccgag ctttaaacag tattggaatc gtggtgaacc gaataatgtt 1080
ggtgaagaag attgcgcaga atttagcggt aatggttgga atgatgataa atgcaacctg 1140
gccaaattct ggatctgtaa aaaaagtgca gcaagctgta gccgtgatga agaacagttt 1200
ctgagtccgg caccggcaac cccgaatccg cctccggcaa caggtgaaaa tctgtatttt 1260
cagggcacag gttggagcca tccgcagttt gaaaaatgat aaactagtag cctgcttttt 1320
tgtacctgca g 1331
<210> 53
<211> 83
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DC-SIGN细胞外结构域(ECD) - 正向引物
<400> 53
gccgcctcta gagagtaata cgactcacta tagggactag agaaagagga gaaaactaga 60
tggccaaagt tccgagcagc att 83
<210> 54
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DC-SIGN细胞外结构域(ECD) - 反向引物
<400> 54
ggcggcctgc aggtacaaaa aagcaggcta ctagt 35
<210> 55
<211> 85
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DC-SIGN碳水化合物识别结构域(CRD) - 正向引物
<400> 55
ccgcctctag aggagtaata cgactcacta tagggactag agaaagagga gaaaactaga 60
tggctgaacg tctgtgtcat ccgtg 85
<210> 56
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DC-SIGN碳水化合物识别结构域(CRD) - 反向引物
<400> 56
ggcggcctgc aggtacaaaa aagcaggcta ctagt 35
<210> 57
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mLangerin 正向引物
<400> 57
ctggctagcg tttaaactta agcatgccag aggcagagat gaag 44
<210> 58
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mLangerin 反向引物
<400> 58
ctagactcga gcggcctcat tcagttgttt ggacg 35
<210> 59
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mLangerin 骨架质粒正向引物
<400> 59
gcttaagttt aaacgctagc c 21
<210> 60
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mLangerin 骨架质粒反向引物
<400> 60
ggccgctcga gtctagag 18
<210> 61
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mLangerin pcDNA5 正向引物
<400> 61
ctggctagcg tttaaactta agcatgccag aggcagagat gaag 44
<210> 62
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mLangerin pcDNA5 反向引物
<400> 62
gtgatggtga tgatgactca ttcagttgtt tggacg 36
<210> 63
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mLangerin pcDNA5 骨架质粒正向引物
<400> 63
gcttaagttt aaacgctagc c 21
<210> 64
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mLangerin pcDNA5 骨架质粒正向引物
<400> 64
gtcatcatca ccatcacc 18
<210> 65
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mLangerin RP172 正向引物
<400> 65
ctggctagcg tttaaactta ag 22
<210> 66
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mLangerin RP172 反向引物
<400> 66
caatggtgat ggtgatgatg 20
<210> 67
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mLangerin RP172 骨架质粒正向引物
<400> 67
gagctagcag tattaattaa ccaccctggc tagcgtttaa acttaag 47
<210> 68
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mLangerin RP172 骨架质粒反向引物
<400> 68
gtaccggtta ggatgcatgc caatggtgat ggtgatgatg 40
<210> 69
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mDectin-1 正向引物
<400> 69
tagcgtttaa acttaagcat gaaatatcac tctcatatag agaatc 46
<210> 70
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mDectin-1 反向引物
<400> 70
tagactcgag cggccttaca gttccttctc acagatac 38
<210> 71
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mDectin-1 骨架质粒正向引物
<400> 71
gcttaagttt aaacgctagc c 21
<210> 72
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mDectin-1 骨架质粒反向引物
<400> 72
ggccgctcga gtctagag 18
<210> 73
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mDectin-1 pcDNA5 正向引物
<400> 73
tagcgtttaa acttaagcat gaaatatcac tctcatatag agaatc 46
<210> 74
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mDectin-1 pcDNA5 反向引物
<400> 74
gtgatggtga tgatgactta cagttccttc tcacagatac 40
<210> 75
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mDectin-1 pcDNA5 骨架质粒 正向
<400> 75
gcttaagttt aaacgctagc c 21
<210> 76
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mDectin-1 pcDNA5 骨架质粒 反向
<400> 76
gtcatcatca ccatcacc 18
<210> 77
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mDectin-1 RP172 正向引物
<400> 77
ctggctagcg tttaaactta ag 22
<210> 78
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mDectin-1 RP172 反向引物
<400> 78
caatggtgat ggtgatgatg 20
<210> 79
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mDectin-1 RP172 骨架质粒正向引物
<400> 79
gagctagcag tattaattaa ccaccctggc tagcgtttaa acttaag 47
<210> 80
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mDectin-1 RP172 骨架质粒反向引物
<400> 80
gtaccggtta ggatgcatgc caatggtgat ggtgatgatg 40
<210> 81
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于载体的两亲性肽
<400> 81
Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu Ile Ser Trp Ile Lys Arg Lys
1 5 10 15
Arg Gln Gln
<210> 82
<211> 240
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的GFP
<400> 82
Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu
1 5 10 15
Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly
20 25 30
Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile
35 40 45
Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr
50 55 60
Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys
65 70 75 80
Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu
85 90 95
Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu
100 105 110
Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly
115 120 125
Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr
130 135 140
Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn
145 150 155 160
Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser
165 170 175
Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly
180 185 190
Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu
195 200 205
Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe
210 215 220
Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Ala
225 230 235 240

Claims (62)

1.用于特异性分子靶向Langerin+细胞的介质在将靶向的运载物递送至Langerin+细胞中的用途，其中所述介质能够与Langerin+细胞特异性结合，所述介质包含(a)至少一种载体和(b)至少一种通式(I)的缀合物
Figure FDA0002687448120000011
其中
(i)R独立地选自：
取代或未取代的烷基、烯基、炔基、环烷基、C1-C8烷基环烷基、芳基、C1-C8烷基芳基、杂芳基、C1-C8烷基杂芳基、联芳基和C1-C8烷基联芳基；
其中取代基独立地选自：
-N(Ra)(Rb)，-ORa，-SRa，-C(O)Ra，-C(O)ORa，-C(O)N(Ra)(Rb)，-N(Ra)C(O)Rb，-N(Ra)S(O)2Rb，-OS(O)2Ra，卤素，-NO2，-CN，-NC，-N3，-NCO，-OCN，-NCS，-SCN，取代或未取代的烷基、烯基、炔基、芳基和杂芳基；
其中Ra和Rb独立地选自：氢，取代或未取代的C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基、C3-6环烷基、芳基-C1-5烷基、杂芳基-C1-5烷基、芳基、杂芳基；
(ii)R’独立地选自：
-ORa和-NHS(O)2Ra，
其中Ra如上定义；
(iii)A-D-B-L是接头基团，其将式(I)的葡萄糖衍生物与所述载体或与所述载体的一部分共价结合。
2.根据权利要求1所述的用途，其中R’是-OH、-OCH3、-OCH2CH3或-NHS(O)2Ra。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其中R’是-OH或-NHS(O)2Ra。
4.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中R’是–OH、-NHS(O)2CH3或N-甲苯磺酰基。
5.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中R’是-OH。
6.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中R独立地选自：
取代或未取代的烷基、环烷基、C1-C8烷基环烷基、芳基、C1-C8烷基芳基、杂芳基、C1-C8烷基杂芳基、联芳基和C1-C8烷基联芳基。
7.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中R独立地选自：
取代或未取代的C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C1-C3烷基C3-C6环烷基、C6-C14芳基、C1-C3烷基C6-C14芳基、杂芳基、C1-C3烷基杂芳基、联芳基和C1-C3烷基联芳基。
8.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中R独立地选自：
取代或未取代的环己基、苯基、苄基、联苯基、吡啶基和噁唑基。
9.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中R是取代或未取代的苯基。
10.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中R的取代基独立地选自：
-N(Ra)(Rb)，-ORa，-SRa,-C(O)Ra，-C(O)ORa，-C(O)N(Ra)(Rb)，-N(Ra)C(O)Rb，-N(Ra)S(O)2Rb，-OS(O)2Ra，卤素，-NO2，-CN，-NC，-N3，-NCO，-OCN，-NCS，-SCN，取代或未取代的烷基、烯基、炔基、芳基和杂芳基，
其中Ra和Rb独立地选自氢和C1-2烷基。
11.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中R的取代基独立地选自：
-NH2，-OH，-OCH3，-C(O)CH3，-NHC(O)CH3，-F，-Cl，-Br，-NO2，-CN，C1-C4烷基和苯基。
12.根据权利要求9所述的用途，其中所述苯基是单取代的、二取代的或三取代的，并且所述苯基的取代基独立地选自：
-NH2，-OH，-OCH3，-C(O)CH3，C(O)NH2，-C(O)NHCH3，-CH2OH，-NHC(O)CH3，-F，-Cl，-Br，-NO2，-CN，C1-C4烷基，萘基和苯基。
13.根据权利要求9所述的用途，其中所述苯基在对位单取代，并且所述苯基的取代基独立地选自：
-NHC(O)CH3，-CN，-CH3，-F，-C(O)NH2，-NH2，-C(O)NHCH3，-CH2OH和苯基。
14.根据权利要求12所述的用途，其中所述缀合物是下面式(I-1)或式(I-2)的缀合物：
Figure FDA0002687448120000031
15.根据权利要求12所述的用途，其中所述缀合物是下面式(I-3)至式(I-15)中任一个的缀合物：
Figure FDA0002687448120000032
Figure FDA0002687448120000041
16.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中所述A-D-B-L接头基团是由间隔基A-D-B和连接葡萄糖衍生物与载体的接头L组成的基团。
17.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中所述接头L包含合成聚合物或天然聚合物中的一种或多种，或者这些聚合物的一种或多种单个单元，或其组合。
18.根据权利要求17所述的用途，其中所述合成聚合物选自：饱和和不饱和烃聚合物；聚胺；聚酰胺；聚酯；聚醚，聚乙二醇，聚丙二醇；嵌段共聚物，泊洛沙姆。
19.根据权利要求17所述的用途，其中所述天然聚合物选自碳水化合物、修饰的碳水化合物、肽、修饰的肽、脂质和修饰的脂质。
20.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中
D是与通式(D-1)的A和B连接的间隔基，
A-(CH2)c-(CH2-O)c1-(CH2-CH2-O)c2-(CH2)c3-B (D-1)，
其中
D通过B与接头L连接，其中B选自：
-O-，-S-，-C(Rc1)(Rc2)-，-S-S-，-N(Rc1)-，-C(O)-，-C(Rc1)＝N-，-N＝N-，-OC(O)-，-C(O)O-，-C(O)N(Rc1)-，-N(Rc1)C(O)-，-N(Rc1)C(O)N(Rc2)-，-N(Rc1)C(S)N(Rc2)-，-N(Rc1)C(O)O-，-OC(O)N(Rc1)-，-环己烯-和-三唑-；
其中Rc1和Rc2独立地选自：氢，取代或未取代的烷基、烯基、环烷基、C1-C8烷基环烷基、芳基、C1-C8烷基芳基、杂芳基和C1-C8烷基杂芳基；
D通过A与葡萄糖衍生物连接，其中A选自：-O-，-CH2-，-S-，-NH-，-NHC(O)-，-OC(O)-，-环己烯-和-三唑-；
c是选自0至20的整数，c1是选自0至20的整数，以及c2是选自0至20的整数，c3是选自1至20的整数，如果A是-CH2-，则c3是选自0至20的整数。
21.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中所述接头L是下面通式(L-1)的接头
Figure FDA0002687448120000051
其中
U1是通过B与间隔基V连接的基团，其中U1选自-CH2-、-CH＝CH-或-C≡C-；
Z1是将所述接头与所述载体结合的部分，选自：-O-，-S-，-N(Rd)-，-C(Rd)(Re)-，-RdC＝CRe-，-C(O)-，-C(O)O-，-OC(O)-，-C(O)S-，-C(O)N(Rd)-，-N(Rd)C(O)-，-N(Rd)C(O)N(Re)-，-N(Rd)C(S)N(Re)-，-N(Rd)C(O)O-，-OC(O)N(Rd)-，-环己烯-，-三唑-，-NHS(O)2-，-S(O)2-，-OP(O)(H)O-，或-OP(O)(OH)O；
其中Rd和Re独立地选自：氢，取代或未取代的C1-32烷基、C2-32烯基、C3-8环烷基、芳基、C1-C8烷基芳基、杂芳基、C1-C8烷基杂芳基；并且
d1至d5各自是0至50的整数，d6是1至50的整数。
22.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中所述A-D-B-L接头基团是主链中所含的碳原子、氮原子和氧原子总数为至少4的分子链。
23.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中所述A-D-B-L接头基团是主链中所含的碳原子、氮原子和氧原子总数在4个原子至600个原子之间的分子链。
24.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中所述A-D-B-L接头基团是主链的长度在约0.4nm至约400nm之间的分子链。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的用途，其中所述至少一种载体是软粒子。
26.根据权利要求25所述的用途，其中所述软粒子选自脂质体、niosome、胶束、sequessomeTM和传递体，并且其中所述缀合物通过Z1直接与所述软粒子的一部分结合，其中所述软粒子的一部分是：脂质，修饰的脂质例如sequessome或传递体、磷脂、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油酰基-3-磷酸乙醇胺(DSPE)，膜脂质，修饰的磷脂酰胆碱。
27.根据权利要求26所述的用途，其中所述缀合物与软粒子载体的一部分结合，从而产生下式(II)：
Figure FDA0002687448120000061
其中n是0至150的整数。
28.根据权利要求1至24中任一项所述的用途，其中至少一种载体选自纳米粒子、肽、蛋白质、毒素、树枝状聚合物、富勒烯和碳纳米管，其中所述缀合物通过Z1直接与所述载体结合，或其中所述缀合物通过Z1与所述载体另外的间隔元件键合。
29.根据权利要求28所述的用途，其中所述另外的间隔元件是天然聚合物或合成聚合物。
30.根据权利要求26或27所述的用途，其中所述脂质体是双层磷脂脂质体，优选尺寸为30nm至250nm。
31.根据权利要求26或27或30所述的用途，其中所述脂质体包含附加组分例如胆固醇，优选的量约20mol％至50mol％，更优选的量约40mol％。
32.根据权利要求28所述的用途，其中所述纳米粒子是金纳米粒子、银纳米粒子或铁纳米粒子，优选尺寸为5nm至1000nm。
33.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中所述载体包含运载物或与运载物缔合。
34.根据权利要求33所述的用途，其中所述运载物位于所述载体内和/或与所述载体的外部联接和/或整合在所述载体的单层或双层结构中。
35.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中所述的特异性分子靶向包括所述缀合物和存在于Langerin+细胞上的受体之间的相互作用。
36.根据权利要求35所述的用途，其中存在于树突细胞上的所述受体是C型凝集素受体(CLR)Langerin(CD207)。
37.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中所述介质与树突细胞的所述特异性结合是基于在基于细胞的测定中以比对照高至少2倍、4倍、8倍或16倍的特异性与C型凝集素受体(CLR)Langerin(CD207)结合，所述基于细胞的测定包括在相同条件下将脂质体引入呈递重组Langerin的Raji B细胞、呈递重组DC-SIGN的Raji B细胞(对照1)和不呈递C型凝集素受体的Raji野生型B细胞(WT，对照2)。
38.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中通过动态光散射(DLS)测量，所述介质的平均尺寸为2nm至1000nm。
39.组合物将靶向的运载物递送至Langerin+细胞中的用途，所述组合物包含至少一种权利要求1至38中任一项所述的特异性分子靶向Langerin+细胞的介质，所述介质包含权利要求33或34所述的运载物或与所述运载物缔合，以及添加剂。
40.根据权利要求39所述的用途，其中所述添加剂是：二价离子、优选Ca2+或Zn2+，佐剂，或促进与C型凝集素受体(CLR)Langerin结合的因子。
41.根据权利要求39或40所述的用途，其中所述组合物还包含溶剂诸如H2O、蔗糖水溶液、磷酸盐缓冲盐水、tricine缓冲液、HEPES缓冲液或溶剂，诸如这些提到的任何溶剂与优选以10％浓度的DMSO的组合。
42.根据权利要求39至41中任一项所述的用途，其中所述组合物包含约1mol％至10mol％、优选约4mol％至6mol％、更优选4.75mol％至5mol％的量的权利要求1至38中任一项所述的缀合物。
43.用于将靶向的运载物递送至Langerin+细胞中的方法，所述方法包括使权利要求1至38中任一项所述的用于特异性分子靶向Langerin+细胞的介质或权利要求39至42中任一项所述的组合物与Langerin+树突细胞接触。
44.根据权利要求33至42中任一项所述的用途，或根据权利要求43所述的方法，其中所述运载物选自小分子、肽、蛋白质、细胞毒性物质、核酸、色素、染料、金属、放射性核素、病毒、修饰的病毒、病毒载体、接种物、质粒和/或多组分系统，所述多组分系统诸如包含不同组分的用于基因组编辑的系统，优选CRISPR/Cas系统。
45.根据权利要求33至42或44中任一项所述的用途，或根据权利要求43或44所述的方法，其中所述运载物是药物活性化合物或免疫活性化合物。
46.根据权利要求45所述的用途，其中所述药物活性化合物是细胞功能的抑制剂，诸如凋亡抑制剂。
47.根据权利要求45所述的用途，其中所述免疫活性化合物是(i)能够在体内引起免疫反应的化合物，(ii)免疫调节剂，或(iii)免疫耐受诱导剂。
48.根据权利要求33至42、44或45或47中任一项所述的用途，或根据权利要求43、44或45所述的方法，其中所述运载物包含以下、基本由以下组成或由以下组成：(i)癌症抗原或表位，或包含癌症抗原或表位，(ii)自身免疫性疾病抗原或表位，或包含自身免疫性疾病抗原或表位，(iii)细菌抗原或包含细菌抗原或表位，(iv)病毒抗原或包含病毒抗原或表位，(v)寄生虫抗原或包含寄生虫抗原或表位，或(vi)变应原、或变应原的表位、或包含变应原或变应原的表位。
49.一种药物组合物，其包含权利要求1至38、或44至48中任一项所述的介质，或权利要求39至42或44至48中任一项所述的组合物，其中所述载体包含药物活性运载物或与所述运载物缔合，以及任选的药学上可接受的载体物质或药物佐剂。
50.根据权利要求49所述的药物组合物，其中所述药物组合物适合于口服、静脉内、局部、角膜、鼻、皮下、皮内、经皮施用，适合于疫苗接种或适合于经毛囊施用。
51.根据权利要求49或50所述的药物组合物，其中所述药物组合物作为贴剂诸如纳米贴剂或水凝胶贴剂、液体、乳膏、软膏、糊剂、凝胶、洗剂、胶带、薄膜、舌下剂、颊含剂、片剂、喷雾剂、栓剂、疫苗或以微针的形式提供。
52.根据权利要求49至51中任一项所述的药物组合物，其通过医用装置诸如针头、疫苗接种枪、膏药或吸入器施用。
53.根据权利要求49至52中任一项所述的药物组合物，其用于治疗或预防癌症、自身免疫性疾病、细菌感染、病毒感染、寄生虫感染或移植物抗宿主病、局部或全身性炎症、变态反应、或用于减敏。
54.一种诊断组合物，其包含权利要求1至38或44至48中任一项所述的介质、或权利要求39至42或44至48中任一项所述的组合物，其中所述载体包含药物活性运载物或与所述运载物缔合，以及任选的药学上可接受的载体物质或药物佐剂。
55.根据权利要求54所述的诊断组合物，其用于诊断、检测、监测或预后癌症、自身免疫性疾病、细菌感染、病毒感染、寄生虫感染或移植物抗宿主病、局部或全身性炎症、或变态反应。
56.一种鉴定用于疾病的Langerin+树突细胞靶向疗法的合适剂量的方法，所述方法包括：(a)使Langerin+细胞群与能够被引入所述细胞的化合物接触，(b)确定所述化合物参入的细胞的数量；(c)通过优选在1-3天时间后比较化合物参入的细胞的数量和起始群体，任选通过另外将化合物参入的细胞的数量或它们的状态与观察到的文献结果相关联，来确定所述化合物的合适剂量。
57.一种医用试剂盒，其包含至少一种选自权利要求1至38或44至48中任一项所述的介质和/或权利要求39至42或44至48中任一项所述的组合物的元件，其中所述载体包含药物活性运载物或与所述运载物缔合，以及任选的带有说明书的印刷品。
58.一种疫苗，其包含权利要求1至38或44至48中任一项所述的介质、或权利要求39至42或44至48中任一项所述的组合物，其中所述载体包含接种体运载物或与接种体运载物缔合。
59.根据权利要求58所述的疫苗在治疗或预防癌症、自身免疫性疾病、细菌感染、病毒感染、寄生虫感染或移植物抗宿主病中的用途。
60.一种在对象中诱导对抗癌症、细菌感染、病毒感染的免疫应答的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗有效量的权利要求1至38或44至48中任一项所述的介质，其中所述载体包含药物活性运载物或与所述运载物缔合，权利要求39至42或44至48中任一项所述的组合物，其中所述载体包含药物活性运载物或与所述运载物缔合，根据权利要求49至53中任一项所述的药物组合物，或根据权利要求58和59中任一项所述的疫苗。
61.一种治疗或预防癌症、自身免疫性疾病、细菌感染、病毒感染、寄生虫感染或移植物抗宿主病、局部或全身性炎症、变态反应、或用于减敏的方法，所述方法包括向对象施用治疗有效量的权利要求1至38或44至48中任一项所述的介质，其中所述载体包含药物活性运载物或与所述运载物缔合，权利要求39至42或44至48中任一项所述的组合物，其中所述载体包含药物活性运载物或与所述运载物缔合，根据权利要求47至51中任一项所述的药物组合物，或根据权利要求58和59中任一项所述的疫苗。
62.根据权利要求60或61所述的方法，其中所述施用是口服、角膜、鼻、静脉、局部、皮下、皮内、经皮施用、疫苗接种或经毛囊施用。
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