CN112067591A - 基于氮掺杂石墨烯量子点荧光探针的鲜味氨基酸检测方法及探针 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于氮掺杂石墨烯量子点荧光探针的鲜味氨基酸检测方法,其包括以下步骤:步骤一,制备氮掺杂石墨烯量子点,按照7:6的比例取水合柠檬酸和尿素置于去离子水中,制得浓度为10‑50mg/mL的混合溶液,所述混合溶液再反应釜中,160℃水热反应4h;步骤二,构建氮掺杂石墨烯量子点荧光探针;步骤三,测定鲜味氨基酸的含量,将待测汤煲样品以水溶液形式与1mL浓度为100μg/mL的N‑GQDs溶液混合,测量其荧光发射光谱读取荧光值,其中,激发波长为355nm。本发明还提供了一种氮掺杂石墨烯量子点荧光探针。本发明具有操作简单快捷,结果准确的优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种氨基酸检测方法。更具体地说,本发明涉及一种基于氮掺杂石墨烯量子点荧光探针的鲜味氨基酸检测方法及氮掺杂石墨烯量子点荧光探针。
背景技术
鲜味是汤煲类产品最重要的品质指标之一,主要呈鲜物质是氨基酸类、核苷酸类、有机酸类、小分子肽类等。鲜味氨基酸(谷氨酸、天冬氨酸)是汤煲鲜味的主要来源,快速准确地检测汤煲中鲜味氨基酸,是汤煲品质控制非常重要的一环。
目前氨基酸常见检测方法是氨基酸分析仪和高效液相色谱,但是这两种方法存在预处理过程复杂,需要专门的检测人员,同时需要消耗大量有机溶剂等问题,因此,迫切需要开发一种检测成本低、操作简单、灵敏度高的谷氨酸和天冬氨酸定量检测方法,为快速鲜味评价提供依据。
随着碳基纳米材料的不断发展,石墨烯量子点(GQDs)因其易于控制、特殊的荧光发射特征等内在优势而发展迅速。氮原子掺杂能够调节GQDs的带隙并在导带附近产生大量局部能级,实现量子产率、荧光强度的显著提高,因此开发一种简易、易于控制的方法且具有高性能的N-GQDs对于实际应用而言具有非常重要的意义。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题,并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种基于氮掺杂石墨烯量子点荧光探针的鲜味氨基酸检测方法,其能够快速简便地制备线性范围广、灵敏度高、特异性好的氮掺杂石墨烯量子点(N-GQDs)探针,快速精确的对汤煲中鲜味氨基酸进行定量检测。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点,提供了一种基于氮掺杂石墨烯量子点荧光探针的鲜味氨基酸检测方法,其包括以下步骤:
步骤一,制备氮掺杂石墨烯量子点,按照7:6的比例取水合柠檬酸和尿素置于去离子水中,制得浓度为10-50mg/mL的混合溶液,所述混合溶液再反应釜中,160℃水热反应4h后,经冷却、透析纯化以及冷冻干燥后即可;
步骤二,构建氮掺杂石墨烯量子点荧光探针,取氮掺杂石墨烯量子点粉末溶于水制得浓度为100μg/mL的N-GQDs(氮掺杂石墨烯量子点)溶液;
步骤三,测定鲜味氨基酸的含量,将待测汤煲样品以水溶液形式与1mL浓度为100μg/mL的N-GQDs溶液混合,测量其荧光发射光谱读取荧光值,其中,激发波长为355nm。
优选的是,所述步骤三还包括建立谷氨酸和天冬氨酸标准曲线,具体步骤为:室温下,将1mL 100μg/mL的N-GQDs溶液分别与1mL预定浓度梯度的谷氨酸或天冬氨酸溶液,在355nm激发下测量荧光发射光谱,读取梯度荧光值,建立浓度与梯度荧光值变化的标准曲线特异性检测;其中,所述预定浓度梯度为5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL以及400μg/mL。
优选的是,所述步骤三还包括:将所得荧光值代入步骤四中所得标准曲线,计算出样品中谷氨酸含量和天冬氨酸含量。
优选的是,所述步骤二中构建氮掺杂石墨烯量子点荧光探针的具体步骤为:室温下,取1mL 100μg/mL的N-GQDs溶液和1mL氨基酸溶液以及缓冲液在10mL的离心管混合,室温孵育40min后,将混合溶液转移到一个200μL的石英比色皿中即得。
优选的是,所述缓冲液为pH=7的超纯水。本发明针对酸性氨基酸尤其是谷氨酸及天冬氨酸进行特异性检测。在制备所述氮掺杂石墨烯量子点荧光探针过程中,无需进行PH值的调整,大大降低了制备难度,提高了检测效率。
优选的是,所述透析纯化选用MW=1000Da的透析膜,透析时间为8h。所述透析纯化的目的是去除未反应的反应物和过量的反应物。
本发明还提供了一种用于检测鲜味氨基酸的氮掺杂石墨烯量子点荧光探针,其通过以下方法制备:
步骤一,制备氮掺杂石墨烯量子点,按照7:6的比例取水合柠檬酸和尿素置于去离子水中,制得浓度为10-50mg/mL的混合溶液,所述混合溶液再反应釜中,160℃水热反应4h后,经冷却、透析纯化以及冷冻干燥后即可;
步骤二,构建氮掺杂石墨烯量子点荧光探针,取氮掺杂石墨烯量子点粉末溶于水制得浓度为100μg/mL的N-GQDs(氮掺杂石墨烯量子点)溶液;室温下,取1mL 100μg/mL的N-GQDs溶液和1mL氨基酸溶液以及缓冲液在10mL的离心管混合,室温下孵育40min即得。
其中,所述缓冲液为pH=7的超纯水。
本发明至少包括以下有益效果:本发明利用成本低廉的水合柠檬酸和尿素作为反应前体,采用一步水热法和简单的设备合成氮掺杂石墨烯量子点(N-GQDs),制备步骤简单,无需进行PH值的调整。本发明对所述氮掺杂石墨烯量子点(N-GQDs)的形貌、结构等理化性质和光学性质等方面进行表征,证明所述氮掺杂石墨烯量子点(N-GQDs)探针具有线性范围广(2.5~400μg/mL)、灵敏度高、特异性好的优点。本发明还开发了基于N-GQDs的鲜味氨基酸快速荧光探针检测技术,并与高效液相色谱检测方法作为对照,对实际不同加工工艺的汤煲样品进行鲜味氨基酸定量检测,为鲜味评价提供了一个新的方法。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现,部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明其中一个实施例所述氮掺杂石墨烯量子点(N-GQDs)的电镜图;
图2为本发明其中一个实施例所述氮掺杂石墨烯量子点(N-GQDs)的粒径分析曲线图;
图3为本发明其中一个实施例所述氮掺杂石墨烯量子点(N-GQDs)的红外光谱图;
图4为本发明其中一个实施例所述氮掺杂石墨烯量子点(N-GQDs)的XRD图;
图5为本发明其中一个实施例所述氮掺杂石墨烯量子点(N-GQDs)的UV-vis谱图;
图6为本发明其中一个实施例所述氮掺杂石墨烯量子点(N-GQDs)的荧光发射光谱图;
图7为本发明其中一个实施例所述氮掺杂石墨烯量子点(N-GQDs)在不同NaCl浓度下的荧光强度;
图8为本发明各实施例所述氮掺杂石墨烯量子点(N-GQDs)在不同激发波长下的荧光强度曲线图;
图9为本发明其中一个实施例所述氮掺杂石墨烯量子点(N-GQDs)检测天冬氨酸的标准曲线图;
图10为本发明其中一个实施例所述氮掺杂石墨烯量子点(N-GQDs)检测谷氨酸的标准曲线图;
图11为本发明其中一个实施例中利用肉品中常见15种氨基酸对谷氨酸和天冬氨酸检测的干扰检测图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明,以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解,本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
本发明提供一种基于氮掺杂石墨烯量子点荧光探针的鲜味氨基酸检测方法,其包括以下步骤:
步骤一,制备氮掺杂石墨烯量子点,按照7:6的比例取水合柠檬酸和尿素置于去离子水中,制得浓度为10-50mg/mL的混合溶液,所述混合溶液再反应釜中,160℃水热反应4h后,经冷却、透析纯化以及冷冻干燥后即可;
步骤二,构建氮掺杂石墨烯量子点荧光探针,取氮掺杂石墨烯量子点粉末溶于水制得浓度为100μg/mL的N-GQDs(氮掺杂石墨烯量子点)溶液;
步骤三,测定鲜味氨基酸的含量,将待测汤煲样品以水溶液形式与1mL浓度为100μg/mL的N-GQDs溶液混合,测量其荧光发射光谱读取荧光值,其中,激发波长为355nm。
在其中一个实施例中,所述步骤三还包括建立谷氨酸和天冬氨酸标准曲线,具体步骤为:室温下,将1mL 100μg/mL的N-GQDs溶液分别与1mL预定浓度梯度的谷氨酸或天冬氨酸溶液,在355nm激发下测量荧光发射光谱,读取梯度荧光值,建立浓度与梯度荧光值变化的标准曲线特异性检测;其中,所述预定浓度梯度为5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL以及400μg/mL。
在其中一个实施例中,所述步骤三还包括:将所得荧光值代入步骤四中所得标准曲线,计算出样品中谷氨酸含量和天冬氨酸含量。
在其中一个实施例中,所述步骤二中构建氮掺杂石墨烯量子点荧光探针的具体步骤为:室温下,取1mL 100μg/mL的N-GQDs溶液和1mL氨基酸溶液以及缓冲液在10mL的离心管混合,室温孵育40min后,将混合溶液转移到一个200μL的石英比色皿中即得。
在其中一个实施例中,所述缓冲液为pH=7的超纯水。
在其中一个实施例中,所述透析纯化选用MW=1000Da的透析膜,透析时间为8h。
本发明还提供了一种用于检测鲜味氨基酸的氮掺杂石墨烯量子点荧光探针,其通过以下方法制备:
步骤一,制备氮掺杂石墨烯量子点,按照7:6的比例取水合柠檬酸和尿素置于去离子水中,制得浓度为10-50mg/mL的混合溶液,所述混合溶液再反应釜中,160℃水热反应4h后,经冷却、透析纯化以及冷冻干燥后即可;
步骤二,构建氮掺杂石墨烯量子点荧光探针,取氮掺杂石墨烯量子点粉末溶于水制得浓度为100μg/mL的N-GQDs(氮掺杂石墨烯量子点)溶液;室温下,取1mL 100μg/mL的N-GQDs溶液和1mL氨基酸溶液以及缓冲液在10mL的离心管混合,室温下孵育40min即得。其中,所述缓冲液为pH=7的超纯水。
本发明其中一个实施例中,将氮掺杂石墨烯量子点粉末溶于水,采用透射电镜、拉曼光谱、傅里叶红外光谱、X射线衍射、X射线光电子能谱进行形态表征。包括以下几个方面:
1,TEM与粒径分析
1.1使用HITACHI H-7650(HITACHI,日本)透射电镜与NICOMP ZX-54(NICOMP,美国),投射电镜加速电压为80kV。由图1和图2可知,本发明所述氮掺杂石墨烯量子点(N-GQDs)的分散性良好,粒径分布均匀,平均粒径5nm。
1.2红外光谱实验
采用傅立叶变换红光谱仪(Nicolet 5700,美国Thermo公司),检测范围是4000cm-1到500cm-1。由图3可知,N-GQDs在3187cm-1和776cm-1处出现两个峰值,这是由于C-H键的拉伸振动引起的。同时,1316cm-1和1377cm-1处的峰值为C-N键振动带,2831cm-1和2996cm-1为O-H键的拉伸振动,证明本发明所述氮掺杂石墨烯量子点(N-GQDs)的成功制备。
1.3X-射线衍射(XRD)分析
使用X-射线衍射仪(D/max 2500/PC,日本)对所述氮掺杂石墨烯量子点进行X射线衍射光谱分析。如图4所示,2θ=25~30°的位置有一宽衍射峰,与石墨面的的衍射结果相似,表明本发明制备的所述氮掺杂石墨烯量子点(N-GQDs)具有石墨烯的片状结构。
2N-GQDs光学性质表征
2.1紫外可见吸收光谱(UV-vis)和荧光发射光谱
图5示出了本发明所述氮掺杂石墨烯量子点(N-GQDs)的UV-vis图谱,图中位于230nm和340nm处的吸收峰,分别是由C=C的π-π*跃迁和C=O的n-π*跃迁形成的。图6示出了本发明所述氮掺杂石墨烯量子点(N-GQDs)的荧光发射光谱图,如图6所示,所述氮掺杂石墨烯量子点(N-GQDs)在λex=355nm时,445nm处荧光信号最大,与文献有相类似的结果,其中内置图为N-GQDs溶液在该激发波长下的照片,呈蓝色。
2.2N-GQDs的荧光稳定性
为了研究N-GQDs的荧光稳定性,本发明利用不同NaCl浓度对N-GQDs荧光强度进行离子强度影响实验。结果如图7所示,在NaCl浓度为0-4mol/L范围内,荧光强度没有明显的变化,说明本发明所述氮掺杂石墨烯量子点(N-GQDs)具有良好的荧光稳定性。
2.3荧光量子产率和荧光寿命
本发明利用Fluoromax-4荧光光谱仪检测本发明所述氮掺杂石墨烯量子点(N-GQDs)的绝对量子产率和荧光寿命。其中,绝对量子产率为38%,荧光性能相对较好。本发明所述氮掺杂石墨烯量子点(N-GQDs)的荧光寿命为7.55ns,当溶液中谷氨酸的浓度依次为20、50、100、200μg/mL时,对应荧光寿命分别为7.67、7.62、7.48、7.24ns,变化不明显,可以认为谷氨酸使N-GQDs荧光猝灭为静态猝灭。天冬氨酸实验现象相同,猝灭机理相同。
实施例1
本发明所述基于氮掺杂石墨烯量子点荧光探针的鲜味氨基酸检测方法包括以下步骤:
步骤一,制备氮掺杂石墨烯量子点,取1.4g水合柠檬酸和1.2g尿素置于100mL的去离子水中,持续搅拌溶解。随后转移至反应釜中,160℃水热反应4h。冷却后,透析8h纯化(MW=1000Da),将得到的产品真空冷冻干燥,获得氮掺杂石墨烯量子点粉末。
步骤二,构建氮掺杂石墨烯量子点荧光探针,取氮掺杂石墨烯量子点粉末溶于水制得浓度为100μg/mL的氮掺杂石墨烯量子点(N-GQDs)溶液;
步骤三,测定鲜味氨基酸的含量,建立谷氨酸和天冬氨酸标准曲线,具体步骤为:在室温下分别将1mL 100μg/mL的氮掺杂石墨烯量子点(N-GQDs)溶液与1mL不同浓度的谷氨酸或天冬氨酸(5μg/mL,10μg/mL,20μg/mL,50μg/mL,100μg/mL,200μg/mL,400μg/mL)在355nm激发光下测量荧光发射光谱。将所得数据建立浓度与荧光值变化的标准曲线,得到天冬氨酸检测的线性方程为I(nm)=1.5695c+5.1423(R2=0.9946),检出限为0.5802mg/mL,见图9。谷氨酸检测的线性方程为I(nm)=1.3258c+4.34288(R2=0.9951),检出限为0.6722mg/mL,见图10。
步骤四,将待测汤煲样品以水溶液形式与1mL浓度为100μg/mL的N-GQDs溶液混合,室温下在10mL的离心管混合,缓冲液为pH=7的超纯水。室温孵育40min后,将混合物转移到一个200μL的石英比色皿中,在355nm激发下测量荧光发射光谱。
实施例2
本发明所述基于氮掺杂石墨烯量子点荧光探针的鲜味氨基酸检测方法,制备步骤同实施例1,其中激发波长为350nm。
实施例3
本发明所述基于氮掺杂石墨烯量子点荧光探针的鲜味氨基酸检测方法,制备步骤同实施例1,其中激发波长为355nm。
实施例4
本发明所述基于氮掺杂石墨烯量子点荧光探针的鲜味氨基酸检测方法,制备步骤同实施例1,其中激发波长为360nm。
实施例5
本发明所述基于氮掺杂石墨烯量子点荧光探针的鲜味氨基酸检测方法,制备步骤同实施例1,其中激发波长为365nm。
将上述实施例获得的荧光值绘制曲线图,结果如图8所示。从图8中可以看出,在激发波长范围从345~370nm范围内,荧光强度先增大后减小,在355nm处荧光强度
本发明还进行了所述氮掺杂石墨烯量子点荧光探针的孵化时间的测定,结果见图9,如图9所示,荧光信号强度在短时间内呈现迅速下降趋势,之后缓慢降低,在40min时荧光强度降至最低,最终保持平缓。因此本发明选择40min作为最优孵化时间。
验证试验,本发明利用分析仪器和本发明所述氮掺杂石墨烯量子点(N-GQDs)对汤煲样品进行分析,对比结果见下表:
所得数值均是每个样品平行五次测定得到,并取其平均值。
由上表可见:该荧光探针测得的数据是与分析仪器中测得的数据结果相吻合。这些数据均说明了该荧光探针具有潜在的实际应用价值。
本发明进一步对所述氮掺杂石墨烯量子点(N-GQDs)进行了干扰实验
选取汤煲中可能存在的15种氨基酸(谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、酪氨酸、精氨酸、脯氨酸、胱氨酸)进行分析,结果见图11。如图11所示,N-GQDs荧光探针对这些氨基酸的荧光猝灭能力远远小于谷氨酸、天冬氨酸,因此不会对谷氨酸、天冬氨酸的测定产生干扰,该荧光探针对谷氨酸和天冬氨酸具有良好的特异性检测能力。
尽管本发明的实施方案已公开如上,但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用,它完全可以被适用于各种适合本发明的领域,对于熟悉本领域的人员而言,可容易地实现另外的修改,因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下,本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
Claims (8)
1.基于氮掺杂石墨烯量子点荧光探针的鲜味氨基酸检测方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤一,制备氮掺杂石墨烯量子点,按照7:6的比例取水合柠檬酸和尿素置于去离子水中,制得浓度为10-50mg/mL的混合溶液,所述混合溶液再反应釜中,160℃水热反应4h后,经冷却、透析纯化以及冷冻干燥后即可;
步骤二,构建氮掺杂石墨烯量子点荧光探针,取氮掺杂石墨烯量子点粉末溶于水制得浓度为100μg/mL的N-GQDs(氮掺杂石墨烯量子点)溶液;
步骤三,测定鲜味氨基酸的含量,将待测汤煲样品以水溶液形式与1mL浓度为100μg/mL的N-GQDs溶液混合,测量其荧光发射光谱读取荧光值,其中,激发波长为355nm。
2.如权利要求1所述的基于氮掺杂石墨烯量子点荧光探针的鲜味氨基酸检测方法,其特征在于,所述步骤三还包括建立谷氨酸和天冬氨酸标准曲线,具体步骤为:室温下,将1mL100μg/mL的N-GQDs溶液分别与1mL预定浓度梯度的谷氨酸或天冬氨酸溶液,在355nm激发下测量荧光发射光谱,读取梯度荧光值,建立浓度与梯度荧光值变化的标准曲线特异性检测;其中,所述预定浓度梯度为5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL以及400μg/mL。
3.如权利要求2所述的基于氮掺杂石墨烯量子点荧光探针的鲜味氨基酸检测方法,其特征在于,所述步骤三还包括:将所得荧光值代入步骤四中所得标准曲线,计算出样品中谷氨酸含量和天冬氨酸含量。
4.如权利要求1所述的基于氮掺杂石墨烯量子点荧光探针的鲜味氨基酸检测方法,其特征在于,所述步骤二中构建氮掺杂石墨烯量子点荧光探针的具体步骤为:室温下,取1mL100μg/mL的N-GQDs溶液和1mL氨基酸溶液以及缓冲液在10mL的离心管混合,室温孵育40min后,将混合溶液转移到一个200μL的石英比色皿中即得。
5.如权利要求4所述的基于氮掺杂石墨烯量子点荧光探针的鲜味氨基酸检测方法,其特征在于,所述缓冲液为pH=7的超纯水。
6.如权利要求1所述的基于氮掺杂石墨烯量子点荧光探针的鲜味氨基酸检测方法,其特征在于,所述透析纯化选用MW=1000Da的透析膜,透析时间为8h。
7.一种用于检测鲜味氨基酸的氮掺杂石墨烯量子点荧光探针,其特征在于,通过以下方法制备:
步骤一,制备氮掺杂石墨烯量子点,按照7:6的比例取水合柠檬酸和尿素置于去离子水中,制得浓度为10-50mg/mL的混合溶液,所述混合溶液再反应釜中,160℃水热反应4h后,经冷却、透析纯化以及冷冻干燥后即可;
步骤二,构建氮掺杂石墨烯量子点荧光探针,取氮掺杂石墨烯量子点粉末溶于水制得浓度为100μg/mL的N-GQDs(氮掺杂石墨烯量子点)溶液;室温下,取1mL 100μg/mL的N-GQDs溶液和1mL氨基酸溶液以及缓冲液在10mL的离心管混合,室温下孵育40min即得。
8.如权利要求7所述的用于检测鲜味氨基酸的氮掺杂石墨烯量子点荧光探针,其特征在于:所述缓冲液为pH=7的超纯水。
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