CN112067532A - 测量微粒三维位移光轴向位置的复合式数字全息显微方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微粒三维位置监测的研究领域,尤其是测量微粒三维位移光轴向位置的复合式数字全息显微方法,本发明提供一种复合式数字全息显微方法,通过分析全息记录距离对微粒位移测量的影响,确定参量——临界记录距离,当记录距离在临界记录距离内时选用同轴数字全息显微技术,当记录距离超过临界记录距离时选用离轴数字全息显微技术,对微粒进行三维位移测量。这种方法能够充分利用同轴和离轴全息的优势,避其弊端,实现对微粒三维位移纳米级测量。
Description
技术领域
本发明涉及微粒三维位置监测的研究领域,尤其是测量微粒三维位移光轴向位置的复合式数字全息显微方法。
背景技术
固体和液体粒子,特别是微小粒子位移的检测在许多领域中存在重要的作用。如可应用于纳米颗粒的相互作用,细胞对环境的响应,以及微生物的粘附等研究中。
对于微粒动态行为研究中,需对微粒的实时三维位置尤其是轴向位置进行测量。在现有测量过程中多采用数字全息显微技术,其原理为采用数字全息显微镜记录物光和参考光想干形成的全息图,之后在通过数值重建全息图中被测物体的光场信息,继而可获得物体实时的三维坐标。
在实际的三维位移测量时,同轴数字全息显微技术测量信噪比高、分辨力高,但由于孪生像的影响导致不能测量聚焦像面附近的微粒位移;离轴数字全息显微技术不存在聚焦像面微粒的测量限制,但测量分辨力低于同轴数字全息显微技术。
因此,可设计一种集合两种方式优点的新的显微方式。该方式可通过对分析全息记录距离对微粒位移测量的影响确定一个参量,并将该参量与微粒的记录距离进行比较,进而选取适合的全息显微方法。应用这种方法能够充分利用同轴和离轴全息的优势,避其弊端,实现对微粒三维位移纳米级测量。
发明内容
本发明的目的在于填补现有技术的空白,提出一种复合式,根据参量选取适合的全息显微技术测量,确保测量准确性的测量微粒三维位移的复合式数字全息显微方法。
本发明采取的技术方案是:
测量微粒三维位移光轴向位置的复合式数字全息显微方法,其特征在于:包括如下步骤:
步骤1:对介质中相应直径的微粒进行光学成像模拟,形成光学成像示意图,并计算出射光线于光轴交点与微粒中心点的轴向距离;
步骤2:将介质中相应直径的微粒参数代入,生成微粒出射光线与光轴交点位置的概率密度曲线,将微粒的透射光线与光轴交点最密集点与微粒的距离设置为焦距f;
步骤3:将微粒视为透镜,以f为焦距,设置透镜的成像示意图,并在该透镜的成像示意图中建立坐标,在距离为z的平面处光场分布为D(u,v,z);
步骤4:计算微粒轴上强度为|DP(0,0,z)|2,建立微粒投射成像图即全息显微重构的强度图,并确定临界重构距离;
步骤5:将像方重构距离与临界重构距离进行比较,如像方重构距离大于临界重构距离,则采用同轴数字全息微粒轴向位移重构法计算微粒轴向位移;如像方重构距离不大于临界重构距离,则采用离轴数字全息显微技术测量微粒轴向位移。
进一步的,所述步骤1中,计算出射光线于光轴交点与微粒中心点的轴向距离,采用式1:
其中,r为微粒半径,d为入射光线与光轴间的垂直距离,nl为液态环境的折射率,np为微粒的折射率,laxis为出射光线于光轴交点与微粒中心点的轴向距离,根据折射定律,可以计算laxis。
进一步的,所述步骤2中,将介质中相应微粒的参数代入式1,得到不同入射角度光线出射时与光轴的交点位置,求取这些交点的概率密度,生成微粒出射光线与光轴交点位置的概率密度曲线,将微粒等效为透镜,因此,可将微粒的透射光线与光轴交点最密集点laxis设置为焦距f。
进一步的,所述步骤3中,以焦距f设置透镜的成像示意图,并在该透镜的成像示意图中建立坐标,其中透镜平面和成像光场平面坐标为(x,y,0)和(u,v,z),当复振幅为G(x,y)的光波被透镜聚焦,根据菲涅尔衍射原理,在距离为z的平面处光场分布为D(u,v,z)
微粒相对于照明光束,尺寸微小,因此照射微粒的光束可等效于平面波,而平面波照明透镜的轴上光场分布为
进一步的,所述步骤4中,计算微粒轴上强度为|DP(0,0,z)|2,建立微粒投射成像图即全息显微重构的强度图,并建立微粒轴上强度曲线模拟图,从强度图中提取微粒中心点的重构强度与微粒轴上强度曲线模拟图相吻合,定位微粒中心点重构强度曲线最大值,即轴上强度曲线最大值的轴向位置点,即可实现对微粒轴向位移的测量。
进一步的,所述步骤4中,在同轴数字全息显微技术中,重构强度图不仅包含微粒自身重构信息,还包含共轭像即孪生像的强度信息,孪生像面、重构像面以及全息记录面,选取轴上强度值在95%的置信区间内的z值,判断物方重构距离d≥(z-中心点重构强度曲线最大值)/2,则此时像方重构距离即为临界重构距离。
本发明的优点和积极效果是:
微粒属于透光的相位型物体。因此,本发明中,可将微粒视为一种特殊的光学元件——特型透镜。平行光照射到微粒在微粒内部发生折射、从微粒出射后成像,同轴数字全息显微重构的微粒强度像即为微粒作为透镜的光学成像。透射光线在出射微粒后发生会聚,会聚能量最高的轴上点即为微粒成像“焦点”,亦为光轴上的,同轴全息重构强度曲线的最高点。测量强度曲线最高点的位置变化量,实现轴向位移的测量。全息重构时,记录面和微粒所在平面之间的距离为记录距离。通过重构,可实现对微粒面的重构,重构的微粒面称为重构面。同轴全息显微中,如果记录面与重构面距离较近,与重构面相对于记录面对称的共轭面距离记录面也较近,导致共轭面的孪生像对重构像的强度混叠影响,使测量不准确;反之,如果记录距离较大,孪生像对重构像的影响可以忽略。
因此存在临界记录距离,当记录距离大于临界距离时,可利用同轴数字全息显微技术对微粒进行轴向位移测量,当记录距离小于临界距离时,需要选择离轴全息显微技术测量轴向位移,保证测量的准确性。
附图说明
图1为本发明中复合式全息显微方法的流程图;
图2为模拟微粒光学成像示意图;
图3为微粒出射光线与光轴交点位置的概率密度曲线示意图;
图4为透镜的成像示意图;
图5为微粒轴上强度曲线模拟图;
图6为孪生像面、重构像面以及全息记录面之间轴上强度;
图7为微粒内部透射光线图;
图8为多个纵向位置入射光线追迹图;
图9为图8中A-A截面的光线追迹图;
图10为图8中B-B截面的光线追迹图;
图11为各环带与微粒中心像素点之间的光程长差值;
图12为图11中环带7与微粒中心像素点光程长差值的二阶导数;
图13为应用三维位移的复合式数字全息显微方法的位移测试系统;
图14为大于临界重构距离状态的微粒全息图;
图15为图14中微粒全息图中微粒部分的局部放大图;
图16为去条纹化的全息图;
图17为图16中微粒全息图中微粒部分的局部放大图;
图18为微粒强度重构图;
图19为微粒中心点强度与像方重构距离的关系;
图20为微粒轴向位移(像方聚焦重构距离为29.5mm);
图21为小于临界重构距离状态的微粒全息图;
图22为环带像素光程长差二阶导数;
图23为微粒的轴向位移图。
具体实施方式
下面结合实施例,对本发明进一步说明,下述实施例是说明性的,不是限定性的,不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
测量微粒三维位移光轴向位置的复合式数字全息显微方法,本发明的创新在于,包括如下步骤:
步骤1:对介质中相应直径的微粒进行光学成像模拟,形成光学成像示意图,并计算出射光线于光轴交点与微粒中心点的轴向距离;
步骤2:将介质中相应直径的微粒参数代入,生成微粒出射光线与光轴交点位置的概率密度曲线,将微粒的透射光线与光轴交点最密集点与微粒的距离设置为焦距f;
步骤3:将微粒视为透镜,以f为焦距,设置透镜的成像示意图,并在该透镜的成像示意图中建立坐标,在距离为z的平面处光场分布为D(u,v,z);
步骤4:计算微粒轴上强度为|DP(0,0,z)|2,建立微粒投射成像图即全息显微重构的强度图,并确定临界重构距离;
步骤5:将像方重构距离与临界重构距离进行比较,如像方重构距离大于临界重构距离,则采用同轴数字全息微粒轴向位移重构法计算微粒轴向位移;如像方重构距离不大于临界重构距离,则采用离轴数字全息显微技术测量微粒轴向位移。
本发明将纯水中直径为5微米的二氧化硅微球作为实施例。
本实施例中,对水中直径为5微米的二氧化硅微球(SiO2,折射率n=1.5,半径r=2.5微米,介质为纯水n=1.33,照射光波长λ=670nm)的光学成像进行模拟,如图2所示:
所述步骤1中,计算出射光线于光轴交点与微粒中心点的轴向距离,采用式1:
其中,r为微粒半径,d为入射光线与光轴间的垂直距离,nl为液态环境的折射率,np为微粒的折射率,laxis为出射光线于光轴交点与微粒中心点的轴向距离,根据折射定律,可以计算laxis
本实施例中,所述步骤2中,将纯水中直径为5微米的二氧化硅微球的参数代入式1,得到不同入射角度光线出射时与光轴的交点位置,求取这些交点的概率密度如图3所示。生成微粒出射光线与光轴交点位置的概率密度曲线,将微粒等效为透镜,分析图3,可知微粒的透射光线与光轴交点最密集存在于laxis=10.69μm,因此将微粒等效于透镜时,其焦距f=10.69μm。
本实施例中,所述步骤3中,如图4所示,以焦距f设置透镜的成像示意图,并在该透镜的成像示意图中建立坐标,其中透镜平面和成像光场平面坐标为(x,y,0)和(u,v,z),当复振幅为G(x,y)的光波被透镜聚焦,根据菲涅尔衍射原理,在距离为z的平面处光场分布为D(u,v,z)
微粒相对于照明光束,尺寸微小,因此照射微粒的光束可等效于平面波,而平面波照明透镜的轴上光场分布为
本实施例中,所述步骤4中,计算微粒轴上强度为|DP(0,0,z)|2,如图5所示。建立微粒投射成像图即全息显微重构的强度图,并建立微粒轴上强度曲线模拟图,从强度图中提取微粒中心点的重构强度与微粒轴上强度曲线模拟图相吻合,定位微粒中心点重构强度曲线最大值,即轴上强度曲线最大值的轴向位置点,即可实现对微粒轴向位移的测量。
本实施例中,所述步骤4中,在同轴数字全息显微技术中,重构强度图不仅包含微粒自身重构信息,还包含共轭像即孪生像的强度信息,孪生像面、重构像面以及全息记录面,如图6所示。当z=19.9微米时,轴上强度值在95%置信区间内,(19.9-9.53)/2=5.19微米,物方重构距离d≥5.19μm,即像方重构距离15.6mm。此像方重构距离即为临界重构距离。
当重构距离小于临界重构距离,利用离轴数字全息显微技术测量微粒轴向位移时,在取得离轴全息图后,本实施例中采用环带像素光程长差分法计算微粒轴向位移。
如图7所示,为微粒内部透射光线图。设n1为周围介质的折射率,n2为微粒的折射率,r为微粒半径。进入微粒时,光线入射角为θ1,出射角为θ2。根据折射定律,
n1sinθ1=n2sinθ2 (5)
设出射光线经过点A(y,z),经过计算,可得
y(z)=-tan(2θ1-2θ2)[z-rcos(2θ2-θ1)]-rsin(2θ2-θ1) (6)
则任意出射点所对应的光程长值(从z=-r面开始计算)
根据公式(7)计算接收面上每一点的光程长值,可建立光电接收器件CCD接收面y-z面与OPL的矩阵。
公式(7)中,第二项随着θ1的增大而增大,第三项随着θ1的增大而减小,而第一项与y,z的值有关。在同一轴向位置,即z固定的情况下,若y取两个值y1和y2,OPL(z,y1)和OPL(z,y2)的大小相对关系随着z的变化而变化。因此分析光程长差值的变化规律,计算OPL(z,y1)-OPL(z,y2)与z之间的关系曲线,必存在拐点。当微粒在光轴方向发生位移时,拐点也发生同样的位移,计算重构相位所对应的光程长差值的变化可计算拐点的位移,确定微粒在轴向的位移。为更加凸显拐点,采用微粒中心像素点与微粒内部另一像素点,计算光程长的差值。
在模拟时,采用枚举的方式,将透射入每个像素点区域内的光线尽可能多地计算进平均化的光程长结果中,使得模拟的每个像素点的光程长值尽量接近真实值。考虑到微粒自身尺寸与CCD像素点尺寸接近,经过数十倍的放大,微粒占据CCD面像素个数仍然在两位数,环状计算可用带状计算代替。建立像素坐标系x-y-z,中心像素点标记为(0,0,z),满足|x|=n&|y|≤n或|y|=n&|x|≤n条件的所有像素点组成的环带标记为环带n。计算各环带与微粒中心像素点之间的光程长差值。枚举各点的光程长值为
设CCD像素尺寸为Δx×Δy,则环带n的光程长差值计算方法为
对文中实验样本微球(SiO2,折射率n2=1.5,半径r=2.5μm,介质为纯水n1=1.33)进行透射光线的追迹。如图8所示。以微粒中心为原点建立x-y-z坐标系,设光轴方向为z轴,图中红线、蓝线、粉线、绿线分别代表进入微粒以前,yoz平面内y=±0.3微米(绿线)、y=±0.9微米(粉线)、y=±1.5(蓝线)微米和y=±2.1微米(红线)位置处入射光线的光线追迹图。
光线经过水-微粒-水后,出射位置随轴向位置的变化而变化,光线出射后,作为物光与参考光干涉形成全息图,被光电记录器件CCD接收。对全息图进行衍射重构计算,可得到不同轴向位置的物光相位,即CCD上每个像素点的相位值均可得到。同时,由于相位与光程长呈线性关系,因此任意轴向位置的每个像素点光程长值可计算得到。通过模拟分析像素点间光程长的变化情况,与轴向位置建立模型,可计算微粒轴向位移。
由于入射微粒前,光束为平面波,同一轴向位置xoy面内任意一点光程长均相等,因此光程长的变化从图8中z=-2.5微米出开始计算。计算图8中每一根光线的光程长值,可得到A-A位置(z=2.5微米)和B-B位置(z=10.69微米,即微粒“焦点”处)的光程长分布图。如图9所示。
图9为A-A轴向位置xoy面内对应图7中每一根光线的光线追迹图,实际上每一根光线在xoy面内呈现光环,但示意图以光环上离散的点简单表示。根据计算,红、蓝、粉、绿代表不同角度入射的光线在A-A位置对应的光程长分别7.3099微米、7.3936微米、7.4617微米和7.4957微米。即入射角度越小,光程长值越大。
图10为B-B轴向位置的xoy面光线追迹图。根据计算,红、蓝、粉、绿(即图9中由外之内采用“叉”环绕形成的线)代表不同角度入射的光线在B-B位置对应的光程长分别16.5292微米、16.2798微米、16.2597微米和16.2638微米。在B-B轴向位置,随着入射角度增大,光程长并未呈现增大或减小的单一趋势。因此,如前面理论分析,若两根固定光线光程长做差分,必有拐点存在。根据之前理论分析,计算环带像素光程长与中心像素点的光程长差值,得到如图11所示的结果。
图11和12中,环带4-7与中心像素点之间的光程长差值曲线均出现拐点,和理论预期一致。因此,微粒在轴向的绝对位置发生改变时,拐点绝对位置同样改变,且拐点的轴向位移与微粒轴向位移相等。根据CCD记录的微粒离焦像在轴向上进行重构,可获取微粒在任一轴向位置的相位分布,从而得到微粒内部每一像素点的光程长值,求取环带与微粒中心像素点见的光程长差值曲线,获取实时拐点的位置,计算拐点轴向位移,即为微粒轴向位移。以上就是利用离轴全息方法测量微粒轴向位移的原理。
本发明的使用过程:
本发明中,如图13所示为应用三维位移的复合式数字全息显微方法的位移测试系统,在激光器的出射端安装有中灰镜和分光棱镜1,出射的激光束衰减强度后,由分光棱镜1分束形成物光和参考光。物光束通过反射镜1从微粒样本后透射、出射,携带有样本信息并经过显微物镜1放大,形成放大的微粒像;参考光束通过反射镜2经过显微物镜2,物光和参考光通过分光棱镜2汇合,在CCD面上发生干涉,形成微粒的全息图。
为保证物参光仅存在样本的差别,将显微物镜1、显微物镜2设置为完全一样的器件。通过调节分光棱镜的角度,可以改变物光与参考光之间的离轴夹角。其中显微物镜采用的型号为Mitutoyo,50×,NA=0.42;CCD采用的型号为Thorlabs,DCC1545M,5.2μm×5.2μm,1280×1024。
应用上述(如图13所示)的位移测试系统,对微粒(SiO2,折射率n=1.5,半径r=2.5微米,介质为纯水n=1.33,照射光波长λ=670nm)进行位移测试实验。将微粒样本放置于压电陶瓷位移台(PI,S-303,分辨力为0.1nm),沿三维方向移动微粒样本并测量位移。
应用该系统采集衣服微粒的全息图,如图14所示。以图14黑色矩形框选位置为起点,调节位移台沿光轴方向移动微粒,移动位移为-10nm,+5nm,-5nm,+5nm,-5nm,+2nm,-2nm,+2nm。通过去干涉条纹化处理(如图16所示),根据全息重构理论,通过重聚焦算法判断强度图中微粒的聚焦位置,可计算图14中微粒的像方聚焦重构距离为29.5mm。此时由于29.5mm大于临界重构距离15.6mm,可采用同轴数字全息微粒轴向位移重构法计算微粒轴向位移。
根据瑞丽索末菲定律,利用角谱法计算全息重构强度,如图18所示。选取微粒中心像素点的重构强度进行分析,建立中心点强度-重构距离曲线,选取强度最强点作为追踪微粒移动的标记,强度最大点的位移即为微粒的轴向位移。如图19所示。图19为移动过程中,根据记录的第100帧和第150帧全息图计算出的中心点强度-重构距离曲线。曲线最大值的位置发生变化,微粒的像方重构距离也发生变化,可确定微粒轴向的位移。计算整个移动过程的像方重构距离,考虑显微物镜放大倍数54.77倍,确定移动过程中物空间微粒的轴向相对位置。假设起点为轴向相对位置的0点,则微粒轴向位移如图20所示,位移计算结果如表1所示,微粒的相对位置分别为0±0.57nm,-9.97±0.78nm,-5.01±0.75nm,-10.02±0.70nm,-4.88±0.73nm,-10.25±0.81nm,-8.39±0.92nm,-10.02±0.72nm,-7.72±0.70nm。图20中可看出,大于临界重构距离时,使用复合型全息测量方法,微粒的轴向位移分辨力能够达到至少2nm。
表1微粒轴向位移数据(像方聚焦重构距离为29.5mm)
采集一幅能够近似聚焦在CCD平面上的微粒全息图,如图21所示。全息重构理论结合重聚焦算法,判定图21的像方聚焦重构距离为9.3mm,小于临界重构距离15.6mm,应采用离轴数字全息微粒轴向位移重构法——环状像素光程长差分法计算微粒轴向位移。以图21黑色矩形框选位置为起点,调节位移台沿光轴方向移动微粒,移动位移为-+20nm,-20nm,+10nm,-10nm,+5nm,-5nm,+5nm,-5nm,+2nm,-2nm,+2nm。图18是环带像素光程长差分二阶导数的示意图,图中两条曲线分别是移动过程中第405帧和445帧的结果。图22中,第405帧和445帧尖峰位置有明显的位移,尖峰位置的位移即为微粒像方重构距离的变化,结合放大倍数54.77倍,可计算物方重构距离的变化,从而获取微粒的轴向位移。通过计算,假设起点为轴向相对位置的0点,可得到如图23所示的整个移动过程中微粒轴向位移的变化。将图22的计算结果用表2表示,微粒的轴向相对位置为,0±1.03nm,20.33±1.03nm,0.24±1.05nm,10.29±1.06nm,0.33±1.08nm,5.31±1.14nm,0.12±0.97nm,5.13±1.01nm,0.19±1.29nm。图22中可看出,小于临界重构距离时,使用复合型全息测量方法,微粒的轴向位移分辨力能够达到至少5nm。
表2微粒轴向位移结果
Claims (6)
1.测量微粒三维位移光轴向位置的复合式数字全息显微方法,其特征在于:包括如下步骤:
步骤1:对介质中相应直径的微粒进行光学成像模拟,形成光学成像示意图,并计算出射光线于光轴交点与微粒中心点的轴向距离;
步骤2:将介质中相应直径的微粒参数代入,生成微粒出射光线与光轴交点位置的概率密度曲线,将微粒的透射光线与光轴交点最密集点与微粒的距离设置为焦距f;
步骤3:将微粒视为透镜,以f为焦距,设置透镜的成像示意图,并在该透镜的成像示意图中建立坐标,在距离为z的平面处光场分布为D(u,v,z);
步骤4:计算微粒轴上强度为|DP(0,0,z)|2,建立微粒投射成像图即全息显微重构的强度图,并确定临界重构距离;
步骤5:将像方重构距离与临界重构距离进行比较,如像方重构距离大于临界重构距离,则采用同轴数字全息微粒轴向位移重构法计算微粒轴向位移;如像方重构距离不大于临界重构距离,则采用离轴数字全息显微技术测量微粒轴向位移。
3.根据权利要求1所述的测量微粒三维位移光轴向位置的复合式数字全息显微方法,其特征在于:所述步骤2中,将介质中相应微粒的参数代入式1,得到不同入射角度光线出射时与光轴的交点位置,求取这些交点的概率密度,生成微粒出射光线与光轴交点位置的概率密度曲线,将微粒等效为透镜,因此,可将微粒的透射光线与光轴交点最密集点laxis设置为焦距f。
5.根据权利要求1所述的测量微粒三维位移光轴向位置的复合式数字全息显微方法,其特征在于:所述步骤4中,计算微粒轴上强度为|DP(0,0,z)|2,建立微粒投射成像图即全息显微重构的强度图,并建立微粒轴上强度曲线模拟图,从强度图中提取微粒中心点的重构强度与微粒轴上强度曲线模拟图相吻合,定位微粒中心点重构强度曲线最大值,即轴上强度曲线最大值的轴向位置点,即可实现对微粒轴向位移的测量。
6.根据权利要求1所述的测量微粒三维位移光轴向位置的复合式数字全息显微方法,其特征在于:所述步骤4中,在同轴数字全息显微技术中,重构强度图不仅包含微粒自身重构信息,还包含共轭像即孪生像的强度信息,孪生像面、重构像面以及全息记录面,选取轴上强度值在95%的置信区间内的z值,判断物方重构距离d≥(z-中心点重构强度曲线最大值)/2,则此时像方重构距离即为临界重构距离。
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