CN104567682A

CN104567682A - 液态环境下微粒三维位置纳米级分辨力测量方法

Info

Publication number: CN104567682A
Application number: CN201510018116.2A
Authority: CN
Inventors: 胡小唐; 雷海; 胡晓东; 常新宇; 胡春光; 李宏斌
Original assignee: Tianjin University
Current assignee: Tianjin University
Priority date: 2015-01-14
Filing date: 2015-01-14
Publication date: 2015-04-29
Anticipated expiration: 2035-01-14
Also published as: CN104567682B

Abstract

本发明涉及数字全息显微测量领域以及微粒位置测量领域，为提出基于同轴数字全息显微技术及图像处理方法，实现复杂液态环境下多微粒三维位置纳米级分辨力测量。为此，本发明采取的技术方案是，液态环境下微粒三维位置纳米级分辨力测量方法，包括如下步骤：利用同轴数字全息显微成像系统对微粒进行实时跟踪并记录微粒全息图像；对微粒的全息图进行预处理；对上述处理得到的全息图进行全息重构；对上述得到的重构信息进行去卷积运算；利用质心法得到微粒的横向位置；通过上述得到的微粒质心位置，得到其在纵向的强度分布曲线；采用多项式拟合对上述曲线进行拟合，其峰值则为微粒在纵向的位置。本发明主要应用于显微测量。

Description

液态环境下微粒三维位置纳米级分辨力测量方法

技术领域

本发明涉及数字全息显微测量领域以及微粒位置测量领域，具体地说，是一种利用数字全息显微测量技术对液态环境下微粒三维位置进行纳米级测量的方法，特别涉及液态环境下微粒三维位置纳米级分辨力测量方法。

背景技术

微粒是泛指亚微米到数百微米尺寸大小的粒子，包括细胞、病毒等生物粒子，也包括聚苯乙烯小球、磁珠、硅球、胶体、荧光粒子等非生物粒子，同时还包括数微米长的棒状物等。微粒在液态环境下的三维位置的测量技术一直是测量学科的重要课题，在科学和工程领域具有广泛的应用，如：海洋、气象、燃烧、导热、环境污染、化学、材料、生物医学/生命等。对于大多数传统的应用研究领域，微粒的尺寸主要为数微米至数百微米，微粒位置变化的空间范围在毫米量级以上，而对应的测量分辨力一般在微米量级就可以满足要求；对于纳米生物学、纳米流体学和纳米热力学等研究领域，微粒尺寸主要都在10微米以下，空间位置变化的范围一般只有数十微米，甚至数百纳米，这就要求测量分辨力达到数纳米，甚至亚纳米量级。目前微粒三维位置在横向测量已经达到纳米甚至亚纳米分辨力，主要方法有Hough变换法、质心法、胡相关法、梯度法等；其在纵向测量测量方法主要有米氏散射匹配法、微视觉法、后焦平面干涉法等。米氏散射测量方法分辨力能达到1nm，但是其需要精确标定各个物理参量，测量方法复杂，且只能对规则的微粒进行测量；而其它方法测量分辨力约为10nm左右，不能达到测量要求。上述方法不能同时对多个微粒进行测量，测量效率低，且不能对液体环境中交叠的微粒进行测量，其鲁棒性低。

发明内容

为克服现有技术的不足，本发明旨在提出基于同轴数字全息显微技术及图像处理方法，实现复杂液态环境下多微粒三维位置纳米级分辨力测量。为此，本发明采取的技术方案是，液态环境下微粒三维位置纳米级分辨力测量方法，包括如下步骤：

搭建同轴数字全息显微成像系统；

将微粒放置于样品池中，样品池由盖玻片、载玻片及封口膜组成，由环氧树脂密封；

利用上述成像系统对微粒进行实时跟踪并记录微粒全息图像；

对微粒的全息图进行预处理，利用二维整体经验模态分解(BEEMD)方法消除微粒全息图的散斑噪声以及背景噪声；

对上述处理得到的全息图进行全息重构，得到微粒的三维重构强度分布信息；

对上述得到的重构信息进行去卷积运算，减少离焦信号及孪生像所产生的噪声影响；

利用质心法得到微粒的横向位置；

通过上述得到的微粒质心位置，得到其在纵向的强度分布曲线；

采用多项式拟合对上述曲线进行拟合，其峰值则为微粒在纵向的位置。

微粒包括细胞、病毒、磁珠、硅球、聚苯乙烯小球、纳米棒。

利用质心法得到微粒的横向位置进一步具体步骤是，全息图中微粒的圆心即为位置的X-Y方向的位置，由下述方程计算得到：

(x_{c}, y_{c}) = (\frac{Σ I_{i} x_{i}}{{ΣI}_{i}}, \frac{Σ I_{i} y_{i}}{Σ I_{i}}) - - - (1)

其中，(x_c,y_c)为圆心的坐标，I_i为相机测量的第i个像素的光强度，(x_i,y_i)为图像中像素的位置。

对得到的全息图进行全息重构进一步具体步骤是，按照瑞利-索末菲传播原理对全息图进行三维重构，得到硅球在三维空间中的强度分布信息，其计算公式如下：

\begin{matrix} h (r, - z) = \frac{1}{2 π} \frac{&PartialD;}{&PartialD; z} \frac{e^{jkR}}{R} \\ u_{r} (r, z) = {FT}^{- 1} (FT (I_{s} (r, 0)) \cdot H (q - z)) \end{matrix} - - - (2)

其中，h(r,-z)为瑞利-索末菲传播函数，的傅里叶变换；式中r为全息平面内坐标，z为轴向坐标，I_s为步骤7得到的全息图的强度，FT^-1、FT分别表示傅里叶逆变换与傅里叶变换，j表示虚数单位，k为波数，q为频域坐标，R为光传播距离。

对重构三维空间强度信息进行去卷积运算，计算公式如下，减弱离焦信号和孪生像等产生的噪声对硅球三维重构光场的影响；

u (r, z) = {FT}^{- 1} (\frac{FT ({| u_{r} (r, z) |}^{2})}{FT ({| h (r, - z) |}^{2} + α)}) - - - (3)

式中α为一个相比于FT(|h(r,-z)|²非常小的常数，一般取值范围为0.001～0.01。

与已有技术相比，本发明的技术特点与效果：

本发明提出的液态环境下微粒三维位置纳米级精度测量方法，能够对液态环境下各种不同的微粒进行并行测量，测量横向分辨力优于1nm，纵向分辨力优于2nm，适合纳米生物学、纳米流体学，以及生命科学中的分子动力学研究中。

附图说明

图1所示为硅球的全息图(a)通过BEEMD方法进行分解得到的噪声(b)、基频(c)以及背景图(d)；

图2所示为硅球在X、Y方向1nm阶跃位置变化运动测量结果；

图3所示为硅球全息图的三维重构强度分布图(a)去卷积运算前，(b)去卷积运算后；

图4所示为硅球在Z方向5nm阶跃位置变化运动测量结果；

图5所示为本发明实施流程图。

具体实施方式

本发明提出基于同轴数字全息显微技术与图像处理技术的三维微粒位置测量方法，包括下列步骤：

搭建同轴数字全息显微成像系统；

将微粒(包括细胞、病毒、磁珠、硅球、聚苯乙烯小球、纳米棒等)放置于样品池中，样品池通常由盖玻片、载玻片及封口膜组成，由环氧树脂密封；

利用质心法得到微粒的横向位置；

通过上述技术方案，本发明能够对微粒三维位置进行测量，被测微粒可以是细胞等生物分子，也可以是胶粒等非生物分子；可以是规则的磁珠、硅球，也可以是无规则的纳米棒等；可以对单个微粒进行测量，也可以同时测量多个甚至交叠的微粒。

本发明提出一种态环境下微粒三维位置纳米级精度测量方法，包括下列步骤：

步骤1：搭建同轴数字全息显微成像系统，系统主要器件为CCD相机，显微物镜以及激光光源；

步骤2：本实施例中所用微粒为直径5μm的硅球，将硅球放置于样品池中，样品池由盖玻片、载玻片以及密封膜组成。为了实现对硅球的纳米级运动进行控制并测量，通过熔融方式固定在基底(载玻片)上，并将样品固定在纳米位移台上。所用纳米位移台为PI公司生产的型号为517.3CL三维纳米位移台。

步骤3：确定横向(即X、Y方向)测量分辨力。通过控制器控制三维纳米位移台分别在X、Y方向进行高度为1nm的阶跃变化，同时将硅球的全息图记录并储存；

步骤4：确定纵向(即Z方向)测量分辨力。通过控制器控制三维纳米位移台在Z方向进行高度为5nm的阶跃变化，同时将硅球的全息图记录并储存；

步骤5：采用二维整体经验模态分解(BEEMD)方法消除微粒全息图的散斑噪声以及背景噪声。经验模态分解(EMD)方法是近年来提出的一种新型自适应信号时频处理方法，特别适用于非线性非平稳信号的分析处理，将其扩展到二维图像分析，即为二维经验模态分解(BEMD)方法。但由于BEMD方法在对图像进行分解时，可能会造成混频等现象，因此BEEMD方法被提出来解决降低混频等影响，能够有效地对图像进行分解，从而消除散斑噪声和背景噪声。将BEEMD方法应用在数字全息图中，有效的消除了散斑噪声和背景噪声。图1为微球全息图以及利用BEEMD方法对图像进行分解得到的分量，从而得到去噪音的全息图。

步骤6：采用质心法确定上述处理后的全息图中的硅球的位置。由于所研究对象为硅球，其为规则的球体，则全息图中硅球的圆心即为位置的X-Y方向的位置，可由下述方程计算得到：

(x_{c}, y_{c}) = (\frac{Σ I_{i} x_{i}}{Σ I_{i}}, \frac{Σ I_{i} y_{i}}{Σ I_{i}}) - - - (1)

其中，(x_c,y_c)为圆心的坐标，I_i为相机测量的第i个像素的光强度，(x_i,y_i)为图像中像素的位置。图2所示为对高度为1nm的阶跃位置变化结果，能够清楚的看到1nm的阶跃变化，其X、Y方向的测量标准差为0.41nm和0.34nm，表明其测量分辨力优于1nm；

步骤7：对步骤4中得到的全息图进行步骤5和6操作，得到去除噪声的硅球全息图及其球心坐标。

步骤8：对步骤7得到的全息图进行数字全息重构，按照瑞利-索末菲传播原理对全息图进行三维重构，得到硅球在三维空间中的强度分布信息，其计算公式如下：

\begin{matrix} h (r, - z) = \frac{1}{2 π} \frac{&PartialD;}{&PartialD; z} \frac{e^{jkR}}{R} \\ u_{r} (r, z) = {FT}^{- 1} (FT (I_{s} (r, 0)) \cdot H (q - z)) \end{matrix} - - - (2)

其中，h(r,-z)为瑞利-索末菲传播函数，的傅里叶变换，式中r为全息平面内坐标，z为轴向坐标，I_s为步骤7得到的全息图的强度，FT^-1、FT分别表示傅里叶逆变换与傅里叶变换，j表示虚数单位，k为波数，q为频域坐标，R为光传播距离。

步骤9：对上述得到的重构三维空间强度信息进行去卷积运算，计算公式如下，减弱离焦信号和孪生像等产生的噪声对硅球三维重构光场的影响；图3所示为去卷积前后的微球重构三维强度分布图；

u (r, z) = {FT}^{- 1} (\frac{FT ({| u_{r} (r, z) |}^{2})}{FT ({| h (r, - z) |}^{2} + α)}) - - - (3)

步骤10：根据步骤7得到的硅球的球心位置坐标以及步骤9得到的重构三维空间强度信息，得到硅球球心在Z向的强度分布曲线；

步骤11：对上述曲线进行多项式拟合，其峰值即为硅球在Z向的位置。图4所示为对步骤4中阶跃位置变化运动的测量结果，从中能够清楚的看到5nm的阶跃，测量标准差为1.79nm，即表明此方法在纵向(Z向)的测量分辨力优于2nm。

通过上述步骤，即能得到硅球在液态环境中的三维位置，在横向(X、Y方向)的测量分辨力优于1nm，在纵向(Z方向)的测量分辨力优于2nm。

Claims

1.一种液态环境下微粒三维位置纳米级分辨力测量方法，其特征是，包括如下步骤：

搭建同轴数字全息显微成像系统；

利用质心法得到微粒的横向位置；

2.如权利要求1所述的液态环境下微粒三维位置纳米级分辨力测量方法，其特征是，利用质心法得到微粒的横向位置进一步具体步骤是，全息图中微粒的圆心即为位置的X-Y方向的位置，由下述方程计算得到：

(x_{c}, y_{c}) = (\frac{Σ I_{i} x_{i}}{Σ I_{i}}, \frac{Σ I_{i} y_{i}}{Σ I_{i}}) - - - (1)

3.如权利要求1所述的液态环境下微粒三维位置纳米级分辨力测量方法，其特征是，对得到的全息图进行全息重构进一步具体步骤是，按照瑞利-索末菲传播原理对全息图进行三维重构，得到硅球在三维空间中的强度分布信息，其计算公式如下：

h (r, - z) = \frac{1}{2 π} \frac{&PartialD;}{&PartialD; z} \frac{e^{ikR}}{R}

u_r(r,z)＝FT^-1(FT(I_s(r,0))·H(q,-z)) (2)

4.如权利要求1所述的液态环境下微粒三维位置纳米级分辨力测量方法，其特征是，对重构三维空间强度信息进行去卷积运算，计算公式如下，减弱离焦信号和孪生像等产生的噪声对硅球三维重构光场的影响；

u (r, z) = {FT}^{- 1} (\frac{FT ({| u_{r} (r, z) |}^{2})}{FT ({| h (r, - z) |}^{2} + α)}) - - - (3)

5.如权利要求1所述的液态环境下微粒三维位置纳米级分辨力测量方法，其特征是，微粒包括细胞、病毒、磁珠、硅球、聚苯乙烯小球、纳米棒。