CN112063703A - 提高条形码拆分率的测序方法和试剂盒 - Google Patents

Abstract

一种提高条形码拆分率的测序方法和试剂盒，该方法包括：提供插入片段测序引物、阻断的占位引物和待测模板，其中占位引物的3’端被阻断而不能延伸，且占位引物在待测模板上的杂交位置位于条形码测序引物杂交位置或其下游区域；将插入片段测序引物和占位引物杂交到待测模板上，对插入片段进行测序；在插入片段测序完成并阻断测序产物3’羟基端后，去除占位引物并杂交上条形码测序引物，或将占位引物的3’端恢复成3’羟基基团作为条形码测序引物，进行条形码测序。本发明的方法在不影响单端测序数据质量的前提下，解决单端测序读长超过插入片段长度而导致部分插入片段过短的序列不能被拆分出来的问题。

Description

提高条形码拆分率的测序方法和试剂盒

技术领域

本发明涉及测序技术领域，具体涉及一种提高条形码拆分率的测序方法和试剂盒。

背景技术

现有的二代测序方法包括插入片段测序和条形码测序，可以先测序插入片段，再测序条形码；或者先测序条形码，再测插入片段。

先测序插入片段，再测序条形码的方法存在一个问题：文库的插入片段长度是弥散分布的，当需要将插入片段读通时，较短的插入片段待测物的接头和条形码部分会被测通而导致条形码的测序引物无法与待测序列结合而不能测序，从而导致这部分插入片段过短的待测物不能被拆分出而被过滤掉。

但是如果先测序条形码，再测插入片段，会导致插入片段的起始质量值偏低和整体质量值降低，可能是因为测条形码序列后，插入片段的测序引物的杂交会受影响。

发明内容

本发明提供一种提高条形码拆分率的测序方法和试剂盒，在不影响单端测序数据质量的前提下，解决单端测序读长超过插入片段长度而导致部分插入片段过短的序列不能被拆分出来的问题。

根据第一方面，一种实施例中提供一种提高条形码拆分率的测序方法，该方法包括：

提供插入片段测序引物、阻断的占位引物和待测模板，其中，上述待测模板上具有插入片段测序引物杂交位置、插入片段和条形码测序引物杂交位置，上述占位引物的3’端被阻断而不能延伸，且上述占位引物在上述待测模板上的杂交位置位于上述条形码测序引物杂交位置或其下游区域；

将上述插入片段测序引物和上述占位引物杂交到上述待测模板上，从上述插入片段测序引物开始延伸而对上述插入片段进行测序；

在上述插入片段测序完成并阻断测序产物3’羟基端后，去除上述占位引物并杂交上条形码测序引物，或将杂交位置位于上述条形码测序引物杂交位置的占位引物的3’端恢复成3’羟基基团作为条形码测序引物，进行条形码测序。

根据第一方面，一种实施例中提供一种提高条形码拆分率的测序方法，该方法包括：

提供阻断的插入片段测序引物、条形码测序引物和待测模板，其中，上述待测模板上具有插入片段测序引物杂交位置、插入片段和条形码测序引物杂交位置，上述插入片段测序引物的3’端被阻断而不能延伸；

将上述阻断的插入片段测序引物和上述条形码测序引物杂交到上述待测模板上，从上述条形码测序引物开始延伸而进行条形码测序；

在条形码测序完成并阻断测序产物3’羟基端后，将上述阻断的插入片段测序引物的3’端恢复成3’羟基基团作为插入片段测序引物，或去除上述阻断的插入片段测序引物并杂交上具有3’羟基基团的插入片段测序引物，对上述插入片段进行测序。

在优选实施例中，上述阻断的占位引物或上述阻断的插入片段测序引物的3’羟基端被不可恢复或可恢复的阻断，其中上述不可恢复的阻断通过3’羟基端加ddNTP方式进行，上述可恢复的阻断通过3’羟基端加磷酸化修饰方式进行，该3’羟基端的磷酸化修饰，能够通过T4多聚核苷酸激酶去除，恢复3’羟基基团。

在优选实施例中，上述待测模板是DNA纳米球。

在优选实施例中，用甲酰胺去除上述阻断的占位引物或上述阻断的插入片段测序引物。

在优选实施例中，上述方法还包括对上述插入片段测序和条形码测序的数据进行拆分的信息分析步骤。

根据第二方面，一种实施例中提供一种提高条形码拆分率的测序试剂盒，该试剂盒用于第一方面的测序方法，该试剂盒包括：

插入片段测序引物，其与待测模板上的插入片段测序引物杂交位置杂交而对插入片段进行测序；

阻断的占位引物，其3’端被阻断而不能延伸，且与上述待测模板上的条形码测序引物杂交位置或其下游区域杂交，在上述插入片段测序完成并阻断测序产物3’羟基端后，上述阻断的占位引物3’端能够被恢复成3’羟基基团作为条形码测序引物而进行条形码测序，或能够被去除；以及

任选地，还包括：

条形码测序引物，用于在上述阻断的占位引物被去除后，与上述待测模板上的条形码测序引物杂交位置杂交而进行条形码测序。

根据第二方面，一种实施例中提供一种提高条形码拆分率的测序试剂盒，该试剂盒用于第一方面的测序方法，该试剂盒包括：

条形码测序引物，其与待测模板上的条形码测序引物杂交位置杂交而进行条形码测序；

阻断的插入片段测序引物，其3’端被阻断而不能延伸，且与上述待测模板上的插入片段测序引物杂交位置杂交，在条形码测序完成并阻断测序产物3’羟基端后，上述阻断的插入片段测序引物3’端能够被恢复成3’羟基基团作为插入片段测序引物而对上述插入片段进行测序，或能够被去除；以及

任选地，还包括：

插入片段测序引物，用于在上述阻断的插入片段测序引物被去除后，与上述待测模板上的插入片段测序引物杂交位置杂交而对插入片段进行测序。

在优选实施例中，上述阻断的占位引物或上述阻断的插入片段测序引物的3’羟基端被不可恢复或可恢复的阻断，其中上述不可恢复的阻断通过3’羟基端加ddNTP方式进行，上述可恢复的阻断通过3’羟基端加磷酸化修饰方式进行，该3’羟基端的磷酸化修饰，能够通过T4多聚核苷酸激酶去除，恢复3’羟基基团。

在优选实施例中，上述待测模板是DNA纳米球。

本发明的测序方法和试剂盒，大大提高了条形码的拆分率，尤其解决了短串联重复片段(short tandem repeat,STR)文库、免疫组库、转录间隔区(internal transcribedspacer,ITS)等插入片段长短不一，但都要求单端测序尽量测通的扩增子文库的长读长测序和拆分率低的问题。

附图说明

图1为本发明一个实施例的提高条形码拆分率的测序方法原理流程图；

图2为本发明另一个实施例的提高条形码拆分率的测序方法原理流程图；

图3本发明一个实施例中对照组和占位引物组的测序质量值Q30％和拆分率比较结果图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本申请能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他材料、方法所替代。

另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时，方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此，说明书和附图中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例，并不意味着是必须的顺序，除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。

如图1所示，一种提高条形码拆分率的测序方法，该方法包括：

提供插入片段测序引物、阻断的占位引物和待测模板(图中待测DNA模板)，其中，上述待测模板上具有插入片段测序引物杂交位置、插入片段和条形码测序引物杂交位置，上述占位引物的3’端被阻断(图中五角星表示)而不能延伸，且上述占位引物在上述待测模板上的杂交位置位于上述条形码测序引物杂交位置或其下游区域，其中下游区域是指例如条形码测序引物杂交位置的3’端，只要能够阻止插入片段测序时延伸到条形码测序引物杂交位置即可。

将上述插入片段测序引物和上述占位引物杂交到上述待测模板上，从上述插入片段测序引物开始延伸而对上述插入片段进行测序。

在上述插入片段测序完成并阻断测序产物3’羟基端(图中dd表示双脱氧核苷酸)后，去除上述占位引物并杂交上条形码测序引物，或将杂交位置位于上述条形码测序引物杂交位置的占位引物的3’端恢复成3’羟基基团作为条形码测序引物，进行条形码测序。

其中，占位引物的3’端恢复成3’羟基基团的方式包括物理、化学或生物的方式。其中，物理方式例如，高温变性将占位引物去掉，重新杂交新的带有3’羟基基团的引物；化学方式例如，占位引物的3’羟基端是可逆阻断基团，如丙烯基等，可以被金属钯催化的脱丙烯基作用移除，或占位引物的3’羟基端是双脱氧核苷酸，通过甲酰胺试剂，将此占位引物洗脱掉，并重新杂交新的带有3’羟基基团的引物；生物方式例如，占位引物的3’羟基端加磷酸化修饰进行阻断，通过T4多聚核苷酸激酶去除磷酸化，恢复3’羟基基团。

图1所示的测序方法的基本原理是：预先用失去延伸功能的一段单链核苷酸序列(即“阻断的占位引物”)杂交在条形码测序引物杂交位置或其下游区域进行占位；先对插入片段进行测序；测完插入片段后，使条形码测序引物恢复延伸功能，即将占位引物的3’端恢复成3’羟基基团，或重新杂交条形码测序引物，并进行条形码测序。

图1所示的测序方法中，阻断的占位引物3’羟基端可以被不可恢复或可恢复的阻断，其中不可恢复的阻断可以通过3’羟基端加ddNTP方式进行，可恢复的阻断可以通过3’羟基端加磷酸化修饰方式进行。按照阻断方式不同，后续条形码测序有所差异。具体而言，如果阻断的占位引物3’羟基端是可恢复的阻断，即该占位引物的3’端能够恢复成3’羟基基团获得延伸功能，那么后续条形码测序就以该恢复后的引物作为条形码测序引物，进行条形码测序，无需杂交新的条形码测序引物。需要说明的是，阻断的占位引物经恢复成为条形码测序引物的情况下，阻断的占位引物在待测模板上的杂交位置应该位于条形码测序引物杂交位置区域，这有这样才能成为有效的条形码测序引物。如果阻断的占位引物3’羟基端是不可恢复的阻断，即该占位引物的3’端不能恢复成3’羟基基团获得延伸功能，那么后续条形码测序就需要杂交新的条形码测序引物，这种占位引物需要在杂交新的条形码测序引物之前从模板上去除掉，合适的去除方式包括甲酰胺或其他方式。需要说明的是，阻断的占位引物在待测模板上的杂交位置位于条形码测序引物杂交位置的下游区域的情况下，必须将占位引物从模板上去除掉，然后杂交新的条形码测序引物才能进行条形码测序。

图1所示的测序方法中，待测模板可以是DNA纳米球，适用于依赖于DNA纳米球的测序策略，DNA纳米球固定在测序芯片上被测序引物读取实现测序，这样的测序策略包括但不限于华大基因的MGI测序平台。

如图2所示，一种提高条形码拆分率的测序方法，该方法包括：

提供阻断的插入片段测序引物、条形码测序引物和待测模板(图中待测DNA模板)，其中，上述待测模板上具有插入片段测序引物杂交位置、插入片段和条形码测序引物杂交位置，上述插入片段测序引物的3’端被阻断(图中五角星表示阻断基团)而不能延伸；

将上述阻断的插入片段测序引物和上述条形码测序引物杂交到上述待测模板上，从上述条形码测序引物开始延伸而进行条形码测序；

在条形码测序完成并阻断测序产物3’羟基端(图中dd表示双脱氧核苷酸)后，将上述阻断的插入片段测序引物的3’端恢复成3’羟基基团作为插入片段测序引物，或去除上述阻断的插入片段测序引物并杂交上具有3’羟基基团的插入片段测序引物，对上述插入片段进行测序。

其中，阻断的插入片段测序引物的3’端恢复成3’羟基基团的方式包括物理、化学或生物的方式。

图2所示的测序方法的基本原理是：预先用失去延伸功能的一段单链核苷酸序列(即“阻断的插入片段测序引物”)杂交在插入片段测序引物杂交位置进行占位；先进行条形码测序；条形码测序完成后，使阻断的插入片段测序引物恢复延伸功能，即将阻断的插入片段测序引物的3’端恢复成3’羟基基团，或重新杂交插入片段测序引物，并对插入片段进行测序。

图2所示的测序方法中，阻断的插入片段测序引物3’羟基端可以被不可恢复或可恢复的阻断，其中不可恢复的阻断可以通过3’羟基端加ddNTP方式进行，可恢复的阻断可以通过3’羟基端加磷酸化修饰方式进行。按照阻断方式不同，后续对插入片段进行测序有所差异。具体而言，如果阻断的插入片段测序引物3’羟基端是可恢复的阻断，即该阻断的插入片段测序引物的3’端能够恢复成3’羟基基团获得延伸功能，那么后续对插入片段进行测序就以该恢复后的引物作为插入片段测序引物，进行插入片段测序，无需杂交新的插入片段测序引物。如果阻断的插入片段测序引物3’羟基端是不可恢复的阻断，即该阻断的插入片段测序引物的3’端不能恢复成3’羟基基团获得延伸功能，那么后续对插入片段进行测序就需要杂交新的插入片段测序引物，这种阻断的插入片段测序引物需要在杂交新的插入片段测序引物之前从模板上去除掉，合适的去除方式包括甲酰胺或其他方式。

图2所示的测序方法中，待测模板可以是DNA纳米球，适用于依赖于DNA纳米球的测序策略，DNA纳米球固定在测序芯片上被测序引物读取实现测序，这样的测序策略包括但不限于华大基因的MGI测序平台。

本发明的测序方法，还可以进一步包括对插入片段测序和条形码测序的数据进行拆分的信息分析步骤。本发明中的信息分析按照本领域现有方法进行即可。

对应于本发明的提高条形码拆分率的测序方法，本发明实施例还提供一种提高条形码拆分率的测序试剂盒，该试剂盒用于本发明的测序方法中，该试剂盒包括：

插入片段测序引物，其与待测模板上的插入片段测序引物杂交位置杂交而对插入片段进行测序；

阻断的占位引物，其3’端被阻断而不能延伸，且与上述待测模板上的条形码测序引物杂交位置或其下游区域杂交，在上述插入片段测序完成并阻断测序产物3’羟基端后，上述阻断的占位引物3’端能够被恢复成3’羟基基团作为条形码测序引物而进行条形码测序，或能够被去除。

需要说明的是，在阻断的占位引物3’端能够被恢复成3’羟基基团作为条形码测序引物的情况下，试剂盒不需要条形码测序引物作为必需成分。而在阻断的占位引物3’端不能被恢复成3’羟基基团作为条形码测序引物而需要被去除的情况下，试剂盒还需要条形码测序引物，该条形码测序引物用于在上述阻断的占位引物被去除后，与上述待测模板上的条形码测序引物杂交位置杂交而进行条形码测序。因此，条形码测序引物是“任选的”，即根据阻断的占位引物的情况而确定是否需要。

对应于本发明的提高条形码拆分率的测序方法，本发明实施例还提供一种提高条形码拆分率的测序试剂盒，该试剂盒用于本发明的测序方法中，该试剂盒包括：

条形码测序引物，其与待测模板上的条形码测序引物杂交位置杂交而进行条形码测序；

阻断的插入片段测序引物，其3’端被阻断而不能延伸，且与上述待测模板上的插入片段测序引物杂交位置杂交，在条形码测序完成并阻断测序产物3’羟基端后，上述阻断的插入片段测序引物3’端能够被恢复成3’羟基基团作为插入片段测序引物而对上述插入片段进行测序，或能够被去除。

需要说明的是，在阻断的插入片段测序引物3’端能够被恢复成3’羟基基团作为插入片段测序引物的情况下，试剂盒不需要插入片段测序引物作为必需成分。而在阻断的插入片段测序引物3’端不能被恢复成3’羟基基团作为插入片段测序引物而需要被去除的情况下，试剂盒还需要插入片段测序引物，该插入片段测序引物用于在上述阻断的插入片段测序引物被去除后，与上述待测模板上的插入片段测序引物杂交位置杂交而对插入片段进行测序。因此，插入片段测序引物是“任选的”，即根据阻断的插入片段测序引物的情况而确定是否需要。

以下通过具体实施例详细说明本发明的技术方案核心，应当理解，实施例仅是示例性的，不能理解为对本发明保护范围的限制。

实施例1

1.器材：

本实施例中使用的器材包括：MGISEQ-2000RS测序仪，MGISEQ-2000RS测序试剂载片(715nm)，迷你装载仪，PCR仪，PCR八连管，Eppendorf移液器一套，Effendorf高速离心机。

2.试剂：

1)引物序列：

占位引物序列：AAGTCGGAGGCCAAGCGGTCTTAGGAAGA-ddC(SEQ ID NO：1，阻断方式为引物的3’端被双脱氧胞嘧啶核苷酸阻断，恢复方式是通过甲酰胺变性方式将占位引物去掉，并重新杂交3’端为羟基基团的条形码测序引物)。

插入片段测序引物序列：GCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTT(SEQ ID NO：2)。

2)本实施例中使用的试剂如下表1所示：

表1

3.试剂准备：

1)引物序列的溶解：

将装有测序引物粉末的1.5毫升的离心管在Eppendorf高速离心机(5415D)上，最高转速离心5分钟；按照引物标签上的说明，用1×TE缓冲液将引物溶解至100μM的测序引物母液。

2)1μM引物序列的配制体系如下表2所示：

表2

试剂名称	体积
		100μM测序引物母液	100微升
5×SSC缓冲液	9.9毫升
		总计	10毫升

4.操作步骤：

1)参考《MGISEQ-2000RS高通量测序试剂套装使用说明书》对大肠杆菌文库、NA12878文库和扩增子文库进行DNA纳米球的制备和定量，准备两张一样的芯片，将这三种DNA纳米球都装载到这两张MGISEQ-2000测序试剂载片(715nm)上。

2)参考《MGISEQ-2000RS高通量测序试剂套装使用说明书》准备两套SE400测序试剂盒。

3)其中一套试剂盒，用移液器取出6号孔试剂(6号孔中为1μM的占位引物，起占位作用)，超纯水清洗6号孔，向6号孔加入3毫升1μM的测序引物工作液(作为对照组)，另外一套试剂盒保持不变(SE400测序试剂盒的6号孔试剂为1μM的占位引物，作为占位引物组)。

4)按照《MGISEQ-2000RS高通量测序试剂套装使用说明书》将测序试剂盒、芯片放在MGI2000-RS测序仪上，选择对应的脚本，设置SE400+10，进行测序。

5)测序时，一链测序引物杂交之后，仪器的内置程序会自动抽取并向测序载片中泵入6号孔的试剂，由于对照组的6号孔被替换对一链测序引物，因此对照组被杂交了两次一链测序引物；而占位引物组的6号孔试剂为占位引物，因此一链测序引物杂交之后，占位引物组会杂交占位引物到待测模板上。一链测序完成之后，仪器的内置程序会自动抽取7号孔的甲酰胺试剂并泵入测序载片中，在40℃孵育10分钟后，甲酰胺可以将占位引物从待测模板上洗掉，之后，仪器的内置程序会自动抽取5号孔的试剂(条形码测序引物)并泵入测序载片中，条形码测序引物杂交之后，进行条形码测序。

5.结果：

测序后，对占位引物组和对照组的测序质量值Q30和拆分率进行统计，图3示出了占位引物组和对照组的测序质量值Q30和拆分率情况，占位引物组比对照组的Q30低-1％～4％，拆分率提高了2％～21％，文库不同，差异不同。表明本发明的方法能够有效提高单端测序中条形码的拆分率，特别是提高扩增子文库的条形码的拆分率。

以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳华大智造科技有限公司

<120> 提高条形码拆分率的测序方法和试剂盒

<130> 19I28150

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aagtcggagg ccaagcggtc ttaggaagac 30

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gctcacagaa cgacatggct acgatccgac tt 32

Claims (10)

1.一种提高条形码拆分率的测序方法，其特征在于，所述方法包括：

提供插入片段测序引物、阻断的占位引物和待测模板，其中，所述待测模板上具有插入片段测序引物杂交位置、插入片段和条形码测序引物杂交位置，所述占位引物的3’端被阻断而不能延伸，且所述占位引物在所述待测模板上的杂交位置位于所述条形码测序引物杂交位置或其下游区域；

将所述插入片段测序引物和所述占位引物杂交到所述待测模板上，从所述插入片段测序引物开始延伸而对所述插入片段进行测序；

在所述插入片段测序完成并阻断测序产物3’羟基端后，去除所述占位引物并杂交上条形码测序引物，或将杂交位置位于所述条形码测序引物杂交位置的占位引物的3’端恢复成3’羟基基团作为条形码测序引物，进行条形码测序。

2.一种提高条形码拆分率的测序方法，其特征在于，所述方法包括：

提供阻断的插入片段测序引物、条形码测序引物和待测模板，其中，所述待测模板上具有插入片段测序引物杂交位置、插入片段和条形码测序引物杂交位置，所述插入片段测序引物的3’端被阻断而不能延伸；

将所述阻断的插入片段测序引物和所述条形码测序引物杂交到所述待测模板上，从所述条形码测序引物开始延伸而进行条形码测序；

在条形码测序完成并阻断测序产物3’羟基端后，将所述阻断的插入片段测序引物的3’端恢复成3’羟基基团作为插入片段测序引物，或去除所述阻断的插入片段测序引物并杂交上具有3’羟基基团的插入片段测序引物，对所述插入片段进行测序。

3.根据权利要求1或2所述的测序方法，其特征在于，所述阻断的占位引物或所述阻断的插入片段测序引物的3’羟基端被不可恢复或可恢复的阻断，其中所述不可恢复的阻断通过3’羟基端加ddNTP方式进行，所述可恢复的阻断通过3’羟基端加磷酸化修饰方式进行。

4.根据权利要求1或2所述的测序方法，其特征在于，所述待测模板是DNA纳米球。

5.根据权利要求1或2所述的测序方法，其特征在于，用甲酰胺去除所述阻断的占位引物或所述阻断的插入片段测序引物。

6.根据权利要求1或2所述的测序方法，其特征在于，所述方法还包括对所述插入片段测序和条形码测序的数据进行拆分的信息分析步骤。

7.一种提高条形码拆分率的测序试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于权利要求1或权利要求3至6任一项所述的测序方法，所述试剂盒包括：

插入片段测序引物，其与待测模板上的插入片段测序引物杂交位置杂交而对插入片段进行测序；

阻断的占位引物，其3’端被阻断而不能延伸，且与所述待测模板上的条形码测序引物杂交位置或其下游区域杂交，在所述插入片段测序完成并阻断测序产物3’羟基端后，所述阻断的占位引物3’端能够被恢复成3’羟基基团作为条形码测序引物而进行条形码测序，或能够被去除；以及

任选地，还包括：

条形码测序引物，用于在所述阻断的占位引物被去除后，与所述待测模板上的条形码测序引物杂交位置杂交而进行条形码测序。

8.一种提高条形码拆分率的测序试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于权利要求2至6任一项所述的测序方法，所述试剂盒包括：

条形码测序引物，其与待测模板上的条形码测序引物杂交位置杂交而进行条形码测序；

阻断的插入片段测序引物，其3’端被阻断而不能延伸，且与所述待测模板上的插入片段测序引物杂交位置杂交，在条形码测序完成并阻断测序产物3’羟基端后，所述阻断的插入片段测序引物3’端能够被恢复成3’羟基基团作为插入片段测序引物而对所述插入片段进行测序，或能够被去除；以及

任选地，还包括：

插入片段测序引物，用于在所述阻断的插入片段测序引物被去除后，与所述待测模板上的插入片段测序引物杂交位置杂交而对插入片段进行测序。

9.根据权利要求7或8所述的测序试剂盒，其特征在于，所述阻断的占位引物或所述阻断的插入片段测序引物的3’羟基端被不可恢复或可恢复的阻断，其中所述不可恢复的阻断通过3’羟基端加ddNTP方式进行，所述可恢复的阻断通过3’羟基端加磷酸化修饰方式进行。

10.根据权利要求7或8所述的测序试剂盒，其特征在于，所述待测模板是DNA纳米球。

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