CN112055716A - 用于可激发和不可激发细胞中Ca2+成像的低亲和力红色荧光指示剂 - Google Patents

用于可激发和不可激发细胞中Ca2+成像的低亲和力红色荧光指示剂 Download PDF

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Abstract

本发明提供了红移的低亲和力Ca2+指示剂和检测细胞中Ca2+水平变化的方法。该方法包括以下步骤：获得样品；以及通过使样品与指示剂接触，检测SR Ca2+或线粒体Ca2+水平的变化，使用红移的低亲和力Ca2+指示剂来检测SR Ca2+或线粒体Ca2+水平的变化。

Description

用于可激发和不可激发细胞中Ca2+成像的低亲和力红色荧光 指示剂
技术领域
本发明通常涉及低亲和力的荧光Ca2+指示剂，该指示剂可靶向内质网、肌质网和/或线粒体。
背景技术
在心脏细胞中，肌质网(SR)负责Ca2+诱导的Ca2+释放(CICR)的放大，这使得电压依赖性Ca2+进入触发肌丝收缩。由于收缩与SR的运动有关，必须采用比率型(ratiometric)(与强度型(intensiometric)相对)的成像方法来校正运动伪影。
亚细胞区室(例如线粒体、内质网(ER)和SR)的钙离子(Ca2+)浓度范围跨度为低至微摩尔到高至毫摩尔。在具有高Ca2+浓度的区室中，经优化以用于检测细胞质Ca2+(通常为0.1μM至10μM)的荧光指示剂变得饱和，变得对Ca2+浓度的生理相关变化无反应。为解决此问题，已进行大量的研究工作来开发低亲和力的Ca2+指示剂，包括基因编码的荧光蛋白(FP)。与基于合成染料的指示剂相比，基于FP的指示剂随其相应的DNA编码序列递送至细胞，并且可包括在特定组织中表达或靶向特定亚细胞区室的其他序列。
低亲和力指示剂的早期示例包括D1ER和D4cpv，它们基于青色FP和黄色FP之间的Ca2+依赖性荧光共振能量转移(FRET，
Figure BDA0002745310340000011
Resonance Energy Transfer)。基于FRET的指示剂本质上是比率型的，可提供不受因细胞器或细胞运动而产生的成像伪影影响的定量测量值。由单个FP工程化的指示剂往往是强度型的，通常会提供更大的信号变化。第一个基于单个FP的靶向ER的低亲和力Ca2+指示剂是CatchERTM。最近，已发现了许多低亲和力GCaMP型Ca2+指示剂，它们由与钙调蛋白(CaM)融合的环状排列(cp，circularly permutated)FP和与CaM的Ca2+结合形式结合的肽组成。这些指示剂包括CEPIATM、LAR-GECOTM和ER-GCaMPTM系列。另一种发射比率型的低亲和力的基于单个FP的Ca2+指示剂是GEM-CEPIA1erTM，但它需要用高能紫外光(≤400nm)激发，高能紫外光通常与增加的光毒性和自体荧光有关。
可能需要使用可用更长波长(即，更多红移或＞400nm)的光激发的指示剂，因为更长波长(即，更多红移或＞400nm)的光通常与降低的光毒性和自体荧光有关。
提供此背景信息是出于提供申请人认为可能与本发明相关的已知信息的目的。不必然意图为也不应被解释为承认任何前述信息构成了本发明的现有技术。
发明内容
在一方面，本发明可包括一种检测细胞中Ca2+水平变化的方法，该方法包括：
(a)获得包含细胞的样品，该细胞经工程化以表达一种以上低亲和力的Ca2+指示剂，该指示剂选自：LAR-GECO1.5、LAR-GECO2和LAR-GECO3、LAR-GECO4、LAREX-GECO1、LAREX-GECO2、LAREX-GECO3和LAREX-GECO4，或具有与前述任一项基本相似的氨基酸序列的多肽；
(b)使细胞暴露于激发光；以及
(c)通过可视化或成像细胞来检测ER、SR和/或线粒体的Ca2+水平的变化。
在另一方面，本发明可包含选自下组的低亲和力的荧光Ca2+多肽：LAR-GECO1.5，LAR-GECO2和LAR-GECO3、LAR-GECO4、LAREX-GECO1、LAREX-GECO2、LAREX-GECO3和LAREX-GECO4，或具有与前述任一项基本相似的氨基酸序列的多肽。在一些实施方式中，该多肽的氨基酸序列可为SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16或18之一。
在一些实施方式中，该多肽可包含选自下组的突变：I54A、I330M和D327N/I330M/D363N。该多肽对Ca2+的Kd可大于20μM，或优选为约60μM。
在另一方面，本发明可包括编码本发明的低亲和力荧光Ca2+多肽的多核苷酸或基本相似的多核苷酸序列。在一些实施方式中，多核苷酸可包含选自下组的核酸序列：
(a)SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、15或17；
(b)与SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、15或17之一具有至少90％序列同一性且编码荧光Ca2+指示剂的核酸序列，该荧光Ca2+指示剂对Ca2+的Kd大于20μM或可选地为约60μM，但排除SEQ ID NO：1；
(c)编码荧光Ca2+指示剂的核酸序列，该荧光Ca2+指示剂包含SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16或18的氨基酸序列；以及
(d)编码荧光Ca2+指示剂的核酸序列，该荧光Ca2+指示剂与SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16或18(但不包括SEQ ID NO：2)的氨基酸序列具有至少90％序列同一性，该荧光Ca2+指示剂大于20μM或可选地为约60μM。
在一些实施方式中，多核苷酸包含编码氨基酸突变的突变，该氨基酸突变选自：I54A、I330M和D327N/I330M/D363N。
在其他方面，本发明可包括载体或宿主细胞，该载体或宿主细胞包含本发明的多核苷酸序列。在一些实施方式中，宿主细胞是心肌细胞。
附图说明
参考附图，附图通过示例而非限制性的方式详细说明了本发明的几个方面，其中：
图1显示了对低亲和力Ca2+指示剂进行工程化的示意性策略。
图2显示了LAR-GECO1、LAR-GECO1.5、LAR-GECO2、LAR-GECO3和LAR-GECO4的氨基酸序列比对。
图3显示了LAREX-GECO1、LAREX-GECO2、LAREX-GECO3和LAREX-GECO4的氨基酸序列比对。
图4显示了对Ca2+具有宽范围亲和力的强度型和比率型红色Ca2+指示剂。
图5显示了LAR-GECO的体外表征。(A、D、G和J)LAR-GECO1.5(A)、LAR-GECO2(D)、LAR-GECO3(G)和LAR-GECO4(J)的激发光谱和发射光谱。(B、E、H和K)在不含Ca2+的状态(虚线)和结合Ca2+的状态(实线)下的LARGECO1.5(B)、LAR-GECO2(E)、LAR-GECO3(H)和LAR-GECO4(K)的吸收光谱和发射光谱。(C、F、I、L)LAR-GECO1.5(C)、LAR-GECO2(F)、LAR-GECO3(I)和LAR-GECO4(L)的荧光强度与pH的关系。
图6显示了LAREX-GECO的体外表征。(A、D、G和J)LAREX-GECO1(A)、LAREX-GECO2(D)、LAREX-GECO3(G)和LAREX-GECO4(J)的激发光谱和发射光谱。(B、E、H和K)在不含Ca2+的状态(虚线)和结合Ca2+的状态(实线)下的LAREX-GECO1(B)、LAREX-GECO2(E)、LAREX-GECO3(H)和LAREXGECO4(K)的吸收光谱和发射光谱。(C、F、I和L)LAREX-GECO1(C)、LAREX-GECO2(F)、LAREX-GECO3(I)和LAREX-GECO4(L)的荧光强度与pH的关系。
图7显示了HeLa细胞中表达的ER-LAREX-GECO4(n＝7)可检测组胺刺激后的SR Ca2+动力学。ΔR/R＝(R初始-R)/R初始*100％，其中R为在470nm激发下的发射强度与在595nm激发下的发射强度的比率，R初始为初始比率。灰色条表示施用20μM组胺。
图8显示了永生化小鼠心房HL1细胞系中低亲和力Ca2+指示剂的比较。(A)HL1细胞中ER-LAR-GECO3和ER-LAR-GECO4的表达。活细胞图像为左侧的假色红色(图像)，通过共聚焦显微镜拍摄的ER-LAR-GECO3和ER-LAR-GECO4的固定图像在右侧显示为灰度。观察到ER-LAR-GECO3(B)、ER-LAR-GECO4(C)和ER-LAREX-GECO4(D-F)响应于咖啡因刺激后的ER/SRCa2+变化。用488nm(D)和594nm(E)的激光照射实现ER-LAREX-GECO4的比率型刺激。(F)由(D)和(E)计算出ΔR/R0曲线。(G)ER-LAR-GECO4(n＝21)、ER-LAR-GECO3(n＝14)、ER-LAREX-GECO2(n＝8)、ER-LAREX-GECO1(n＝7)、ER-LAREX-GECO4(n＝14)、ER-LAREX-GECO3(n＝8)、R-CEPIAer(n＝15)的性能比较。对于强度型指示剂，ΔFSR＝(F初始-F咖啡因)/F初始*100％，其中F为荧光强度，F初始为初始强度，F咖啡因为添加咖啡因后即刻的强度。对于比率型指示剂，ΔRSR＝(R初始-R咖啡因)/R初始*100％，其中R为在488nm激发下的发射强度与在594nm激发下的发射强度的比率，R初始为初始比率，R咖啡因为添加咖啡因后即刻的比率。
图9显示了相对于G-CEPIAer基准，人胚胎干细胞来源的心肌细胞(hES-CM)中ER-LAR-GECO和ER-LAREX-GECO的性能比较。将hES-CM与ER-LAR-GECO、ER-LAREX-GECO或R-CEPIAer以及G-CEPIAer共转染。通过双视图系统(Dual View system)同时获得单个细胞的每个报告对的代表性发射信号(图的垂直对)。一些细胞(即R-CEPIA-G-CEPIA对)经历了同时收缩和松弛的自发振荡。内插图显示了表达G-CEPIAer和R-CEPIAer的hES-CM的0.8至1分钟的延时。灰色条显示了咖啡因的添加。
图10显示了iPSC来源的心肌细胞(iPSC-CM)中胞质溶胶Ca2+和SR Ca2+的观察。将细胞与G-GECO和ER-LAREX-GECO3共转染，以观察其自发活性和对咖啡因刺激的反应(灰色条)。用488nm的激光照射G-GECO。通过488nm和594nm的激光照射来激发ER-LAREX-GECO3。观察到两种类型的反应。(A和B)在一组细胞中观察到对咖啡因施用的大量初始反应，但自发SR耗竭与随后的Ca2+振荡的关联(coupling)并不明显。(C)第二组细胞显示，在施用咖啡因之前(蓝色箭头)和之后，在iPS-CM中可检测到的自发SR排空与细胞质Ca2+变化的关联。左侧显示各个发射通道的强度，右侧显示已处理的比率型数据集合。
图11显示了在HL 1细胞中观察到响应于G-GECO1的咖啡因刺激的胞质溶胶Ca2+和ER/SR Ca2+变化，其中G-GECO1为(A)ER-LAR-GECO4和(B)ER-LAR-GECO3。灰色粗线表示以相关左侧y轴为比率尺的G-GECO1细胞质发射的平均响应(F/Fo(Cyto))。黑色粗线表示以右侧y轴为比率尺的SR目标红移指示剂的平均响应((F/Fo(SR))。单个细胞响应以细灰色线显示。咖啡因施用以灰色条表示。
图12显示了使用ER-LAREX-GECO3通过比率测量值对人胚胎干细胞来源的心肌细胞(hES-CM)中ER/SR储存的表征。通过488nm和594nm的激光照射来激发ER-LAREX-GECO3。咖啡因会耗尽SR储存，Ca2+会缓慢再填充，伴随小的Ca2+振荡，这在比率(黑色，iii)曲线中更清楚地观察到。
图13显示单波长激发证明在hES-CM中观察细胞质Ca2+(G-GECO)和ER/SR Ca2+(ER-LAREX-GECO4)。(A)显示了蓝光激发的G-GECO和ER-LAREX-GECO4。通过共聚焦显微镜进一步拍摄了ER-LAREX-GECO4的图像(右侧灰度图像)，显示了这些细胞类型中SR的典型无序排列。(B)hES-CM响应于咖啡因治疗的延时。480nm LED用于激发G-GECO和ER-LAREX-GECO4。双视图系统在10Hz同时观察到信号。灰色条显示了咖啡因的施用。
图14显示可在电起搏下使用ER-LAREX-GECO3通过比率测量值监测iPSC-CM中的ER/SR Ca2+动力学。(A)响应于0.5Hz和1.0Hz的电起搏，表达ER-LAREX-GECO3的iPSC-CM的延时。通过470nm(i)和595nm(ii)的LED照明激发ER-LAREX-GECO3，以获取比率成像。在25Hz处观察到信号。(B)由(A)计算出F/F0，其中F为荧光强度，F0为静止强度。R为F/F0(ex 470)/F/F0(ex 595)的比率，显示为黑线(iii)。通过C-Pace EP(ION OPTIX)起搏细胞，电压条件设置为15V。灰色框表示用电极刺激细胞的时隙。
图15显示了干细胞来源的心肌细胞(显示出典型的基本圆形的外观而不是细长的外观)的免疫荧光表征，对肌节成分肌钙蛋白-T和α-辅肌动蛋白进行免疫荧光染色以确认心肌细胞的身份。在这些混合的群中，一小部分细胞是双核的，其中某些区域具有明显更组织化的SERCA染色，可能指示与图13A相比细胞发展成熟。比率尺，10μm。如图所示，从主图像截取的缩放图。
图16显示了用于比率型观察线粒体中钙动力学的HeLa细胞中mt-LAREX-GECO4的表达。(A)mt-LAREX-GECO4的亚细胞分布。比率尺表示10μm。(B)检测到响应于20μM组胺的线粒体中的大量Ca2+流入。通过470nm和595nm的LED发光激发mt-LAREX-GECO4。灰色条表示组胺的施加。
具体实施方式
下文阐述的具体实施方式和附图旨在作为对本发明的各种实施方式的描述，而并非旨在表示发明人所设想的仅有实施方式。出于提供全面理解本发明的目的，具体实施方式包括特定细节，然而，要求保护的发明可不受这些特定细节的限制。
本发明的实施例可提供新型红移低亲和力Ca2+指示剂的工具箱以及编码此类指示剂的多核苷酸序列，该指示剂具有有用的动力学范围和Ca2+亲和力。本文所述的Ca2+指示剂可通过将细胞器特异性靶向序列与指示剂分子融合而选择性地表达并保留在细胞器中。因此，这些指示剂可靶向高浓度的Ca2+储存(例如培养的心肌细胞或线粒体中的SR)，并且可单独成像或与其他指示剂组合成像，使得能直接可视化(迄今为止通常是间接研究的)疾病相关生物学的重要方面。
在一些实施方式中，本发明可包含衍生自LAR-GECO1(Kd＝24μM)[SEQ ID NO：2]的强度型红色荧光低亲和力Ca2+指示剂。为了工程化强度型红色荧光低亲和力Ca2+指示剂，通过改变钙调蛋白(CaM)与鸡砂囊肌球蛋白轻链激酶(RS20)的短肽之间的相互作用以及通过修饰CaM对Ca2+的亲和力，来调节LAR-GECO1的解离常数。参考图1，采用不同的策略合成本文所述的红色荧光低亲和力Ca2+指示剂。
第一种策略涉及通过将RS20的N末端与CaM的C末端融合来修改指示剂拓扑，同时恢复原始的非环状排列(ncp)FP端(即“camgaroo”拓扑，如此称呼是因为指示剂袋携带更小的伴侣)。环状排列(cp)R-GECO1(PDB ID 4I2Y)的结构在此处用于表示LAR-GECO1变体，如图1A的左侧所示。红色荧光蛋白结构域连接至Ca2+结合结构域，该Ca2+结合结构域由钙调蛋白(橙色圆柱)和RS20(灰色圆柱)组成。Ca2+表示为紫色的球。图1A的右侧表示非环状排列(ncp)LAR-GECO1.5[SEQ ID NO：4]。蓝线表示用于ncp拓扑的cp接头或CaM-RS20接头。
替代策略涉及位点特异性诱变，例如，丙氨酸扫描CaM-RS20界面以减弱此种相互作用、在Ca2+结合位点之外的位置掺入突变或在CaM的Ca2+结合位点掺入突变。图1B示例性地显示了策略2、策略3和策略4的实施例。在左侧，显示了LAR-GECO1.5结构，突出了策略2至4的靶向残基。在右侧为RS20和CaM的一级序列，如LAR-GECO1.5结构所示突出了靶向残基。
基于图1所示的策略1，将LAR-GECO1转换为ncp拓扑，得到LAR-GECO1.5，其中CaM和RS20通过Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Val-Asp接头连接，其中FP末端被还原(restore)。在不限于理论的情况下，此种改变的拓扑可能具有两个可能的优点。第一个优点是可将RS20和CaM之间的接头工程化以潜在地改变有效Kd。第二个优点是，由于RS20和CaM之间的直接连接，它们与ER或SR中的内源蛋白相互作用的可能性较小。
LAR-GECO1.5具有与LAR-GECO1相似的Ca2+亲和力，同时保持对Ca2+的荧光响应为7.4倍，表明ncp拓扑结构不会不利地影响该功能。图4显示了归一化的荧光强度与缓冲液(10mM MOPS，100mM KCl，pH 7.2)中游离Ca2+浓度的关系。LAR-GECO1.5的曲线与LAR-GECO1基本上相同。因此，保留了ncp拓扑用于低亲和力Ca2+指示剂的设计和工程化。
使用LAR-GECO1.5作为模板，研究了策略2、3和4(和/或它们的组合)以产生基因变体并在大肠杆菌菌落的背景下表达它们。菌落的荧光成像用于鉴定明亮的荧光克隆，对其进行挑选、培养和检测其Ca2+反应和亲和力。该过程使得鉴定出对Ca2+亲和力降低的三个示例性指示剂。
在丙氨酸扫描构建体中，具有Ile54Ala突变的指示剂(称为LAR-GECO2[SEQ IDNO：6])显示出Ca2+Kd为60μM，发现与Ca2+结合后荧光增加了5.7倍。基于Ile330Met突变，发现了Kd为110μM且对Ca2+的荧光响应为7.5倍的指示剂(称为LAR-GECO3[SEQ ID NO：8])。基于Asp327Asn、Ile330Met和Asp363Asn的突变，发现了Kd为540μM且对Ca2+的荧光响应为13倍的指示剂(命名为LAR-GECO4[SEQ ID NO：10])。
LAR-GECO2、LAR-GECO3和LAR-GECO4的低亲和力与所识别的突变有关，因此，本发明的一些实施方式可包括其他结构域不同但保留相同或相似功能并保留一个以上这些突变的变体多肽。
所有指示剂与ER靶向和保留序列的基因融合以及在HeLa细胞中的表达表现出预期的ER定位模式和亮红色荧光。图7显示，HeLa细胞中表达的ER-LAREX-GECO4可检测组胺刺激后的ER/SR Ca2+动力学。
表1：LAR-GECO系列的体外表征
Figure BDA0002745310340000071
Figure BDA0002745310340000081
因此，如表1所示，LAR-GECO2、LAR-GECO3和LAR-GECO4为红色荧光Ca2+指示剂，它们其为强度型且亲和力低于它们的亲代指示剂LAR-GECO1。
在另一方面，本发明包括比率型低亲和力红色GECO。在一些实施方式中，这些指示剂具有比率型特性，其可降低对运动的敏感性、改善定量测量，并且能够利用双色成像策略进行单波长激发。因此，在一些实施方式中，本发明包括至少四个新的比率型低亲和力红色GECO，其对Ca2+的亲和力为146μM至1023μM，在此称为LAREX-GECO。
这些新型新指示剂源自REX-GECO1，REX-GECO1是先前报道的激发比率型红色Ca2+指示剂，其被工程化为ncp拓扑结构。然后，引入用于工程化上述LAR-GECO3和LAR-GECO4的相同突变，以产生新型指示剂LAREX-GECO1[SEQ ID NO：12]和LAREX-GECO2[SEQ ID NO：14]。图4的图B显示了归一化的激发比率与缓冲液(10mM MOPS，100mM KCl，pH 7.2)中游离Ca2+浓度的关系。激发比率＝480nm/580nm激发荧光强度比率。Kd为Ca2+的解离常数。相对于REX-GECO1(Kd为240nM)，新型指示剂(称为LAREX-GECO1和LAREX-GECO2)分别提供了大幅降低的Ca2+亲和力，分别为146μM和1023μM。
在其他实施方式中，进一步产生了LAREX-GECO衍生物，其中REX-GECO1的CaM部分被R-CEPIA1er的CaM部分替代，R-CEPIA1er是先前报道的强度型低亲和力红色Ca2+指示剂。所得的新型指示剂(称为LAREX-GECO3[SEQ ID NO：16])显示出Ca2+Kd为564μM以及动力学范围为23倍。将LAREX-GECO3蛋白转化为ncp拓扑结构产生了另一个新的指示剂(称为LAREX-GECO4[SEQ ID NO：[18])，其具有相似的Kd为593μM，动力学范围为18倍。
表2总结了LAREX-GECO的表征。
表2：比率型指示剂的概述
Figure BDA0002745310340000091
表3提供了指示剂的钙亲和力的总结。这些指示剂的表征描述如下。
表3：Ca2+指示剂的概述
名称 K<sub>d</sub>(μM) 拓扑结构
LAR-GECO1 24 cp
LAR-GECO1.5 24 ncp
LAR-GECO2 60 ncp
LAR-GECO3 110 ncp
LAR-GECO4 540 ncp
LAREX-GECO1 146 ncp
LAREX-GECO2 1023 ncp
LAREX-GECO3 564 cp
LAREX-GECO4 593 ncp
观察心肌细胞中的Ca2+动力学
在心脏肌肉细胞(称为心肌细胞)中，收缩和松弛需要周期性释放和再摄取Ca2+，因此Ca2+是收缩的关键调节剂。通常，细胞质浓度从舒张期范围(～0.1μM游离Ca2+)变为高一个数量级的收缩期范围(～1μM游离Ca2+)。由于细胞内Ca2+缓冲作用显著，需要约100μM总量的Ca2+才能实现此变化。所需的大多数Ca2+来自SR，SR仅占细胞体积的一小部分，因此所含Ca2+的浓度远高于细胞质。结果，由于缺乏低亲和力Ca2+指示剂，很难观察SR中的Ca2+动力学。由于此原因，通常使用在存在或不存在各种化学抑制剂的情况下响应于咖啡因诱导的SR排空的细胞质Ca2+的间接测量。
低亲和力Ca2+染料Fluo-5N(Kd＝97μM)已用于可视化分离的透性化成年人心室肌细胞中SR Ca2+的变化，但是没有细胞质污染的特定SR负载可能难以实现，并且作为强度型指示剂，它可能易受运动伪影的影响。干细胞来源的心肌细胞缺乏在心室肌细胞中所见的典型空间T管/SR结构，因此无法根据位置信息识别错误的胞质信号。
在一个实施方式中，本发明的指示剂可减轻这些挑战并提供SR Ca2+的生理性逐拍(beat-to-beat)变化，其可在细胞培养物以及干细胞来源的心肌细胞中直接可视化。
细胞培养物中可视化的SR Ca2+的生理变化
在心血管研究中使用了多种模型。在本发明的一个方面，将稳定的永生化细胞系(称为HL1细胞系，来自小鼠心房心肌细胞)的细胞培养物用作模型。
参照图8(图A、B和C)和图11，通过在HL1细胞系中同时表达细胞质G-GECO1来评估ER-LAR-GECO3和ER-LAR-GECO4。响应于10mM咖啡因的添加，胞质溶胶Ca2+信号升高可伴随ER/SR Ca2+信号降低。
参考图8的图D、E和F，通过用在488nm激发的发射强度除以在594nm激发的发射强度，获得ER-LAREX-GECO4的比率型成像。
参考图8的图G，用咖啡因刺激HL1细胞系后，本发明的各种指示剂的强度型或比率型响应(ΔFSR或ΔRSR)的比较显示：ER-LAREX-GECO4和ER-LAREX-GECO3的信号变化最大(分别为-72.9+/-15.2％和-76.0+/-16.1％)。本发明还提供了体外表征，证明ER-LAREX-GECO4(动力学范围18×，Kd＝593μM)和ER-LAREX-GECO3(动力学范围23×，Kd＝564μM)对于检测SR的心肌细胞中周期性舒张(～1000μM至1500μM)至收缩(～300μM至600μM)的Ca2+变化具有大的动力学范围和最佳Kd值。
干细胞中可视化的SR Ca2+的生理变化
在另一方面，本文所述指示剂可提供例如源自人胚胎干细胞(hES)或人诱导的多能干细胞(hiPSC)的心肌细胞中的SR Ca2+水平变化的可视化。此类干细胞可为遗传性心脏病或体外药物毒性和药物筛选平台的模型。
参考图9，绿色低亲和力指示剂G-CEPIAer(报告的动力学范围为4.7×，Kd＝672μM)被用作内标，以最小化细胞表型变异性和不成熟性的影响。在干细胞来源的心肌细胞中，将本文所述指示剂与绿色低亲和力指示剂G-CEPIAer进行比较。除了响应于咖啡因施用引起的SR Ca2+耗竭外，本发明还能可视化生理性逐拍SR排空。
从强度曲线中，红色指示剂的响应(ΔFSR)可除以G-CEPIAer的成对ΔFSR，在同一细胞中产生用于比较的R红/绿比率(红色通道的ΔFSR/G-CEPIAer的ΔFSR)。ER-LAREX-GECO3(R红/绿＝1.03+/-0.08)，它似乎与G-CEPIAer等值。在此系统中，ER-LAREX-GECO3和ER-LAREX-GECO4(R红/绿＝0.71+/-0.02)的性能似乎均优于R-CEPIAer(R红/绿＝0.60+/-0.06)，这与在HL1培养的细胞系中获得的结果以及体外数据一致。细胞之间的孤立比较(例如单独使用G-CEPIAer曲线)可揭示个体应答中的显著异质性，这可能是当前体外干细胞来源的心肌细胞模型的弱点。
比率型LAREX-GECO3和LAREX-GECO4指示剂可在体外系统中提供优势，可在干细胞模型中进一步表征。
相对于一些强度型指示剂，比率型(指示剂)的优点是它们对细胞运动进行自我校正。这是咖啡因刺激方法的一个特殊问题，因为与培养的心肌细胞的规律性振荡收缩和松弛相比，SR的排空可引起更大的运动。此种比率型成像可观察自发性逐拍Ca2+释放和再摄取。参考图12，在施用咖啡因以耗竭SR中的Ca2+浓度后，可很容易地检测到Ca2+再摄取至SR期间的振荡。
另一方面，如图14所示，也可通过ER-LAREX-GECO3检测电起搏下iPSC-CM中逐拍Ca2+浓度变化。
如图6所示，由于比率型指示剂在蓝绿色光谱中具有依赖于Ca2+的激发(如图12所示，其似乎捕获了SR排空和再充填的大部分信息)，本发明的实施方式可能包括在干细胞衍生的心肌细胞中使用G-GECO1和ER-LAREX-GECO4进行单波长双色成像(如图13所示)。这避免了切换照明源的需求，因此它是用于高帧频成像或在某些情况下可能需要长时间观察的策略。
参照图9，由于可能无法在所有表达G-CEPIA的细胞中检测到生理性SR Ca2+耗竭，即使它们全部明显地收缩，本发明可以允许使用iPSC心肌细胞中的G-GECO和ER-LAREX-GECO3的共表达，通过观察胞质溶胶Ca2+来比率测量SR Ca2+的释放，如图10所示。
参考图10的图B，尽管一些细胞似乎在初始咖啡因引起的SR Ca2+耗竭和细胞质Ca2 +积累之间具有初始关联，但可以看出随后的振荡没有联系。然而，参考图10的图C，来自相同干细胞分化的其他细胞已显示出自发胞质溶胶Ca2+瞬变与相邻SR中Ca2+波动的关联，表明咖啡因处理前的SR储存的生理性Ca2+释放有助于胞质溶胶Ca2+。施用咖啡因后，这些细胞显示出细胞质Ca2+瞬时恢复的幅度与SR Ca2+含量的逐渐恢复的相关性，以及后续振荡期间细胞质信号和SR信号的持久关联。
此种细胞自主行为(单独使用细胞质Ca2+曲线可能无法识别)可能反映了体外成熟的不同阶段。支持该点的是，如图13所示，一小部分干细胞来源的心肌细胞似乎发展了组件(例如SERCATM)的更高阶结构，这可能与观察到的激发和收缩的关联有关。
观察线粒体中的Ca2+动力学
已知钙信号传导在调节线粒体功能中起重要作用。线粒体钙(Ca2+)超载是诱导线粒体肿胀的促凋亡方式之一。因此，以预测细胞状态或对不同刺激的响应的方式来实时监测Ca2+动力学将是令人关注的。但是，像ER/SR一样，线粒体也含有高浓度的Ca2+，因此，优化用于研究线粒体中钙信号传导的变体相对较少。本发明的低亲和力指示剂可提供解决方案。图16显示了HeLa细胞中mt-LAREX-GECO4的表达，用于比率型观察线粒体中的钙动力学。(A)mt-LAREX-GECO4的亚细胞分布。比率尺表示10μm。(B)检测到响应于20μM组胺的线粒体中的大量Ca2+流入。通过470nm和595nm的LED发光激发mt-LAREX-GECO4。灰色条表示组胺的施加。
多肽和核苷酸序列
本发明的方面包括本文所述的荧光多肽，其具有所示氨基酸序列或基本相似的氨基酸序列。基本相似的氨基酸序列将具有至少一些水平的序列同一性，具有相同或相似功能。本领域技术人员众所周知，许多水平的序列同一性可用于鉴定多肽，其中此类多肽具有相同或相似的功能或活性。90％以上(即91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的百分比同一性可能是有用的。
在本发明的实施例中，如果多肽具有相似的荧光且对Ca2+具有低亲和力(Kd大于20μM，更优选大于约60μM)，则它们将具有相同或相似的功能。但是，应理解，不包括起源(progenitor)荧光多肽LAR-GECO1和REX-GECO1作为基本相似的序列，也不包括编码起源荧光多肽的任何核酸序列。
如本文所用，“核酸”指多核苷酸，包括脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的单链或双链聚合物。核酸还可包括片段和经修饰的核苷酸。因此，术语“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“核酸片段”可互换使用，其为单链或双链的RNA或DNA的聚合物，可选地含有合成的非天然或改变的核苷酸碱基。核苷酸(通常以5'-单磷酸酯形式存在)用以下单个字母表示：“A”代表腺苷酸或脱氧腺苷酸(分别为RNA或DNA)，“C”代表胞苷酸或脱氧胞苷酸，“G”代表代表鸟苷酸或脱氧鸟苷酸，“U”代表尿嘧啶，“T”代表脱氧胸苷酸，“R”代表嘌呤(A或G)，“Y”代表嘧啶(C或T)，“K”代表G或T，“H”代表A或C或T，“I”代表肌苷，“N”代表任何核苷酸。
术语“同源性”、“同源”、“基本上相似”和“基本上对应”在本文中可互换使用。它们指核酸片段，其中一个以上核苷酸碱基的改变不影响该核酸片段介导基因表达或产生某种表型的能力。这些术语还指核酸片段的修饰，例如，相对于未经修饰的初始片段基本上不改变所得核酸片段的功能特性的一个以上核苷酸的缺失或插入。因此，如本领域技术人员理解的，本发明不仅仅包括特定的示例性序列。
本发明还可包含编码具有本文所述氨基酸序列或基本相似的氨基酸序列的多肽的核酸序列，以及基本相似的核酸序列。基本相似的核酸序列可具有90％以上(即91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的序列同一性。
在核酸或多肽序列的上下文中，“序列同一性”或“同一性”指当在指定的比较窗口上比对以获得最大对应性时，两个序列中相同的核酸碱基或氨基酸残基。因此，“序列同一性百分比”指通过在比较窗口中比较两个最佳比对的序列而确定的值；其中，对于两个序列最佳比对，与参考序列(其不包含添加或缺失)相比，比较窗口中多核苷酸或多肽序列的部分可包含添加或缺失(即空位)。通过确定两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位点数，产生匹配位点数，将匹配位点数除以比较窗口中的位点总数，计算百分比，然后将结果乘以100产生序列同一性的百分比，由此来计算百分比。这些同一性可由本领域技术人员确定，包括使用本文所述的任何程序。
可使用被设计为检测同源序列的多种比较方法来确定序列比对和同一性百分比或相似性百分比计算，包括但不限于LASERGENE生物信息学计算套件的MegAlignTM程序(DNASTAR Inc.，麦迪逊，威斯康星州)。在本申请的上下文中，应理解，在使用序列分析软件进行分析的情况下，除非另有说明，否则分析的结果将基于所用程序的“默认值”。如本文中所使用的，“默认值”将指在首次初始化时软件最初加载的任何一组值或参数。
“Clustal V比对方法”对应于标记为Clustal V(描述于Higgins和Sharp，CABIOS，5：151-153(1989)；Higgins，DG等(1992)Comput.Appl.Biosci.8：189-191)，且可在LASERGENE生物信息学计算套件(DNASTAR Inc.，麦迪逊，威斯康星州)的MegAlignTM程序中找到的比对方法。对于多重比对，默认值对应于GAP PENALTY＝10和GAP LENGTH PENALTY＝10。使用Clustal方法进行配对比对和计算蛋白质序列同一性百分比的默认参数为KTUPLE＝1、GAP PENALTY＝3、WINDOW＝5和DIAGONALS SAVED＝5。对于核酸，这些参数为KTUPLE＝2、GAP PENALTY＝5、WINDOW＝4和DIAGONALS SAVED＝4。使用Clustal V程序比对后序列后，可通过查看同一程序中的“序列距离”表来获得“同一性百分比”。
“BLASTN比对方法”是由美国国家生物技术信息中心(NCBI)提供的用于使用默认参数比较核苷酸序列的算法。
此外，本领域技术人员认可，本发明涵盖的基本相似的核酸序列也由它们与本文所述序列或与本文所公开核苷酸序列的任何部分(并且其在功能上等同于本文所公开的任何核酸序列)杂交的能力(在中等严格条件下，例如0.5xSSC、0.1％SDS、60℃)定义。可调节严格条件以筛选中等相似的片段(例如来自远亲生物的同源序列)至高度相似的片段(例如复制近亲生物的功能酶的基因)。杂交后洗涤要求严格条件。
术语“选择性杂交”包括在严格杂交条件下，与杂交非靶核酸序列相比，核酸序列与特定核酸靶序列的杂交达到可检测的更高程度(例如比背景高至少2倍)，实质性地排除了“非靶核酸”。选择性杂交序列彼此之间通常具有至少约80％的序列同一性，或85％、90％或95％的序列同一性，直至并包括100％的序列同一性(即，完全互补)。
术语“严格条件”或“严格杂交条件”包括探针将选择性地与其靶序列杂交的条件。严格条件取决于序列，在不同情况下会有所不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可鉴定与探针100％互补的靶序列(同源探测)。或者，可调节严格条件以允许序列中的一些失配(mismatching)，从而检测到更低的相似度(异源探测)。通常，探针的长度小于约1000个核苷酸，可选地长度小于500个核苷酸。
通常，严格条件将为以下条件：在pH 7.0至8.3下，盐浓度小于约1.5M Na离子，通常约0.01M至1.0M Na离子浓度(或其他盐)，对于短探针(例如10至50个核苷酸)温度为至少约30℃，对于长探针(例如大于50个核苷酸)温度为至少约60℃。加入去稳定剂(例如甲酰胺)也可达到严格条件。示例性的低严格性条件包括：在37℃下用30％至35％甲酰胺、1MNaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液杂交，在50℃至55℃下用1x SSC至2x SSC(20xSSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)洗涤。示例性的中等严格条件包括：在37℃下用40至45％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS杂交，在55℃至60℃下在0.5x SSC至1x SSC洗涤。示例性的高严格性条件包括：在37℃下用50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS杂交，在60℃至65℃下用0.1xSSC洗涤。
通常，特异性是杂交后洗涤的函数(function)，关键因素是最终洗涤溶液的离子强度和温度。对于DNA-DNA杂交体，可根据Meinkoth等(Anal.Biochem.138:267-284(1984))的方程近似得到Tm：Tm＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％甲酰胺)-500/L；其中，M为单价阳离子的摩尔浓度，％GC为DNA中鸟苷核苷酸和胞嘧啶核苷酸的百分比，％甲酰胺为杂交溶液中甲酰胺的百分比，以及L为碱基对中杂交体的长度。Tm是(在规定离子强度和pH下)50％的互补靶序列与完全匹配的探针杂交时的温度。每失配1％，Tm降低约1℃；因此，可调节Tm、杂交和/或洗涤条件以与所需同一性的序列杂交。例如，如果寻求具有>90％同一性的序列，则可将Tm降低10℃。通常，将严格条件选择为比特定序列及其补体在规定离子强度和pH值下的热熔点(Tm)低约5℃。但是，高严格条件可利用在比热熔点(Tm)低1℃、2℃、3℃或4℃下进行杂交和/或洗涤；中等严格条件可利用在比热熔点(Tm)低6℃、7℃、8℃、9℃或10℃下进行杂交和/或洗涤；低严格条件可利用在比热熔点(Tm)低11℃、12℃、13℃、14℃、15℃或20℃下进行杂交和/或洗涤。使用该方程，杂交和洗涤组合物以及所需的Tm，普通技术人员将理解，内在地描述了杂交和/或洗涤溶液的严格性的变化。如果所需的失配程度导致Tm小于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，则优选增加SSC浓度，使得可使用更高的温度。有关核酸杂交的详尽指南可见于Tijssen，《生物化学和分子生物学实验室技术-用核酸探针杂交》(Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes)第I部分第2章“杂交原理和核酸探针测定策略概述”，Elsevier，纽约(1993)；以及《分子生物学当前方案》(Current Protocols inMolecular Biology)，第2章，Ausubel等编，Greene Publishing和Wiley-Interscience，纽约(1995)。杂交和/或洗涤条件可施加至少10分钟、30分钟、60分钟、90分钟、120分钟或240分钟。
实施例
参考以下实施例描述本发明的实施方式。提供这些实施例仅用于说明目的。
实施例1A：LAR-GECO的工程化
pBAD/His B vectorTM(Life Technologies)中的LAR-GECO1被用作组装LAR-GECO1.5的初始模板(策略1–图1)。Wu等，Red fluorescent genetically encoded Ca2+indicators for use in mitochondria and endoplasmic reticulum，Biochem J.2014Nov 15；464(1):13-22描述了LAR-GECO1的发展，其全部内容通过引用并入本文(允许时)。
LAR-GECO1中RS20的N末端和CaM的C末端通过氨基酸序列(GGGGSVD)连接，而初始的ncp FP末端通过重叠延伸聚合酶链反应(PCR)恢复。为探索导致LAR-GECO2、LAR-GECO3和LAR-GECO4形成的策略2、策略3和策略4，遵循制造商的说明，使用Quikchange LightningSite-directed Mutagenesis KitTM(安捷伦)，将表4中所列点突变引入LAR-GECO1.5。借助安捷伦在线诱变引物设计程序设计包含特定突变的寡核苷酸。
表4：为工程化LAR指示剂系列引入的突变的概述
Figure BDA0002745310340000161
Figure BDA0002745310340000171
实施例1B：LAREX-GECO的工程化
为工程化LAREX-GECO1和LAREX-GECO2，如上所述，首先通过重叠延伸PCR将pBAD/His B载体(Life Technologies)中的REX-GECO1转变为ncp拓扑结构。然后使用如上所述的Quikchange闪电定点诱变试剂盒(Quikchange Lightning Site-Directed MutagenesisKit)(安捷伦)，将LAR-GECO3和LAR-GECO4的点突变引入REX-GECO1的此ncp版本，分别制成LAREX-GECO1和LAREX-GECO2。为构建LAREX-GECO3，通过重叠延伸PCR，将REX-GECO1的CaM结构域替换为R-CEPIA1er的CaM结构域。pCMV R-CEPIA1erTM为Masamitsu IinoTM(Addgene质粒#58216)的赠品。如上所述，通过将LAREX-GECO3的拓扑结构变更为ncp来构建LAREX-GECO4。通过测序来验证所有LAR-GECO和LAREX-GECO构建体的序列。
为测试所有LAR-GECO和LAREX-GECO变体的Ca2+亲和力，将pBAD/His B载体(LifeTechnologies)中的每种变体电穿孔到大肠杆菌(E.coli)菌株DH10BTM(Invitrogen)中。然后将含有这些变体的大肠杆菌在补充有400μg/mL氨苄青霉素(Sigma)和0.02％(wt/vol)L-阿拉伯糖(Alfa Aesar)的10cm LB-琼脂培养皿中于37℃培养过夜。然后将这些培养皿在室温下放置24小时，然后成像。成像期间，通过使用542/27nm(用于LAR-GECO变体)或438/24nm和542/27nm两者(用于LAREX-GECO变体)的激发滤光片来照射大肠杆菌菌落和609/57nm的发射滤光片，捕获每个培养皿的图像。然后，挑出每种变体的发射红色荧光的单个大肠杆菌菌落，在加有100μg/mL氨苄青霉素和0.02％(wt/vol)L-阿拉伯糖的4mL液体LB中于37℃培养过夜。然后按照制造商的说明，通过B-PERTM(Pierce)从液体LB培养物中提取蛋白质。然后将提取的每种变体的蛋白溶液进行Ca2+滴定。在Ca2+滴定中，将提取的蛋白质溶液添加到具有不同游离Ca2+浓度的Ca2+缓冲液中。通过混合Ca2+饱和的缓冲液和不含Ca2+的缓冲液(30mMMOPS，100mM KCl，10mM螯合剂，pH 7.2，含或不含10mM Ca2+)，来制备Ca2+/HEDTA缓冲液和Ca2 +/NTA缓冲液，实现0mM至1.3mM的缓冲液Ca2+浓度。通过使用Safire2TM荧光酶标仪(Tecan)，记录不同Ca2+浓度下每种变体的荧光光谱。然后将这些荧光强度相对于Ca2+浓度作图，通过希尔方程进行拟合，计算每种变体对Ca2+的解离常数。
实施例2：体外表征
为详细表征LAR-GECO，按照Wu J，Liu L，Matsuda T，Zhao Y，Rebane A，DrobizhevM等，Improved orange and red Ca2+indicators and photophysical considerationsfor optogenetic applications，ACS Chem Neurosci.2013；4:963–972(Wu等，2013)中所述，表达和纯化蛋白质。在含有10mM EGTA或10mM CaNTA、30mM MOPS、100mM KCl、pH 7.2的溶液中进行光谱测量。为确定LAR-GECO和LAREX-GECO的荧光量子产率，以mCherry和LSS-mKate2为标准。Wu等(2013年)已描述了测量Ca2+的荧光量子产率、消光系数、pKa、Kd的程序。对于Ca2+滴定，将纯化的蛋白添加到Ca2+/HEDTA缓冲液和Ca2+/NTA缓冲液中，如上所述进行荧光测量。
参考图5，LAR-GECO1.5、LAR-GECO2、LAR-GECO3和LAR-GECO4的体外表征显示，所有四个ncp Ca2+指示剂与其起源LAR-GECO1具有基本相同的光谱特性。此外，这些新型LAR-GECO在无Ca2+的状态下表现出相似的对pH的单相依赖性。与Ca2+结合后，对pH的这种依赖性从单相变为双相，这与LAR-GECO1的pH依赖性非常相似。
参考图6，新型LAREX-GECO与它们的起源REX-GECO1具有非常相似的光谱特性。此外，这些LAREX-GECO显示出与REX-GECO1类似的pH依赖性曲线，其中最大Ca2+依赖性比率变化发生pH 7至9之间。
实施例3：用于哺乳动物细胞成像的质粒
使用含有ER靶向序列(MLLPVPLLLGLLGAAAD[SEQ ID NO：19])和ER保留信号序列(KDEL)的引物，产生靶向ER的GECO基因。用BamHITM和EcoRITM限制酶(Thermo)消化PCR产物。将消化的DNA片段与事先用相同的两种酶消化的经修饰的pcDNA3质粒进行连接。用GeneJETminiprep kitTM(Thermo)纯化质粒，然后测序以验证插入的基因。
实施例4：细胞培养条件和转染
为培养HL1细胞系，用明胶/纤连蛋白预涂烧瓶，在37℃下过夜。在补充ClaycombMediumTM(含10％胎牛血清的Claycomb培养基(Sigma Aldrich 12103C(批次8A0177))、1U/ml青霉素/链霉素、0.1mM去甲肾上腺素和2mM L-谷氨酰胺)中培养细胞，在细胞达到汇合时进行1：3分装。使用转染试剂Lipofectamine 2000(Invitrogen)转染细胞48小时，然后获取图像。
在含有DMEM/F12TM(Invitrogen)、20％敲除血清替代品(Knockout SerumReplacer)TM(KSR，Invitrogen)、1mM谷氨酰胺、1％非必需氨基酸、125μM巯基乙醇、0.625％青霉素/链霉素和4ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)(Peprotech)的ES培养基中，用小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)培养OxF2人类胚胎干细胞系。分化前一周，手动分割ES集落，将其置于mTeSR1培养基TM(Stemcell)的GeltrexTM(Gibco)包被的六孔板上。
人iPSC来源的心肌细胞(人iPSC心肌细胞-男性|ax2505TM)购自Axol Bioscience。将细胞铺在6孔板的2个孔中，在Axol心肌细胞维持培养基(Axol's CardiomyocyteMaintenance Medium)TM中培养8天，至80％-90％汇合。然后将细胞重新铺在纤连蛋白/明胶(0.5％/0.1％)包被的玻璃底培养皿上，用转染试剂Lipofectamine 2000(Invitrogen)进行转染。台氏缓冲液(Tyrode’s buffer)用于最终观察。
在自制的35mm玻璃底培养皿中，用含有10％胎牛血清(Invitrogen)的Dulbecco改良Eagle培养基(Dulbecco’s modified Eagle medium)(Sigma–Aldrich)培养HeLa细胞。使用转染试剂Lipofectamine 2000(Invitrogen)，用CMV-mito-LAREX-GECO4、ER-LAREX-GECO3和ER-LAREX-GECO4转染细胞。
实施例5：由人多能干细胞分化心肌细胞
此方案基于Lian X，Zhang J，Azarin SM，Zhu K，Hazeltine LB，Bao X等Lian X,Zhang J,Azarin SM,Zhu K,Hazeltine LB,Bao X,et al.Directed cardiomyocytedifferentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-cateninsignaling under fully defined conditions，Nat Protoc.2013；8:162–175中报道的方法。使用Accutase将ES细胞集落解离为单个细胞，放入Geltrex包被的6孔板中(0.5×106个细胞/孔)，6孔板中装有添加有rock抑制剂Y27632(10μM)的mTeSR1。在第3天，在80％至90％汇合时，将培养基更换为RPMI/B27(不含胰岛素的B27补充剂–Gibco)，该培养基含有12μMGSK-3抑制剂(CHIR 99021TocrisTM)。24小时后，更换培养基以除去CHIR。48小时后，从每个孔中吸出一半的培养基(1ml)，用新鲜RPMI/B27代替，该新鲜RPMI/B27中含有最终浓度为5μM的wnt抑制剂IWP 2TM(Tocris)。48小时后，除去IWP，再过48小时后，将培养基换为含胰岛素的RPMI+B27TM(Gibco)。将培养物保持在该培养基中，该培养基每周更换两次。然后将细胞重新铺在纤连蛋白/明胶(0.5％/0.1％)包被的玻璃底培养皿上，用转染试剂Lipofectamine2000(Invitrogen)转染。
实施例6：免疫染色以表征hES来源的心肌细胞
一抗为小鼠单克隆抗辅肌动蛋白(Sigma号A7811)兔多克隆抗肌钙蛋白I(abcam，ab47003)和小鼠单克隆抗SERCA2 ATPaseTM(ABR号MA3-910)。二抗为Fab片段抗小鼠488和抗兔568TM(Molecular Probes)。程序如下：4％低聚甲醛固定(室温10分钟)，Tris缓冲盐水(TBST)中的0.1％Triton x-100进行透化和洗涤，TBST中加有0.001％叠氮化钠的2％BSA进行封闭(室温1小时)，1：200的一抗(室温2小时)，用TBST洗涤3次(每次洗涤5分钟)，1：1000的二抗(室温1小时)，用TBST洗涤3次(每次洗涤5分钟)，干燥盖玻片，安装在VectorshieldTM(Vector Laboratories)中。用Leica SP5共焦显微镜使用63x油镜在488nm和543nm激发下进行荧光成像。
实施例7：活细胞成像条件
对于非比率型成像，使用配备有60倍物镜(NA 1.42TM，奥林巴斯)和多波长LED光源(OptoLEDTM，CARIN)的倒置显微镜(IX81TM，奥林巴斯)。蓝色(470nm)和绿色(550nm)激发分别用于照亮G-GECO或G-CEPIA和LAR-GECO。GFP滤光片组(DS/FF02-485/20-25，T495lpxr二向色镜和ET525/50发射滤光片)用于观察HL1细胞中G-GECO的信号。RFP滤波器组(DS/FF01-560/25-25，T565lpxr二向色镜和ET620/60发射滤波器)用于观察HL1细胞中LAR-GECO3和LAR-GECO4的信号。四频滤波器组，包括四频带通滤波器(DS/FF01-387/485/559/649-25，Semrock)、二向色四边分束器(DS/FF410/504/582/669-Di01-25x36TM(Semrock)和四波段带通发射滤波器(DS/FF01-440/521/607/700-25TM，Semrock)用于同时观察ES-CM中的G-CEPIA和LAR-GECO或G-GECO和LAR-GECO。通过由软件(CellRTM，Olympus)控制的双视图系统(DC2TM，Photometrics)记录荧光信号，该系统具有连接至EM-CCD相机(ImagEMTM，Hamamatsu)的绿色(520/30nm)和红色(630/50nm)通道。
为了通过LAREX-GECO对HL1细胞、ES-CM和iPS-CM进行比率成像，使用配备有63×1.40NA油物镜和多氩离子激光的倒置共聚焦显微镜ZEISS LSM710TM。在HL1细胞中，使用488nm激发和594nm激发分别在560nm-710nm和630nm-720nm波长范围内检测到LAREX-GECO的红色荧光图像和远红色信号。对于iPS-CM中的同时比率型ER Ca2+和细胞质Ca2+瞬变，使用488nm激发和594nm激发分别在492nm-540nm、630nm-728nm和630-728nm波长范围内检测到绿色、红色和远红色信号。
为了对HeLa细胞(图7和图16)和iPSC-CM(图14)进行比率成像，使用配备有63倍物镜(NA 1.4，Zeiss)和多波长LED光源(pE-4000，CoolLED)的倒置显微镜(D1，Zeiss)。使用蓝色(470nm)和橙色(595nm)激发来照亮LAREX-GECO，以进行比率激发。RFP滤光片组(T590lpxr二向色镜和ET 590lp发射滤光片)用于LAREX的成像。使用由软件(HC Image)控制的CMOS相机(ORCA-Flash4.0LT，HAMAMATSU)记录荧光信号。
实施例8：CMV-mito-LAREX-GECO4载体的构建
如下由pcDNA3-LAREX-GECO4(无ER靶向和保留序列)亚克隆LAREX-GECO4：使用具有5'BamHI接头(MT-BamHI-LAREX_GECO4-F)和3'HindIII接头(MT-HindIII-LAREX-GECO4-R)的PCR引物扩增LAREX-GECO4，该LAREX-GECO4不包含ER靶向(MLLPVPLLLGLLGAAAD[SEQ IDNO：19])和来自pcDNA3-LAREX-GECO4质粒、连接有BamHI的保留序列(KDEL)，用HindIII消化的CMV-mito-LAR-GECO1.2(Addgene#61245)代替LAR-GECO1.2片段。添加起始密码子(ATG)替代ER靶向序列，添加终止密码子(TAA)代替保留序列。
克隆步骤中使用的寡核苷酸为MT-BamHI-LAREX_GECO4-F：5'-GATCGGATCCAACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGGAT-3'[SEQ ID NO：20]和MT-HindIII-LAREX_GECO4-R：5’-GATCAAGCTTTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3’[SEQ ID NO：21]。
序列表
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说明
已出于说明和描述的目的给出了本发明的说明书，但其并不旨在为穷举的或将本发明限于所公开的形式。在不脱离本发明的范围和精神的情况下，许多修改和变型对于本领域普通技术人员将是显而易见的。选择和描述实施方式是为最好地解释本发明的原理和实际应用，并使本领域的其他普通技术人员理解，可对本发明各种实施方式进行各种修改以适用于预期的特定用途。就以下描述是本发明的特定实施方式或特定用途的程度而言，其仅旨在是说明性的，而非限制要求保护的发明。
本说明书所附权利要求书中的所有手段或步骤加上功能元件的相应结构、材料、操作和等同物，旨在包括用于进行与如具体要求保护的其他要素相结合的功能的任何结构、材料或操作。
说明书中对“一个实施方式”、“一个实施例”等的引用表示，所描述的实施方式可包括特定方面、特征、结构或特性，但是并非每个实施例都必须包括该方面、特征、结构或特性。而且，此类短语可以指但并非必须指说明书其他部分中所指的相同实施方式。此外，当结合实施方式描述特定方面、特征、结构或特性时，将此种方面、特征、结构或特性与其他实施方式组合、影响或连接在本领域技术人员的知识范围内，无论是否明确地说明此种连接或组合。换言之，任何要素或特征可与任何不同实施方式中的其他要素或特征组合，除非两者之间存在明显或固有的不兼容，或者将其特别排除在外。
还应注意，权利要求书可被撰写为排除任何可选要素。如此，该陈述旨在作为与权利要求要素的叙述相关的排他性术语(例如“只”、“仅”等)的使用或“否定”限定的在先基础。术语“优选地”、“优选的”、“优选”、“可选地”、“可”和类似的术语用于表示，所引用的项目、条件或步骤是本发明的可选的(非必需的)特征。
除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数形式。术语“和/或”指与该术语相关的任一项、这些项的任何组合或所有项。
如本领域技术人员将理解的，出于任何目的和所有目的，特别是在提供书面说明方面，本文列举的所有范围也涵盖任何和所有可能的子范围及其子范围的组合，以及组成范围的单个值，特别是整数值。列举的范围(例如，重量百分比或碳基)包括该范围内的每个特定值、整数、小数或恒等式。任何列出的范围均可很容易地识别为充分描述，并且可将同一范围分解为至少相等的二分之一、三分之一、四分之一、五分之一或十分之一。作为非限制性示例，本文所述任何范围可容易地分成下三分之一、中三分之一和上三分之一等。
如本领域的技术人员还将理解，本文描述的所有范围以及所有语言，例如“最多”、“至少”、“大于”、“小于”、“超过”“以上”等，包括所列举的数字，并且这些术语指可随后分成上述子范围的范围。
序列表
<110> 阿尔伯塔大学理事会（The Governors of the University of Alberta）
<120> 用于可激发和不可激发细胞中Ca2+成像的低亲和力红色荧光指示剂
<130> 55326.272 PCT
<160> 21
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1251
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
atggtcgact cttcacgtcg taagtggaat aaggcaggtc acgcatggag agctataggt 60
cggctgagct cacccgtggt ttccgagcgg atgtaccccg aggacggagc cctgaagagc 120
gagatcaaga aggggctgag gctgaaggac ggcggccact acgccgccga ggtcaagacc 180
acctacaagg ccaagaagcc cgtgcagctg cccggcgcct acgtcgtcga catcaagttg 240
gacatcgtgt cccacaacga ggactacacc atcgtggaac agtgcgaacg cgccgagggc 300
cgccactcca ccggcggcat ggacgagctg tacaagggag gtacaggcgg gagtctggtg 360
agcaagggcg aggaggataa catggccatc atcaaggagt tcatgcgctt caaggtgcac 420
atggagggct ccgtgaacgg ccacgagttc gagatcgagg gcgagggcga gggccgcccc 480
tacgaggcct ttcagaccgc taagctgaag gtgaccaagg gtggccccct gcccttcgcc 540
tgggacatcc tgtcccctca gttcatgtac ggctccaagg cctacattaa gcacccagcc 600
gacatccccg actacttcaa gctgtccttc cccgagggct tcaggtggga gcgcgtgatg 660
aacttcgagg acggcggcat tattcacgtt aaccaggact cctccctgca ggacggcgta 720
ttcatctaca aggtgaagct gcgcggcacc aacttccccc ccgacggccc cgtaatgcag 780
aagaagacca tgggctggga ggctacgcgc gaccaactga ctgaagagca gatcgcagaa 840
tttaaagagg ctttctccct atttgacaag gacggggatg ggacgataac aaccaaggag 900
ctggggacgg tgatgcggtc tctggggcag aaccccacag aagcagagct gcaggacatg 960
atcagtgaag tagatgccga cggtgacggc acattcgact tccctgagtt cctgacgatg 1020
atggcaagaa aaatgaatta cacagacagt gaagaggaaa ttagagaagc gttccgcgtg 1080
gcggataagg acggcaatgg ctacatcggc gcagcagagc ttcgccacgc gatgacagac 1140
attggagaga agttaacaga tgaggaggtt gatgaaatga tcagggtagc agacatcgat 1200
ggggatggtc aggtaaacta cgaagagttt gtacaaatga tgacagcgaa g 1251
<210> 2
<211> 417
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 2
Met Val Asp Ser Ser Arg Arg Lys Trp Asn Lys Ala Gly His Ala Trp
1 5 10 15
Arg Ala Ile Gly Arg Leu Ser Ser Pro Val Val Ser Glu Arg Met Tyr
20 25 30
Pro Glu Asp Gly Ala Leu Lys Ser Glu Ile Lys Lys Gly Leu Arg Leu
35 40 45
Lys Asp Gly Gly His Tyr Ala Ala Glu Val Lys Thr Thr Tyr Lys Ala
50 55 60
Lys Lys Pro Val Gln Leu Pro Gly Ala Tyr Val Val Asp Ile Lys Leu
65 70 75 80
Asp Ile Val Ser His Asn Glu Asp Tyr Thr Ile Val Glu Gln Cys Glu
85 90 95
Arg Ala Glu Gly Arg His Ser Thr Gly Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
100 105 110
Gly Gly Thr Gly Gly Ser Leu Val Ser Lys Gly Glu Glu Asp Asn Met
115 120 125
Ala Ile Ile Lys Glu Phe Met Arg Phe Lys Val His Met Glu Gly Ser
130 135 140
Val Asn Gly His Glu Phe Glu Ile Glu Gly Glu Gly Glu Gly Arg Pro
145 150 155 160
Tyr Glu Ala Phe Gln Thr Ala Lys Leu Lys Val Thr Lys Gly Gly Pro
165 170 175
Leu Pro Phe Ala Trp Asp Ile Leu Ser Pro Gln Phe Met Tyr Gly Ser
180 185 190
Lys Ala Tyr Ile Lys His Pro Ala Asp Ile Pro Asp Tyr Phe Lys Leu
195 200 205
Ser Phe Pro Glu Gly Phe Arg Trp Glu Arg Val Met Asn Phe Glu Asp
210 215 220
Gly Gly Ile Ile His Val Asn Gln Asp Ser Ser Leu Gln Asp Gly Val
225 230 235 240
Phe Ile Tyr Lys Val Lys Leu Arg Gly Thr Asn Phe Pro Pro Asp Gly
245 250 255
Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Met Gly Trp Glu Ala Thr Arg Asp Gln
260 265 270
Leu Thr Glu Glu Gln Ile Ala Glu Phe Lys Glu Ala Phe Ser Leu Phe
275 280 285
Asp Lys Asp Gly Asp Gly Thr Ile Thr Thr Lys Glu Leu Gly Thr Val
290 295 300
Met Arg Ser Leu Gly Gln Asn Pro Thr Glu Ala Glu Leu Gln Asp Met
305 310 315 320
Ile Ser Glu Val Asp Ala Asp Gly Asp Gly Thr Phe Asp Phe Pro Glu
325 330 335
Phe Leu Thr Met Met Ala Arg Lys Met Asn Tyr Thr Asp Ser Glu Glu
340 345 350
Glu Ile Arg Glu Ala Phe Arg Val Ala Asp Lys Asp Gly Asn Gly Tyr
355 360 365
Ile Gly Ala Ala Glu Leu Arg His Ala Met Thr Asp Ile Gly Glu Lys
370 375 380
Leu Thr Asp Glu Glu Val Asp Glu Met Ile Arg Val Ala Asp Ile Asp
385 390 395 400
Gly Asp Gly Gln Val Asn Tyr Glu Glu Phe Val Gln Met Met Thr Ala
405 410 415
Lys
<210> 3
<211> 1254
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 3
atggggagtc tggtgagcaa gggcgaggag gataacatgg ccatcatcaa ggagttcatg 60
cgcttcaagg tgcacatgga gggctccgtg aacggccacg agttcgagat cgagggcgag 120
ggcgagggcc gcccctacga ggcctttcag accgctaagc tgaaggtgac caagggtggc 180
cccctgccct tcgcctggga catcctgtcc cctcagttca tgtacggctc caaggcctac 240
attaagcacc cagccgacat ccccgactac ttcaagctgt ccttccccga gggcttcagg 300
tgggagcgcg tgatgaactt cgaggacggc ggcattattc acgttaacca ggactcctcc 360
ctgcaggacg gcgtattcat ctacaaggtg aagctgcgcg gcaccaactt cccccccgac 420
ggccccgtaa tgcagaagaa gaccatgggc tgggaggcta cgcgcgacca actgactgaa 480
gagcagatcg cagaatttaa agaggctttc tccctatttg acaaggacgg ggatgggacg 540
ataacaacca aggagctggg gacggtgatg cggtctctgg ggcagaaccc cacagaagca 600
gagctgcagg acatgatcag tgaagtagat gccgacggtg acggcacatt cgacttccct 660
gagttcctga cgatgatggc aagaaaaatg aattacacag acagtgaaga ggaaattaga 720
gaagcgttcc gcgtggcgga taaggacggc aatggctaca tcggcgcagc agagcttcgc 780
cacgcgatga cagacattgg agagaagtta acagatgagg aggttgatga aatgatcagg 840
gtagcagaca tcgatgggga tggtcaggta aactacgaag agtttgtaca aatgatgaca 900
gcgaagggtg gcggaggttc tgtcgactca tcacgtcgta agtggaataa ggcaggtcac 960
gcatggagag ctataggtcg gctgagctca cccgtggttt ccgagcggat gtaccccgag 1020
gacggagccc tgaagagcga gatcaagaag gggctgaggc tgaaggacgg cggccactac 1080
gccgccgagg tcaagaccac ctacaaggcc aagaagcccg tgcagctgcc cggcgcctac 1140
gtcgtcgaca tcaagttgga catcgtgtcc cacaacgagg actacaccat cgtggaacag 1200
tgcgaacgcg ccgagggccg ccactccacc ggcggcatgg tcgggctgta caag 1254
<210> 4
<211> 418
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 4
Met Gly Ser Leu Val Ser Lys Gly Glu Glu Asp Asn Met Ala Ile Ile
1 5 10 15
Lys Glu Phe Met Arg Phe Lys Val His Met Glu Gly Ser Val Asn Gly
20 25 30
His Glu Phe Glu Ile Glu Gly Glu Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Ala
35 40 45
Phe Gln Thr Ala Lys Leu Lys Val Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe
50 55 60
Ala Trp Asp Ile Leu Ser Pro Gln Phe Met Tyr Gly Ser Lys Ala Tyr
65 70 75 80
Ile Lys His Pro Ala Asp Ile Pro Asp Tyr Phe Lys Leu Ser Phe Pro
85 90 95
Glu Gly Phe Arg Trp Glu Arg Val Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Ile
100 105 110
Ile His Val Asn Gln Asp Ser Ser Leu Gln Asp Gly Val Phe Ile Tyr
115 120 125
Lys Val Lys Leu Arg Gly Thr Asn Phe Pro Pro Asp Gly Pro Val Met
130 135 140
Gln Lys Lys Thr Met Gly Trp Glu Ala Thr Arg Asp Gln Leu Thr Glu
145 150 155 160
Glu Gln Ile Ala Glu Phe Lys Glu Ala Phe Ser Leu Phe Asp Lys Asp
165 170 175
Gly Asp Gly Thr Ile Thr Thr Lys Glu Leu Gly Thr Val Met Arg Ser
180 185 190
Leu Gly Gln Asn Pro Thr Glu Ala Glu Leu Gln Asp Met Ile Ser Glu
195 200 205
Val Asp Ala Asp Gly Asp Gly Thr Phe Asp Phe Pro Glu Phe Leu Thr
210 215 220
Met Met Ala Arg Lys Met Asn Tyr Thr Asp Ser Glu Glu Glu Ile Arg
225 230 235 240
Glu Ala Phe Arg Val Ala Asp Lys Asp Gly Asn Gly Tyr Ile Gly Ala
245 250 255
Ala Glu Leu Arg His Ala Met Thr Asp Ile Gly Glu Lys Leu Thr Asp
260 265 270
Glu Glu Val Asp Glu Met Ile Arg Val Ala Asp Ile Asp Gly Asp Gly
275 280 285
Gln Val Asn Tyr Glu Glu Phe Val Gln Met Met Thr Ala Lys Gly Gly
290 295 300
Gly Gly Ser Val Asp Ser Ser Arg Arg Lys Trp Asn Lys Ala Gly His
305 310 315 320
Ala Trp Arg Ala Ile Gly Arg Leu Ser Ser Pro Val Val Ser Glu Arg
325 330 335
Met Tyr Pro Glu Asp Gly Ala Leu Lys Ser Glu Ile Lys Lys Gly Leu
340 345 350
Arg Leu Lys Asp Gly Gly His Tyr Ala Ala Glu Val Lys Thr Thr Tyr
355 360 365
Lys Ala Lys Lys Pro Val Gln Leu Pro Gly Ala Tyr Val Val Asp Ile
370 375 380
Lys Leu Asp Ile Val Ser His Asn Glu Asp Tyr Thr Ile Val Glu Gln
385 390 395 400
Cys Glu Arg Ala Glu Gly Arg His Ser Thr Gly Gly Met Val Gly Leu
405 410 415
Tyr Lys
<210> 5
<211> 1254
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 5
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405 410 415
<210> 15
<211> 1251
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 15
atggttgact cttcacgtcg taagtggaat aaggcaggtc acgcagtcag agctataggt 60
cggctgagct cacgttgggt ttccgagtgg atgtaccccg aggacggcgc cctgaagagc 120
gtgatcaagg aggggttgag gctgaaggac ggcggccact acgccgccga ggtcaggacc 180
acctacaagg ccaaaaagcc cgtgcagctg cccggcgcct acatcgtcga catcaagttg 240
gacatcgtgt cccacaacga ggactacacc atcgtggaac agtgcgaacg cgccgagggc 300
cgccacccca ccggcggcat ggtcgggctg tacaagggag gtacaggcgg gagtctggtg 360
agcaagggcg aggaggataa catggccatc atcaaggagt tcatgcgctt caaggtgcac 420
atggagggct ccgtgaacgg ccacgagttc gagatcgagg gcgagggcga gggccgcccc 480
tacgaggcct ttcagaccgc taagctgaag gtgaccaagg gtggccccct gcccttcgcc 540
tgggacatcc tgtcccttca gttcatgtac ggctccaagg cctacattaa gcacccagcc 600
gacatccccg actacttcaa gctgtccttc cccgagggct tcaggtggga gcgcgtgatg 660
atcttcgagg acggcggcat tattcacgtt aaccaggact cctccctgca ggacggcgta 720
ttcatctaca aggtgaagct gcgcggcacc aacttccccc ccgacggccc cgtaatgcag 780
aagaagacca tgggctggga gcctacgcgt gaccaactga ctgaagagca gatcgcagaa 840
tttaaagagg ctttctccct atttgacaag gacggggatg ggacaataac aaccaaggat 900
ctggggacgg tgctgcggtc tctggggcag aaccccacag aagcagagct ccaggacatg 960
atcaatgaag tagatgccga cggtaatggc acaatcgact tccctgattt cctgacaatg 1020
atggcaagaa aaatgaaaga cacagacagt gaagaagaaa ttcgcgaagc gttccgtgtg 1080
tgggataagg atggcaatgg ctacatctct gcagcagacc ttcgccacgt gatgacaaac 1140
cttggagaga agttaacaga tgaagaggtt gatgaaatga tcagggaagc agatatcgat 1200
ggagaaggtc aggtaaacta cgaagagttt gtacaaatga tgacagcgaa g 1251
<210> 16
<211> 417
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 16
Met Val Asp Ser Ser Arg Arg Lys Trp Asn Lys Ala Gly His Ala Val
1 5 10 15
Arg Ala Ile Gly Arg Leu Ser Ser Arg Trp Val Ser Glu Trp Met Tyr
20 25 30
Pro Glu Asp Gly Ala Leu Lys Ser Val Ile Lys Glu Gly Leu Arg Leu
35 40 45
Lys Asp Gly Gly His Tyr Ala Ala Glu Val Arg Thr Thr Tyr Lys Ala
50 55 60
Lys Lys Pro Val Gln Leu Pro Gly Ala Tyr Ile Val Asp Ile Lys Leu
65 70 75 80
Asp Ile Val Ser His Asn Glu Asp Tyr Thr Ile Val Glu Gln Cys Glu
85 90 95
Arg Ala Glu Gly Arg His Pro Thr Gly Gly Met Val Gly Leu Tyr Lys
100 105 110
Gly Gly Thr Gly Gly Ser Leu Val Ser Lys Gly Glu Glu Asp Asn Met
115 120 125
Ala Ile Ile Lys Glu Phe Met Arg Phe Lys Val His Met Glu Gly Ser
130 135 140
Val Asn Gly His Glu Phe Glu Ile Glu Gly Glu Gly Glu Gly Arg Pro
145 150 155 160
Tyr Glu Ala Phe Gln Thr Ala Lys Leu Lys Val Thr Lys Gly Gly Pro
165 170 175
Leu Pro Phe Ala Trp Asp Ile Leu Ser Leu Gln Phe Met Tyr Gly Ser
180 185 190
Lys Ala Tyr Ile Lys His Pro Ala Asp Ile Pro Asp Tyr Phe Lys Leu
195 200 205
Ser Phe Pro Glu Gly Phe Arg Trp Glu Arg Val Met Ile Phe Glu Asp
210 215 220
Gly Gly Ile Ile His Val Asn Gln Asp Ser Ser Leu Gln Asp Gly Val
225 230 235 240
Phe Ile Tyr Lys Val Lys Leu Arg Gly Thr Asn Phe Pro Pro Asp Gly
245 250 255
Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Met Gly Trp Glu Pro Thr Arg Asp Gln
260 265 270
Leu Thr Glu Glu Gln Ile Ala Glu Phe Lys Glu Ala Phe Ser Leu Phe
275 280 285
Asp Lys Asp Gly Asp Gly Thr Ile Thr Thr Lys Asp Leu Gly Thr Val
290 295 300
Leu Arg Ser Leu Gly Gln Asn Pro Thr Glu Ala Glu Leu Gln Asp Met
305 310 315 320
Ile Asn Glu Val Asp Ala Asp Gly Asn Gly Thr Ile Asp Phe Pro Asp
325 330 335
Phe Leu Thr Met Met Ala Arg Lys Met Lys Asp Thr Asp Ser Glu Glu
340 345 350
Glu Ile Arg Glu Ala Phe Arg Val Trp Asp Lys Asp Gly Asn Gly Tyr
355 360 365
Ile Ser Ala Ala Asp Leu Arg His Val Met Thr Asn Leu Gly Glu Lys
370 375 380
Leu Thr Asp Glu Glu Val Asp Glu Met Ile Arg Glu Ala Asp Ile Asp
385 390 395 400
Gly Glu Gly Gln Val Asn Tyr Glu Glu Phe Val Gln Met Met Thr Ala
405 410 415
Lys
<210> 17
<211> 1245
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 17
atggtgagca agggcgagga ggataacatg gccatcatca aggagttcat gcgcttcaag 60
gtgcacatgg agggctccgt gaacggccac gagttcgaga tcgagggcga gggcgagggc 120
cgcccctacg aggcctttca gaccgctaag ctgaaggtga ccaagggtgg ccccctgccc 180
ttcgcctggg acatcctgtc ccttcagttc atgtacggct ccaaggccta cattaagcac 240
ccagccgaca tccccgacta cttcaagctg tccttccccg agggcttcag gtgggagcgc 300
gtgatgatct tcgaggacgg cggcattatt cacgttaacc aggactcctc cctgcaggac 360
ggcgtattca tctacaaggt gaagctgcgc ggcaccaact tcccccccga cggccccgta 420
atgcagaaga agaccatggg ctgggagcct actcgggacc aactgactga agagcagatc 480
gcagaattta aagaggcttt ctccctattt gacaaggacg gggatgggac aataacaacc 540
aaggatctgg ggacggtgct gcggtctctg gggcagaacc ccacagaagc agagctccag 600
gacatgatca atgaagtaga tgccgacggt aatggcacaa tcgacttccc tgatttcctg 660
acaatgatgg caagaaaaat gaaagacaca gacagtgaag aagaaattcg cgaagcgttc 720
cgtgtgtggg ataaggatgg caatggctac atctctgcag cagaccttcg ccacgtgatg 780
acaaaccttg gagagaagtt aacagatgaa gaggttgatg aaatgatcag ggaagcagat 840
atcgatggag aaggtcaggt aaactacgaa gagtttgtac aaatgatgac agcgaagggt 900
ggcggaggtt ctgtcgactc atcacgtcgt aagtggaata aggcaggtca cgcagtcaga 960
gctataggtc ggctgagctc acgttgggtt tccgagtgga tgtaccccga ggacggcgcc 1020
ctgaagagcg tgatcaagga ggggttgagg ctgaaggacg gcggccacta cgccgccgag 1080
gtcaggacca cctacaaggc caaaaagccc gtgcagctgc ccggcgccta catcgtcgac 1140
atcaagttgg acatcgtgtc ccacaacgag gactacacca tcgtggaaca gtgcgaacgc 1200
gccgagggcc gccactccac cggcggcatg gacgagctgt acaag 1245
<210> 18
<211> 415
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 18
Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Asp Asn Met Ala Ile Ile Lys Glu Phe
1 5 10 15
Met Arg Phe Lys Val His Met Glu Gly Ser Val Asn Gly His Glu Phe
20 25 30
Glu Ile Glu Gly Glu Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Ala Phe Gln Thr
35 40 45
Ala Lys Leu Lys Val Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp
50 55 60
Ile Leu Ser Leu Gln Phe Met Tyr Gly Ser Lys Ala Tyr Ile Lys His
65 70 75 80
Pro Ala Asp Ile Pro Asp Tyr Phe Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe
85 90 95
Arg Trp Glu Arg Val Met Ile Phe Glu Asp Gly Gly Ile Ile His Val
100 105 110
Asn Gln Asp Ser Ser Leu Gln Asp Gly Val Phe Ile Tyr Lys Val Lys
115 120 125
Leu Arg Gly Thr Asn Phe Pro Pro Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys
130 135 140
Thr Met Gly Trp Glu Pro Thr Arg Asp Gln Leu Thr Glu Glu Gln Ile
145 150 155 160
Ala Glu Phe Lys Glu Ala Phe Ser Leu Phe Asp Lys Asp Gly Asp Gly
165 170 175
Thr Ile Thr Thr Lys Asp Leu Gly Thr Val Leu Arg Ser Leu Gly Gln
180 185 190
Asn Pro Thr Glu Ala Glu Leu Gln Asp Met Ile Asn Glu Val Asp Ala
195 200 205
Asp Gly Asn Gly Thr Ile Asp Phe Pro Asp Phe Leu Thr Met Met Ala
210 215 220
Arg Lys Met Lys Asp Thr Asp Ser Glu Glu Glu Ile Arg Glu Ala Phe
225 230 235 240
Arg Val Trp Asp Lys Asp Gly Asn Gly Tyr Ile Ser Ala Ala Asp Leu
245 250 255
Arg His Val Met Thr Asn Leu Gly Glu Lys Leu Thr Asp Glu Glu Val
260 265 270
Asp Glu Met Ile Arg Glu Ala Asp Ile Asp Gly Glu Gly Gln Val Asn
275 280 285
Tyr Glu Glu Phe Val Gln Met Met Thr Ala Lys Gly Gly Gly Gly Ser
290 295 300
Val Asp Ser Ser Arg Arg Lys Trp Asn Lys Ala Gly His Ala Val Arg
305 310 315 320
Ala Ile Gly Arg Leu Ser Ser Arg Trp Val Ser Glu Trp Met Tyr Pro
325 330 335
Glu Asp Gly Ala Leu Lys Ser Val Ile Lys Glu Gly Leu Arg Leu Lys
340 345 350
Asp Gly Gly His Tyr Ala Ala Glu Val Arg Thr Thr Tyr Lys Ala Lys
355 360 365
Lys Pro Val Gln Leu Pro Gly Ala Tyr Ile Val Asp Ile Lys Leu Asp
370 375 380
Ile Val Ser His Asn Glu Asp Tyr Thr Ile Val Glu Gln Cys Glu Arg
385 390 395 400
Ala Glu Gly Arg His Ser Thr Gly Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
405 410 415
<210> 19
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 19
Met Leu Leu Pro Val Pro Leu Leu Leu Gly Leu Leu Gly Ala Ala Ala
1 5 10 15
Asp
<210> 20
<211> 38
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 20
gatcggatcc aaccatggtg agcaagggcg aggaggat 38
<210> 21
<211> 34
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 21
gatcaagctt ttacttgtac agctcgtcca tgcc 34
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种检测细胞中Ca2+水平变化的方法，其中，所述方法包括：
a.获得包含细胞的样品，所述细胞经工程化以表达一种以上低亲和力的Ca2+指示剂，所述指示剂选自：SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16和18，或与前述任一项具有至少90％序列同一性的多肽，所述多肽是荧光的且对Ca2+的亲和力满足Kd大于20μM，但排除SEQ ID NO：2；
b.使细胞暴露于激发光；以及
c.通过可视化或成像细胞来检测ER、SR和/或线粒体的Ca2+水平的变化。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述样品包括细胞培养物、干细胞或哺乳动物血浆。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述样品包含稳定的永生化细胞系的细胞培养物。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述细胞培养物包括HL1细胞系。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述指示剂是比率型的。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述指示剂是强度型的。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，所述指示剂与另一种荧光指示剂组合使用。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述方法使用单波长双色成像方法。
9.根据权利要求7所述的方法，其中，所述另一种荧光指示剂是细胞质钙指示剂。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中，所述指示剂靶向具有细胞器特异性靶向序列的细胞器。
11.一种低亲和力的荧光Ca2+多肽，其中，所述低亲和力的荧光Ca2+多肽选自：SEQ IDNO：4、6、8、10、12、14、16和18，或与前述任一项具有至少90％序列同一性的多肽，所述多肽是荧光的且对Ca2+的亲和力满足Kd大于20μM，但排除SEQ ID NO：2。
12.根据权利要求11所述的多肽，其中，所述多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16或18之一。
13.根据权利要求11或12所述的多肽，其中，所述多肽还包含细胞器特异性靶向序列。
14.根据权利要求13所述的多肽，其中，所述多肽包含SEQ ID NO：19的靶向序列。
15.根据权利要求11或12所述的多肽，其中，所述多肽包含SEQ ID NO：4中的选自下组的突变：I54A、I330M和D327N/I330M/D363N。
16.根据权利要求11所述的多肽，其中，所述多肽对Ca2+的Kd大于60μM。
17.编码权利要求11至16中任一项所述的多肽的多核苷酸。
18.根据权利要求17所述的多核苷酸，其中，所述多核苷酸包含选自下组的核酸序列：
a.SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、15或17；
b.与SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、15或17之一具有至少90％序列同一性且编码荧光Ca2+指示剂的核酸序列，所述荧光Ca2+指示剂对Ca2+的Kd大于20μM或可选地为60μM，但排除SEQID NO：1；
c.编码荧光Ca2+指示剂的核酸序列，所述荧光Ca2+指示剂包含SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16或18的氨基酸序列；以及
d.编码荧光Ca2+指示剂的核酸序列，所述荧光Ca2+指示剂对Ca2+的Kd大于20μM，所述荧光Ca2+指示剂与SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16或18的氨基酸序列具有至少90％序列同一性，但排除SEQ ID NO：2。
19.根据权利要求17或18所述的多核苷酸，其中，所述多核苷酸还包含编码细胞器特异性靶向序列的序列。
20.根据权利要求19所述的多核苷酸，其中，所述细胞器特异性靶向序列编码SEQ IDNO：19。
21.根据权利要求17或18所述的多核苷酸，其中，所述多核苷酸包含SEQ ID NO：4中的选自下组的突变：I54A、I330M和D327N/I330M/D363N。
22.载体，其中，所述载体包含权利要求17至21中任一项所述的多核苷酸。
23.宿主细胞，其中，所述宿主细胞包含权利要求17至21中任一项所述的多核苷酸序列或权利要求22所述的载体。
24.根据权利要求23所述的宿主细胞，其中，所述宿主细胞是心肌细胞。
25.根据权利要求23所述的宿主细胞，其中，所述宿主细胞共表达另一种荧光钙指示剂。

Claims (25)

1.一种检测细胞中Ca2+水平变化的方法，其中，所述方法包括：
a.获得包含细胞的样品，所述细胞经工程化以表达一种以上低亲和力的Ca2+指示剂，所述指示剂选自：LAR-GECO1.5、LAR-GECO2和LAR-GECO3、LAR-GECO4、LAREX-GECO1、LAREX-GECO2、LAREX-GECO3和LAREX-GECO4，或具有与前述任一项基本相似的氨基酸序列的多肽；
b.使细胞暴露于激发光；以及
c.通过可视化或成像细胞来检测ER、SR和/或线粒体的Ca2+水平的变化。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述样品包括细胞培养物、干细胞或哺乳动物血浆。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述样品包含稳定的永生化细胞系的细胞培养物。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述细胞培养物包括HL1细胞系。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述指示剂是比率型的。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述指示剂是强度型的。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，所述指示剂与另一种荧光指示剂组合使用。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述方法使用单波长双色成像方法。
9.根据权利要求7所述的方法，其中，所述另一种荧光指示剂是细胞质钙指示剂。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中，所述指示剂靶向具有细胞器特异性靶向序列的细胞器。
11.一种低亲和力的荧光Ca2+多肽，其中，所述低亲和力的荧光Ca2+多肽选自：LAR-GECO1.5、LAR-GECO2和LAR-GECO3、LAR-GECO4、LAREX-GECO1、LAREX-GECO2、LAREX-GECO3和LAREX-GECO4，或具有与前述任一项基本相似的氨基酸序列的多肽。
12.根据权利要求11所述的多肽，其中，所述多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16或18之一。
13.根据权利要求11或12所述的多肽，其中，所述多肽还包含细胞器特异性靶向序列。
14.根据权利要求13所述的多肽，其中，所述多肽包含SEQ ID NO：19的靶向序列。
15.根据权利要求11或12所述的多肽，其中，所述多肽包含选自下组的突变：I54A、I330M和D327N/I330M/D363N。
16.根据权利要求11所述的多肽，其中，所述多肽对Ca2+的Kd大于20μM，或可选地为60μM。
17.编码权利要求11至16中任一项所述的多肽的多核苷酸，或基本相似的多核苷酸序列。
18.根据权利要求17所述的多核苷酸，其中，所述多核苷酸包含选自下组的核酸序列：
a.SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、15或17；
b.与SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、15或17之一具有至少90％序列同一性且编码荧光Ca2+指示剂的核酸序列，所述荧光Ca2+指示剂对Ca2+的Kd大于20μM或可选地为60μM，但排除SEQID NO：1；
c.编码荧光Ca2+指示剂的核酸序列，所述荧光Ca2+指示剂包含SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16或18的氨基酸序列；以及
d.编码荧光Ca2+指示剂的核酸序列，所述荧光Ca2+指示剂对Ca2+的Kd大于20μM，所述荧光Ca2+指示剂与SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16或18的氨基酸序列具有至少90％序列同一性，但排除SEQ ID NO：2。
19.根据权利要求17或18所述的多核苷酸，其中，所述多核苷酸还包含编码细胞器特异性靶向序列的序列。
20.根据权利要求19所述的多核苷酸，其中，所述细胞器特异性靶向序列编码SEQ IDNO：19。
21.根据权利要求17或18所述的多核苷酸，其中，所述多核苷酸包含选自下组的突变：I54A、I330M和D327N/I330M/D363N。
22.载体，其中，所述载体包含权利要求17至21中任一项所述的多核苷酸。
23.宿主细胞，其中，所述宿主细胞包含权利要求17至21中任一项所述的多核苷酸序列或权利要求22所述的载体。
24.根据权利要求23所述的宿主细胞，其中，所述宿主细胞是心肌细胞。
25.根据权利要求23所述的宿主细胞，其中，所述宿主细胞共表达另一种荧光钙指示剂。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115197301A (zh) * 2022-06-10 2022-10-18 北京师范大学 用于胞内钙信号检测及相关药物筛选的钙指示工具及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101137667A (zh) * 2005-03-11 2008-03-05 阿克萨姆股份公司 生物发光增强的光蛋白及其作为细胞内钙指示剂的用途
US20110154515A1 (en) * 2007-08-24 2011-06-23 Oliver Griesbeck Genetically encoded calcium sensors comprising the c-terminal lobe of troponin c and a fluorescence tag
US20160176931A1 (en) * 2014-12-23 2016-06-23 Howard Hughes Medical Institute Red genetically encoded calcium indicators and methods of use

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6051438B2 (ja) * 2012-06-19 2016-12-27 国立大学法人埼玉大学 赤色蛍光蛋白質を用いたカルシウムセンサー蛋白質
EP3156482B1 (en) * 2014-06-11 2019-09-25 Japan Science and Technology Agency Calcium reporter gene
WO2017048808A1 (en) * 2015-09-15 2017-03-23 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Light-responsive polypeptides and methods of use thereof
WO2017087542A1 (en) * 2015-11-18 2017-05-26 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Method and systems for measuring neural activity
CN205757212U (zh) * 2016-06-29 2016-12-07 湖南中烟工业有限责任公司 无棉型超声波雾化器及电子烟
WO2018034298A1 (ja) * 2016-08-16 2018-02-22 国立研究開発法人理化学研究所 カルシウムインジケーターを有する遺伝子改変トリパノソーマ・クルージおよび抗トリパノソーマ薬のスクリーニングのためのその応用
US20200393447A1 (en) * 2017-07-09 2020-12-17 Thomas Hughes Biosensors for measuring cell signaling in stressed and healthy cells

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101137667A (zh) * 2005-03-11 2008-03-05 阿克萨姆股份公司 生物发光增强的光蛋白及其作为细胞内钙指示剂的用途
US20110154515A1 (en) * 2007-08-24 2011-06-23 Oliver Griesbeck Genetically encoded calcium sensors comprising the c-terminal lobe of troponin c and a fluorescence tag
US20160176931A1 (en) * 2014-12-23 2016-06-23 Howard Hughes Medical Institute Red genetically encoded calcium indicators and methods of use

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JIAHUI WU: "Development of red fluorescent protein-based calcium ion and glutamate indicators" *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115197301A (zh) * 2022-06-10 2022-10-18 北京师范大学 用于胞内钙信号检测及相关药物筛选的钙指示工具及其应用

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