CN112051398A - 一种氨苄西林和卡那霉素联合检测试条 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种氨苄西林和卡那霉素联合检测试条，包括一底板和依次设于该底板上且彼此相接的一样品垫、一结合垫、一反应膜和一吸水垫，其中，结合垫上包被有等摩尔的荧光标记内标DNA、荧光标记AMP DNA和荧光标记KAM DNA；反应膜上沿样品垫至吸水垫的方向依次设有一内标线、一AMP检测线、一KAM检测线和一控制线，内标线、AMP检测线、KAM检测线和控制线上依次固定有链霉亲和素‑生物素化的内部捕获DNA、AMP捕获DNA、KAM捕获DNA和控制捕获DNA。本发明具有灵敏度高、特异性强、成本低、操作简单、检测时间短、储存简单、保质期长、适合各种场合使用的优点。
Description
技术领域
本发明属于抗生素残留技术领域，具体涉及一种氨苄西林和卡那霉素联合检测试条。
背景技术
随着人们生活水平的提高，动物源食品中的药物残留日益受到国际社会的重视。由于抗生素可以通过食物链传递到血液中，微量的抗生素足以影响人体的健康，因此，抗生素残留检测对食品安全、农业安全和环境安全具有重要意义。氨苄西林和卡那霉素是食品、水产品和临床用药中广泛使用的抗生素。氨苄西林是一种β-内酰胺类抗生素，高浓度的氨苄西林残留物会导致严重的过敏反应，消化不良和癫痫等疾病。卡那霉素是一种被广泛使用的氨基糖苷类抗生素，主要通过与细菌的30S核糖体RNA相互作用抑制其蛋白质合成而起到杀菌作用。由于价格低廉且抗菌性能好，抗生素被广泛使用，但由于操作不当或监管不力，实际生产中，抗生素被滥用或在饲料中被过量使用，造成其在动物源性食品中存在残留。
目前，常见的抗生素检测方法包括高效液相色谱法、气相色谱法、液相色谱-质谱联用技术、化学发光法、微生物检测法以及酶联免疫吸附测定法等，尽管这些方法能够灵敏检测食品中的抗生素，但由于所用仪器昂贵，耗时较长，难以实现定量分析、难以解决非特异性吸附引起的假阳性且操作繁琐，限制了其实际应用。因此，开发一种低成本、便携式、高灵敏度、高特异性、简便快速且可以多组分同时测定的食品中抗生素残留量的检测方法具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种氨苄西林和卡那霉素联合检测试条。
本发明的技术方案如下：
一种氨苄西林和卡那霉素联合检测试条，包括一底板和依次设于该底板上且彼此相接的一样品垫、一结合垫、一反应膜和一吸水垫，其中，
结合垫上包被有等摩尔的荧光标记内标DNA、荧光标记AMP DNA和荧光标记KAMDNA，其序列依次如SEQ ID NO.01至03所示；
反应膜上沿样品垫至吸水垫的方向依次设有一内标线、一AMP检测线、一KAM检测线和一控制线，内标线、AMP检测线、KAM检测线和控制线上依次固定有链霉亲和素-生物素化的内部捕获DNA、AMP捕获DNA、KAM捕获DNA和控制捕获DNA，其序列依次如SEQ ID NO.04至07所示；
待测样品与流动缓冲液混合后，滴加于样品垫上，产生的液流先流经结合垫，其中的氨苄西林和卡那霉素先分别与结合垫上的荧光标记AMP DNA和荧光标记KAM DNA结合形成AMP-DNA复合物和KAM-DNA复合物；
结合垫上的荧光标记内标DNA、AMP-DNA复合物、KAM-DNA复合物、未结合氨苄西林的荧光标记AMP DNA和未结合卡那霉素的荧光标记KAM DNA随液流继续流经反应膜，荧光标记内标DNA与内标线上的内部捕获DNA结合，未结合氨苄西林的荧光标记AMP DNA与AMP检测线上的AMP捕获DNA结合，未结合卡那霉素的荧光标记KAM DNA与KAM检测线上的KAM捕获DNA结合，AMP-DNA复合物和KAM-DNA复合物则与控制线上的控制捕获DNA结合；
通过检测内标线、AMP检测线、KAM检测线和控制线上的荧光信号，即可对待测样品中的氨苄西林和卡那霉素进行定性和定量检测。
在本发明的一个优选实施方案中，所述样品垫为玻璃纤维膜。
在本发明的一个优选实施方案中，所述结合垫为玻璃纤维膜。
在本发明的一个优选实施方案中，所述反应膜为硝酸纤维素膜。
进一步优选的，所述硝酸纤维素膜为CN140膜。
在本发明的一个优选实施方案中，所述吸水垫为吸水纸。
在本发明的一个优选实施方案中，所述内标线、AMP检测线、KAM检测线和控制线彼此之间的间距为0.3-0.5cm。
进一步优选的，所述内标线、AMP检测线、KAM检测线和控制线彼此之间的间距为0.4cm。
在本发明的一个优选实施方案中，所述荧光标记的荧光基团为HEX。
在本发明的一个优选实施方案中，其长度为5-7cm，宽度为0.2-0.4cm。
本发明的有益效果是：
1、本发明的氨苄西林和卡那霉素联合检测试条具有灵敏度高、特异性强、成本低、操作简单、检测时间短、储存简单、保质期长、适合各种场合使用的优点。其中包被和固定的高特异性的氨苄西林和卡那霉素DNA，保证了检测结果的可靠性。
2、本发明将特异性适配体DNA和荧光标记DNA修饰在试条上，能够使特异性适配体DNA和标记DNA与待检样品溶液充分接触，充分反应，从而减少误差，增加整个体系的反应灵敏度。
3、用本发明检测抗生素，简便、快速、直观、准确，成本低，易推广使用。
附图说明
图1为本发明实施例1的结构示意图。
图2为本发明实施例2中琼脂糖凝胶电泳检测KAM和AMP的内标线的结果图。其中，A：寡核苷酸之间的相互作用；B：内部捕获DNA与内部检测DNA之间的相互作用。
图3为本发明实施例3中的基于FNAs的检测参数的优化图。其中，A：反应膜类型的图像，B：不同类型反应膜的相应FL强度，C：检测线之间的距离，D：内标线与结合垫之间的距离。
图4为本发明实施例3中的优化测流法试纸条检测时间的结果图。
图5为本发明实施例4中的基于适配体的测流法检测KAM和AMP的特异性分析图。其中，(A)用于特异性分析的LFA荧光图像和(B)其相应的强度。试纸条6和试纸条7上的KAM和AMP浓度分别为30ng/mL和80ng/mL。条带1、2、3、4和5的SMS、OTC、DOC、CAP和CTC浓度分别为80.0ng/mL。
图6为本发明实施例5中用不同的AMP和KAM浓度来证明所研制的测流法试纸条具有定量AMP和KAM的能力的结果图。其中，A：对应AMP和KAM浓度的强度图像，B：不同KAM浓度的定量分析曲线，显示的范围从0.5ng/L到500ng/L，C：不同AMP浓度的定量分析曲线，显示的范围从0.1ng/mL到1000ng/mL。
具体实施方式
以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
实施例1
如图1所示，一种氨苄西林和卡那霉素联合检测试条，长度为5-7cm，宽度为0.2-0.4cm，包括一底板1和依次设于该底板1上且彼此相接的一样品垫2、一结合垫3、一反应膜4和一吸水垫5，其中，
结合垫3上包被有等摩尔的荧光标记内标DNA、荧光标记AMP DNA和荧光标记KAMDNA，其序列依次如SEQ ID NO.01至03所示；
反应膜4上沿样品垫2至吸水垫5的方向依次设有一内标线41、一AMP检测线42、一KAM检测线43和一控制线44(Control line)，内标线41(Internal line)、AMP检测线42、KAM检测线43和控制线44上依次固定有链霉亲和素-生物素化的内部捕获DNA、AMP捕获DNA、KAM捕获DNA和控制捕获DNA，其序列依次如SEQ ID NO.04至07所示；优选的，所述内标线41、AMP检测线42、KAM检测线43和控制线44彼此之间的间距为0.3-0.5cm。进一步优选的，所述内标线41、AMP检测线42、KAM检测线43和控制线44彼此之间的间距为0.4cm。
待测样品与流动缓冲液混合后，滴加于样品垫2上，产生的液流先流经结合垫3，其中的氨苄西林和卡那霉素先分别与结合垫3上的荧光标记AMP DNA和荧光标记KAM DNA结合形成AMP-DNA复合物和KAM-DNA复合物。
结合垫3上的荧光标记内标DNA、AMP-DNA复合物、KAM-DNA复合物、未结合氨苄西林的荧光标记AMP DNA和未结合卡那霉素的荧光标记KAM DNA随液流继续流经反应膜4，荧光标记内标DNA与内标线41上的内部捕获DNA结合，未结合氨苄西林的荧光标记AMP DNA与AMP检测线42上的AMP捕获DNA结合，未结合卡那霉素的荧光标记KAM DNA与KAM检测线43上的KAM捕获DNA结合，AMP-DNA复合物和KAM-DNA复合物则与控制线44上的控制捕获DNA结合；
通过检测内标线41、AMP检测线42、KAM检测线43和控制线44上的荧光信号，即可对待测样品中的氨苄西林和卡那霉素进行定性和定量检测。
优选的，所述样品垫2为玻璃纤维膜，所述结合垫3为玻璃纤维膜，所述反应膜4为硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜为CN140膜，所述吸水垫5为吸水纸。
上述各DNA的序列如下表1所示：
表1本实施例中使用的DNA序列
上述表1中，内部捕获DNA、AMP捕获DNA和KAM捕获DNA中的下划线字母分别是与荧光标记内标DNA、荧光标记AMP DNA和荧光标记KAM DNA的部分互补序列。荧光标记AMP DNA和荧光标记KAM DNA中的斜体粗体字母分别代表AMP和KAM的适配体序列，它们分别可以识别AMP和KAM。荧光标记AMP DNA和荧光标记KAM DNA的粗体字母是与控制捕获DNA互补的DNA片段。六氯-6-羧基荧光素(HEX)由于其在NC膜中的背景信号较低，被用作荧光染料。
链霉亲和素-生物素化的内部捕获DNA、AMP捕获DNA、KAM捕获DNA和控制捕获DNA的制备具体为：将200μL的2.5mg/mL链霉亲和素溶液与50nmol生物素化DNA混合。将混合物在37℃上孵育，混匀30min。在4℃，6000rpm超滤离心20min，混合物中加入500μL PBS后重悬。以上步骤重复三次。用PBS将过滤器中的剩余溶液稀释至500μL。
本实施例的氨苄西林和卡那霉素联合检测试条的制备过程包括如下：
结合垫3用混合液室温处理。混合液包含了500nM荧光标记AMP DNA、500nM荧光标记KAM DNA和500nM荧光标记内标DNA和封闭缓冲液(1.5％BSA(W/V)、0.06％海藻酸钠(W/V)和1％TritonX-100(V/V)至0.01MPBS(pH7.4)))。然后在37℃下干燥24h。将制备的链霉素-生物素化DNA复合物溶解在包被液中(1％BSA(V/V)和10mmoLTris-HCl缓冲液(pH7.4))，然后分别喷涂在反应膜4上作为内标线41，KAM检测线43，AMP检测线42和控制线44。在37℃下干燥2h，然后室温干燥约24小时，然后在4℃处储存直到使用。最后将样品垫2、结合垫3、反应膜4和吸水垫5粘贴在PVC板上组装成试条。组件的排列使每个部分重叠2mm，以确保溶液的迁移。组装后的试条成片排列(0.3×6.0cm2)，安装在塑料外壳中，并在室温下储存在干燥器中。
在典型的抗生素残留试验中，将5μL running buffer(0.6MNaCl、0.06M柠檬酸钠和1％BSA(W/V)的柠檬酸钠缓冲液)，10μL预处理水样和5μLMilliQ水混合。混合物在室温孵育1min，然后加入到样品垫2上，液流通过毛细管力从样品垫2向吸水垫5流动，静置10min，通过荧光化学发光成像系统进行检测。
本实施例的试条对样品的定量分析是基于Y与分析物的浓度，其中Y的值是通过下面的公式计算的。
I0是内标线41的信号强度，I是KAM或者AMP检测线42上的信号强度.检出限(LOD)＝本底(空白)值+3×标准差(SD)，定量限(LOQ＝目标(空白)零浓度平均值+10×SD。
本发明的具体原理为：包含一条内标线41、两条检测线和一条控制线44。利用链霉亲和素-生物素反应，用链霉亲和素-生物素化DNA寡核苷酸包被这四条线。内标线41是第一条线，KAM检测线43是第二条检测线，AMP检测线42是第三条检测线，控制线44是第四条线。所有捕获的DNA均预固定在反应膜4上。如果样品溶液中含有AMP和KAM，当样品溶液通过接合垫时，荧光标记内标DNA、荧光标记AMP DNA和荧光标记KAM DNA与相应的分析物结合，形成AMP-DNA和KAM-DNA复合物，并继续沿着条带流动。当荧光标记内标DNA到达内标线41，被捕获在内标线41。游离的荧光标记AMP DNA和荧光标记KAM DNA分别捕获在AMP检测线42和KAM检测线43上，而两种复合物(AMP-DNA和KAM-DNA)则捕获在控制线44上。如果样品溶液中没有AMP和KAM，则样品溶液直接通过结合垫3，没有复合物形成。荧光标记内标DNA被捕获在内标线41。荧光标记AMP DNA和荧光标记KAM DNA分别捕获在AMP检测线42和KAM检测线43上，而剩下的荧光标记AMP DNA和荧光标记KAM DNA被捕获在控制线44上。控制线44的强度与KAM线和AMP线相反。由于内标线41信号受目标物含量和基质干扰的影响很小，本发明用于KAM和AMP的分析不仅基于免疫竞争，也结合了内标线41，可以获得准确的定量分析。
实施例2
本发明是要同时定量分析KAM和AMP。最关键的元素是添加的内标线41系统，内部DNA不应影响目标分析。因此，用2％琼脂糖凝胶对内标线41进行了研究。图2A显示内部捕获DNA-荧光标记内标DNA复合物物迁移最快，其次是荧光标记AMP DNA-AMP复合物，第三是荧光标记KAM DNA-AMP复合物。从图中可以看出，由于内标线41系统很少受到其他DNA的干扰。为了实现KAM和AMP的高灵敏度，本实施例将内标线41设为第一条离开结合垫3的检测线。KAM检测线43为第二条线，AMP检测线42为第三条线以获得更多的荧光标记AMP DNA-AMP复合物在检测线上。控制线44设为第四条线。虽然AMP和KAM的引入可以加快DNA的迁移速度，促进DNA的扩散，改变DNA的电负性，但凝胶图上也显示出少量杂质带，表明不同种类的DNA之间几乎没有交叉反应。这些结果表明所提出来的检测方法可用于AMP和KAM残留的定性和定量分析。
实施例3
为了达到定量分析AMP和KAM的最佳条件，本实施例进行了反应膜4类型的研究、检测线间的距离、内标线41与结合垫3之间的距离以及检测时间。
在免疫层析快速检测中，不同种类反应膜4的性质拥有不同的色谱分离，DNA的结合能力，检测时间，灵敏度，假阳性信号有显著影响。此外，迁移速度过快会影响检测结果的准确性，从而使反应不充分。然而，如果色谱速度太慢，就不能实现快速检测。因此，对反应膜4的类型进行了优化。结果显示，CN140膜中信号清晰，色谱时间约为2min。而PALL170的色谱不像CN140那样清晰，色谱时间大于4min。此外，PALL90具有较短的亮度保持时间，因此选择CN140作为反应膜4。
如果每个检测线之间的距离太近，会导致分离不足，而且不利于检测DNA的固定的操作。但是，如果距离太远，反应膜4和吸收垫会延长，检测时间延长。因此，研究彼此之间的距离是很重要的。首先，将每条检测线之间的距离设置为0.35cm，0.40cm，0.45cm，0.50cm。图3C表明，所有这些距离都具有良好的强度稳定性和分离效果，但考虑到反应膜4的长度有限和操作的可行性，选择了0.4cm。然后研究了结合垫3与内标线41之间的距离。进一步研究了内标线41与结合垫3之间的距离，分别设置在0.4cm、0.8cm、1.2cm和1.6cm。图3D表明在短时间内，这些距离都可以实现良好的分离。进一步研究表明，当距离为0.8cm或1.2cm时，获得了较高的强度，检测时间在10min左右或15min左右。因此，选择0.8cm作为内标线41与结合垫3之间的距离，以平衡发光信号强度和检测时间。
样品滴加后，荧光标记DNA、目标物和荧光标记DNA复合物A在检测线上被捕获和累积，导致检测线信号增强。由于反应膜4有一定尺寸的孔隙，所以随着时间的推移，其上的液体会逐渐蒸发；强度发生变化。同时，发光基团也会随着时间的增加而发生淬灭。为了获得准确的结果，需要在指定的时间进行检测。所以检测时间的选择很重要。图4中，本实施例观察到强度从0到7min逐渐增加，然后可以保持10min左右。为了获得准确的数据和高灵敏度，检测时间选择10min。
实施例4
为了证明实施例1制得的检测试条的特异性，在样品中加入不同种类的抗生素，然后分析方法的选择性。选择两种AMP和KAM浓度分别为30ng/mL和80ng/mL，其余抗生素浓度均为80ng/mL。图5显示了在其他抗生素存在下，发光信号几乎不变。随着目标物浓度的变化，强发光信号发生明显。这些结果表明，本发明对AMP和KAM的测定具有较高的特异性。
实施例5
在内标线41的基础上，利用一系列AMP和KAM浓度来考察所构建的LFA试纸条是否具有定量分析AMP和KAM的能力。图6A显示不同浓度KAM和AMP的条带的图像。图6B和C表明，对于AMP，回归方程为y＝-0.0977ln(X)+0.8001(R2＝0.990)，其中y表示用检测线与内标线41之比计算的相对强度。X表示AMP的浓度。AMP的LOQ为0.06ng/mL。对于KAM，方程为y＝-0.063011n(X)+0.6903(R2＝0.984)，X表示KAM的浓度LOQ为0.015ng/mL。三次平行测定的相对标准偏差(RSDs)在2.89％～6.70％之间。结果表明，所建立的方法适合于抗生素残留检测的痕量分析。为了评价实施例1制得的检测试条的定量检测能力，评估了其对AMP和KAM的分析性能，并将其与作为抗生素残留分析标准检测方法的LC-MS进行了比较。结果表明，本发明比LC-MS(AMP和KAM的LOQ在1.0×10左右)具有更高的灵敏度。
实施例6
为了证明本发明的可行性，对医院废水、自来水、养鸡场废水和湖水进行了收集和分析。结果见表2。在医院废水中，检测到AMP和KAM的荧光，但浓度低于相应的LOQ，表明AMP和KAM常在临床诊断使用。此外，在养鸡场废水中发现AMP残留，虽然其含量低于相应的LOQ，但也说明了AMP在养鸡过程相对比较常用的。此外，AMP和KAM在医院废水(≤95.65％)和养鸡场废水(≤96.51％)中的回收率低于其他水(≥99.53％)。这可能是由于抗生素在水中的迁移导致抗生素被吸附、水解、光解、生物降解等。此外，高回收率和低RSD％表明，本发明可以检测环境水中的AMP和KAM。
表2实际样品中的AMP和KAM的残留量(n＝3)
＜LOQ——低于量化限额，ND——未检出
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。
序列表
<110> 华侨大学
<120> 一种氨苄西林和卡那霉素联合检测试条
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gggtaggggt tgg 13
<210> 2
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcgggcggtt gtatagcggt tttttctcac acgaattcat ctgac 45
<210> 3
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tcggcttagc ctcaacccca ttttttaatt catctgac 38
<210> 4
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
attcgtgtga gaaaaccaac ccgccctacc caaaagtcag atga 44
<210> 5
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ccgctacaac cgcccg 16
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tgggggttga ggctaagccg attttt 26
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gtcagatgaa ttcgtgtgag aaaaa 25
Claims (10)
1.一种氨苄西林和卡那霉素联合检测试条，其特征在于：包括一底板和依次设于该底板上且彼此相接的一样品垫、一结合垫、一反应膜和一吸水垫，其中，
结合垫上包被有等摩尔的荧光标记内标DNA、荧光标记AMP DNA和荧光标记KAM DNA，其序列依次如SEQ ID NO.01至03所示；
反应膜上沿样品垫至吸水垫的方向依次设有一内标线、一AMP检测线、一KAM检测线和一控制线，内标线、AMP检测线、KAM检测线和控制线上依次固定有链霉亲和素-生物素化的内部捕获DNA、AMP捕获DNA、KAM捕获DNA和控制捕获DNA，其序列依次如SEQ ID NO.04至07所示；
待测样品与流动缓冲液混合后，滴加于样品垫上，产生的液流先流经结合垫，其中的氨苄西林和卡那霉素先分别与结合垫上的荧光标记AMP DNA和荧光标记KAM DNA结合形成AMP-DNA复合物和KAM-DNA复合物；
结合垫上的荧光标记内标DNA、AMP-DNA复合物、KAM-DNA复合物、未结合氨苄西林的荧光标记AMP DNA和未结合卡那霉素的荧光标记KAM DNA随液流继续流经反应膜，荧光标记内标DNA与内标线上的内部捕获DNA结合，未结合氨苄西林的荧光标记AMP DNA与AMP检测线上的AMP捕获DNA结合，未结合卡那霉素的荧光标记KAM DNA与KAM检测线上的KAM捕获DNA结合，AMP-DNA复合物和KAM-DNA复合物则与控制线上的控制捕获DNA结合；
通过检测内标线、AMP检测线、KAM检测线和控制线上的荧光信号，即可对待测样品中的氨苄西林和卡那霉素进行定性和定量检测。
2.如权利要求1所述的一种氨苄西林和卡那霉素联合检测试条，其特征在于：所述样品垫为玻璃纤维膜。
3.如权利要求1所述的一种氨苄西林和卡那霉素联合检测试条，其特征在于：所述结合垫为玻璃纤维膜。
4.如权利要求1所述的一种氨苄西林和卡那霉素联合检测试条，其特征在于：所述反应膜为硝酸纤维素膜。
5.如权利要求4所述的一种氨苄西林和卡那霉素联合检测试条，其特征在于：所述硝酸纤维素膜为CN140膜。
6.如权利要求1所述的一种氨苄西林和卡那霉素联合检测试条，其特征在于：所述吸水垫为吸水纸。
7.如权利要求1所述的一种氨苄西林和卡那霉素联合检测试条，其特征在于：所述内标线、AMP检测线、KAM检测线和控制线彼此之间的间距为0.3-0.5cm。
8.如权利要求7所述的一种氨苄西林和卡那霉素联合检测试条，其特征在于：所述内标线、AMP检测线、KAM检测线和控制线彼此之间的间距为0.4cm。
9.如权利要求1所述的一种氨苄西林和卡那霉素联合检测试条，其特征在于：所述荧光标记的荧光基团为HEX。
10.如权利要求1至9中任一权利要求所述的一种氨苄西林和卡那霉素联合检测试条，其特征在于：其长度为5-7cm，宽度为0.2-0.4cm。
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