CN112051340A - 一种鲜马乳中乳脂肪球膜的提取及其蛋白质组学分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明一种鲜马乳中乳脂肪球膜的提取及其蛋白质组学分析方法，所述提取方法先将罗氏蛋白酶抑制剂加入到鲜马乳中，离心后得到乳脂肪层，清洗后得到乳脂肪球膜蛋白溶液；再加入二硫苏糖醇孵育、碘乙酰胺室温避光孵育，加入尿酸缓冲液、碳酸氢铵溶液、含有胰蛋白酶的碳酸氢铵溶液酶解后得到酶解液，最后终止消化得到含有肽混合物的溶液，脱盐后冷冻干燥，得到肽混合物。蛋白质组学分析方法先采用液相色谱‑高分辨质谱技术获得m/z为300‑1700范围内的肽段，之后完成峰提取和峰对齐，对蛋白质种类和数量进行定性分析，LFQ响应强度统计学分析，筛选显著性表达蛋白质，完成聚类和差异可视化，对显著性表达蛋白质进行生物信息学分析。
Description
技术领域
本发明涉及乳脂肪球膜分析技术领域，具体涉及一种鲜马乳中乳脂肪球膜的提取及其蛋白质组学分析方法。
背景技术
乳脂肪是鲜马乳和鲜牛乳的主要成分之一，乳脂肪以脂肪球的形式存在于鲜马乳体系中。乳脂肪表面由脂肪球膜包裹，脂肪球膜主要由以糖蛋白为主的特异性膜蛋白质和以神经鞘脂类为主的磷脂共同组成，这些组分具有重要的生物功能。乳脂肪球膜是厚度为10-50nm的3层结构，形成于乳腺上皮细胞的内质网，乳脂肪球膜最内层由甘油三酯吸附在疏水基上构成，乳脂肪球膜外层是被具有强亲水基结构的蛋白质覆盖，在强亲水基表面结合离子形成大量结合水。单层内膜是由极性脂质和蛋白质复合体形成，围绕的外膜是从分泌细胞的顶端质膜获得外层双层膜。
乳脂肪球膜中含有25％-60％的蛋白质，虽然在整个鲜马乳体系中占比很少，但却具有重要的生物功能特性，如抗黏附性、抗菌、抗癌等，并且与肠道相关疾病、自闭症和多发性硬化症等疾病相关，同时也参与信号传导和细胞调节、凋亡、分化、生长等生物过程。乳脂肪球膜中含量较高且具有显著生理活性功能的蛋白质有嗜乳脂蛋白、黄嘌呤脱氢酶/氧化酶、血小板糖蛋白4、脂肪酸结合蛋白、脂滴包被蛋白-2和黏蛋白-1等。
当前，乳脂肪球膜一般采用离心法从全乳中分离，对分离所得的上层固体用氯化钠缓冲液在特定温度下冲洗2～3次以减少膜成分的流失，随后在低温条件下破坏脂肪球膜，释放出脂肪球膜成分，再使用低pH值沉淀、高速离心或添加硫酸铵离心等方法收集脂肪球膜成分。在收集到乳脂肪球膜样品后，对它进行乳脂肪球膜蛋白质还原烷基化及酶解后获得乳脂肪球膜蛋白质，但是这种方式蛋白质提取得率较低，并且肽段生成量少，在之后数据库匹配过程中准确性较差。与此同时，蛋白质组学分析流程因其具有鉴别和量化数千种蛋白质的能力，已广泛应用在食品营养特性的深入研究中，但目前建立的鲜马乳中乳脂肪球膜的分析流程很少，而在小样本快速、可重复和高灵敏分析的情况下基于蛋白质组学分析乳脂肪球膜的方法还未见报道。
发明内容
针对现有技术中存在的不足，本发明提供了一种鲜马乳中乳脂肪球膜的提取及其蛋白质组学分析方法，提高了蛋白质提取得率，提高了肽段的生成量，在使用数据库匹配过程中，保证了一定的准确性，实现鲜马乳的乳脂肪球膜蛋白质精准相对定量和功能富集注释，加深了人们对鲜马乳蛋白质的认识并对其深加工及副产品加工提供一定的方向。
本发明是通过以下技术方案来实现：
一种鲜马乳中乳脂肪球膜的提取方法，包括以下步骤：
步骤1，将罗氏蛋白酶抑制剂加入到鲜马乳中，罗氏蛋白酶抑制剂和鲜马乳的比例为42mg：50mL，将得到的混合体系离心后得到乳脂肪层，将乳脂肪层依次用磷酸盐缓冲液和十二烷基硫酸钠溶液清洗后，得到乳脂肪球膜蛋白的十二烷基硫酸钠溶液；
步骤2，按(1-2.4)μmol：(80-90)μL的比例，将二硫苏糖醇加入到乳脂肪球膜蛋白的十二烷基硫酸钠溶液中，得到的混合体系A在46℃-50℃下孵育后冷却至室温后，得到混合体系B；
步骤3，向混合体系B中加入碘乙酰胺至碘乙酰胺的最终浓度为60mM-70mM，之后将得到的混合体系C在室温下避光孵育后，得到混合体系D，再向混合体系D中加入尿酸缓冲液去除二硫苏糖醇和碘乙酰胺，得到混合体系E；
步骤4，向混合体系E中加入碳酸氢铵溶液去除尿素和Tris-HCl，之后向得到的混合体系中加入含有胰蛋白酶的碳酸氢铵溶液，胰蛋白酶与该混合体系中乳脂肪球膜蛋白的质量比为1:(60-80)，得到混合体系F，将混合体系F在35℃-40℃下酶解后得到酶解液；
步骤5，将酶解液进行终止消化，得到含有肽混合物的溶液，将含有肽混合物的溶液进行脱盐后冷冻干燥，得到肽混合物，完成对鲜马乳中乳脂肪球膜的提取。
优选的，步骤1将得到的混合体系在0℃-4℃下于10000r/min-12000r/min离心40min-60min后得到乳脂肪层。
优选的，步骤1先在乳脂肪层中加入pH＝6.8-7.2的磷酸盐缓冲液，乳脂肪层与磷酸盐的比例为1L:(0.21-0.35)mol，之后超声25min-30min，再在0℃-4℃下以10000r/min-12000r/min离心40min-60min，得到第一次清洗的乳脂肪层，之后按照上述清洗过程对第一次清洗的乳脂肪层清洗2-4次，得到初步提纯的乳脂肪层，完成磷酸盐缓冲液对乳脂肪层的清洗。
进一步，步骤1先在初步提纯的乳脂肪层中加入质量分数为0.7％-1.0％的十二烷基硫酸钠溶液，该溶液与初步提纯的乳脂肪层的体积比为1:1，之后超声洗涤10min-15min，最后在10000r/min-12000r/min、0℃-4℃下离心40min-60min，得到乳脂肪球膜蛋白的十二烷基硫酸钠溶液。
优选的，步骤2将混合体系A在所述温度范围下孵育2h-2.5h。
优选的，步骤3将混合体系C在室温下避光孵育40min-60min。
优选的，步骤4将混合体系F在所述温度范围下酶解8h-10h得到酶解液。
一种鲜马乳中乳脂肪球膜的蛋白质组学分析方法，基于上述任意一项所述的鲜马乳中乳脂肪球膜的提取方法，包括以下步骤：
步骤1，采用液相色谱-高分辨质谱技术在数据依赖的扫描模式下对权利要求1-7中任意一项所得的肽混合物的甲酸水溶液进行信息采集，获得m/z为300-1700范围内的肽段；
步骤2，先对m/z为300-1700范围内的肽段进行解卷积处理，完成峰提取和峰对齐，之后对得到的蛋白质种类和数量进行定性分析，再对得到的LFQ响应强度进行统计学分析，筛选显著性表达蛋白质，最后通过构建热图分析模型完成显著性表达蛋白质的聚类和差异可视化；
步骤3，对聚类和差异可视化的显著性表达蛋白质进行生物信息学分析，完成鲜马乳中乳脂肪球膜的蛋白质组学分析。
进一步，步骤1采用纳升级液相色谱系统串联四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱仪对所述的肽混合物的甲酸水溶液进行信息采集；
其中在纳升级液相色谱系统中，将所述的肽混合物的甲酸水溶液在C18反相色谱柱中进行处理；流动相A为水、甲酸和甲酸铵的混合溶液，甲酸体积占混合溶液体积的1％，甲酸铵的浓度为20.0mmol/L；流动相B为混合溶剂、甲酸和甲酸铵的混合溶液，混合溶剂由体积占比为80％的乙腈和体积占比为20％的水组成，甲酸体积占混合溶液体积的1％，甲酸铵的浓度为20.0mmol/L；
梯度洗脱程序为：0-50min内，流动相B的体积比例由5％线性增加至35％；50min-95min内，流动相B的体积比例由35％线性增加至100％；95min-100min内，流动相B的体积比例保持100％；100min-110.1min内，流动相B的体积比例由100％线性减小至5％；110.1min-120min内，流动相B的比例保持5％。
进一步，在静电场轨道阱高分辨质谱仪的HESI离子源中，设置的相关参数如下：
喷雾电压为3.0kV-3.5kV、射频透镜电压为50V-60V、毛细管温度为300℃-350℃；正离子模式下一级扫描分辨率为60000-80000，二级扫描的分辨率为15000-20000，最大离子注入时间为120ms，在线性离子阱中对前25-30个响应最高的前体离子进行碎裂，隔离窗口为m/z 2-4，碰撞能量为25eV-35eV，前体离子的动态排除时间为60s-70s。
相对于现有技术，本发明具有以下优点：
本发明一种鲜马乳中乳脂肪球膜的提取方法，在乳脂肪球膜提取前加入罗氏蛋白酶抑制剂防止了乳体系中蛋白质被天然蛋白酶酶解，减少了蛋白质损失，提高了蛋白质提取得率，之后利用磷酸盐缓冲液和十二烷基硫酸钠溶液清洗，可得到乳脂肪球膜蛋白溶液，便于下一步的分离提取；之后使用超滤辅助样品制备消化对蛋白质进行酶解，二硫苏糖醇使蛋白质巯基处于还原状态，以防蛋白质中半胱氨酸之间形成二硫键，而碘乙酰胺可使巯基烷基化，防止游离的巯基再生成二硫键，最后逐步去除二硫苏糖醇和碘乙酰胺和后续的杂质，便于胰蛋白酶将乳脂肪球膜蛋白酶解为肽混合物，经脱盐后冷冻干燥，完成对鲜马乳中乳脂肪球膜的提取，二硫苏糖醇和碘乙酰胺结合使用使得蛋白质易于被酶解消化，提高了肽段的生成量，在使用数据库匹配过程中，保证了一定的准确性。本发明建立的乳脂肪球膜蛋白质的提取方法操作简便，成本低，提取效率高，且提取后蛋白质样品可直接用于色谱质谱分析。
本发明一种鲜马乳中乳脂肪球膜的蛋白质组学分析方法，根据乳脂肪球膜蛋白质的性质，先提取了鲜马乳中的乳脂肪球膜蛋白，之后采用液相色谱-高分辨质谱技术在数据依赖的扫描模式下对肽混合物进行信息采集，获得m/z为300-1700范围内的肽段并进行解卷积处理，完成峰提取和峰对齐，紧接着对得到的蛋白质种类和数量进行定性分析，再对得到的LFQ响应强度进行统计学分析，筛选出显著性表达蛋白质，最后通过构建热图分析模型完成显著性表达蛋白质的聚类和差异可视化，对聚类和差异可视化的显著性表达蛋白质进行生物信息学分析，即可完成鲜马乳中乳脂肪球膜的蛋白质组学分析。本发明可使用数据依赖扫描和LFQ算法对鉴定蛋白质进行统计学分析和生物信息学分析，可评估鲜马乳中乳脂肪球膜蛋白的潜在生物活性功能；同时基于高分辨率和准确度的海量信息的质谱特征建立的数据依赖扫描和处理平台可最大限度利用原始数据信息，尽可能少的减少误差，实现鲜马乳的乳脂肪球膜蛋白质精准相对定量和功能富集注释，加深了人们对鲜马乳蛋白质的认识并对其深加工及副产品加工提供一定的方向。该方法将具有高分辨率和准确度的海量信息的质谱特征可用于小样本快速、可重复和高灵敏分析，有助于人们更好地了解鲜马乳的乳脂肪球膜蛋白质种类及生物学功能，同时完成了鲜马乳的乳脂肪球膜蛋白质精准相对定量和功能富集注释，为今后马乳的深加工及副产品加工提供一定的方向。
附图说明
图1为本发明所述的在马乳和牛乳中差异表达的乳脂肪球膜蛋白质；
图2为在马乳和牛乳中差异表达的乳脂肪球膜蛋白质的GO功能注释；
图3为在马乳和牛乳中差异表达的乳脂肪球膜蛋白质的KEGG通路分析。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明原理及优势进行解释和说明，以便本领域技术人员更好的理解本发明。下述说明仅是示例性的，并不对其内容进行限定。
本发明结合特异性的乳脂肪球膜蛋白质提取技术与MaxQuant和Andromeda搜索引擎，可为鲜马乳的乳脂肪球膜蛋白质组学中定量实验提供了完整的解决方案。
本发明一种鲜马乳中乳脂肪球膜的提取方法，其中使用鲜牛乳作为对比，包括以下步骤：
步骤1，收集鲜马乳和鲜牛乳作为全乳样品，缓冲液溶解提取乳脂肪球膜蛋白；
本发明的样品由中国内蒙古自治区中部锡林郭勒盟的二十个马养殖户和二十个牛养殖户提供，经由实验人员采集后放入无菌袋内，置于冰盒中在1-3小时内带回检测中心，作为鲜马乳和鲜牛乳的全乳样品，用于接下来的分析；
加入42mg罗氏蛋白酶抑制剂(罗氏蛋白酶抑制剂是10种单独的蛋白酶抑制剂的混合物，包括抗蛋白酶74μM、乌苯美司130μM、胰凝乳蛋白酶抑制剂10μM-100μM、E-64 1.4μM-28.0μM、亮肽素1μM、胃蛋白酶抑制剂1μM、磷酰二肽7nM-600nM、Pefabloc SC 0.4mM-4mM、EDTA 0.5mM-1.3mM、抑肽酶0.01μM-0.3μM)分别加入到50mL的鲜马乳和鲜牛乳中，并在0℃-4℃下于10000r/min-12000r/min离心40min-60min获得乳脂肪层、乳清层和固体颗粒，固体颗粒分离之后不再处理，之后的所有操作平行做两份，一份是鲜马乳的全乳样品，另一份是鲜牛乳的全乳样品，不在具体说明。冷冻后使用刮板分离出乳脂肪层，转移至新的离心管中并加入磷酸盐缓冲液(PBS，0.3M-0.5M，pH＝6.8-7.2)超声洗涤25min-30min，乳脂肪层与磷酸盐缓冲液的体积比为1:7，在0℃-4℃下以10000r/min-12000r/min离心40min-60min，离心后去除下层磷酸盐缓冲液，在保留的上层乳脂肪样品中再次加入上述体积的磷酸盐缓冲液，继续超声、离心，此过程重复三次，以去除脂肪球膜提取过程中的乳清蛋白和酪蛋白。随后，加入与样品体积比为1:1的质量分数为0.7％-1.0％的十二烷基硫酸钠溶液(SDS)，再次超声洗涤初步提纯的乳脂肪层10min-15min，在10000r/min-12000r/min、0℃-4℃下离心40min-60min，收集得到乳脂肪球膜蛋白的SDS溶液；
步骤2，用超滤辅助样品制备消化从乳脂肪球膜蛋白的SDS溶液中分离提取乳脂肪球膜蛋白；
超滤辅助样品制备消化在使用二硫苏糖醇和碘乙酰胺进行还原烷基化后，使用分子量为10kDa的超滤膜及胰蛋白酶进行超滤和酶解，提取并收集乳脂肪球膜蛋白；
将10μL-20μL 100mM-120mM的DTT(二硫苏糖醇)加入至80μL-90μL乳脂肪球膜蛋白的SDS溶液中，将混合样品溶液于46℃-50℃下孵育2h-2.5h，以保持蛋白质巯基处于还原状态，以防蛋白质中半胱氨酸之间形成二硫键。冷却至室温后，加入碘乙酰胺至碘乙酰胺的最终浓度为60mM-70mM，并在室温下避光孵育40min-60min，使巯基烷基化，防止游离的巯基再生成二硫键。然后，将孵育后溶液加入分子量为10kDa的超滤离心管，超滤离心管备有分子量为10kDa的超滤膜，用100μL-200μL尿酸(UA)缓冲液(即将8-10M的尿素加入到100mM-120mM的Tris-HCl缓冲液中，pH＝7.6-7.8)高速离心后，移除管外液体，此洗涤过程重复两次，以去掉孵育此过程中过量的DTT和碘乙酰胺。再加入100μL-200μL 60mM-70mM碳酸氢铵溶液高速离心移除管外液体，以去掉洗涤过程中过量的尿素和Tris-HCl。将加有胰蛋白酶的60mM-70mM碳酸氢铵溶液加入上述超滤离心管，胰蛋白酶与底物的质量比为1:(60-80)，底物即碳酸氢铵溶液洗涤后的乳脂肪球膜样品，在35℃-40℃下进行8h-10h酶解，得到酶解液。最后用3％-5％(v/v)甲酸水溶液终止消化过程，其中甲酸占超纯水体积的3％-5％，得到含有肽混合物的样品溶液。使用C18柱对酶解所得的马乳和牛乳样品肽混合物进行脱盐，真空冷冻干燥后，将所得粉末即为肽混合物，将肽混合物复溶在100μL 3％-5％(v/v)甲酸水溶液中进行质谱鉴定。
本发明一种鲜马乳中乳脂肪球膜的蛋白质组学分析方法，继续使用鲜牛乳作为对比，承接之前的步骤，包括以下步骤：
步骤3，采用液相色谱-高分辨质谱技术在数据依赖的扫描模式下对经步骤2处理得到的肽混合物样品进行信息采集，获得m/z为300-1700范围内的肽段；
肽段的鉴定在纳升级液相色谱系统(EASY-nLC 1000)串联四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱仪(Q-Exactive)上通过平行三次进样分析完成。
具体地，将5μL步骤2中复溶后样品注入C18反相色谱柱中(100mm×75μm，3μm，Thermo Fisher Scientific公司)，以IntelliFlow控制流速为250nL/min，用流动相A(流动相A为水、甲酸和甲酸铵的混合溶液，其中甲酸体积占混合溶液体积的1％，甲酸铵的浓度为20.0mmol/L)和流动相B(流动相B为混合溶剂、甲酸和甲酸铵的混合溶液，其中混合溶剂由体积占比为80％的乙腈和体积占比为20％的水组成，甲酸体积占混合溶液体积的1％，甲酸铵的浓度为20.0mmol/L)作为流动相进行样品洗脱。梯度洗脱程序为：0-50min内(流动相B的比例由5％线性增加至35％)，50-95min内(流动相B的比例由35％线性增加至100％)，95-100min内，(流动相B的比例保持100％)，100-110.1min内，(流动相B的比例由100％线性减小至5％)，110.1-120min内(流动相B的比例保持5％)。
在HESI离子源中设置肽段分离流速为250nL/min，喷雾电压为3.0kV-3.5kV、RF透镜电压为50V-60V、毛细管温度为300℃-350℃的数据依赖采集(dd/MS2)模式下，采用Q-Exactive进行质谱鉴定，在m/z为300-1700范围内采集所有数据信息，正离子模式下一级扫描分辨率为60000-80000(m/z 200的半峰宽)。二级扫描的分辨率为15000-20000，最大离子注入时间为120ms，在线性离子阱中对前25-30个响应最高的前体离子进行碎裂，隔离窗口为m/z 2-4，碰撞能量高达25eV-35eV。前体离子的动态排除时间为60s-70s；
步骤4，对步骤3采集的信息进行解卷积处理，完成峰提取和峰对齐，之后使用MaxQuant软件对蛋白质的种类和数量进行定性分析，再对得到的LFQ响应强度进行统计学分析，以0.05和2作为p和倍数变化的阈值筛选显著性表达蛋白质，并通过构建热图分析模型完成显著性表达蛋白质的聚类及差异可视化；
具体地，通过UniProtKB在线数据库(网址为http://www.uniprot.org)下载最新的牛(即Bos taurus，共64796个条目)和马(即Equus caballus，共50423个条目)的蛋白序列数据库，使用MaxQuant 1.6.7.0软件对二级实际谱图与肽段理论碎裂谱图进行匹配，以Andromeda为搜索引擎，并采用LFQ算法进行相对定量分析。在选定胰蛋白酶作为消化酶，设置如表1所示的参数，使用target-decoy搜索策略来调整肽段和蛋白质鉴定的阈值，使错误发现率在0.07。使用肽段长度和母离子质量误差进行数据质控，在肽段长度主要分布在5-15内，质量误差为±3的范围内，说明所建立蛋白质分析模型具有可靠性和稳健性。
表1 MaxQuant参数设置
通过肽段在马乳中共鉴定出277种乳脂肪球膜蛋白，其定量LFQ强度跨越近5个数量级。使用T-检验和倍数变化分析对马乳和牛乳的所有乳脂肪球膜蛋白进行差异分析，选取p<0.05、倍数变化>2的蛋白作为显著差异蛋白，共发现178种具有显著性差异的蛋白，中心粒旁素(Pericentrin，PCNT)、凝溶胶蛋白(Gelsolin，GSN)、黄嘌呤脱氢酶/氧化酶(Xanthine dehydrogenase/oxidase，XDH)等28种蛋白质在两种乳样中均有表达，热休克蛋白(Heat shock protein alpha，HSPCA)、叶酸受体(Folate receptor gamma，FOLR3)和MAP28蛋白(MAP28 protein，map28)等10种蛋白质仅在马乳中有表达，补体蛋白C3(Complement component 3，C3)、丛生蛋白(Clusterin，CLU)和酪氨酸蛋白激酶(Tyrosine-protein kinase，HCK)等140种蛋白质仅在牛乳中有表达。
使用匹配到蛋白质的Label-free定量数据矩阵，使用热图对牛乳和马乳中鉴定的差异表达的乳脂肪球膜蛋白进行可视化分析，如图1所示，其中EM-1、EM-2和EM-3代表马乳，BM-1、BM-2和BM-3代表牛乳，每行表示每种乳脂肪球膜蛋白在马乳和牛乳表达相对丰度的情况，每列表示马乳和牛乳的每个样品中所有乳脂肪球膜蛋白的表达相对丰度情况。牛乳和马乳样品显示两个不同趋势，说明两种乳在差异表达蛋白方面具有较大的差异，两种乳样的各组样品之间颜色变化较小，说明所建立方法采集的数据重复性良好以及使用MaxQuant分析获得了精准的匹配度。结果显示在牛乳和马乳中鉴定出包括组蛋白H2A、XDH和凝溶胶蛋白在内的28种蛋白质差异表达，其中上调蛋白包括乳凝集素(MFGE8)和中心粒旁素(PCNT)等共16种，下调蛋白包括抗凝血酶III、脂滴包被蛋白-2(PLIN2)和脂滴包被蛋白-3(PLIN3)等共12种(表2)。
表2 在牛乳和马乳中差异表达的乳脂肪球膜蛋白
UniProtKB在线数据库集成了Uniprot中的Bos taurus和Equus caballus的蛋白序列数据库，基于前体离子m/z值和MS2匹配评分以及正向和反向搜索策略来优化库匹配规范，使用肽段长度分布和母离子质量容差分布对蛋白质数据进行质控，从而建立数据分析的工作流程用于在单次液相色谱-质谱运行中筛选目标化合物和非目标化合物，同时进行同位素模式匹配，质量准确性评估和碎片鉴定及深入的数据可视化，从而增强工作流分析的置信度。
使用MaxQuant软件在设置蛋氨酸氧化和蛋白质N端乙酰化为可变修饰，半胱氨酸的氨基甲基为固定修饰后，一级搜索肽质量耐受性为30ppm，二级搜索7ppm。胰蛋白酶/P调整为蛋白水解酶，最多有4个缺失的断裂。启用了无标签量化，对峰面积的积分获得肽段的丰度，然后对每个鉴定肽段的丰度标准化为每个特征肽的丰度，最后对所有特征标准化肽段离子的丰度进行求和。0.05和2被定义为蛋白质显著性差异表达满足相对丰度比p和倍数变化的阈值，对显著性表达蛋白质构建热图分析模型，进行聚类及差异可视化；
步骤5，对显著性表达蛋白质进行生物信息学分析，即基因功能注释和京都基因与基因组百科全书通路途径分析，以评估差异蛋白质的潜在生物活性功能；
使用Retrieve/ID MAP对鲜马乳中鉴定匹配的乳脂肪球膜蛋白从Uniprot ID到Gene name进行基因转化，随后在DAVID生物信息学资源6.8中实现乳脂肪球膜蛋白的基因本体论富集和京都基因基因组百科全书途径分析，以0.01为显著性富集表达途径的阈值。
使用DAVID对牛乳和马乳差异表达的乳脂肪球膜蛋白进行基因本体功能注释分析，根据其结果将各分支中最显著的富集注释信息显示在图2。差异表达蛋白质参与的主要生物过程是细胞过程(cellular process)；参与的主要细胞组分是胞外区(extracellularregion)；具有的主要分子功能是结合功能(binding)。使用KEGG分析了牛乳和马乳差异表达的乳脂肪球膜蛋白所参与主要通路，结果如图3。图中显示了其参与的五个通路，包括病毒性心肌炎(Viral myocarditis)、PPAR信号通路(PPAR signaling pathway)、河马信号通路(Hippo signaling pathway)、脂肪酸生物合成(Fatty acid biosynthesis)和血小板活化(Platelet activation)。PPAR信号通路分为PPARα、PPARβ/δ、PPARγ三个亚型，参与脂质代谢、糖代谢、细胞分化和凋亡等生理反应的调节。相关研究表明三种PPAR亚型参与炎症反应的调节，PPARα可增加IκB的表达，抑制NF-κB的活化和核移位，抑制炎性细胞因子的表达。PPARβ/δ与PPARα有相似的作用，但主要表达于心脏、肝脏和骨骼肌。PPARγ具有PPARγ1和PPARγ2亚型，分别在白色脂肪组织和棕色脂肪组织中表达，参与脂质代谢和胰岛素敏感性。脂肪酸可以激活PPAR，从而改变脂质代谢、炎症和2型糖尿病。
Claims (10)
1.一种鲜马乳中乳脂肪球膜的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，将罗氏蛋白酶抑制剂加入到鲜马乳中，罗氏蛋白酶抑制剂和鲜马乳的比例为42mg：50mL，将得到的混合体系离心后得到乳脂肪层，将乳脂肪层依次用磷酸盐缓冲液和十二烷基硫酸钠溶液清洗后，得到乳脂肪球膜蛋白的十二烷基硫酸钠溶液；
步骤2，按(1-2.4)μmol：(80-90)μL的比例，将二硫苏糖醇加入到乳脂肪球膜蛋白的十二烷基硫酸钠溶液中，得到的混合体系A在46℃-50℃下孵育后冷却至室温后，得到混合体系B；
步骤3，向混合体系B中加入碘乙酰胺至碘乙酰胺的最终浓度为60mM-70mM，之后将得到的混合体系C在室温下避光孵育后，得到混合体系D，再向混合体系D中加入尿酸缓冲液去除二硫苏糖醇和碘乙酰胺，得到混合体系E；
步骤4，向混合体系E中加入碳酸氢铵溶液去除尿素和Tris-HCl，之后向得到的混合体系中加入含有胰蛋白酶的碳酸氢铵溶液，胰蛋白酶与该混合体系中乳脂肪球膜蛋白的质量比为1:(60-80)，得到混合体系F，将混合体系F在35℃-40℃下酶解后得到酶解液；
步骤5，将酶解液进行终止消化，得到含有肽混合物的溶液，将含有肽混合物的溶液进行脱盐后冷冻干燥，得到肽混合物，完成对鲜马乳中乳脂肪球膜的提取。
2.根据权利要求1所述的鲜马乳中乳脂肪球膜的提取方法，其特征在于，步骤1将得到的混合体系在0℃-4℃下于10000r/min-12000r/min离心40min-60min后得到乳脂肪层。
3.根据权利要求1所述的鲜马乳中乳脂肪球膜的提取方法，其特征在于，步骤1先在乳脂肪层中加入pH＝6.8-7.2的磷酸盐缓冲液，乳脂肪层与磷酸盐的比例为1L:(0.21-0.35)mol，之后超声25min-30min，再在0℃-4℃下以10000r/min-12000r/min离心40min-60min，得到第一次清洗的乳脂肪层，之后按照上述清洗过程对第一次清洗的乳脂肪层清洗2-4次，得到初步提纯的乳脂肪层，完成磷酸盐缓冲液对乳脂肪层的清洗。
4.根据权利要求3所述的鲜马乳中乳脂肪球膜的提取方法，其特征在于，步骤1先在初步提纯的乳脂肪层中加入质量分数为0.7％-1.0％的十二烷基硫酸钠溶液，该溶液与初步提纯的乳脂肪层的体积比为1:1，之后超声洗涤10min-15min，最后在10000r/min-12000r/min、0℃-4℃下离心40min-60min，得到乳脂肪球膜蛋白的十二烷基硫酸钠溶液。
5.根据权利要求1所述的鲜马乳中乳脂肪球膜的提取方法，其特征在于，步骤2将混合体系A在所述温度范围下孵育2h-2.5h。
6.根据权利要求1所述的鲜马乳中乳脂肪球膜的提取方法，其特征在于，步骤3将混合体系C在室温下避光孵育40min-60min。
7.根据权利要求1所述的鲜马乳中乳脂肪球膜的提取方法，其特征在于，步骤4将混合体系F在所述温度范围下酶解8h-10h得到酶解液。
8.一种鲜马乳中乳脂肪球膜的蛋白质组学分析方法，其特征在于，基于权利要求1-7中任意一项所述的鲜马乳中乳脂肪球膜的提取方法，包括以下步骤：
步骤1，采用液相色谱-高分辨质谱技术在数据依赖的扫描模式下对权利要求1-7中任意一项所得的肽混合物的甲酸水溶液进行信息采集，获得m/z为300-1700范围内的肽段；
步骤2，先对m/z为300-1700范围内的肽段进行解卷积处理，完成峰提取和峰对齐，之后对得到的蛋白质种类和数量进行定性分析，再对得到的LFQ响应强度进行统计学分析，筛选显著性表达蛋白质，最后通过构建热图分析模型完成显著性表达蛋白质的聚类和差异可视化；
步骤3，对聚类和差异可视化的显著性表达蛋白质进行生物信息学分析，完成鲜马乳中乳脂肪球膜的蛋白质组学分析。
9.根据权利要求8所述的鲜马乳中乳脂肪球膜的蛋白质组学分析方法，其特征在于，步骤1采用纳升级液相色谱系统串联四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱仪对所述的肽混合物的甲酸水溶液进行信息采集；
其中在纳升级液相色谱系统中，将所述的肽混合物的甲酸水溶液在C18反相色谱柱中进行处理；流动相A为水、甲酸和甲酸铵的混合溶液，甲酸体积占混合溶液体积的1％，甲酸铵的浓度为20.0mmol/L；流动相B为混合溶剂、甲酸和甲酸铵的混合溶液，混合溶剂由体积占比为80％的乙腈和体积占比为20％的水组成，甲酸体积占混合溶液体积的1％，甲酸铵的浓度为20.0mmol/L；
梯度洗脱程序为：0-50min内，流动相B的体积比例由5％线性增加至35％；50min-95min内，流动相B的体积比例由35％线性增加至100％；95min-100min内，流动相B的体积比例保持100％；100min-110.1min内，流动相B的体积比例由100％线性减小至5％；110.1min-120min内，流动相B的比例保持5％。
10.根据权利要求9所述的鲜马乳中乳脂肪球膜的蛋白质组学分析方法，其特征在于，在静电场轨道阱高分辨质谱仪的HESI离子源中，设置的相关参数如下：
喷雾电压为3.0kV-3.5kV、射频透镜电压为50V-60V、毛细管温度为300℃-350℃；正离子模式下一级扫描分辨率为60000-80000，二级扫描的分辨率为15000-20000，最大离子注入时间为120ms，在线性离子阱中对前25-30个响应最高的前体离子进行碎裂，隔离窗口为m/z 2-4，碰撞能量为25eV-35eV，前体离子的动态排除时间为60s-70s。
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| CN101090635A (zh) * | 2004-10-12 | 2007-12-19 | 方塔拉合作集团有限公司 | β－乳清乳制品、除去中性脂质和/或富含极性脂质的乳制品、以及它们的生产方法 |
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| CN101090635A (zh) * | 2004-10-12 | 2007-12-19 | 方塔拉合作集团有限公司 | β－乳清乳制品、除去中性脂质和/或富含极性脂质的乳制品、以及它们的生产方法 |
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