CN112047952A - 一种喜树碱-光敏剂前药及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于化学医药领域，具体涉及一种喜树碱‑光敏剂前药及其制备方法和应用。本发明提供的喜树碱‑光敏剂前药，其结构如式Ⅰ所示。本发明将喜树碱和光敏剂通过前药策略共同接枝于同一聚乙二醇载体上，形成的前药化合物不仅可以在水溶液中自组装形成纳米粒，而且体内应用是不仅可以有效避免药物的泄漏、降低药物的毒副作用，而且可以同步两种药物在体内的分布，使其同步、同时达到体内靶向作用部位，而在体外近红外光的激发下，产生的ROS不仅能够杀伤肿瘤细胞，而且可以激发喜树碱的响应性释放，从而实现实时、局部、可控的药物释放和协同的肿瘤治疗。
Figure DDA0002655582350000011

Description

一种喜树碱-光敏剂前药及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于化学医药领域，具体涉及一种喜树碱-光敏剂前药及其制备方法和应用。
背景技术
癌症目前仍是一个全球性的难题，严重威胁着人类的生存和发展。临床上，化学疗法仍然是治疗癌症最常用且有效的方法之一。CPT(喜树碱)虽然因为严重的毒副作用而未在临床中使用，但它仍是一种重要的化疗药物，获得了广泛的研究，其衍生物伊立替康、拓扑替康已经被应用于临床。CPT通过抑制拓扑异构酶I破坏DNA的合成并引起癌细胞的凋亡，它对肠胃道癌、头颈部癌、肝癌等多种肿瘤均表现出优异的肿瘤生长抑制活性。除毒副作用大外，其水溶性差和内酯环的不稳定性限制了其进一步的临床应用。随着纳米技术的发展，CPT的纳米制剂可以提高水溶性和稳定性，引起了广泛的关注。但简单的物理装载方式制备的纳米制剂在全身循环过程中通常会发生药物过早的释放或泄漏，易引起副作用。而通过化学键将其共价接枝到药物载体上的前药形式，则可能使其保持稳定并避免药物在全身循环中泄漏。近年来，前药制剂已引起广泛关注。
基于异常的肿瘤环境，如肿瘤间隙和细胞内溶酶体/内涵体的低pH值、肿瘤细胞内高的GSH(谷胱甘肽)浓度、高表达的MMP(基质金属蛋白酶)、高的ROS(活性氧)水平等，一些pH、GSH、MMP敏感的前药递送系统已经被开发出来，研究显示这些前药系统显示出比常规系统更好的生物安全性和更低的毒性，但是仍存在潜在的脱靶风险，因为这些内在信号并不完全是肿瘤组织所特有。随着精准医学的发展，亟需更高的肿瘤特异性前药系统。
最近，基于ROS(活性氧)的智能响应性前药递送体系已经被开发出来，常用的ROS响应性基团有聚(硫化丙烯)、硫缩酮、硒键、氧化草酸酯和苯硼酸基等，其中硫缩酮、氧化草酸酯需要较高ROS(高于肿瘤组织的ROS)才能够实现ROS响应性断裂。将ROS响应的前药体系与ROS产生剂相配合使用，则有可能增强体系的可控性。目前常用的ROS产生剂有β-拉帕琨、光敏剂等。其中，光敏剂是在激光照射下与氧气发生反应才产生大量的ROS，因而可能实现局部可控的药物释放行为。同时，由于没有激光照射，循环中的前药没有活性，因此降低了全身毒性。但是，光敏剂通常是通过物理包载方式装载于ROS敏感系统的前药纳米载体中，在血液循环过程中不可避免地会发生泄漏。泄漏的光敏剂不仅具有强的光毒性，而且由于到达靶组织的量减少，易导致ROS生成不足，难以达到预期治疗效果。
发明内容
本发明提供了一种喜树碱-光敏剂前药，其结构如式Ⅰ所示：
Figure BDA0002655582330000021
其中，X为
Figure BDA0002655582330000022
n1、n2、n3和n4均为重复单元数，n1的范围为3～300，n2、n3、n4的范围独立地为1～10；R1为C1～C4烷氧基、-NH2、-SH、C1～C4羧基、C1～C4醛基、
Figure BDA0002655582330000023
R2为
Figure BDA0002655582330000024
R3为
Figure BDA0002655582330000025
Figure BDA0002655582330000026
优选的，X为
Figure BDA0002655582330000027
n1、n2、n3和n4均为重复单元数，n1的范围为10～120，n2、n3、n4的范围独立地为1～10；R1为C1～C4烷氧基、-NH2、-SH、C1～C4羧基、C1～C4醛基、
Figure BDA0002655582330000028
R2为
Figure BDA0002655582330000029
R3为
Figure BDA00026555823300000210
Figure BDA00026555823300000211
再优选的，X为
Figure BDA0002655582330000031
n1、n2、n3和n4均为重复单元数，n1的范围为40～50，n2、n3、n4的范围独立地为1～10；R1为C1～C4烷氧基、-NH2、-SH、C1～C4羧基、C1～C4醛基、
Figure BDA0002655582330000032
R2为
Figure BDA0002655582330000033
R3为
Figure BDA0002655582330000034
Figure BDA0002655582330000035
最优的，X为
Figure BDA0002655582330000036
n1、n2、n3和n4均为重复单元数，n1的范围为40～50，n2、n3、n4的范围独立地为1～10；R1为-OCH3、-NH2、-SH、-COOH、-CHO、
Figure BDA0002655582330000037
Figure BDA0002655582330000038
R2为
Figure BDA0002655582330000039
Figure BDA00026555823300000310
R3为
Figure BDA00026555823300000311
Figure BDA00026555823300000312
上述喜树碱-光敏剂前药，当X为
Figure BDA00026555823300000313
时，其结构如式Ⅱ所示：
Figure BDA0002655582330000041
其中，n1、n2、n3和n4均为重复单元数，n1的范围为40～50，n2、n3、n4的范围独立地为1～10；R1为C1～C4烷氧基、-NH2、-SH、C1～C4羧基、C1～C4醛基、
Figure BDA0002655582330000042
Figure BDA0002655582330000043
R2为
Figure BDA0002655582330000044
Figure BDA0002655582330000045
R3为
Figure BDA0002655582330000046
Figure BDA0002655582330000047
优选的，n1、n2、n3和n4均为重复单元数，n1的范围为40～50，n2、n3、n4的范围独立地为1～10；R1为-OCH3、-NH2、-SH、-COOH、-CHO、
Figure BDA0002655582330000048
Figure BDA0002655582330000049
R2为
Figure BDA00026555823300000410
R3为
Figure BDA00026555823300000411
上述喜树碱-光敏剂前药，当X为
Figure BDA00026555823300000412
时，其结构如式Ⅲ所示：
Figure BDA0002655582330000051
其中，n1、n2、n3和n4均为重复单元数，n1的范围为40～50，n2、n3、n4的范围独立地为1～10；R1为C1～C4烷氧基、-NH2、-SH、C1～C4羧基、C1～C4醛基、
Figure BDA0002655582330000052
Figure BDA0002655582330000053
R2为
Figure BDA0002655582330000054
Figure BDA0002655582330000055
R3为
Figure BDA0002655582330000056
Figure BDA0002655582330000057
优选的，n1、n2、n3和n4均为重复单元数，n1的范围为40～50，n2、n3、n4的范围独立地为1～10；R1为-OCH3、-NH2、-SH、-COOH、-CHO、
Figure BDA0002655582330000058
Figure BDA0002655582330000059
R2为
Figure BDA00026555823300000510
R3为
Figure BDA00026555823300000511
本发明提供的喜树碱-光敏剂前药的结构式为
Figure BDA0002655582330000061
Figure BDA0002655582330000062
本发明还提供了上述喜树碱-光敏剂前药的制备方法。当X为
Figure BDA0002655582330000063
时，所述喜树碱-光敏剂前药的制备方法的合成路线为：
Figure BDA0002655582330000064
当X为
Figure BDA0002655582330000071
时，上述喜树碱-光敏剂前药的制备方法包括以下步骤：
a、无水巯基酸和无水丙酮混合，通入过量的干燥氯化氢气体，使其饱和，在室温下反应4～10小时后，得到TK-COOH(羧基末端的硫缩酮连接剂)；将LiAlH4(四氢铝锂)的四氢呋喃溶液滴加到上述TK-COOH的四氢呋喃溶液中，回流反应0.5～2小时，用NaOH水溶液终止反应，过滤后的滤液除去溶剂后，经柱层析纯化得到TK-OH(羟基末端的硫缩酮连接剂)；
b1、将R2H和三光气混悬于无水DCM(二氯甲烷)中，随后DMAP(4-二甲氨基吡啶)的无水DCM溶液滴加到上述悬浮液中，室温下搅拌0.5～2小时后加入溶有TK-OH的无水THF溶液，室温反应10～30小时后，将反应混合物过滤滤液除去溶剂，柱层析纯化后得到R2-TK-OH；将R2-TK-OH和氯甲酸4-硝基苯酯溶解于DCM中，将无水三乙胺滴加到上述溶液中，室温反应10～30小时后，将反应混合物过滤，滤液浓缩后经柱层析纯化得到R2-TK-PNP；
c、N-Boc-N'-Fmoc-氨基酸、HATU(2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯)和TEA(三乙胺)在无水DMF中氮气下反应1～3小时,随后将
Figure BDA0002655582330000072
加入上述反应物中,反应30～60小时后，将混合物在去离子水中透析72小时，过滤除去不溶物后，将滤液冻干，得到R1-N-Boc-N'-Fmoc-氨基酸结合物；
d1、将R1-N-Boc-N'-Fmoc-氨基酸溶解在DCM中，然后滴加的TFA(三氟乙酸)，反应1～4小时后，除去溶剂，残余物用乙醚洗涤，得到氨基末端R1-N-Fmoc-氨基酸；将R2-TK-PNP和上述氨基末端R1-N-Fmoc-氨基酸溶于DMF溶液中，滴加TEA，搅拌反应过夜后，将反应溶液在去离子水中透析72小时，滤除不溶物并冻干，得到R1-N-Fmoc-氨基酸-TK-R2复合物；
e1、将R1-N-Fmoc-氨基酸-TK-R2加入到哌啶的DMF(N，N-二甲基甲酰胺)溶液中，室温下搅拌30～60分钟后，将混合物倒入冷的乙醚中以获得氨基末端的R1-氨基酸-TK-R2沉淀物，用冷乙醚洗涤后，将沉淀物真空干燥以进一步使用；以无水DMF为溶剂，使用HATU和TEA活化R3H，1～2小时后，加入氨基末端的R1-氨基酸-TK-R2，并在氮气环境下再反应20～40小时，然后将反应溶液在去离子水中透析72小时，过滤除去不溶物并冻干，得到式Ⅱ复合物。
步骤a所述无水巯基酸与无水丙酮的摩尔比为1:1.5～3；所述的室温反应结束后，将反应混合物倒入冰水浴中，沉淀物经洗涤、干燥后得到TK-COOH；所述LiAlH4与TK-COOH的摩尔比为2～5:1；所述柱层析的洗脱剂为二氯甲烷(DCM):甲醇(CH3OH)＝20:1(v/v)。
步骤b1所述R2H、三光气、DMAP的摩尔比为1:0.2～0.5:2～5；所述R2H与TK-OH的摩尔比为1:2～8；所述柱层析的洗脱剂为DCM:CH3OH＝60～100:1(v/v)；所述R2-TK-OH与氯甲酸4-硝基苯酯的摩尔比为1:2～10；所述R2-TK-OH与TEA的摩尔比为1:2～10。
步骤c所述N-Boc-N'-Fmoc-氨基酸、HATU、TEA的摩尔比为1:1～3:1～3；所述透析使用的透析袋MWCO＝2000。
步骤d1所述R2-TK-PNP、氨基末端R1-N-Fmoc-氨基酸、TEA的摩尔比为1:1～2:1.5～3；所述透析使用的透析袋截留分子量为2000。
步骤e1所述HATU、TEA、R3H的摩尔比为1～3:1～3:1；所述R3H与R1-氨基酸-TK-R2的摩尔比为1～1.5:1；所述透析使用的透析袋截留分子量为2000。
当X为
Figure BDA0002655582330000081
时，所述喜树碱-光敏剂前药的制备方法的合成路线为：
Figure BDA0002655582330000082
当X为
Figure BDA0002655582330000083
时，上述喜树碱-光敏剂前药的制备方法包括以下步骤：
b2、将R2H和三光气混悬于无水DCM中，随后DMAP的无水DCM溶液滴加到上述悬浮液中，室温下搅拌0.5～2小时后加入溶有1,6-己二醇的无水THF溶液，室温反应10～30小时后，将反应混合物过滤滤液除去溶剂，柱层析纯化后得到R2-CC-OH；将R2-CC-OH和氯甲酸4-硝基苯酯溶解于DCM中，将无水三乙胺滴加到上述溶液中，室温反应10～30小时后，将反应混合物过滤，滤液浓缩后经柱层析纯化得到R2-CC-PNP；
c、N-Boc-N'-Fmoc-氨基酸、HATU(2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯)和TEA在无水DMF中氮气下反应1～3小时,随后将
Figure BDA0002655582330000084
加入上述反应物中,反应30～60小时后，将混合物在去离子水中透析72小时，过滤除去不溶物后，将滤液冻干，得到R1-N-Boc-N'-Fmoc-氨基酸结合物；
d2、将R1-N-Boc-N'-Fmoc-氨基酸溶解在DCM中，然后滴加的TFA，反应1～4小时后，除去溶剂，残余物用乙醚洗涤，得到氨基末端R1-N-Fmoc-氨基酸；将R2-CC-PNP和上述氨基末端R1-N-Fmoc-氨基酸溶于DMF溶液中，滴加TEA，搅拌反应过夜后，将反应溶液在去离子水中透析72小时，滤除不溶物并冻干，得到R1-N-Fmoc-氨基酸-CC-R2复合物；
e2、将R1-N-Fmoc-氨基酸-CC-R2加入到哌啶的DMF溶液中，室温下搅拌30～60分钟后，将混合物倒入冷的乙醚中以获得氨基末端的R1-氨基酸-CC-R2沉淀物，用冷乙醚洗涤后，将沉淀物真空干燥以进一步使用；以无水DMF为溶剂，使用HATU和TEA活化R3H，1～2小时后，加入氨基末端的R1-氨基酸-CC-R2，并在氮气环境下再反应20～40小时，然后将反应溶液在去离子水中透析72小时，过滤除去不溶物并冻干，得到式Ⅲ复合物。
步骤b2所述R2H、三光气、DMAP的摩尔比为1:0.2～0.5:2～5；所述R2H与1,6-己二醇的摩尔比为1:2～8；所述柱层析的洗脱剂为DCM:CH3OH＝60～100:1(v/v)；所述R2-CC-OH与氯甲酸4-硝基苯酯的摩尔比为1:2～10；所述R2-CC-OH与TEA的摩尔比为1:2～10。
步骤c所述N-Boc-N'-Fmoc-氨基酸、HATU、TEA的摩尔比为1:1～3:1～3；所述透析使用的透析袋MWCO＝2000。
步骤d2所述R2-CC-PNP、氨基末端R1-N-Fmoc-氨基酸、TEA的摩尔比为1:1～2:1.5～3；所述透析使用的透析袋截留分子量为2000。
步骤e2所述HATU、TEA、R3H的摩尔比为1～3:1～3:1；所述R3H与R1-氨基酸-CC-R2的摩尔比为1～1.5:1；所述透析使用的透析袋截留分子量为2000。
本发明还提供了喜树碱-光敏剂前药在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明的有益效果在于：本发明将喜树碱和光敏剂通过前药策略共同接枝于同一聚乙二醇载体上，形成的前药化合物不仅可以在水溶液中自组装形成纳米粒，而且在体内应用时还可以有效避免药物的泄漏、降低药物的毒副作用。同时还可以同步两种药物在体内的分布，使其同步、同时达到体内靶向作用部位。在体外近红外光的激发下，产生的ROS不仅能够杀伤肿瘤细胞，而且可以激发喜树碱的响应性释放，从而实现实时、局部、可控的药物释放和协同的肿瘤治疗。
附图说明
图1MPEG-(TK-CPT)-PPa的核磁共振氢谱图。
图2MPEG-(CC-CPT)-PPa的核磁共振氢谱图。
图3MPEG-TK-CPT的核磁共振氢谱图。
图4MPEG-CC-CPT的核磁共振氢谱图。
图5MPEG-PPa的核磁共振氢谱图。
图6MPEG-(TK-CPT)-PPa的DLS粒径分布图和TEM图。
图7体外ROS的产生。
图8ROS响应性的药物释放。
图9体外细胞摄取和胞内ROS水平图，G1为MPEG-(TK-CPT)-PPa纳米粒组，G2为MPEG-(TK-CPT)-PPa纳米粒+激光组，G3为MPEG-(TK-CPT)-PPa纳米粒+Vitamin C+激光。
图10体外细胞毒性结果图。
图11体内活体近红外荧光成像图。
图12体内治疗后肿瘤体积和小鼠体重变化图，G1为PBS组，G2为PBS+激光组，G3为MPEG-PPa纳米粒+激光组，G4为MPEG-(cc-CPT)纳米粒组，G5为MPEG-(TK-CPT)组，G6为MPEG-(cc-CPT)-PPa组，G7为MPEG-(TK-CPT)-PPa组，G8为MPEG-(cc-CPT)-PPa+激光组，G9为MPEG-(TK-CPT)-PPa+激光组。
具体实施方式
喜树碱-光敏剂前药的制备方法包括以下步骤：
a、无水巯基酸和无水丙酮混合，通入过量的干燥氯化氢气体，使其饱和，在室温下反应4～10小时后，得到TK-COOH；将LiAlH4的四氢呋喃溶液滴加到上述TK-COOH的四氢呋喃溶液中，回流反应0.5～2小时，用NaOH水溶液终止反应，过滤后的滤液除去溶剂后，经柱层析纯化得到TK-OH；
b、将R2H和三光气混悬于无水DCM中，随后DMAP的无水DCM溶液滴加到上述悬浮液中，室温下搅拌0.5～2小时后加入溶有TK-OH或1,6-己二醇的无水THF溶液，室温反应10～30小时后，将反应混合物过滤滤液除去溶剂，柱层析纯化后得到R2-TK-OH或R2-CC-OH；将R2-TK-OH或R2-CC-OH与氯甲酸4-硝基苯酯溶解于DCM中，将无水三乙胺滴加到上述溶液中，室温反应10～30小时后，将反应混合物过滤，滤液浓缩后经柱层析纯化得到R2-TK-PNP或R2-CC-PNP；
c、N-Boc-N'-Fmoc-氨基酸、HATU和TEA在无水DMF中氮气下反应1～3小时,随后将
Figure BDA0002655582330000101
加入上述反应物中,反应30～60小时后，将混合物在去离子水中透析72小时，过滤除去不溶物后，将滤液冻干，得到R1-N-Boc-N'-Fmoc-氨基酸结合物；
d、将R1-N-Boc-N'-Fmoc-氨基酸溶解在DCM中，然后滴加的TFA，反应1～4小时后，除去溶剂，残余物用乙醚洗涤，得到氨基末端R1-N-Fmoc-氨基酸；将R2-TK-PNP或R2-CC-PNP与上述氨基末端R1-N-Fmoc-氨基酸溶于DMF溶液中，滴加TEA，搅拌反应过夜后，将反应溶液在去离子水中透析72小时，滤除不溶物并冻干，得到R1-N-Fmoc-氨基酸-TK-R2复合物或R1-N-Fmoc-氨基酸-CC-R2复合物；
e、将R1-N-Fmoc-氨基酸-TK-R2或R1-N-Fmoc-氨基酸-CC-R2加入到哌啶的DMF溶液中，室温下搅拌30～60分钟后，将混合物倒入冷的乙醚中以获得氨基末端的R1-氨基酸-TK-R2或R1-氨基酸-CC-R2沉淀物，用冷乙醚洗涤后，将沉淀物真空干燥以进一步使用；以无水DMF为溶剂，使用HATU和TEA活化R3H，1～2小时后，加入氨基末端的R1-氨基酸-TK-R2或R1-氨基酸-CC-R2，并在氮气环境下再反应20～40小时，然后将反应溶液在去离子水中透析72小时，过滤除去不溶物并冻干，得到式Ⅰ复合物。
步骤a所述无水巯基酸与无水丙酮的摩尔比为1:1.5～3；所述的室温反应结束后，将反应混合物倒入冰水浴中，沉淀物经洗涤、干燥后得到TK-COOH；所述LiAlH4与TK-COOH的摩尔比为2～5:1；所述柱层析的洗脱剂为二氯甲烷(DCM):甲醇(CH3OH)＝20:1(v/v)。
步骤b所述R2H、三光气、DMAP的摩尔比为1:0.2～0.5:2～5；所述R2H与TK-OH或1,6-己二醇的摩尔比为1:2～8；所述柱层析的洗脱剂为DCM:CH3OH＝60～100:1(v/v)；所述R2-TK-OH或R2-CC-OH与氯甲酸4-硝基苯酯的摩尔比为1:2～10；所述R2-TK-OH或R2-CC-OH与TEA的摩尔比为1:2～10。
步骤c所述N-Boc-N'-Fmoc-氨基酸、HATU、TEA的摩尔比为1:1～3:1～3；所述透析使用的透析袋MWCO＝2000。
步骤d所述R2-TK-PNP或R2-CC-PNP、氨基末端R1-N-Fmoc-氨基酸、TEA的摩尔比为1:1～2:1.5～3；所述透析使用的透析袋截留分子量为2000。
步骤e所述HATU、TEA、R3H的摩尔比为1～3:1～3:1；所述R3H与R1-氨基酸-TK-R2或R1-氨基酸-CC-R2的摩尔比为1～1.5:1；所述透析使用的透析袋截留分子量为2000。
实施例1：羧基硫缩酮(TK-COOH)的制备
Figure BDA0002655582330000111
氮气条件下，将无水巯基乙酸(4.6g，50mmol)和无水丙酮(5.9g，100mmol)混合，通入过量的干燥氯化氢气体，使其饱和。在室温下搅拌6小时后，然后将混合物倒入冰水浴中，得白色沉淀物，并用正己烷和冷水洗涤三次。在真空干燥器中干燥后，得白色羧基末端的硫缩酮连接剂(TK-COOH)。
1H NMR(400MHz,CD3OD)δ3.45(s,4H),1.64(s,6H)。ESI-MS负离子模式),m/z:理论值224.0177,实测值223.0097(M-H)。
实施例2：羟基硫缩酮(TK-OH)的制备
Figure BDA0002655582330000121
将15.4mL LiAlH4/四氢呋喃溶液(2.4mol/L)滴加到20mL干燥的含5g TK-COOH的THF溶液中，回流反应1小时。然后将15％NaOH水溶液缓慢滴加入反应混合物中，直到没有气体产生为止。过滤混合物，所得滤液减压蒸馏以除去溶剂。将粗产物通过硅胶柱色谱法进一步纯化，以DCM(二氯甲烷)/CH3OH(甲醇)(20：1，v/v)作为洗脱剂，得羟基末端的硫缩酮连接剂(TK-OH)。
1H NMR(400MHz,CD3OD)δ3.74(t,J＝6.9Hz,4H),2.83(t,J＝6.9Hz,4H),1.64(s,6H)。ESI-MS(负离子模式)m/z:理论值196.0592,实测值231.0275(M+Cl)。
实施例3：喜树碱-羟基硫缩酮碳酸酯(CPT-TK-OH)的制备
Figure BDA0002655582330000122
在冰浴条件下、氮气氛围中，将CPT(喜树碱，0.70g，2mmol)和三光气(0.2g，0.66mmol)混悬于50mL无水DCM溶液中，随后将10mL DMAP(4-二甲氨基吡啶)0.73g，6mmol)/无水DCM溶液逐滴滴加到上述悬浮液中。室温下搅拌1小时，黄色悬浮液逐渐变为澄清溶液。将过量的TK-OH(1.96g，10mmol)溶解在10mL无水THF(四氢呋喃)中，并快速加入到上述混合物中。室温反应24小时后，将反应混合物过滤除盐，旋蒸除溶剂。将残留物重新溶解于DCM中，依次用0.1M盐酸溶液，饱和氯化钠溶液各洗涤两次。有机层经无水MgSO4干燥过夜，收集并浓缩上清液，并将残留物通过硅胶柱色谱法纯化，使用DCM/CH3OH(60/1，v/v)作为洗脱剂，获得黄色浅色CPT-TK-OH。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.41(d,J＝7.6Hz,1H),8.24(d,J＝8.5Hz,1H),7.94(t,J＝6.6Hz,1H),7.84(dd,J＝14.0,6.5Hz,1H),7.72-7.63(m,1H),7.40(s,1H),5.76-5.66(m,1H),5.45–5.34(m,1H),5.35-5.28(m,2H),4.30(t,J＝6.7Hz,2H),3.77(t,J＝6.4Hz,2H),2.91(t,J＝6.7Hz,2H),2.89-2.78(m,2H),2.36-2.11(m,2H),1.54(s,6H),1.03(dt,J＝17.8,7.4Hz,3H)。ESI-MS(正离子模式)m/z:理论值570.1494,实测值571.1569(M+H)。
实施例4：喜树碱-己烷醇碳酸酯(CPT-CC-OH)的制备
Figure BDA0002655582330000131
在冰浴条件下、氮气氛围中，将CPT(0.70g，2mmol)和三光气(0.2g，0.66mmol)混悬于50mL无水DCM溶液中，随后将10mL DMAP(0.73g，6mmol)/无水DCM溶液逐滴滴加到上述悬浮液中。室温下搅拌1小时，黄色悬浮液逐渐变为澄清溶液。将过量的1,6-己二醇(1.18g，10mmol)溶解在10mL无水THF中，并快速加入到上述混合物中。室温反应24小时后，将反应混合物过滤除盐，旋蒸除溶剂。将残留物重新溶解于DCM中，依次用0.1M盐酸溶液，饱和氯化钠溶液各洗涤两次。有机层经无水MgSO4干燥过夜，收集并浓缩上清液，并将残留物通过硅胶柱色谱法纯化，使用DCM/CH3OH(60/1，v/v)作为洗脱剂，获得黄色浅色CPT-CC-OH。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.41(s,1H),8.24(d,J＝8.5Hz,1H),7.95(d,J＝7.9Hz,1H),7.85(t,J＝7.2Hz,1H),7.68(t,J＝7.4Hz,1H),7.37(s,1H),5.70(d,J＝17.3Hz,1H),5.39(d,J＝17.3Hz,1H),5.36-5.23(m,2H),4.22-4.07(m,2H),3.60(t,J＝6.5Hz,2H),2.29(dq,J＝14.9,7.5Hz,1H),2.16(dq,J＝14.8,7.4Hz,1H),1.75-1.60(m,2H),1.60-1.48(m,2H),1.47-1.31(m,4H),1.00(t,J＝7.5Hz,3H)。ESI-MS(正离子模式)m/z:理论值492.1896,实测值493.1966(M+H)。
实施例5：喜树碱-硫缩酮-对硝基苯酯(CPT-TK-PNP)的制备
Figure BDA0002655582330000132
在冰盐浴条件下，将CPT-TK-OH(114mg，0.2mmol)和氯甲酸4-硝基苯酯(201.6mg，1mmol)溶解于50mL DCM中。将无水TEA(三乙胺，121.2mg，1.2mmol)逐滴滴加到上述溶液中，室温搅拌24小时。随后，将反应混合物过滤以除去盐。浓缩滤液，并将残余物通过硅胶柱色谱法纯化，使用DCM/CH3OH(100/1，v/v)作为洗脱剂，获得黄色浅色CPT-TK-PNP。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.39(d,J＝11.3Hz,1H),8.28-8.25(m,1H),8.24(d,J＝3.1Hz,1H),8.23(d,J＝5.4Hz,1H),7.95(d,J＝8.1Hz,1H),7.88-7.81(m,1H),7.68(t,J＝7.5Hz,1H),7.40-7.37(m,1H),7.36(s,1H),7.35(s,1H),5.76-5.64(m,1H),5.45-5.35(m,1H),5.33-5.25(m,2H),4.38(q,J＝7.1Hz,2H),4.35-4.18(m,2H),2.95(dd,J＝12.1,5.2Hz,2H),2.91(dd,J＝14.5,7.4Hz,2H),2.35-2.11(m,2H),1.56(dd,J＝11.7,5.8Hz,6H),1.00(dd,J＝9.1,5.9Hz,3H)。ESI-MS(正离子模式)m/z:理论值735.1557,实测值736.1630(M+H)。
实施例6：MPEG-N-Boc-N′-Fmoc-赖氨酸的制备
Figure BDA0002655582330000141
将N-Boc-N'-Fmoc-赖氨酸(1.17g，2.5mmol)，HATU(2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯，1.42g，3.75mmol)和TEA(379mg，3.75mmol)加入到20mL无水DMF中，在氮气下搅拌1小时。随后将MPEG-NH2(氨基聚乙二醇单甲醚，1g，0.5mmol)加入上述混合物中。反应2天后，使用透析袋(MWCO＝2000)将混合物在去离子水中透析72小时。过滤除去不溶物后，将滤液冻干，得到MPEG-N-Boc-N'-Fmoc-赖氨酸结合物。
实施例7：MPEG-N-Fmoc-赖氨酸-TK-CPT的制备
Figure BDA0002655582330000142
将MPEG-N-Boc-N'-Fmoc-赖氨酸(500mg)溶解在10mL DCM中，然后逐滴加入10mL的三氟乙酸(TFA)。反应2小时后，通过旋转蒸发仪除去溶液，并将残余物用乙醚洗涤，然后获得氨基末端MPEG-N-Fmoc-赖氨酸。
将CPT-TK-PNP(67.9mg，92.4μmol)和上述氨基末端MPEG-N-Fmoc-Lysine溶于10mLDMF溶液中，将TEA(16.9mg，168μmol)逐滴添加到上述混和溶液中。搅拌反应过夜后，将反应溶液加入到截留分子量2000的透析袋，于在去离子水中透析72小时。滤除不溶物并冻干，得MPEG-N-Fmoc-Lysine-TK-CPT复合物。
实施例8：聚乙二醇单甲醚-(硫缩酮喜树碱)-焦脱镁叶绿酸α(MPEG-(TK-CPT)-PPa)的制备
Figure BDA0002655582330000151
将MPEG-N-Fmoc-赖氨酸-TK-CPT(200mg)加入到10mL 20％哌啶的DMF(N，N-二甲基甲酰胺)溶液中。室温下搅拌30分钟后，将混合物倒入冷的乙醚中以获得游离氨基末端的MPEG-赖氨酸-TK-CPT沉淀物。用冷乙醚洗涤三遍后，将沉淀物真空干燥以进一步使用。
以无水DMF为溶剂，使用HATU(11.3mg，29.7μmol)和TEA(3.0mg，29.7μmol)活化PPa羧基(10.6mg，19.8μmol)。1小时后，将氨基末端MPEG-赖氨酸-TK-CPT(50mg，18μmol)加入上述溶液中，并在氮气环境下再搅拌24小时。将反应溶液置于截留分子量为2000的透析袋，使用去离子水中透析72小时。过滤除去不溶物并冻干，得到MPEG-(TK-CPT)-PPa复合物。结果如图1所示，主要特征峰均可以找到在核磁图谱中找到，表明合成成功。
实施例9：喜树碱-己烷-对硝基苯酯(CPT-CC-PNP)的制备
Figure BDA0002655582330000152
在冰盐浴条件下，将CPT-CC-OH(98.6mg，0.2mmol)和氯甲酸4-硝基苯酯(201.6mg，1mmol)溶解于50mL DCM中。将无水TEA(121.2mg，1.2mmol)逐滴滴加到上述溶液中，室温搅拌24小时。随后，将反应混合物过滤以除去盐。浓缩滤液，并将残余物通过硅胶柱色谱法纯化，使用DCM/CH3OH(100/1，v/v)作为洗脱剂，获得黄色浅色CPT-CC-PNP。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.41(s,1H),8.33-8.19(m,3H)，7.95(d,J＝7.9Hz,1H),7.81(m,1H),7.68(m,1H),7.40-7.31(m,3H),5.70(d,J＝17.2Hz,1H),5.39(d,J＝17.3Hz,1H),5.30(s,5H),4.13(t,J＝13.1,11.3,10.7,6.6Hz,4H),2.36-2.09(m,2H),1.81-1.66(m,4H),1.48-1.41(m,3H),1.00(t,J＝7.5Hz,3H)。ESI-MS(正离子模式)m/z:理论值657.1958,实测值658.2033(M+H)。
实施例10：MPEG-N-Fmoc-赖氨酸-CC-CPT的制备
Figure BDA0002655582330000161
将CPT-CC-PNP(60.8mg，92.4μmol)和氨基末端MPEG-N-Fmoc-赖氨酸溶于10mL DMF溶液中，将TEA(16.9mg，168μmol)逐滴添加到上述混和溶液中。搅拌反应过夜后，将反应溶液加入到截留分子量2000的透析袋，于在去离子水中透析72小时。滤除不溶物并冻干，得MPEG-N-Fmoc-赖氨酸-CC-CPT复合物。
实施例11：MPEG-(CC-CPT)-PPa(聚乙二醇单甲醚-己烷基喜树碱-焦脱镁叶绿酸α)的制备
Figure BDA0002655582330000162
将MPEG-N-Fmoc-赖氨酸-CC-CPT(200mg)加入到10mL 20％哌啶的DMF溶液中。室温下搅拌30分钟后，将混合物倒入冷的乙醚中以获得游离氨基末端的MPEG-赖氨酸-CC-CPT沉淀物。用冷乙醚洗涤三遍后，将沉淀物真空干燥以进一步使用。
以无水DMF为溶剂，使用HATU(11.3mg，29.7μmol)和TEA(3.0mg，29.7μmol)活化PPa羧基(10.6mg，19.8μmol)。1小时后，将氨基末端MPEG-赖氨酸-CC-CPT(50mg，18μmol)加入上述溶液中，并在氮气环境下再搅拌24小时。将反应溶液置于截留分子量为2000的透析袋，使用去离子水中透析72小时。过滤除去不溶物并冻干，得到MPEG-(CC-CPT)-PPa复合物。结果如图2所示，主要特征峰均可以找到在核磁图谱中找到，表明合成成功。
实施例12：聚乙二醇单甲醚-硫缩酮喜树碱(MPEG-TK-CPT)的制备
Figure BDA0002655582330000163
将CPT-TK-PNP(40.4mg，55μmol)和MPEG-NH2(100mg，50μmol)溶于5mL DMF溶液，搅拌下，将TEA(10.1mg，100μmol)加入到混合物溶液中。搅拌反应过夜后，将反应溶液置于截留分子量为2000的透析袋，在去离子水中透析72小时。过滤去除不溶物，并冻干，得MPEG-TK-CPT复合物。结果如图3所示，主要特征峰均可以找到在核磁图谱中找到，表明合成成功。
实施例13：聚乙二醇单甲醚-己烷基喜树碱(MPEG-CC-CPT)的制备
Figure BDA0002655582330000171
将CPT-CC-PNP(31.2mg，55μmol)和MPEG-NH2(100mg，50μmol)溶于5mL DMF溶液，搅拌下，将TEA(10.1mg，100μmol)加入到混合物溶液中。搅拌反应过夜后，将反应溶液置于截留分子量为2000的透析袋，在去离子水中透析72小时。过滤去除不溶物，并冻干，得MPEG-CC-CPT复合物。结果如图4所示，主要特征峰均可以找到在核磁图谱中找到，表明合成成功。
实施例14：聚乙二醇单甲醚-焦脱镁叶绿酸α(MPEG-PPa)的制备
Figure BDA0002655582330000172
将PPa(焦脱镁叶绿酸α，29.4mg，55μmol)、HATU(31.4mg，82.5μmol)和TEA(8.3mg，82.5μmol)加入到5mL无水DMF中。活化1h后，将MPEG-NH2(100mg，50μmol)加入到上述溶液中，在氮气氛下再搅拌反应24小时。将反应溶液置于截留分子量为2000的透析袋，在去离子水中透析72小时。过滤去除不溶物，并冻干，得MPEG-PPa复合物。结果如图5所示，主要特征峰均可以找到在核磁图谱中找到，表明合成成功。
实施例15：纳米粒的制备
通过透析方法制备了MPEG-(TK-CPT)-PPa纳米粒。将MPEG-(TK-CPT)-PPa(10.0mg)溶解在1.0mL DMSO(二甲基亚砜)中，然后滴加到9.0mL的去离子水中。避光搅拌6小时后，将溶液转移至透析袋(截留分子量/MWCO＝2000Da)中，并用去离子水透析24小时。随后，使用0.22μm过滤器(Millipore)过滤NP溶液，以除去不溶物，以备后用。采用相似的方法制备MPEG-PPa，MPEG-TK-CPT，MPEG-cc-CPT，MPEG-(CC-CPT)-PPa纳米粒。
如图6所示，所制得的MPEG-(TK-CPT)-PPa纳米粒呈均匀的单分散的球形，TEM粒径约为28.0±3.3nm，DLS测得粒径为43.6±0.8nm。
实施例16：前药纳米粒在体外产生活性氧(ROS)的能力评价
使用ABDA(9,10-蒽二基-双(亚甲基)二甲酸)作为ROS指示剂监测前药纳米粒的ROS生成能力。简要地，首先制备在379nm处的吸收强度为0.5的ABDA溶液。然后，将100μL实施例15制备的纳米粒或游离PPa添加到上述ABDA溶液中，最终PPa浓度为10μM的溶液。之后，将所得溶液用660nm激光以100mV/cm2的功率照射5分钟。每隔一分钟测定一次溶液的紫外-可见光谱。ABDA溶液在379nm处的吸光度变化反应ROS的产生多少。
结果如图7所示，可以看出，在激光照射下，纳米粒组和游离的PPa组均有ROS产生，而且在照射后期，纳米粒组的吸光度减少的更多，表明纳米粒组产生了更多的ROS。
实施例17：体外药物释放
将实施例15中的各纳米粒溶液(1mg/mL)置于透析袋(MWCO，2000Da)中，然后置于10mL含有0.5％吐温80的PBS(磷酸缓冲盐溶液)缓冲液(pH＝7.4)中。释放测试温度为37℃，振荡速率为100rpm。在预定时间点，收取释放介质，并补加新鲜的介质。为了评价CPT的光响应性释放行为，在4h，将溶液用660nm激光以100mW/cm2的功率照射5分钟。而没有激光照射的样品作为阴性对照。另外，将其中一组的释放介质中添加50mM H2O2和1.0μM Fe2+作为外源性ROS，用作阳性对照组。将收取的释放介质冻干，再用甲醇溶解，然后通过HPLC分析以确定CPT的含量，重复三次取平均值。
释放结果如图8所示，可以看出，在没有660nm激光照射时，几乎没有CPT释放；而施以660nm激光以后，CPT可以快速从MPEG-(TK-CPT)-PPa纳米粒中释放，但是MPEG-(CC-CPT)-PPa纳米粒仍几乎没有释放；而外源性ROS存在下，CPT可以一直释放。表明了，该纳米体系，确实具有ROS响应性的CPT释放行为。
实施例18：体外细胞摄取及活性氧产生
将处于对数期的人源HCT116结肠癌细胞(购自美国典型菌株保藏中心(ATCC))以每孔1×105个细胞的密度接种到玻璃底细胞培养皿中，并在37℃下培养24小时。然后，使用PPa浓度为0.5μM的实施例15制备的纳米粒处理细胞4小时。分为三个实验组，1)激光照射，2)同时加入0.5mM的ROS清除剂维生素c(Vc)后再激光照射，3)激光未照射。接着，将细胞用PBS洗涤3次，将10μM活性氧指示剂DCFH-DA(2',7'-二氯荧光素二乙酸盐)加入到每孔中，并用660nm激光以100mW/cm2的光强度照射5分钟。加入新鲜杜氏改良Eagle DMEM培养基(是对BME培养基的一种修改，含有四倍浓度的氨基酸和维生素)并再培养2小时后；再用PBS洗涤细胞；用10％中性福尔马林溶液进一步固定细胞，PBS洗涤后通过激光共聚焦显微镜观察细胞摄取和细胞内ROS的产生，其中CPT呈蓝色荧光，PPa呈红色荧光，产生的ROS激活DCFH-DA生成绿色荧光的DCF(2',7'-二氯荧光素)。
结果如图9所示，可以看出，CPT蓝色荧光和PPa红色荧光共定位于细胞中；三组的DCF绿色荧光信号有显著差异，其中激光照射组最强，未照射的绿色荧光几乎没有，而加入Vc的激光照射组介于二者之间，表明所制备的纳米粒确实可以被细胞摄取，并在激光照射下的细胞内产生活性氧物质。
实施例19：体外细胞毒性评价
将处于对数期的人源HCT116结肠癌细胞以5×103个细胞每孔接种到96孔板中。培养24小时后，将100μL含有不同浓度的游离药物或纳米粒的新鲜DMEM培养基添加到每孔中。再培养24小时后，将培养基替换为新鲜培养基。对于激光处理组，每个孔用660nm激光以100mW/cm2照射5分钟，接着将这些细胞再培养24小时。对于激光不照射的组，将细胞直接培养48小时。之后，将每个孔的培养基替换为100μL新鲜DMEM培养基，然后添加到20μL新鲜制备的噻唑蓝(MTT)溶液(5mg/mL)中。再培养4小时后，除去培养基，加入150μL DMSO(二甲基亚砜)溶解形成的甲臢晶体。用酶标仪测定570nm处的吸光度。各样品的吸光度对比空白对照的吸光度计算细胞活力。
体外细胞毒性如图10所示，单纯的激光照射对细胞的生长几乎没有影响，所有细胞的活力均高于85％。在没有激光照射时，MPEG-PPa纳米粒对癌细胞的生长也没有抑制作用(IC50>100μM)；但是该纳米粒联合使用激光后，IC50显著降低为1.0μM，这表明PPa可产生强大的细胞光毒性。游离CPT的IC50值为0.87μM，而将CPT和MPEG-PPa纳米粒联合应用并加以激光照射后，IC50显著下降至0.064μM；而计算出的联合治疗指数为0.14，证明了CPT和MPEG-PPa在激光照射下，具有很高的协同治疗效果。当没有激光照射时，有或没有ROS敏感键的MPEG-CPT或MPEG-CPT-PPa纳米粒对癌细胞增殖活性的抑制作用非常有限。但是在激光照射后，MPEG-(TK-CPT)-PPa纳米颗粒处理组的IC50值从16.7μM显着降低至0.12μM。低于MPEG-(cc-CPT)-PPa(0.86μM)和MPEG-PPa；而后两者的IC50值无显着差异。MPEG-(TK-CPT)-PPa增强的抗肿瘤效果主要是得益于在激光照射下PPa产生的ROS不仅触发了CPT的释放，而且还发挥了光动力治疗作用，从而发挥了协同治疗作用。
实施例20：体内活体近红外荧光成像
将100μL的HCT116细胞悬液(1×106个细胞)，皮下注射到BALB/c裸小鼠(购自北京华阜康生物科技股份有限公司)的右背部，建立荷HCT116结肠癌肿瘤模型。当肿瘤体积达到500–1000mm3时，以游离的PPa作为对照，将实施例15制备的MPEG-(TK-CPT)-PPa纳米粒通过尾静脉注射到荷瘤小鼠体内。在预定的时间点，用异氟烷麻醉小鼠，并通过
Figure BDA0002655582330000201
Spectrum(Perkin-Elmer，美国)采集PPa的近红外荧光信号(激发波长为640nm，发射波长为710nm)。
结果如图11所示，由于PPa具有近红外荧光吸收的特性，因而可以直接用于纳米粒的追踪与定位。Free PPa(游离PPa)组的小鼠几乎没有观察到逐渐累积的荧光信号，表明在肿瘤组织中的没有聚集，并且从体内的快速清除。而对于MPEG-(TK-CPT)-PPa纳米给药组，在小鼠注射后1h，荧光信号广泛分布在整个身体上。随着时间的增加，PPa荧光信号在小鼠的其他部位逐渐减少，而肿瘤组织则呈现先增加后减少的趋势，表明具有一定的肿瘤靶向能力。注射后约4小时，肿瘤部位的荧光信号强度最强，在此时给予激光照射，能发挥最大的抗肿瘤效果。
实施例21：体内抗肿瘤治疗
将荷HCT116肿瘤小鼠随机分为9组(G1～G9，每组6只小鼠)，并通过尾静脉分别将100μL的PBS、MPEG-PPa、MPEG-TK-CPT、MPEG-cc-CPT、MPEG-(cc-CPT)-PPa和MPEG-(TK-CPT)-PPa纳米粒注射入不同的小鼠体内，CPT的等效剂量为10mg/kg和PPa为15mg/kg。每两天给药一次，共计给药三次。在注射后4小时，用660nm激光以100mW/cm2的功率强度对激光照射组小鼠的肿瘤进行5分钟照射。每两天测量一次肿瘤大小和小鼠体重。肿瘤体积计算公式为(肿瘤长度L×肿瘤宽度W2)/2。在治疗后第21天，将小鼠安乐死。
结果如图12所示，不论有无激光照射，PBS组的小鼠肿瘤体积均迅速增加，而用激光照射的MPEG-(TK-CPT)-PPa显示出最大的肿瘤抑制作用和抗肿瘤功效。尽管没用激光照射的MPEG-TK-CPT，MPEG-(cc-CPT)-PPa和MPEG-(TK-CPT)-PPa在体外细胞毒性试验中显示出非常弱的抗癌活性，但与之相比，它们在体内却表现出对肿瘤生长的抑制作用可能是由于在肿瘤组织中酯键的降解导致CPT缓慢释放引起的。激光照射的MPEG-PPa纳米粒也由于PPa引起的光动力治疗作用而减小了肿瘤的体积，但其抑制作用却比激光照射的MPEG-(TK-CPT)-PPa纳米粒低。从上述结果可以看出，快速释放的CPT产生的化疗作用和PPa生成的ROS的光动力治疗作用相结合，提高了肿瘤治疗效力。在整个实验期间，所有小鼠均未表现出任何明显的体重降低(图12右)，表明这些前药制剂具有优异的生物相容性和生物安全性。

Claims (8)

1.喜树碱-光敏剂前药，其结构如式Ⅰ所示：
Figure FDA0002655582320000011
其中，X为
Figure FDA0002655582320000012
n1、n2、n3和n4均为重复单元数，n1的范围为3～300，n2、n3、n4的范围独立地为1～10；R1为C1～C4烷氧基、-NH2、-SH、C1～C4羧基、C1～C4醛基、
Figure FDA0002655582320000013
R2为
Figure FDA0002655582320000014
2.根据权利要求1所述的喜树碱-光敏剂前药，其特征在于：n1的范围为10～120。
3.根据权利要求2所述的喜树碱-光敏剂前药，其特征在于：n1的范围为40～50。
4.根据权利要求3所述的喜树碱-光敏剂前药，其特征在于：R1为-OCH3、-NH2、-SH、-COOH、-CHO、
Figure FDA0002655582320000015
5.根据权利要求4所述的喜树碱-光敏剂前药，其特征在于：当X为
Figure FDA0002655582320000016
时，其结构如式Ⅱ所示：
Figure FDA0002655582320000021
其中，n1、n2、n3和n4均为重复单元数，n1的范围为40～50，n2、n3、n4的范围独立地为1～10；R1为C1～C4烷氧基、-NH2、-SH、C1～C4羧基、C1～C4醛基、
Figure FDA0002655582320000022
Figure FDA0002655582320000023
R2为
Figure FDA0002655582320000024
Figure FDA0002655582320000025
R3为
Figure FDA0002655582320000026
Figure FDA0002655582320000027
优选的，n1、n2、n3和n4均为重复单元数，n1的范围为40～50，n2、n3、n4的范围独立地为1～10；R1为-OCH3、-NH2、-SH、-COOH、-CHO、
Figure FDA0002655582320000028
Figure FDA0002655582320000029
R2为
Figure FDA00026555823200000210
R3为
Figure FDA00026555823200000211
6.根据权利要求4所述的喜树碱-光敏剂前药，其特征在于：当X为
Figure FDA00026555823200000212
时，其结构如式Ⅲ所示：
Figure FDA0002655582320000031
其中，n1、n2、n3和n4均为重复单元数，n1的范围为40～50，n2、n3、n4的范围独立地为1～10；R1为C1～C4烷氧基、-NH2、-SH、C1～C4羧基、C1～C4醛基、
Figure FDA0002655582320000032
Figure FDA0002655582320000033
R2为
Figure FDA0002655582320000034
Figure FDA0002655582320000035
R3为
Figure FDA0002655582320000036
Figure FDA0002655582320000037
优选的，n1、n2、n3和n4均为重复单元数，n1的范围为40～50，n2、n3、n4的范围独立地为1～10；R1为-OCH3、-NH2、-SH、-COOH、-CHO、
Figure FDA0002655582320000038
Figure FDA0002655582320000039
R2为
Figure FDA00026555823200000310
R3为
Figure FDA00026555823200000311
7.根据权利要求4所述的喜树碱-光敏剂前药，其特征在于：所述喜树碱-光敏剂前药的结构式为
Figure FDA0002655582320000041
8.权利要求1～7任一项所述的喜树碱-光敏剂前药在制备抗肿瘤药物中的应用。
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