CN112042810A - 复合饲料添加剂在制备提高养殖大黄鱼肌肉质地的饲料中的应用 - Google Patents

复合饲料添加剂在制备提高养殖大黄鱼肌肉质地的饲料中的应用 Download PDF

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Abstract

本申请公开一种复合饲料添加剂在制备提高养殖大黄鱼肌肉质地的饲料中的应用，将月桂酸单甘油酯、癸酸单甘油酯和辛酸单甘油酯作为饲料添加剂按配比量添加至养殖大黄鱼饲料中。本申请中，通过饲料添加剂中链脂肪酸的应用，可以有效提高养殖大黄鱼体内的肌肉纤维合成的mRNA水平，上调蛋白质及氨基酸合成的代谢途径，进而改善大黄鱼肌肉质地及肌肉纤维直径。本申请中，通过中链脂肪酸饲料添加剂的应用，还可以有效提高养殖大黄鱼肌肉氨基酸、脂肪酸及风味物质的含量水平，进而改善大黄鱼风味物质。

Description

复合饲料添加剂在制备提高养殖大黄鱼肌肉质地的饲料中的 应用
技术领域
本申请涉及水产养殖技术领域，具体涉及一种复合饲料添加剂在制备养殖大黄鱼饲料中的应用。
背景技术
中链脂肪酸(MCFAs)是碳链长度为8～12的饱和脂肪酸，包括辛酸(C8:0)、癸酸(C10:0)和月桂酸(C12:0)，其天然存在于动物的乳脂及椰子油、棕榈仁油中，是一种在自然界含量丰富、易获得、易利用的脂肪酸。中链脂肪酸单甘油酯有特殊的化学及物理特性，其与长链脂肪酸相比，有更低的熔点，更易溶解；其在动物体内可直接经门静脉血流运输到肝脏进行代谢，达到快速供能的目的；另外，中链脂肪酸单甘油酯还具有高效、广谱的抑菌性和抗病毒功能。
大黄鱼[Pseudosiciaena crocea(Pichardson)]隶属于硬骨鱼纲、鲈形目、石首鱼科、黄鱼属，俗称黄瓜鱼、黄花鱼、黄鱼等。大黄鱼作为我国特有的地方性品种，是中国传统“四大海产”之一，也是我国沿海水域的主要经济鱼类之一，有“中国国鱼”之称，但大黄鱼海水养殖在快速发展的过程中面临一个重要的问题就是养殖大黄鱼品质的下降，如蛋白质含量低，鲜味氨基酸含量缺乏，腹部脂肪高，肉质松软、口感差，风味下降，品质降低，因而无法满足消费者的要求，并且与野生大黄鱼的价格在市场上往往相差甚大，严重影响了大黄鱼养殖业的经济效益和持续发展。
发明内容
本申请提供一种复合饲料添加剂在制备养殖大黄鱼饲料中的应用，含有该复合饲料添加剂的饲料可显著提升大黄鱼的体型体色和肌肉组织学特性(肌肉硬度、弹性、内聚性等质地属性)。
一种复合饲料添加剂在制备改善大黄鱼肌肉质地的养殖大黄鱼饲料中的应用，所述复合饲料添加剂包括月桂酸单甘油酯、癸酸单甘油酯和辛酸单甘油酯。
可选的，所述肌肉质地包括：肌肉硬度、肌肉弹性、肌肉内聚性和背部肌肉中蛋白质及脂肪含量中的至少一种。
实验发现，本申请的复合添加剂还可改善大黄鱼的体型体色等生长性能，因此，本申请还提供一种复合饲料添加剂在制备改善大黄鱼生长性能的养殖大黄鱼饲料中的应用，所述复合饲料添加剂包括月桂酸单甘油酯、癸酸单甘油酯和辛酸单甘油酯。
可选的，所述生长性能包括体型和体色；可选的，所述大黄鱼体型体色包括体长/体宽比值，体色包括(亮度值(L*)、红色值(a*)、黄色值(b*))。改善养殖大黄鱼体型体色即包括提高以养殖大黄鱼体长/体宽的比值及提高养殖大黄鱼背部皮肤的亮度值、黄色值和红色值。
再一方面，本申请的复合添加剂还可改善大黄鱼的风味物质(氨基酸，电子舌数据等)。因此，本申请还提供一种复合饲料添加剂在制备改善大黄鱼风味物质的养殖大黄鱼饲料中的应用。
可选的，所述改善大黄鱼风味包括提高养殖大黄鱼肌肉中氨基酸、脂肪酸及风味物质中至少一种的含量水平。
可选的，所述复合饲料添加剂以300-1800mg/kg加入养殖大黄鱼饲料的原料中。
可选的，所述复合饲料添加剂以500-1000mg/kg加入养殖大黄鱼饲料的原料中。
可选的，所述复合添加剂中所述月桂酸单甘油酯、癸酸单甘油酯和辛酸单甘油酯的重量比为2～8:1～4:1。
进一步可选的，所述复合添加剂中月桂酸单甘油酯、癸酸单甘油酯和辛酸单甘油酯的重量比为如下配比中的一种：
月桂酸单甘油酯：癸酸单甘油酯：辛酸单甘油酯＝8:1:1；月桂酸单甘油酯：癸酸单甘油酯：辛酸单甘油酯＝7:2:1；月桂酸单甘油酯：癸酸单甘油酯：辛酸单甘油酯＝6:3:1；月桂酸单甘油酯：癸酸单甘油酯：辛酸单甘油酯＝5:4:1；月桂酸单甘油酯：癸酸单甘油酯：辛酸单甘油酯＝5:3:2。
可选的，所述复合饲料添加剂中还包含惰性载体，所述月桂酸单甘油酯、癸酸单甘油酯和辛酸单甘油酯沉积在所述惰性载体上。
可选的，所述养殖大黄鱼饲料中粗蛋白含量为18～30％；粗脂肪含量为5～10％。
满足上述要求的其中一种原料组分包括：鱼粉、豆粕、鱼油、大豆油、小麦粉、酵母粉、卵磷脂、复合矿物质、复合维生素、氯化胆碱、诱食剂、防霉剂、抗氧化剂和维生素C。
可选的，按重量百分比计，所述养殖大黄鱼饲料的原料包括：鱼粉50～55％，豆粕粉10～15％，鱼油2～5％，大豆油2～5％，小麦粉15～25％，酵母粉2～5％，卵磷脂2～5％，复合矿物质1～3％，复合维生素1～3％，氯化胆碱0.1～0.5％，诱食剂0.1～0.5％，防霉剂0.1～0.5％，抗氧化剂0.01～0.1％，维生素C 0.1～0.5％。
进一步地，按重量百分比计，所述养殖大黄鱼饲料的原料包括：鱼粉52％，豆粕粉11.6％，鱼油3％，大豆油3％，小麦粉20％，酵母粉3％，卵磷脂2.5％，复合矿物质2％，复合维生素2％，氯化胆碱0.25％，诱食剂0.3％，防霉剂0.1％，抗氧化剂0.05％，维生素C0.2％。
本申请还提供一种改善大黄鱼肌肉质地和/或生长性能的复合饲料添加剂，.包括月桂酸单甘油酯、癸酸单甘油酯和辛酸单甘油酯；所述月桂酸单甘油酯、癸酸单甘油酯和辛酸单甘油酯的重量比为2～8:1～4:1。
本申请还提供一种改善大黄鱼肌肉质地和/或生长性能的养殖大黄鱼饲料，按重量百分比计，其原料包括：鱼粉50～55％，豆粕粉10～15％，鱼油2～5％，大豆油2～5％，小麦粉15～25％，酵母粉2～5％，卵磷脂2～5％，复合矿物质1～3％，复合维生素1～3％，氯化胆碱0.1～0.5％，诱食剂0.1～0.5％，防霉剂0.1～0.5％，抗氧化剂0.01～0.1％，维生素C0.1～0.5％；以及如上成分基础上按照500～1000mg/kg添加的复合饲料添加剂；所述复合饲料添加剂包括月桂酸单甘油酯、癸酸单甘油酯和辛酸单甘油酯；所述月桂酸单甘油酯、癸酸单甘油酯和辛酸单甘油酯的重量比为2～8:1～4:1。
进一步地，一种养殖大黄鱼饲料，包括：鱼粉52％，豆粕粉11.6％，鱼油3％，大豆油3％，小麦粉20％，酵母粉3％，卵磷脂2.5％，复合矿物质2％，复合维生素2％，氯化胆碱0.25％，诱食剂0.3％，防霉剂0.1％，抗氧化剂0.05％，维生素C 0.1～0.5％；以及如上成分基础上按照700～800mg/kg原料添加的复合饲料添加剂。
本申请还提供一种所述养殖大黄鱼饲料的制备方法，包括：
第一步：将除卵磷脂、鱼油和氯化胆碱外的其他固体原料混合，混合原则如下：按照原料占比从小到大逐级定量均匀混合，然后再将所得混合物充分混匀；
第二步：将卵磷脂溶于鱼油中，然后与充分混合后的固体混合料继续混合均匀；
第三步：将氯化胆碱溶于水中，然后将所得水溶液加入如上的混合料中，继续混合均匀；
第四步：将混合料进行制后烘干，得颗粒饲料。
本发明发现将该复合添加剂添加至养殖大黄鱼的饲料原料中，与现有技术相比，至少具有如下有益效果之一：
(1)本申请中，通过复合饲料添加剂的应用，可以有效提高养殖大黄鱼体内的肌肉纤维合成的mRNA水平，上调蛋白质及氨基酸合成的代谢途径，进而改善大黄鱼肌肉质地及肌肉纤维直径，肌肉硬度、弹性、内聚性等质地属性等均得到显著改善。
(2)本申请中，通过复合饲料添加剂的应用，可以有效增加养殖大黄鱼体长/体宽的比值，提高养殖大黄鱼背部皮肤的亮度值、黄色值和红色值。
(3)本申请中，通过复合饲料添加剂的应用，还可以有效提高养殖大黄鱼肌肉氨基酸、脂肪酸及风味物质的含量水平，进而改善大黄鱼风味物质。
附图说明
图1为不同比例中链脂肪酸单甘酯对养殖大黄鱼体长的比较结果图(图中A对应对照组，B～F分别对应实验组1～5)；
图2为不同比例中链脂肪酸单甘酯对养殖大黄鱼背部肌肉纤维结构的影响结果图；
图3为不同处理组代谢物的PCA图；
图4为复合饲料添加剂干预对代谢物相对含量改变的差异热图分析结果图；
图5为KEGG富集图谱；
图6为复合饲料添加剂对养殖大黄鱼肌肉组织中生肌相关基因表达的影响结果图；
图7为复合饲料添加剂对养殖大黄鱼肌肉组织中生肌负向调节因子相关基因表达的影响结果图。
图3～图7中的实验组均对应实验组1～5中的实验组5。
具体实施方式
下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本申请。
本申请所提供的饲料添加剂，可达到改善大黄鱼体型体色和食用品质的作用，一方面可改善大黄鱼的肌肉组织学特性(肌肉硬度、弹性、内聚性等质地属性)，另一方面可改善大黄鱼体型体色，再一方面还可改善风味物质(氨基酸，电子舌数据等)。
养殖大黄鱼饲料的原料按照最终养殖大黄鱼饲料中粗蛋白含量为18～30％、粗脂肪含量为5～10％进行混配。一种具体的原料配方中，本申请所提供的基础饲料中，各原料如下：
鱼粉，豆粕，鱼油，大豆油，小麦粉，酵母粉，卵磷脂，复合矿物质，复合维生素，氯化胆碱，常规添加剂，复合饲料添加剂按配比量进行添加。
近年来，科研人员通过合理搭配营养素或添加一些改善水产动物品质的饲料添加剂，如富硒酵母、虾青素、抗氧化剂、有机盐、中草药、益生菌、DHA、VC等，改善大黄鱼的质构、口感、风味、肉色等肉质指标，提升水产品食用品质。但传统技术中，没有对中链脂肪酸对于大黄鱼肌肉质地作用影响的研究探索，也没有对于大黄鱼体型/体色及风味物质的探索。本申请的提出，不仅填补了相关领域的研究空白，更是为大黄鱼的饲养提供了很好的参考价值。
本申请所提供的如上配方的配合饲料原料中，作为复合饲料添加剂的质量为原料总质量的300-1800mg/kg，进一步为500-1000mg/kg，优选为900mg/kg。作为本申请最优选的方案，中链脂肪酸的添加量为900mg/kg(由于复合饲料添加剂的添加量较少，因而可不计入总质量中，即除复合饲料添加剂外的原料质量百分比之和为100％，然后复合饲料添加剂以其他原料总质量之和为基础再进行对应的添加量进行称量和添加，不考虑其添加对于除其以外的各原料总质量的影响)，并优选的通过复合饲料添加剂如上的添加，使得饲料中复合饲料添加剂的含量能够达到900mg/Kg左右的水平。
进一步的，如上配合饲料中，所述复合矿物质中，包含：氟化钠，碘化钾，氯化钴，硫酸铜，硫酸铁，硫酸锌，硫酸铜，硫酸镁，磷酸二氢钙，氯化钠，沸石粉。
同时，如上配合饲料中，所述复合维生素中，包含：硫胺素，核黄素，盐酸吡哆醇，维生素B12，维生素K3，肌醇，泛酸，烟酸，叶酸，生物素，维生素A，维生素D3，维生素E，维生素C，胆碱，乙氧基喹啉，微晶纤维素。
以及，如上配合饲料中，添加剂包含：诱食剂、防霉剂及抗氧化剂；其中，诱食剂包括：甘氨酸和甜菜碱(质量比优选为1：2，甘氨酸在前)；防霉剂包括：苯甲酸钠；抗氧化剂包括：乙氧基喹啉。所用原料均为养殖大黄鱼饲料常规配料。
本申请中，作为代表性的饲料配方，其原料组成及占比如下(质量百分比)：鱼粉52％，豆粕粉11.6％，鱼油3％，大豆油3％，小麦粉20％，酵母粉3％，卵磷脂2.5％，复合矿物质2％，复合维生素2％，氯化胆碱0.25％，诱食剂0.3％，防霉剂0.1％，抗氧化剂0.05％，维生素C 0.2％，以及如上成分基础上按照900mg/kg添加的复合饲料添加剂；复合添加剂按照月桂酸单甘油酯、癸酸单甘油酯和辛酸单甘油酯的重量比为2～8:1～4:1进行混配。
按照如前所述，即“除复合饲料添加剂外的原料质量百分比之和为100％”
进一步的，本申请如上配合饲料的制备方法工艺也较为便捷，其中一种制备方法的工艺步骤如下：
第一步：是对于原料进行预处理，例如将鱼粉和豆粕进行粉碎和筛分。
第二步：按照质量配比，称量各原料。
第三步：将除大豆卵磷脂，鱼油，以及氯化胆碱外的其他固体原料混合，混合原则如下：按照原料占比从小到大逐级定量均匀混合进行，然后再将所得混合物在V型搅拌器中充分混匀；
第四步：将大豆卵磷脂溶于鱼油中，然后与充分混合后的固体混合料继续混合均匀。
第五步：将氯化胆碱溶于水中，然后将所得水溶液加入如上的混合料中(水的用量约为原料干重的20％)，继续混合均匀。
第六步：将混合料进行制粒，然后烘干，得到含水量10％左右的颗粒饲料，以供后续研究。
以下以具体实施例进行说明，实施例中所用原料均可通过市购获得：
实施例1：
在正式养殖实验之前，将大黄鱼暂养于3.0×3.0×3.0m的海水浮式网箱以适应环境。两周后，饥饿24h，挑选出体格健壮，大小均一的大黄鱼随机分成6组(对照组，实验组1，实验组2，实验组3，实验组4，实验组5)，每组设6个重复，分别饲养于1.5×1.5×2.0m的浮式网箱中，每个重复30尾。对照组饲喂基础饲料，实验组1、2、3、4、5分别在基础饲料基础上添加900mg/kg的复合饲料添加剂，每天进行两次饱食投喂(05：00和17：30)。养殖期间水温26.5-32.5℃，盐度变化32-36‰，养殖期间溶氧大于6mg/L，养殖周期为45天。
按照如下表1中饲料配方，配置成等氮等能2种饲料，分别命名为饲料1和饲料2。对照组喂表1中饲料1(基础饲料)，实验组1、2、3、4、5在表1中饲料2基础上按照表2配方对应添加复合添加剂。
表1饲料配方及化学组成(％干重)
Figure BDA0002665008250000091
Figure BDA0002665008250000101
1鱼粉：粗蛋白，67.6％；粗脂肪，7.8％；豆粕粉：粗蛋白，46.2％；粗脂肪，1.7％；小麦粉粗蛋白，13.9％；粗脂肪，1.9％；酵母粉：粗蛋白，57.1％；粗脂肪，3.5％。
2、复合矿物质(mg/kg饲料)：氟化钠，2mg；碘化钾，0.8mg；氯化钴(1％)，50mg；硫酸铜，10mg；硫酸铁，80mg；硫酸锌，50mg；硫酸铜，60mg；硫酸镁，1200mg；磷酸二氢钙，8000mg；氯化钠，100mg；沸石粉，10.447g。
3复合维生素(mg/kg饲料)：硫胺素，25mg；核黄素，45mg；盐酸吡哆醇，20mg；维生素B12，0.1mg；维生素K3，10mg；肌醇，800mg；泛酸，60mg；烟酸，200mg；叶酸，20mg；生物素，1.20mg；维生素A，32mg；维生素D3，5mg；维生素E，120mg；维生素C，2000mg；胆碱，2000mg；乙氧基喹啉，150mg；微晶纤维素，14.52g。
4诱食剂：甘氨酸+甜菜碱
5防霉剂：苯甲酸钠
表2不同中链脂肪酸单甘酯的饲料添加剂配比表
Figure BDA0002665008250000102
养殖结束后，将实验鱼饥饿24h后，从网箱中全部捞起，用丁香酚麻醉后计数并称重，利用电子天平对体质量进行精确称量(精确到0.01g)，计算增重量、去内脏重、肝体比和肥满度。用游标卡尺对试验大黄鱼的6个形态性状进行精确的测量(精确到0.01cm)，其包括体长、体高、头长、吻长、尾柄长、尾柄高，计算体长/体高和尾柄长/尾柄高。不同比例中链脂肪酸单甘酯对养殖大黄鱼生长及体型的比较结果见表3。对全鱼体组成分析参照AOAC(1993)的方法进行测定。水分测定在105℃烘箱中烘至恒重；粗蛋白是采用凯氏定氮法测定；粗脂肪采用索氏抽提法测定。不同比例中链脂肪酸单甘酯对养殖大黄鱼身体成分的比较结果见表4。用色差计CR400对6组大黄鱼(n＝6)进行腹部、背部和尾部色差值测定。采用国际发光照明委员会CIE标准规定的亮度值L*、红绿值a*、黄蓝值b*表示色泽。不同比例中链脂肪酸单甘酯对养殖大黄鱼特色的比较结果见表5。
表3不同比例中链脂肪酸单甘酯对养殖大黄鱼生长及体型的比较结果
Figure BDA0002665008250000111
图1为不同比例中链脂肪酸单甘酯对养殖大黄鱼体长的比较结果(图1中A为对照组，B为实验组1，C为实验组2，D为实验组3，E为实验组4，F为实验组5)，由表3及图1可知，与对照组相比，实验组1-5的最终体重、增重量及肥满度都有不同程度的升高，体型也比对照组更加呈现细长，说明不同比例的中链脂肪酸单甘酯饲料添加剂对养殖大黄鱼体重具有促进作用，同时能够促进体型的纤细。
表4不同比例中链脂肪酸单甘酯对养殖大黄鱼身体成分的比较结果
组别 水分 粗蛋白(％) 粗脂肪(％)
对照组 71.74±3.45 54.77±1.91 24.38±1.59
实验组1 72.44±2.47 55.57±2.32 25.28±2.42
实验组2 73.72±3.14 59.53±2.42* 25.32±2.11
实验组3 74.82±3.12 54.72±2.44 26.46±2.23*
实验组4 77.72±4.45 62.63±2.24** 26.62±2.34*
实验组5 73.35±2.47 63.52±2.33** 26.35±2.22*
由表4可知，在对全鱼体成分分析中，与对照组相比，实验组1-5的水分无显著差别，但粗蛋白和粗脂肪均有不同程度的升高，特别是实验组4-5对养殖大黄鱼的粗蛋白和粗脂肪的含量升高特别显著，说明不同比例的中链脂肪酸单甘酯饲料添加剂对养殖大黄鱼的蛋白和脂肪含量有增加的作用。
表5不同比例中链脂肪酸单甘酯对养殖大黄鱼体色的比较结果
组别 亮度值(L*) 红色值(a*) 黄色值(b*)
对照组 75.29±5.05 11.64±2.97 61.46±9.23
实验组1 76.23±4.14 13.42±2.44 62.42±9.11
实验组2 76.33±5.42 12.42±2.12 65.32±8.43*
实验组3 76.24±5.06 12.14±2.42 66.11±8.78*
实验组4 76.22±5.12 13.32±2.88 68.26±9.42*
实验组5 76.23±5.55 12.77±2.34 68.53±9.11*
由表5可知，在对养殖大黄鱼体色的分析中，与对照组相比，实验组1-5的黄色值(b*)均有不同程度的升高，特别是实验组2，金黄色泽着色较优，说明不同比例的中链脂肪酸单甘酯饲料添加剂对养殖大黄鱼的金黄色具有促进作用。
实施例2：
由实施例1可知，实验组4、5中养殖大黄鱼身体的脂肪及蛋白含量明显升高，为了明确脂肪及蛋白含量的升高与大黄鱼肉质的关系，设计实施例2。挑选出体格健壮，大小均一的大黄鱼随机分成3组(对照组，实验组4，实验组5)，每组设6个重复，分别饲养于1.5×1.5×2.0m的浮式网箱中，每个重复30尾。对照组饲喂基础饲料，实验组4、5分别在基础饲料基础上添加900mg/kg的饲料添加剂，每天进行两次饱食投喂(05：00和17：30)。养殖期间水温26.5-32.5℃，盐度变化32-36‰，养殖期间溶氧大于6mg/L，养殖周期为45天。
按照实施例1表1中饲料配方，配置成等氮等能2种饲料，分别命名为饲料1和饲料2。对照组按照表1中饲喂基础饲料(饲料1)，实验组4、5分别在基础饲料基础上添加饲料添加剂配方如表2(对应表2中实验组4和5的添加剂配方)。实验结束后，取6条新鲜大黄鱼背部侧线上方的肌肉做质构分析；另取6条大黄鱼背部侧线上方的肌肉用多聚甲醛固定，做切片及HE染色。
质构检测方法：
将2组大黄鱼(n＝6)去鳃去内脏，取出皮背肌鱼块(2cm×2cm×1cm)，拭干后采用全质构面剖析法(TPA模式)进行测试，采用P/5探头，测试速度50mm/min，形变量50％，回程距离30mm；使用剪切探头进行剪切试验，测试速度50mm/min，回程距离30mm，每组样品平行测定10次。
组织切片分析方法：
组织学切片的制作：(1)脱水：将组织块依次浸入到不同浓度酒精中(70％-80％-95％-100％-100％)，各30min。(2)透明：浸入二甲苯：纯乙醇(1：1)的混合液30min-二甲苯30min-二甲苯30min。(3)透蜡：将组织块浸入二甲苯：石蜡(1：1)的混合液30min—石蜡30min—石蜡30min。(4)包埋。(5)切片(5um)、粘片、烘片。(6)H.E.染色。(7)中性树胶封片。·
表6不同比例中链脂肪酸单甘酯对养殖大黄鱼背部肌肉质构的影响
Figure BDA0002665008250000141
由表6可知，与对照组相比，实验组4的内聚性有所提升，实验组5的硬度，弹性和内聚性都有所提高，说明月桂酸单甘油酯：癸酸单甘油酯：辛酸单甘油酯＝5:3:2的饲料添加剂更好地对养殖大黄鱼硬度、弹性等方面具有改善作用。
图2为不同比例中链脂肪酸单甘酯对养殖大黄鱼背部肌肉纤维结构的影响结果，图2可知，与对照组相比，实验4组和实验5组的养殖大黄鱼肌肉纤维不同程度的增粗，肌间脂肪增多。特别是实验5组，肌间脂肪显著增多，说明月桂酸单甘油酯：癸酸单甘油酯：辛酸单甘油酯＝5:3:2的饲料添加剂更好地对养殖大黄鱼肌肉纤维和肌间脂肪的合成具有促进作用，有助于增强养殖大黄鱼鲜嫩口感。
实施例3：
由实施例1和2可知，实验组5中养殖大黄鱼身体的脂肪及蛋白含量明显升高，质构特性明显增强，且对养殖大黄鱼肌肉纤维和肌间脂肪的合成具有促进作用，为明确实验组5中中链脂肪酸配比对养殖大黄鱼食用品质改善的原因，设计了实施例3。挑选出体格健壮，大小均一的大黄鱼随机分成2组(对照组，实验组5)，每组设6个重复，分别饲养于1.5×1.5×2.0m的浮式网箱中，每个重复30尾。
对照组饲喂基础饲料，实验组5在基础饲料基础上添加900mg/kg的饲料添加剂(对应表2中实验组5的添加剂配方)，每天进行两次饱食投喂(05：00和17：30)。养殖期间水温26.5-32.5℃，盐度变化32-36‰，养殖期间溶氧大于6mg/L，养殖周期为45天。
按照表1中饲料配方，配置成等氮等能2种饲料，分别命名为饲料1和饲料2。对照组按照如表1中饲喂基础饲料(饲料1)，实验组在基础饲料基础上添加饲料添加剂(月桂酸单甘油酯：癸酸单甘油酯：辛酸单甘油酯＝5:3:2)(饲料2)。实验结束后，分别从每个网箱中随机取12尾鱼，分离背部侧线上方的肌肉，于﹣80℃保存用于测定肌肉的代谢成分及肌肉纤维合成相关基因表达情况。
实验方法：
(1)非靶向代谢组学检测
样本预处理：-80℃取出样本，称量60㎎样本，分别加入200ul水MP匀浆，涡旋60s，加入800ul甲醇乙腈溶液(1：1，v/v)，涡旋60s，低温超声30min，2次，-20℃放置1h沉淀蛋白，14000rcf，4℃离心20min，取上清冷冻干燥，-80℃保存样本。
色谱条件：样品采用Agilent 1290Infinity LC超高效液相色谱系统(UHPLC)HILIC色谱柱进行分离；柱温25℃；流速0.3mL/min；流动相组成A：水+25mM乙酸铵+25mM氨水，B：乙腈；梯度洗脱程序如下：0---0.5min，95％B；0.5---7min，B从95％线性变化至65％；7---8min，B从65％线性变化至40％；8---9min，B维持在40％；9---9.1min，B从40％线性变化至95％；9.1---12min，B维持在95％；整个分析过程中样品置于4℃自动进样器中。为避免仪器检测信号波动而造成的影响，采用随机顺序进行样本的连续分析。样本队列中插入QC样品，用于监测和评价系统的稳定性及实验数据的可靠性。
2Q-TOF质谱条件：分别采用电喷雾电离(ESI)正离子和负离子模式进行检测。样品经UHPLC分离后用Agilent 6550质谱仪进行质谱分析。ESI源条件如下：Gas Tem：250℃，Drying gas：16L/min，Nebulizer：20psig，Sheath gas Tem：400℃，sheath Gas Flow：12L/min，Vcap：3000V，Nozzle voltage：0V.Fragment：175V，Mass Range：50-1200，Acquisitionrate：4Hz，cycle time：250ms。样本检测完毕后，采用AB Triple TOF 6600质谱仪对代谢物进行鉴定，采集QC样品的一级、二级谱图。ESI源条件如下：Ion Source Gas1(Gas1)：40，IonSource Gas2(Gas2)：80，Curtain gas(CUR)：30，source temperature：650℃，IonSaparyVoltage Floating(ISVF)±5000V(正负两种模式)；二级质谱采用information dependentacquisition(IDA)获得，并且采用high sensitivity模式，Declustering potential(DP)：±60V(正负两种模式)，Collision Energy：35±15eV，IDA设置如下Exclude isotopeswithin 4Da，Candidate ions to monitor per cycle：10。数据采集是按mass range进行分段，50-300，290-600，590-900，890-1200，从而扩大二级谱图的采集率，每个方法每段采集四个重复。所采集获得的数据，分别使用自建MetDDA和LipDDA方法，进行代谢物的结构鉴定。
数据处理：原始数据经ProteoWizard转换成.mzXML格式，然后采用XCMS程序进行峰对齐、保留时间校正和提取峰面积。代谢物结构鉴定采用精确质量数匹配(<25ppm)和二级谱图匹配的方式，通过查询数据库(HMDB、NIST等)或者相关文献，对标志性代谢产物定性分析。数据经Pareto-scaling预处理后，进行多维统计分析，包括无监督主成分分析(PCA)分析，有监督偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)。单维统计分析包括Student’s t-test和变异倍数分析，R软件绘制火山图。
(2)RT-PCR检测
参照Trizol Reagent总RNA提取试剂盒抽提取肌肉组织总RNA，用Nanodrop分光光度计测定RNA浓度后用PCR仪反转录得到cDNA，利用荧光实时定量PCR检测肌肉生成相关mRNA的表达水平。
(3)数据分析
实验统计方法采用计算软件SPSS17.0，不同处理组数据间进行双因素方差分析(two-way ANOVA)，采用Tukey多重比较法进行事后检验，显著性水平为0.05。实验数据采用均值(Means)表示。
实验结果：
由图3可知，复合饲料添加剂组与对照组之间代谢物存在显著差别。经过中链脂肪酸饲料添加剂处理后，大黄鱼肌肉中显著上调的代谢物包括与蛋白质消化吸收及氨基酸代谢相关代谢物(图4)，如谷氨酰胺，脯氨酸，精氨酸，苏氨酸等，这些代谢物的增多有助于大黄鱼的风味改善。通过比对KEGG数据库可知，中链脂肪酸饲料添加剂可有效上调氨酰生物合成，蛋白质消化吸收，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸的代谢，精氨酸和脯氨酸代谢合成相关代谢通路(如图5)，这些通路都与养殖大黄鱼食用品质的改善密切相关。
如图6所示，复合饲料添加剂可显著上调养殖大黄鱼肌肉组织中生肌调节因子(MyoD、Myf5、MyoG和MRF4)、肌细胞增强子因子2(MEF2A、MEF2B、MEF2C和MEF2D)和胰岛素样生长因子(IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ)基因表达，增强了骨骼肌肌肉生成、分化的复杂过程。同时，中链脂肪酸饲料添加剂可显著下调肌肉组织中生肌负向调节因子相关基因的表达(图7)，如分化抑制因子(Id1和Id2)，肌肉生长抑制素(MSTN)和MyoD抑制素(I-mfa)。
实施例4
挑选出体格健壮，大小均一的大黄鱼随机分成3组(对照组，实验组6，实验组7)，每组设6个重复，分别饲养于1.5×1.5×2.0m的浮式网箱中，每个重复30尾。对照组饲喂基础饲料(表1中饲料1)，实验组6在基础饲料基础上添加900mg/kg的饲料添加剂，实验组7在基础饲料基础上添加1400mg/kg的饲料添加剂，每天进行两次饱食投喂(05：00和17：30)。养殖期间水温26.5-32.5℃，盐度变化32-36‰，养殖期间溶氧大于6mg/L，养殖周期为45天。按照如表7中饲料配方，配置成等氮等能3种饲料。对照组按照如表7中饲喂基础饲料，实验组6和实验组7在基础饲料基础上分别添加900mg/kg和1400mg/kg的饲料添加剂(月桂酸单甘油酯：癸酸单甘油酯：辛酸单甘油酯＝5:3:2)。实验结束后，分别从每个网箱中随机取12尾鱼，分离背部侧线上方的肌肉，于﹣80℃保存用于电子舌测定和肌肉中氨基酸、脂肪酸含量的测定。
表7饲料配方及化学组成(％干重)
Figure BDA0002665008250000181
Figure BDA0002665008250000191
1鱼粉：粗蛋白，67.6％；粗脂肪，7.8％；豆粕粉：粗蛋白，46.2％；粗脂肪，1.7％；小麦粉粗蛋白，13.9％；粗脂肪，1.9％；酵母粉：粗蛋白，57.1％；粗脂肪，3.5％。
2、复合矿物质(mg/kg饲料)：氟化钠，2mg；碘化钾，0.8mg；氯化钴(1％)，50mg；硫酸铜，10mg；硫酸铁，80mg；硫酸锌，50mg；硫酸铜，60mg；硫酸镁，1200mg；磷酸二氢钙，8000mg；氯化钠，100mg；沸石粉，10.447g。
3复合维生素(mg/kg饲料)：硫胺素，25mg；核黄素，45mg；盐酸吡哆醇，20mg；维生素B12，0.1mg；维生素K3，10mg；肌醇，800mg；泛酸，60mg；烟酸，200mg；叶酸，20mg；生物素，1.20mg；维生素A，32mg；维生素D3，5mg；维生素E，120mg；维生素C，2000mg；胆碱，2000mg；乙氧基喹啉，150mg；微晶纤维素，14.52g。
4诱食剂：甘氨酸+甜菜碱
5防霉剂：苯甲酸钠
实验方法：
电子舌测定：
将大黄鱼肌肉混合置于搅拌器中打碎，精确打碎后的样品称取20g，添加200mL娃哈哈纯净水，一并倒入搅拌器中匀浆2min，于4000rpm离心10min，滤纸过滤，将滤液收集到250mL的烧杯中，保鲜膜封口，置于4℃的冰箱中，静置至少12h，取出待回温后上机测试。采用TS-50002电子舌进行测定。电子舌参数:样品延迟时间，获取时间120s，搅拌速率60r/min.
氨基酸含量分析：
精确称取20mg样品于15mL COD消解瓶中，加入1ml 6M HCl后立即充入氮气并封口，移入150℃恒温箱中加热1.5h，取出冷却。取1、5、10、15、20μL氨基酸标准液和6μl水解液分别置于1.5ml离心管，氮气吹干后加入10μL再干燥液，氮气吹干后加入20μL衍生溶液并涡旋混匀，室温静置20min后再次氮气吹干，加入50μL B相，涡旋混匀后再加入450μL A相，再次涡旋混匀后过膜、上机。
上机参数：色谱柱：C18(4.6×250mm，5μm)，柱温38℃，进样量10μL，检测波长：254nm，流速：1.0mL/min。
以各种氨基酸的峰面积为纵坐标，氨基酸标液的质量浓度为横坐标，进行线性回归获得的标准曲线用于样品中氨基酸的定性和定量分析。
脂肪酸含量测定：
脂肪酸甲酯化前处理：称取0.1g肌肉冻干粉(于15ml试管中，加入1M KOH-甲醇溶液3ml，80℃水浴加热20min；冷却后，加入2M HCL-甲醇溶液3ml，80℃水浴加热20min；冷却后加正己烷2ml，振荡萃取，静置分层；取1ml上清液在3500g条件下离心5min(Legend RT离心机，索福，德国)；离心后取上清液450μl加入进样品。同时加入50μl浓度为1mg/ml的十七烷酸甲酯(Sigma)作为内标；在气相-质谱仪上检测(GCMS-QP2010，岛津，日本)。
气相-质谱仪的参数：气相条件，色谱柱：Rxi-1MS(30m×0.25mm，0.25μm)毛细管柱；升温程序：初始温度150℃，以15℃/min升至200℃，再以2℃/min升至250℃；进样口温度：250℃；载气(He)流量：1ml/min；自动进样，进样体积1μl，分流比：20：1；溶剂切除时间：2.5min。质谱条件：电子轰击离子源，离子源温度230℃，接口温度280℃，电子能量70eV，质量扫描范围45-500m/z。
数据处理：定性处理，通过NIST08.LIB谱库进行检索，确定脂肪酸组成(匹配度高于80％)。定量处理，根据内标的浓度以及目标脂肪酸与内标的峰面积之比，分别求得各脂肪酸的绝对含量。
实验结果：
电子舌数据表明，与对照组相比，实验组6可显著提升大黄鱼鲜味和丰富性(表8)，对大黄鱼的食用品质具有改善作用。
表8大黄鱼肌肉样品的电子舌实验数据
Figure BDA0002665008250000211
Figure BDA0002665008250000221
由表9可见，与对照组相比，实验组6、7处理组风味氨基酸和总氨基酸含量显著升高，但实验组6中氨基酸含量显著升高，如谷氨酸(p<0.05)、丝氨酸(p<0.05)、脯氨酸(p<0.05)、精氨酸(p<0.05)水平显著升高。大黄鱼肌肉的脂肪酸谱(如表10)以不饱和脂肪酸(UFA)为主，占总脂肪酸的56.68％以上，以C18：1n9c(24.92％)、C18：2n6c(14.65％)、C20：4n6(5.38％)、C15：1n5(5.12％)最具代表性。饱和脂肪酸(SFA)中含量最多的是软脂酸(C16：0，27.18％)和硬脂酸(C18：0，12.30％)。与对照组相比，实验组6总脂肪酸和UFA浓度分别增加了10.71％(p＝0.0965)和10.81％(p＝0.17)。GML实验组的SFA浓度(p<0.05)、C12：0(p<0.05)、C18：0(p<0.05)和C20：0(p<0.05)也有所增加，但SFA与UFA的比值无差异，以上结果表明900mg/kg的添加量对大黄鱼的风味改善具有显著影响(表6)。
表9不同处理组大黄鱼背腹肉中的氨基酸组成
Figure BDA0002665008250000222
Figure BDA0002665008250000231
表10不同处理组大黄鱼背腹肉中的脂肪酸组成
Figure BDA0002665008250000232
1饱和脂肪酸(C4：0+C12：0+C14：0+C16：0+C18：0+C20：0).
2单饱和脂肪酸(C15：1n5+C16：1n7+C17：1n7+C18：1n9c+C24：1n9).
3多饱和脂肪酸(C18：2n6c+C18：3n3+C20：2n6+C20：3n6+C20：4n6+C22：6n3).
4必需脂肪酸(C18：2n6c+C18：3n3+C20：4n6).
5总脂肪酸
以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (14)

1.复合饲料添加剂在制备改善大黄鱼肌肉质地的养殖大黄鱼饲料中的应用，所述复合饲料添加剂包括月桂酸单甘油酯、癸酸单甘油酯和辛酸单甘油酯。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肌肉质地包括：肌肉硬度、肌肉弹性、肌肉内聚性和背部肌肉中蛋白质及脂肪含量中的至少一种。
3.复合饲料添加剂在制备改善大黄鱼生长性能的养殖大黄鱼饲料中的应用，所述复合饲料添加剂包括月桂酸单甘油酯、癸酸单甘油酯和辛酸单甘油酯。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述生长性能包括体型和体色；所述体型为养殖大黄鱼体长/体宽的比值；所述体色为养殖大黄鱼背部皮肤的亮度值、黄色值和红色值。
5.根据权利要求1或3所述的应用，其特征在于，所述复合饲料添加剂以300-1800mg/kg加入养殖大黄鱼饲料的原料中。
6.根据权利要求1或3所述的应用，其特征在于，所述复合饲料添加剂以500-1000mg/kg加入养殖大黄鱼饲料的原料中。
7.根据权利要求1或3所述的应用，其特征在于，所述复合添加剂中所述月桂酸单甘油酯、癸酸单甘油酯和辛酸单甘油酯的重量比为2～8:1～4:1。
8.根据权利要求1或3所述的应用，其特征在于，所述复合添加剂中月桂酸单甘油酯、癸酸单甘油酯和辛酸单甘油酯的重量比为如下配比中的一种：
月桂酸单甘油酯：癸酸单甘油酯：辛酸单甘油酯＝8:1:1；月桂酸单甘油酯：癸酸单甘油酯：辛酸单甘油酯＝7:2:1；月桂酸单甘油酯：癸酸单甘油酯：辛酸单甘油酯＝6:3:1；月桂酸单甘油酯：癸酸单甘油酯：辛酸单甘油酯＝5:4:1；月桂酸单甘油酯：癸酸单甘油酯：辛酸单甘油酯＝5:3:2。
9.根据权利要求1或3所述的应用，其特征在于，所述复合饲料添加剂中还包含惰性载体，所述月桂酸单甘油酯、癸酸单甘油酯和辛酸单甘油酯沉积在所述惰性载体上。
10.根据权利要求1或3所述的应用，其特征在于，所述养殖大黄鱼饲料中粗蛋白含量为18～30％；粗脂肪含量为5～10％。
11.一种改善大黄鱼肌肉质地和/或生长性能的复合饲料添加剂，其特征在于，包括月桂酸单甘油酯、癸酸单甘油酯和辛酸单甘油酯；所述月桂酸单甘油酯、癸酸单甘油酯和辛酸单甘油酯的重量比为2～8:1～4:1。
12.一种改善大黄鱼肌肉质地和/或生长性能的养殖大黄鱼饲料，其特征在于，包括如权利要求11所述的复合饲料添加剂。
13.根据权利要求12所述的养殖大黄鱼饲料，其特征在于，按重量百分比计，其原料包括：鱼粉50～55％，豆粕粉10～15％，鱼油2～5％，大豆油2～5％，小麦粉15～25％，酵母粉2～5％，卵磷脂2～5％，复合矿物质1～3％，复合维生素1～3％，氯化胆碱0.1～0.5％，诱食剂0.1～0.5％，防霉剂0.1～0.5％，抗氧化剂0.01～0.1％，维生素C 0.1～0.5％；以及如上成分基础上按照300～1800mg/kg添加的所述复合饲料添加剂。
14.如权利要求13所述养殖大黄鱼饲料的制备方法，其特征在于，包括：
第一步：将除卵磷脂、鱼油和氯化胆碱外的其他固体原料混合，混合原则如下：按照原料占比从小到大逐级定量均匀混合，然后再将所得混合物充分混匀；
第二步：将卵磷脂溶于鱼油中，然后与充分混合后的固体混合料继续混合均匀；
第三步：将氯化胆碱溶于水中，然后将所得水溶液加入如上的混合料中，继续混合均匀；
第四步：将混合料进行制后烘干，得颗粒饲料。
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