CN112041445B - 产生具有改善的特性的猪的方法 - Google Patents
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Abstract
提供了一种产生IGF2基因内含子3内的序列被基因编辑的猪的方法。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程领域。具体而言，本发明涉及一种产生具有改善的特性的猪的方法。更具体而言，本发明涉及通过对猪IGF2基因内含子3内的序列进行基因编辑以改善猪肉生产。
背景技术
猪是作为肉类来源的最重要的家畜之一。在过去的几十年里，为了支持人口的快速增长，满足顾客对优质饮食的要求，养殖专家专注于猪分子育种以加速促进瘦肉生产。先前的研究揭示了许多与身体生长、肌肉质量和脂肪沉积有关的基因，如生长激素基因(GH)(Hammer,R.E.et al.Nature 315,680-683(1985))、肌肉生长抑制基因(Myostatin)(Grobet,L.et al.Nat Genet 17,71-74(1997)；McPherron,A.C.&Lee,S.J.Proc NatlAcad Sci U S A 94,12457-12461(1997))和IGF2(Jeon,J.T.et al.Nat Genet 21,157-158(1999)；Nezer,C.et al.Nat Genet 21,155-156(1999))。特定基因在家畜中的转基因表达越来越多地用于育种和生物医学应用，产生了多种期望的性状(Hammer,R.E.etal.Nature 315,680-683(1985)；Laible,G.,Wei,J.&Wagner,S.Biotechnol J 10,109-120(2015))。然而，大多数转基因策略会将外源元件引入基因组，这可能导致不可预见的影响。因此，本领域需要非转基因的方法以改善猪肉的生产。
发明概述
在第一方面，本发明提供一种产生具有改善的特性的猪的方法，包括通过基因编辑修饰猪IGF2基因内含子3中的序列的步骤。
在第二方面，本发明提供了通过本发明的方法产生的具有改善的特性的猪或其后代、生殖细胞、胚胎、分离的体细胞、组织或器官，其中所述猪中IGF2基因内含子3中的序列被修饰。
在第三方面，本发明还提供衍生自通过本发明的方法产生的具有改善的特性的猪或其后代的肉类产品，其中所述猪中IGF2基因内含子3中的序列被修饰。
在第四方面，本发明提供用于通过本发明的方法产生具有改善的特性的猪的试剂盒，其至少包括靶向猪IGF2基因内含子3中的序列的基因编辑系统。
在第五方面，本发明提供通过本发明的方法所产生的猪或其后代、生殖细胞、胚胎、分离的体细胞、组织或器官的用途，例如用于猪育种或用于猪肉生产。
附图说明
图1示出猪品系的基因型分型，以及亲代中的突变等位基因和IGF2的表达。(a)中国地方品种和进口商品猪品种的基因型分型；(b)Sanger测序以确定原代修饰猪中的突变等位基因；(c)深度测序分析原代修饰猪的突变模式；(d)四只不同年龄的雄性原代修饰猪的IGF2的相对表达。误差线表示S.E.M。***，P<0.001；**，P<0.01；*，P<0.05。
图2示出通过编辑猪IGF2调控元件提高原代修饰猪和F1代的体重增长。(a)猪IGF2基因座和成对的sgRNA靶序列的示意图，sgRNA靶序列以粗体显示，下划线示出PAM序列；(b)不同年龄的含有IGF2内含子3-3072区域突变的原代修饰猪和WT的平均体重变化；(c)来自6#3M和6#6M的4种突变等位基因传给F1代；(d)不同年龄的IGF2IVS3 indels和WT的肌肉样品中IGF2的相对表达；(e)不同年龄的F1突变体和WT体重的增长率；(f)4月龄时IGF2IVS3 indels和WT的代表性照片；(g)4个月龄屠宰时F1(N＝6)和WT(N＝4)猪的平均体重；(h)4个月龄屠宰时F1(N＝6)和WT(N＝4)的平均躯体重(n＝10)；(i)4个月龄屠宰时F1(N＝6)和WT(N＝4)的平均瘦肉重量(n＝10)；(j)IGF2IVS3 indels(N＝3)和WT(N＝2)中肌纤维密度的变化。误差线表示S.E.M。***，P<0.001；**，P<0.01；*，P<0.05；ns，不显著。
图3示出4月龄的WT、原代修饰猪6#4M和6#6M的肌肉和耳朵样品中QTN附近的甲基化。WT包含56个CpG，而原代修饰猪丢失了几个CpG。粗下划线示出QTN。竖线和数字表示原代修饰猪相对于WT的CpG位置。
图4示出使用IGF2启动子3的报告基因构建体的萤光素酶测定。(a)每种报告基因载体的示意图，含有来自IGF2内含子3的578bp，之后是IGF2启动子3；(b)每种报告基因的相对萤光素酶活性的变化。实验进行三个生物学重复，误差线表示S.E.M。***，P<0.001；**，P<0.01；*，P<0.05。
图5示出F1代的增重和饲料消耗。(a)F1 IGF2IVS3 indels(n＝15)和WT(n＝6)的平均日增重变化。(b)F1 IGF2IVS3 indels(n＝15)和WT(n＝6)的饲料转化率的变化。数据以平均值±S.E.M表示。***，P<0.001；**，P<0.01；*，P<0.05；ns，不显著。
发明内容
除非另有指示或定义，否则所有所用术语均具有本领域中的通常含义，该含义将为本领域技术人员所了解。参考例如标准手册，如Sambrook et al.,“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”；Lewin,“Genes VIII”；及Roitt et al.,“Immunology”(第8版)，以及本文中引用的一般现有技术；此外，除非另有说明，否则未具体详述的所有方法、步骤、技术及操作均可以且已经以本身已知的方式进行，该方式将为本领域技术人员所了解。亦参考例如标准手册、上述一般现有技术及其中引用的其他参考文献。
如本文所用，术语“CRISPR核酸酶”通常指在天然存在的CRISPR系统中存在的核酸酶，以及其修饰形式、其变体(包括切口酶突变体)、或其催化活性片段。CRISPR核酸酶可以通过与向导RNA(如crRNA和任选的tracrRNA或人工gRNA(如sgRNA))一起相互作用来识别和/或切割靶核酸结构。该术语涵盖基于CRISPR系统的能够在细胞内实现基因编辑的任何核酸酶。
“CRISPR核酸酶”的实例包括Cas9核酸酶或其变体。所述Cas9核酸酶可以是来自不同物种的Cas9核酸酶，例如来自化脓链球菌(S.pyogenes)的spCas9或衍生自金黄色葡萄球菌(S.aureus)的SaCas9。
所述Cas9核酸酶变体的实例包括但不限于Cas9核酸酶的高特异性变体，例如FengZhang等人的Cas9核酸酶变体eSpCas9(1.0)(包含突变K810A/K1003A/R1060A)、eSpCas9(1.1)(包含突变K848A/K1003A/R1060A)，以及J.Keith Joung等人开发的Cas9核酸酶变体SpCas9-HF1(包含突变N497A/R661A/Q695A/Q926A)。
所述Cas9核酸酶变体还包括Cas9切口酶(nCas9)，其中Cas9核酸酶的DNA切割结构域中的两个亚结构域(HNH核酸酶亚结构域和RuvC亚结构域)之一被失活而形成切口酶。所述Cas9切口酶例如相对于野生型Cas9核酸酶包含突变D10A或H840A。
“CRISPR核酸酶”的实例还可以包括Cpf1核酸酶或其变体例如高特异性变体。所述Cpf1核酸酶可以是来自不同物种的Cpf1核酸酶，例如来自Francisella novicida U112、Acidaminococcus sp.BV3L6和Lachnospiraceae bacterium ND2006的Cpf1核酸酶。
可用的“CRISPR核酸酶”的实例还可以包括Cas3、Cas8a、Cas5、Cas8b、Cas8c、Cas10d、Cse1、Cse2、Csy1、Csy2、Csy3、GSU0054、Cas10、Csm2、Cmr5、Cas10、Csx11、Csx10、Csf1、Csn2、Cas4、C2c1、C2c3或C2c2核酸酶或其变体。
如本文所用，“gRNA”和“向导RNA”可互换使用，指的是能够与CRISPR核酸酶形成复合物并由于与靶序列具有一定互补性而能够将所述复合物靶向靶序列的RNA分子。例如，在基于Cas9的基因编辑系统中，gRNA通常由部分互补形成复合物的crRNA和tracrRNA分子构成，其中crRNA包含与靶序列具有足够互补性以便与该靶序列杂交并且指导CRISPR复合物(Cas9+crRNA+tracrRNA)与该靶序列序列特异性地结合的序列。然而，本领域已知可以设计单向导RNA(sgRNA)，其同时包含crRNA和tracrRNA的特征。而在基于Cpf1的基因组编辑系统中，gRNA通常仅由成熟crRNA分子构成，其中crRNA包含的序列与靶序列具有足够相同性以便与靶序列的互补序列杂交并且指导复合物(Cpf1+crRNA)与该靶序列序列特异性结合。基于所使用的CRISPR核酸酶和待编辑的靶序列设计合适的gRNA序列属于本领域技术人员的能力范围内。
如本发明所用，“表达构建体”是指适于感兴趣的核苷酸序列在细胞或生物体中或在体外表达的载体如重组载体。“表达”指功能产物的产生。例如，核苷酸序列的表达可指核苷酸序列的转录(如转录生成mRNA或功能RNA)和/或RNA翻译成前体或成熟蛋白质。本发明的“表达构建体”可以是线性的核酸片段(如mRNA)、环状质粒、病毒载体。本发明的“表达构建体”可包含不同来源的调控序列和感兴趣的核苷酸序列，或相同来源但以不同于通常天然存在的方式排列的调控序列和感兴趣的核苷酸序列。“调控序列”和“调控元件”可互换使用，指位于编码序列的上游(5'非编码序列)、中间或下游(3'非编码序列)，并且影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或者翻译的核苷酸序列。调控序列可包括但不限于启动子、翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化识别序列。
本发明人令人惊奇地发现，通过基于CRISPR的基因编辑系统对猪IGF2基因内含子3中的序列进行突变，能够显著改善猪的生长表现和猪肉品质，例如，瘦肉重量增加可达50％或以上。重要的是，本发明的方法不会向猪中导入整合的外源核酸序列，因此是非转基因的。并且，由于靶向的是非编码区域，不会造成表达产物结构上的改变，可以最小化遗传改变。更为重要的是，已知小鼠中IGF2基因过表达会导致生长异常，然而，令人意想不到的是，通过本发明的方法产生的经基因编辑的猪没有此类不利的副作用，尽管其IGF2基因显著过表达。
因此，在第一方面，本发明提供一种产生具有改善的特性的猪的方法，包括通过基因编辑修饰猪IGF2基因内含子3中的序列的步骤。所述改善的特性包括例如增加的生长速度、增加猪肉产量如增加的瘦肉产量。
猪IGF2基因序列信息可见于Genbank登录号AY242098。猪IGF2基因内含子3的示例性序列示于SEQ ID NO:11。然而，本领域技术人员清楚，对于不同品种的猪，所述序列可能会存在差异，例如单核苷酸多态性。例如，猪IGF2基因内含子3的核苷酸序列可以不同于SEQID NO:11但与SEQ ID NO:11具有至少大约80％、至少大约85％、至少大约90％、至少大约91％、至少大约92％、至少大约93％、至少大约94％、至少大约95％、至少大约96％、至少大约97％、至少大约98％、至少大约99％或更高的序列相同性。因此，当提及猪IGF2基因内含子3中的特定核苷酸例如第3072位核苷酸时，可以指SEQ ID NO:11的第3072位核苷酸，但是如果所述内含子3的序列与SEQ ID NO:11有所不同，也涵盖对应于该位置的核苷酸。本领域技术人员可以容易地确定这种核苷酸位置的对应性。
在一些实施方案中，相对于未经修饰的对应野生型猪，所述修饰造成IGF2基因内含子3中的核苷酸取代。在一些具体实施方案中，所述修饰造成IGF2基因内含子3中第3072位核苷酸G被取代为A。
在一些实施方案中，相对于未经修饰的对应野生型猪，所述修饰造成IGF2基因内含子3中的核苷酸插入，例如大约1-大约10、大约1-大约50、大约1-大约100、大约1-大约150或大约1-大约200个核苷酸的核苷酸插入。在一些具体实施方案中，相对于未经修饰的野生型猪，所述修饰造成IGF2基因内含子3中第3068-3073位的序列内或其侧翼处的核苷酸插入。在一些实施方案中，所述核苷酸插入为如图1b中所示的任一种插入。
在一些实施方案中，相对于未经修饰的对应野生型猪，所述修饰造成IGF2基因内含子3中的核苷酸缺失，例如大约1-大约10、大约1-大约50、大约1-大约100、大约1-大约150或大约1-大约200个核苷酸的核苷酸缺失。
在一些实施方案中，所述核苷酸缺失包含猪IGF2基因内含子3中第3072位核苷酸，例如，所述第3072位核苷酸是G。在一些实施方案中，所述核苷酸缺失包含猪IGF2基因内含子3中第3072位核苷酸的侧翼序列。
在一些实施方案中，所述核苷酸缺失包含猪IGF2基因内含子3中第3068-3073位的序列，例如，所述第3068-3073位的序列是5’-GCTCGC-3’(SEQ ID NO:12)。
在一些实施方案中，所述核苷酸缺失包含序列5’-GAGCGGGGGTGGCCGCCGGGGGTGCTCCCGGGCCCCCGGACCGAGCCAGGGACGAGCCTGCCCGCGGCGGCAGCCGGGCCGCGGCTTCGCCTAGGCTCGCAGCGCGGGAGCGCCGGGGC-3’(SEQ ID NO:13)(6#3M 119bp缺失)。
在一些实施方案中，所述核苷酸缺失包含序列5’-GGCAGCCGGGCCGCGGCTTCGCCTCGGC-3’(SEQ ID NO:14)(6#3M 28bp缺失)。
在一些实施方案中，所述核苷酸缺失包含序列5’-CCGCGGCTTCGCCTAG-3’(SEQ IDNO:15)(6#6M 16bp缺失)。
在一些实施方案中，所述核苷酸缺失包含序列5’-CCGCGGCTTCGCCTAGGCTCGCAGCGCGGG-3’(SEQ ID NO:16)(6#6M 30bp缺失)。
在一些实施方案中，所述核苷酸缺失为如图1b中所示的任一种缺失。
在一些实施方案中，所述方法包括将靶向猪IGF2基因内含子3中的序列的基因编辑系统导入猪中。
在一些实施方案中，所述基因编辑系统靶向猪IGF2基因内含子3中包含第3072位核苷酸的序列。在一些实施方案中，所述基因编辑系统靶向猪IGF2基因内含子3中第3072位核苷酸的侧翼序列。
在一些实施方案中，所述基因编辑系统包含CRISPR核酸酶或编码所述CRISPR核酸酶的表达构建体，和向导RNA或编码所述向导RNA的表达构建体。优选地，所述表达构建体是线性核酸载体。
在一些实施方案中，所述CRISPR核酸酶是CRISPR切口酶例如Cas9切口酶。
在一些实施方案中，所述基因编辑系统包含两种向导RNA，或编码所述两种向导RNA的表达构建体。所述两种向导RNA分别靶向猪IGF2基因内含子3中第3072位核苷酸上游(5’方向)和下游(3’方向)的侧翼序列。在一些实施方案中，所述上游和/或下游的侧翼序列可以包含猪IGF2基因内含子3中第3072位核苷酸。在一些实施方案中，所述上游和下游的侧翼序列位于不同的DNA链上。
在一些实施方式中，所述两种向导RNA分别靶向猪IGF2基因内含子3中的序列5’-GCGCGGGAGCGCGTGGGGCG-3’(下游)和5’-GCCTAGGCGAAGCCGCGGCC-3’(上游)。
本发明的所述基因编辑系统可以通过本领域已知的多种方法导入猪中，例如受精卵或胚胎注射。优选地，所述基因编辑系统的组分并不整合进猪的基因组中。
在一些实施方案中，所述方法包括将所述靶向猪IGF2基因内含子3中的序列的基因编辑系统导入猪的受精卵或胚胎中，然后将所述受精卵或胚胎转移至受体代孕猪以产生其中IGF2基因内含子3中的序列被修饰的猪。
在一些实施方案中，所述待修饰的猪在IGF2基因内含子3中第3072位核苷酸为G。这样的猪包括但不限于巴马猪、民猪、梅山猪、五指山猪。优选地，所述猪是巴马猪。
在第二方面，本发明提供了通过本发明的方法产生的具有改善的特性的猪或其后代、生殖细胞、胚胎、分离的体细胞、组织或器官，所述猪中IGF2基因内含子3中的序列被修饰。
在第三方面，本发明还提供衍生自通过本发明的方法产生的具有改善的特性的猪或其后代的肉类产品，其中所述猪中IGF2基因内含子3中的序列被修饰。
在一些实施方案中，通过本发明的方法产生的具有改善的特性的猪所衍生自的未经修饰的野生型猪在IGF2基因内含子3中第3072位核苷酸为G。这样的猪包括但不限于巴马猪、民猪、梅山猪、五指山猪。优选地，所述猪是巴马猪。
在一些实施方案中，相对于未经修饰的对应野生型猪，通过本发明的方法所产生的猪的IGF2基因内含子3中包含核苷酸取代。在一些具体实施方案中，通过本发明的方法所产生的猪的IGF2基因内含子3中第3072位核苷酸G被取代为A。
在一些实施方案中，相对于未经修饰的对应野生型猪，通过本发明的方法所产生的猪的IGF2基因内含子3中包含核苷酸插入例如大约1-大约10、大约1-大约50、大约1-大约100、大约1-大约150或大约1-大约200个核苷酸的核苷酸插入。在一些具体实施方案中，相对于未经修饰的对应野生型猪，通过本发明的方法所产生的猪的IGF2基因内含子3中第3068-3073位的序列内或其侧翼处包含核苷酸插入。在一些实施方案中，相对于未经修饰的对应野生型猪，通过本发明的方法所产生的猪的IGF2基因内含子3中包含如图1b中所示的任一种插入。
在一些实施方案中，相对于未经修饰的对应野生型猪，通过本发明的方法所产生的猪的IGF2基因内含子3中包含核苷酸缺失，例如大约1-大约10、大约1-大约50、大约1-大约100、大约1-大约150或大约1-大约200个核苷酸的核苷酸缺失。
在一些实施方案中，相对于未经修饰的对应野生型猪，通过本发明的方法所产生的猪的IGF2基因内含子3中第3072位核苷酸被缺失，例如，所述第3072位核苷酸是G。
在一些实施方案中，相对于未经修饰的对应野生型猪，所产生的猪的IGF2基因内含子3中第3068-3073位的核苷酸序列被缺失，例如，所述第3068-3073位的序列是SEQ IDNO:12。
在一些实施方案中，相对于未经修饰的对应野生型猪，通过本发明的方法所产生的猪的IGF2基因内含子3中缺失序列SEQ ID NO:13。在一些实施方案中，相对于未经修饰的对应野生型猪，通过本发明的方法所产生的猪的IGF2基因内含子3中缺失序列SEQ ID NO:14。在一些实施方案中，相对于未经修饰的对应野生型猪，通过本发明的方法所产生的猪的IGF2基因内含子3中缺失序列SEQ ID NO:15。在一些实施方案中，相对于未经修饰的对应野生型猪，通过本发明的方法所产生的猪的IGF2基因内含子3中缺失序列SEQ ID NO:16。
在一些实施方案中，相对于未经修饰的对应野生型猪，通过本发明的方法所产生的猪的IGF2基因内含子3中包含如图1b中所示的任一种缺失。
在第四方面，本发明提供用于通过本发明的方法产生具有改善的特性的猪的试剂盒，其例如可以包括靶向猪IGF2基因内含子3中的序列的基因编辑系统。所述试剂盒还可以包含用于导入所述基因编辑系统的试剂，和/或关于如何实施本发明的方法的说明书。
在一些实施方案中，所述基因编辑系统靶向猪IGF2基因内含子3中包含第3072位核苷酸的序列。在一些实施方案中，所述基因编辑系统靶向猪IGF2基因内含子3中第3072位核苷酸的侧翼序列。
在一些实施方案中，所述基因编辑系统包含CRISPR核酸酶或编码所述CRISPR核酸酶的表达构建体，和向导RNA或编码所述向导RNA的表达构建体。优选地，所述表达构建体是线性核酸载体。
在一些优选实施方案中，所述CRISPR核酸酶是CRISPR切口酶例如Cas9切口酶。
在一些实施方案中，所述基因编辑系统包含两种向导RNA，或编码所述两种向导RNA的表达构建体。所述两种向导RNA分别靶向猪IGF2基因内含子3中第3072位核苷酸上游(5’方向)和下游(3’方向)的侧翼序列。在一些实施方案中，所述上游和/或下游的侧翼序列可以包含猪IGF2基因内含子3中第3072位核苷酸。在一些实施方案中，所述上游和下游的侧翼序列位于不同的DNA链上。
在一些优选实施方式中，所述两种向导RNA分别靶向猪IGF2基因内含子3中的序列5’-GCGCGGGAGCGCGTGGGGCG-3’(下游)和5’-GCCTAGGCGAAGCCGCGGCC-3’(上游)。
在第五方面，本发明提供通过本发明的方法所产生的猪或其后代、生殖细胞、胚胎、、分离的体细胞、组织或器官的用途，例如用于猪育种或用于猪肉生产。
就本发明人所知，本发明是首次在非编码区进行基因编辑以促进家畜肉类生产。以往的大型动物育种工作主要集中在转基因表达或基因敲除上，如敲除Myostain和转基因表达UCP1。每个基因通过整合到特定的调控网络中，发挥其独特的功能，缺失或插入任何基因都可影响天然的网络，从而造成一定的不利影响。另外，转基因的引入往往带有外源元件，可能导致不可预见的效果。敲除内源基因除了敲除所需的表型，通常会改变更多的表型。本发明使用CRISPR系统编辑IGF2调控元件，而不引入任何外源DNA片段，显著提高了瘦肉产量。更重要的是，这种改变保持了猪的一般特性，而不影响其身体的结构。在世界各地，有许多著名和有价值的当地物种。利用这一新的育种策略，可以促进这些猪品系的遗传育种。
实施例
下面将通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所描述的实施例范围中。
材料和方法
伦理声明
本研究中所有与动物实验有关的实验均严格按照《实验动物管理条例》执行，并经中国科学院动物研究所实验动物福利伦理审查委员会批准。
切口酶mRNA和sgRNA的体外转录
使用含有T7启动子、kozak序列和Cas9切口酶正向编码序列的正向引物，与切口酶编码序列的反向引物，以PX335载体为模板扩增T7-切口酶DNA片段(表1)。通过使用mMESSAGE mMACHINE T7 ULTRA试剂盒(Thermo Fisher Scientific，USA)体外转录合成切口酶mRNA。使用含有T7启动子、20bp sgRNA目标序列和sgRNA主链正向序列的正向引物，与sgRNA主链反向引物，以PX335为模板扩增sgRNA DNA片段(表1)。使用MEGAshortscript T7试剂盒(Thermo Fisher Scientific，USA)通过体外转录合成sgRNA。使用MEGAclear试剂盒(Thermo Fisher Scientific，USA)纯化切口酶mRNA和sgRNA。
表1 sgRNA序列和引物
| 引物名称 | 序列(5'-3') | SEQ ID No. |
| IGF2 gRNA pair1-1 | GCGCGGGAGCGCGTGGGGCG | 1 |
| IGF2 gRNA pair1-2 | GCCTAGGCGAAGCCGCGGCC | 2 |
| IGF2-663bp-F | CCTCTCCTTTCCCAGTCCTTC | 3 |
| IGF2-663bp-R | GGAGGTCCCAGAAAAAGTCGT | 4 |
| IGF2 BSP 334bp F | GGATTGTTGAAGTTTTCGAGAG | 5 |
| IGF2 BSP 334bp R | CCACTAAAAACGCCCCGATA | 6 |
| IGF2 qRT F | GTGCTGCTATGCTGCTTACCG | 7 |
| IGF2 qRT R | CCGCAGACAAACTGGAGGG | 8 |
| IGF2-347bp-deep seq-F | ACTGTTGAAGTCCCCGAGAGCGC | 9 |
| IGF2-347bp-deep seq-R | GAGGCCCGCGGACTC | 10 |
受精卵中CRISPR-Cas9系统的显微注射
使用FemtoJet显微注射器(Eppendorf，Germany)将切口酶mRNA、sgRNA和ssODN(单链寡脱氧核苷酸)注射到孤雌激活胚胎和受精卵的细胞质中。为了测试sgRNA的编辑效率，在初步实验中使用孤雌激活胚胎。注射的卵母细胞利用BTX electro-cell manipulator200(BTX，San Diego，CA)在融合介质中用1.2kV/cm的两个30μs直流脉冲(1秒间隔)进行诱导孤雌激活。然后，将激活的卵母细胞在PZM3培养基中在38.5℃和5％CO2的湿润空气中培养144小时至囊胚期，用于基因型分型。
胚胎移植
在全身麻醉下进行中线剖腹手术，将经注射的胚胎转移到受体代孕猪中。28天后诊断为怀孕，每两周通过超声技术常规检查怀孕的猪。
在胚胎和小猪中进行IGF2修饰的基因型分型
在第7天收集每种经注射的胚胎并用10μl裂解缓冲液(10mM Tris-Cl，pH 8.0；2mMEDTA；2.5％(体积/体积)Triton-X 100；2.5％(体积/体积)Tween-20；100ng/mL蛋白酶K)，在50℃孵育60min，之后95℃孵育15min。使用基因型分型引物(表1)，用2μl裂解物在25μlPCR反应中通过AccuPrime Taq聚合酶(Invitrogen，USA)扩增。对纯化的PCR产物进行测序以供进一步分析。
为了对小猪进行基因型分型，收集来自小猪耳朵的组织并裂解，然后用与胚胎基因型分型相同的条件进行扩增。将纯化的PCR产物克隆到pEASY-T1克隆载体(Transgen，中国北京)并转化。通过对每个小猪样品测序10个单菌落确定突变等位基因。
定量实时PCR
使用Trizol试剂(Invitrogen，USA)提取来自肌肉样品的RNA。使用TransScriptmiRNA First-Strand cDNA Synthesis SuperMix(Transgen，北京，中国)反转录cDNA。设计用于检测启动子3驱动的IGF2转录物的特异性引物(表1)。使用ΔΔCt相对定量方法确定相对于GAPDH的表达。
萤光素酶测定
从WT和IGF2m猪中扩增IGF2的调控元件，并将其克隆到含有调控元件、IGF2启动子3和萤火虫萤光素酶的载体中。使用lipofectamine 3000(Invitrogen，USA)将萤火虫萤光素酶构建体和海肾荧光素酶对照载体共转染到C2C12成肌细胞(Promega，USA)中。使用Dual-Lucy Assay Kit(Vigorous，中国北京)测量萤光素酶活性。
动物屠宰
5月龄时将猪安乐死，采集血样进行血常规和生化检查。从每只猪身上取下毛发、内脏器官、头和蹄，以测量躯体重量。从左侧躯体上切下骨、皮肤、肌肉和脂肪并称重。
肌纤维数量的组织化学分析
采集背最长肌样品，并用于组织学检查。将样品置于载玻片上，用苏木精-伊红染色，并通过显微镜观察。对于每个样本，选择五个视野并计算平均数量。
统计分析
所有的统计分析均使用GraphPad Prism 6(GraphPad Software Inc，La Jolla，CA，USA)进行。该值表示为平均值±测量标准误(SEM)。P值由学生t-检验(未配对)确定。
实施例1：不同品种猪的IGF2内含子3基因型分型
IGF2编码重要的生长因子，其影响骨骼肌肉量和脂肪沉积(Jeon,J.T.et al.NatGenet 21,157-158(1999)；Nezer,C.et al.Nat Genet 21,155-156(1999))。若干启动子驱动的IGF2的转录变体编码在不同组织中表达的多个同种型(Ohlsen,S.M.,Lugenbeel,K.A.&Wong,E.A.DNA Cell Biol 13,377-388(1994)；Curchoe,C.et al.Biol Reprod 73,1275-1281(2005))。在小鼠中IGF2基因缺失或过表达导致生长异常(DeChiara,T.M.,Efstratiadis,A.&Robertson,E.J.Nature 345,78-80(1990)；Sun,F.L.,Dean,W.L.,Kelsey,G.,Allen,N.D.&Reik,W.Nature 389,809-815(1997)；及Eggenschwiler,J.etal.Genes Dev 11,3128-3142(1997))。通过数量性状基因座(QTL)作图在猪中鉴定出IGF2的内含子3中天然存在的数量性状核苷酸(QTN)(IGF2-内含子3-核苷酸3072)，其为有助于瘦肉生产的最重要的基因座(Van Laere,A.S.et al.Nature 425,832-836(2003))。ZBED6被鉴定为与IGF2内含子3结合的阻遏蛋白，其保守结合基序序列为5'-GCTCGC-3'(加粗并下划线的为所述QTN)。IGF2内含子3-3072处的G到A转换会破坏ZBED6的结合，导致骨骼肌中IGF2表达的增加以及瘦肉产量的提高(Van Laere,A.S.et al.Nature 425,832-836(2003)；Markljung,E.et al.PLoS Biol 7,e1000256(2009))。
本发明人对几种中国本地品种猪和进口商品猪的IGF2-内含子3-3072区域进行基因型分型。所有中国的本地品种在IGF2的内含子3都具有野生型等位基因(G)，而进口商品猪主要具有突变型等位基因(A)(图1a)。
实施例2：产生在IGF2-内含子3-核苷酸3072区域具有突变的巴马猪
本实施例通过CRISPR系统编辑巴马猪(一种在IGF2-内含子3-3072位点具有G等位基因的中国本地商业品种)的IGF2-内含子3-3072区域，以提高猪肉生产效率。
考虑到使用Cas9切口酶与成对的sgRNA可以大幅提高基因编辑特异性(Ran,F.A.et al.Cell 154,1380-1389(2013))，设计了一对单向导RNA(sgRNA)靶向目标区域两侧(图2a)。为了评估基因编辑效率，将Cas9切口酶mRNA和成对的sgRNA注射到孤雌激活的猪胚胎中。这一对sgRNA在两个独立实验中的编辑效率分别为72.2％和46.7％(表2)。
表2 在猪孤雌激活胚胎中CRISPR-Cas9介导的基因编辑
| 组成 | 浓度(ng/μl) | 注入胚胎数量 | NEHJ效率 |
| 切口酶mRNA+2种gRNA | 100+50+50 | 18 | 72.2％ |
| 切口酶mRNA+2种gRNA | 100+50+50 | 15 | 46.7％ |
在确认了编辑的高效率之后，将相同的编辑系统注入自然受精的巴马猪胚胎，并将总共19个囊胚转移到两个受体中(表3)。
表3 在巴马胚胎中CRISPR-Cas9介导的基因编辑
| 注入胚胎数量 | 转移胚胎数量 | 胚胎类型 | 出生的猪数量 | 基因型 |
| 28 | 14 | 4细胞*5+2细胞*9 | 6 | 突变体 |
| 5 | 5 | 1细胞*5 | 2 | 野生型 |
生出6只原代修饰猪，2雌性(6#1F、6#2F)和4雄性(6#3M、6#4M、6#5M和6#6M)(表3)，且各自在目标区域包含不同突变(图1b)。为了进一步表征这6只小猪中的突变比例，使用深度测序分析肌肉样品的基因型分型PCR产物。结果显示，2只雌性原代修饰猪仍然包含WT等位基因的很大一部分，而4只雄性原代修饰猪主要包含突变等位基因(图1c)。
实施例3：编辑IGF2-内含子3加速原代修饰猪的生长
每个性别的原代修饰猪与对照WT猪一起喂养，并且每天每只猪食用0.4-0.8kg的食物(取决于年龄)，并且每月测量它们的体重。在雌性和雄性中，突变体的体重增加显著快于WT猪(图2b)。在2个月和4个月时从4只雄性原代修饰猪收集肌肉样本，并进行定量实时PCR(qRT-PCR)以确定IGF2的表达水平。在这些原代修饰猪中均观察到IGF2表达提高约2至6倍(图1d)。
IGF2-内含子3-3072位于保守的CpG岛中，并且该区域的甲基化能够损害ZBED6结合(Van Laere,A.S.et al.Nature 425,832-836(2003)；Markljung,E.et al.PLoS Biol7,e1000256(2009))。因此，检查了所有原代修饰动物中以IGF2-内含子3-3072为中心的300bp区域的甲基化状态。收集来自原代修饰猪6#4M和6#6M以及WT巴马猪的肌肉和耳朵样品用于亚硫酸氢盐测序。结果发现这个区域在突变猪和WT猪中都基本未被甲基化(图3)，表明该区域的基因编辑并未改变DNA甲基化的状态，而提高的IGF2表达是由于破坏ZBED6的结合位点。
实施例4：F1代经修饰的猪的产生和生长表现
将2只雄性原代修饰猪(6#3M和6#6M)与雌性野生型猪杂交以产生F1代杂合体。通过自然生产获得携带4种不同突变等位基因的15头小猪和6头野生型猪(表4)。
表4 两只雄性原代修饰猪与WT雌性杂交
对于所有4种突变等位基因(命名为IGF2IVS3 indels)中，ZBED6结合基序被缺失或破坏(图2c)。检查了不同年龄的F1小猪肌肉样本的IGF2表达。正如在原代修饰猪中观察到的，不分性别，在2个月大和3个月大的小猪观察到IGF2表达显著的提高，提高约2倍到6倍。然而，在IGF2IVS3 indels猪中，IGF2表达水平在4个月大时与相同年龄的WT猪相似(图2d)。
为了检测上述在IGF2-内含子3-3072引入的突变与IGF2-内含子3-3072A突变对IGF2表达是否具有相似的作用，使用瞬时转染试验来评估主要在肌肉组织中起作用的IGF2-启动子3的活性。通过将两种突变等位基因、IGF2内含子3-3072G等位基因和IGF2内含子3-3072A等位基因分别插入萤火虫萤光素酶报道基因前以构建4种构建体，命名为IGF2-16、IGF2-30、IGF2G和IGF2A。使用IGF2启动子3(P3)单独驱动的萤火虫萤光素酶报道基因作为对照(图4a)。与单独的P3启动子相比，IGF2G充当阻抑元件并且使萤光素酶活性降低约60％。相反，IGF2A和IGF2-16、IGF2-30是显著较弱的阻抑元件并显示与单独的P3相似的萤光素酶信号(图4b)。
小猪在出生后24小时内被称重以确定出生体重。在断奶21天后，每只F1猪单笼饲养，并提供无限饲料，以精确监测体重变化。IGF2IVS3 indels与WT出生体重无显著差异(IGF2IVS3 indels为0.67±0.02，WT为0.68±0.02，P＝0.71)，而在45日龄时开始出现体重差异(IGF2IVS3 indels为6.26±0.19，WT为5.42±0.19，P＝0.016)(图2e)。通过每月对小猪进行称重直至屠宰，发现IGF2IVS3 indels生长速度比同龄的WT生长速度快。在5月龄时，IGF2IVS3 indels和WT之间的体重差异是高度显著的(IGF2IVS3 indels为37.38±1.41，WT为29.36±2.02，P＝0.005)(图2e)。通过比较IGF2IVS3 indels与WT猪的体型，生长速度的提高也是明显的(图2f)。
此外，对IGF2IVS3 indels和WT猪在45天至150天的平均日增重(ADG)进行了量化，并且计算饲料转化率(FCR)(饲料消耗/体重增加)。结果显示，IGF2IVS3 indels与WT猪之间的ADG有显著差异(IGF2IVS3 indels为0.25±0.01，WT为0.19±0.10，P＝0.00009)(图5a)，而IGF2IVS3 indels与WT猪之间的饲料转化率无显著差异(IGF2IVS3 indels为3.28±0.11，WT为3.51±0.09，P＝0.19)(图5b)。这些结果表明，IGF2IVS3 indels猪的生长速度比WT猪的快，而增加每千克体重没有比WT消耗更多的饲料。这些结果表明，在非编码调控元件进行基因编辑可提高IGF2的表达，导致更快的生长速度。
实施例5：IGF2IVS3 indels猪的躯体表型
为了进一步表征F1 IGF2IVS3 indels猪，在6个月大时屠宰6头IGF2IVS3 indels猪和4头WT猪。表5列出了猪的躯体细节。
表5 IGF2IVS3 indels和WT猪的生长表现和躯体性状
BW：体重；ADG：平均日增重；CW：躯体重；LCW：左侧躯体重；CLW：躯体瘦肉重量；CFW：躯体脂肪重量；LFW：板油(leaf fat)重量；CSW：躯体皮肤重量；CBW：躯体骨重量；BFT：背脂厚度；LMA：背最长肌区域数据以Mean±S.E.M.表示，显著性通过学生t检验建立，在*P<0.05、**P<0.01时差异被认为是显著的。
IGF2IVS3 indels猪的平均体重为49.64±1.55kg，比WT猪的平均体重(36.88±2.06kg)高34.58％(图2g)，此外，与WT猪相比，IGF2IVS3 indels猪的躯体重高33.35％(图2h)。对肌肉、脂肪、皮肤和骨骼组织的进一步分析表明，与WT猪相比，IGF2IVS3 indels猪的瘦肉重量增加了50.82％，这构成躯体重增长的主要原因(图2i、表5)。本发明也确定了肌肉量增加的原因。背最长肌切片的组织学分析显示IGF2IVS3 indels猪的肌肉量增加是由肌纤维肥大引起的，而不是增生(图2j)。皮肤、骨骼和躯体脂肪重量都大为提高。有趣的是，与WT猪相比，瘦肉、脂肪、皮肤和骨骼的比例没有显著差异(表5)。这些结果表明，修饰IGF2调控元件可以显著提高瘦肉产量，同时保持动物品系的一般特征。
实施例6：IGF2IVS3 indels和WT猪的肉品质分析
编辑IGF2内含子3增加肌肉生长，然而其是否改变肉质未知。通过测量主要参数(例如，包括pH值、颜色稳定性、保水性、滴水损失和营养成分)，发现除了肉色的“b”值之外，IGF2IVS3 indels和WT猪之间的肉品质没有显著差异(表6)。此外，IGF2IVS3 indels和WT猪的主要营养成分(包括胶原蛋白、脂肪、水分和蛋白质)也是相似的(表6)。
表6 IGF2IVS3 indels和WT猪背最长肌肉质性状
数据以Mean±S.E.M.表示，显著性通过学生t检验建立。在*P<0.05时差异被认为是显著的。
实施例7：IGF2IVS3 indels猪健康状况评估
之前的工作表明IGF2在小鼠中的过表达可能诱发过度生长紊乱(Eggenschwiler,J.et al.Genes Dev 11,3128-3142(1997))，如Beckwith-Wiedemann综合征(BWS)，其表现为新生儿死亡、不成比例的器官过度生长。为了评估IGF2IVS3 indels猪的健康状况，通过采集血液样本进行反映基本健康状况的血常规检查和反映肝肾功能状况的血液生化检查。在两种分析中，IGF2IVS3 indels猪和WT猪之间没有显著差异(表7、表8)。
表7 IGF2IVS3 indels和WT猪的血液生化检查
TBIL,总胆红素；DBIL,直接胆红素；TP,总蛋白；ALB,白蛋白；Glob,球蛋白；A/G,白蛋白/球蛋白；GLU,葡萄糖；ALT,丙氨酸转氨酶；AST,天冬氨酸转氨酶；GGT,γ-谷氨酰转肽酶；ALP,碱性磷酸单酯酶；TBA,总胆汁酸；CRE,肌酸酐血清；UREE,尿素；U/R,肌酸酐血清/尿素；Ca,钙；P,磷；CHO,胆固醇；TG,甘油三酯；AMY,淀粉酶；CK,肌酸激酶；LDH,乳酸脱氢酶；K,钾；Na,钠；Cl,氯。
数据以Mean±S.E.M.表示，显著性通过学生t检验建立。在*P<0.05时差异被认为是显著的。
表8 IGF2IVS3 indels和WT猪的血常规检查
RBC,红细胞计数；HGB,血红蛋白；HCT,红细胞压积；MCV,红细胞平均体积；MCH,红细胞平均血红蛋白；MCHC,红细胞平均血红蛋白浓度；PLT,血小板计数；WBC,白细胞计数；SEG％,叶状中性粒细胞百分比；BAND％,杆状中性粒细胞百分比；MON％,单核细胞百分比；LYM％,淋巴细胞百分比；EOS％,嗜酸性粒细胞百分比；BAS％,嗜碱性粒细胞百分比。
数据以Mean±S.E.M.表示，显著性通过学生t检验建立。在*P<0.05时差异被认为是显著的。
序列表
SEQ ID NO:1 IGF2 gRNA pair1-1
GCGCGGGAGCGCGTGGGGCG
SEQ ID NO:2 IGF2 gRNA pair1-2
GCCTAGGCGAAGCCGCGGCC
SEQ ID NO:3 IGF2-663bp-F
CCTCTCCTTTCCCAGTCCTTC
SEQ ID NO:4 IGF2-663bp-R
GGAGGTCCCAGAAAAAGTCGT
SEQ ID NO:5 IGF2 BSP 334bp F
GGATTGTTGAAGTTTTCGAGAG
SEQ ID NO:6 IGF2 BSP 334bp R
CCACTAAAAACGCCCCGATA
SEQ ID NO:7 IGF2 qRT F
GTGCTGCTATGCTGCTTACCG
SEQ ID NO:8 IGF2 qRT R
CCGCAGACAAACTGGAGGG
SEQ ID NO:9 IGF2-347bp-deep seq-F
ACTGTTGAAGTCCCCGAGAGCGC
SEQ ID NO:10 IGF2-347bp-deep seq-R
GAGGCCCGCGGACTC
SEQ ID NO:11
GTGAGTGTCTCCAGACCCCAGGGCAGGGCCCGGTGTCCCCCGGCACAGAGAGCTGTGCTGCAGGCCCAGACCTCCCAGGCCGTTTTAGTTCCCATCTCCCCTTGGGGGAGGGGTGGGGCTCAGAGGGGCTGGGGTGCATCCGCAGAGCTGGGGTGCAGGGCTCCAGGTGCCTCTCTCCCAGGCGGCTGGCTCGGAGGGGGGCTGAGCAGGGACAGTCGGGGTCCTCAGCGGGGAGCTCCTGGTGGAAGAAGGAGGGGGAGGGGGTTGGTGGGGGGGAGGCAGGGGGTCCGGGTGAGGGCGGGAAGGGGAGAGAAGAGGGTTCCAGGGACACTCCTAAGCTGGGGAGACTCCGGGACTCCCAGGGAGGCTGGGCCCAGCTGAGGCAGGTGAGACCCAGTCCTCCCTGCCCTGGGCTGCTGGCTGTGGGGCCTCACACCAGTGCTGTGGCCTCTCTGTGTCCTTATCTGTCAAAGTGGCCGGGGTCACAAGCCTGGCTGCTGATCCCCGCGAGCAGCACGTGACAATGACAAGGCCTAGAGGCTCGGGGGCCTTACGAGTCCCTGTGTCATGATTCCACTGTGTTGAGCCGGCAGGGCTTCCTGTGTGTGAGTGGGGGGCGGGGGGGGGCGACTAGAGAGGTCCAGGGGCCAGATCCTCCTCGGACACCTGGTGGAGCAAGCTCTGTGGTGGTGGCCGCCCCATCCCCTGATAAGGTATTGGGCTGGGAGCGCAGGCTGAGCTGCCCCAGAGGGTCCCGGAGAGCTCTGGAGGCGGAGGCGTGGGCCGTGTCCGTGCACCTGCCCCGCAGCGACAGAGTCCGCTCTTCAGGGCCTGCAGTGAGGGGCCCAGCAGGTGTCCCCTCGCAGGCCGGTGTCGCCTCCGAGAGAGATGCCAAGAACGTTGCTTAAAGGTGTCTTAGTCCAGACTCTACATTAGATGGTGCAATGGCGACGCCTGTGTCCTCCAGGAGAGCAGGGCTCAGCCCCTCTTCTGGGGCCCCCACCCCGCCCATACATACTTCCGACTGACTTCTGGTTTATCGATCACATGGCGTGGGTGTCTTGTGCCGTCGGAGTCCCCGTGTCCGGCGGGGGGCCGGGGTCCCTTGTTTCCAGCCAGGGTGGGAACAGGGTCCTCACCCAGGCAGCAGAGCCCTGCAGGGGTGAGGGAGGGACGATCAGGGGACTCTGAGAACGGAGCTGGGTTTGTCAAATGCTGGGCTTGGTCCCAGGGAAGGGGGGAGCGGCAGCTCGGAGCCAGAGCCGGGGGAGGAAACCGGGGAGGGGAGAGGCAGGACGAGCAGAGAGGGAACTGGCGGAGCAGGCGCGAGGCGGCCGCAGGCCTGGTGCAGGGGCCAGGCTCGCGGGGTGAGTCCGAATCTGGGGGGACGCTTGTGTTGTTGGAATAGGGTTTGTGGATGGGGGGGTAGTGCTGGAGCAGGGCCGGGGTGGGGGGGTGGGCCAGGGGATGGTGCTTGGGGCTGAGGTTCCTGCCAGCCAGGCCGCAGCGGAGACCCCCAACCCCATAACATGCTTGGGTTGCTGGCAGGTCCCTTCCTACTGAGGGGCTGGAAGCTGGGGAGGCCCGGGCCACTGGTCCTGGCTAGGGGTGGCCAGGGCCCTTTCTGAGCCCCGCAGTGACCTGGATCTGCCCCTGACAACCCTGCCCTGTTAGCCACACTCGCGACTAATAAGGCGAGAGGTCAGCGGGCAGCCCCACGGGGAGAAAGTGCCTCCGTGCCCCCCACCCCTGGCTCTGATGGCCCAGCCTGGCACCCCAAGGTGGCCTCGGCCTTCCTACCTCCAAGGTCCAGGCGCATGTCCAAGCACCAGCAGAAGCTTCTCCAGGGTTGGTGCCTGCTCAGGGCAGAAAGCAGGGGTGAGGCTCCCCAAAGGGCCACTGGCACCAATGCCCCCAGGCAGCCCCAGCGAAGGGGACAGCCCACCCCCAGCCCGGGGACGCAGGCCTGAGGGGACATGGGGAACCCAGAGCAGGGCCAAGGGGAGCAGAGCCCCTCCTCCGGGACTTGAAATCTTTCCCGGGGGGCCCAGGGAGCTGGGGTCTGCAGAGGGCACTTTCAAAATACGGCCCACCCCCAAATTGCCACGTGGCCACAGAGCAGGGAGTCGCTGCAAAGTGGCCTGGCTTCAGCGCAGGAGGTCCCCTCCTGGGCCTCCCTCCTATAGGCACAGGCCTGAGTGCAAGGACGGGGACTGTGGAAGGCTGTTGGGGAGGGAGGGGGGCGGCGATGGGTGGGGGGAGACAGGCCAGATGTTTTTGGAAAGGGACACGGGGGTGACTGATGCCGACTGGAATTTGAAGGGGGAACATTCCCCACGTGCCTGGGGCTCTGGGTGGAAAATGGACGGTTTTTCATGGGGGGGGGGGTCTCCCTGTCCTGCCAAGCGAATGTGAAAGGCCTGCCTCATCCCTGCCCGGTCCCCACACCTGTCCCATGGCATTAACCCCCGCCTTCCCGGAGAGTCAGGCTTTAAGGGGACCCCCTGCCAGCGGGGTCCCTCTGTGGGGTGACAGTGGGGACAAGCTGTGTCCAGTGTACTGGCCCTAGGGACCTGCCGCTCTGCTCCCCAGCAGTGCCCCCTCCCTGGCAGCCCCTCAACCCACAGCTGCCCCTGGGGCGGCTGGCCCCTGCCCCCAAGGCTGCCCAGTGCCGAGGGGCTGGCCAGTTCCTGGCAGCAGTGCCTTGGGGCTGGGGAGGGTTCAGCAGTTGCCTTTAAGGAACCAGGTTTTCGCAGCCGGGAGAGGGAGGCTTTTCGAGAAAATTCCCTTGGAGAAAACGAAAGGAGACGCTTGACCCCCCGGCCAAGGGCCGGTCCTGCCCCCATCTCCCCCCCCCCATTTTCTCCTCTCCTTTCCCAGTCCTTCCACTCTCTCAATTCCCCAAGCAAAACTGGTTTCGCCCTCCTCCGGGGACTGTTGAAGTCCCCGAGAGCGCCCGCGGAGCGCCGGGGCGAGCGGGGGTGGCCGCCGGGGGTGCTCCCGGGCCCCCGGACCGAGCCAGGGACGAGCCTGCCCGCGGCGGCAGCCGGGCCGCGGCTTCGCCTAGGCTCGCAGCGCGGGAGCGCGTGGGGCGCGGCGGCGGCGGGGAGTCCGCGGGCCTCCTCGGAGGCGGCCGACCGGGGAGCCTGGGGACCCCGGAGCGCCCGGGGAGCAGCGCCCCGACGCGCCCCGGGCCGCTCTCGGCTTCCTCCCTTCCAGCCGGCGCCCGCGCGGCCGGGCTTCGGCACCGGGGCGCTCTCAGTGGCAGGAGAAGCGTGCGCCCCGCGGGGTGGGGGACCCGCAGAAGCCCCGCACCGCCTGGAGCCGCCGCCGCGCGGCCAGCGCTCGCGTCCCCCGGGGAGGGCGCCACTGCTCCGCGCGCGCGTCCCCCGACGCCCCGCGCGCTTCCCCGGCCGGCCCGG？:GATCCTAACCTCTCTCTCGGTCGCAGCCCCGCATCCCCAGGGCTCCAGGCCCCCGGCGACTTGCCCGCTCCTCCCAATTGCAGACACGACTTTTTCTGGGACCTCCCAAAGGACAGCCTGGCTCCAGGGTCCCCCAGATACATTCACCATTTCTCCAGATCACAAGTGGGTTTTTCGGGCACTAACTTCCAGAGACCTCAAAGCACATGAGCCCCTACTGGCTTTCCCAGGTTTCCACTAGTGGCCTCGGTCCCCACCTCACTGGGGATTGTCTCCCAGGCTCTTCGCGGTGTGATCCCACCCATTCGCGCCCAGGTCCCGCAGTGCCAATCCCTCCTCTAGAAAACTTAAACACTGACTCCTGGTCTCGGGGTGAGGCTGCCCAATGTGCCTGACTCCCCAGAAGGTATACCAGTGTTTTTCTGGCATTTGGGCACCGTTCCCCCAAAACACGTGAAGCTCTTTTCCCGCGTCCCCATAATTTTGGACGCCAGGGGCACCCAAGCTTAGCGCCCCTGTTTGGCTCCCCCACACCGCGAAGCCCTGCTCCCTGGGGTTCACGACAGTTTGGGACTTTATCTGCCAAGTTCCACAAACTGATTGGCCCCAAGCTGGGGTCCCTAAATTGTACACAAAGAACCCCAGCCCCCCCCCCCAACTCCAGTACAGGAAGCGATGGCCCCAGGACCCTCGGAGTTGGAACGTGGCTTCCTAAGCCTCCACCAAAATTGAGGCTTTCCGCGCAGGGCGCGCTGATGCCCTTGCTGAATCAGAAGCACTCTGCCCTCTGATTCCTGCTTTCCACAACCCTGAGAGCATGATTTCTGGTCCCCCAAACTCACTGAGCAAAAATCTTTTTGTGGGGGCTGCAAAGATAGGAGGCATTTCTCTCCGGAGCTCTCCAAACTCCCTTGCCTATAATCAAGTTCCCTAAAACTTAGACAGAGCTTCCCAGGCCCCAGAGGCACACAGAGCCATTATTGGAGCTGCGTTTAATGATGACAGGGACCATGGGTCATGCAGCTCCCCCAAGTCACAAATGCCCCAGGTATCCTTGGCTCCAGCCAAGCCCAAAGCAAACTCTTGCACAGATCCCATATCTTGTTATGTCAAGCGCTTTGCGTGTCCCAGTAAACAAATAGTCTGAGTGTTTTCTCCACCTCATAACATTCGGAATATTAAAAAATTCCCTGGGCCCCCGGAGCTGACAGACAAGAATCCGGGCTTCCTAAAATTCAGAACTGATTCCCAAATCCCAGGCCAACGCCAGACCCTCTCCCAATCTGGAGCCCCTCCGACTGGACACACTGGACTCCTAAGTATTACGCGCTGTCCTCCAGGCACCCCAAATGCATTCAAAGTGACGCTTTGGTCACAGAAAGGCACTGATTTCTTGGGCTCCAAAGCAGCCCATGCACCCCCGAGTCACCCCAAACTTAGTCAGCATTTCCCGGGTCTCCCTCCGCACTGCAAACTCCCAACTGCGGACACCGGTTCTTCAGGACCCACCGCCTAGACGGTCTTAATCCCTTTTCCCCCAGACCTAGATTCGGATCCTCAGTTCTCCCGAGGACTCTCAAGAACGTCTTTGGACCCCCAGATTCAAAAACTATTTTTCTGGGGCCTCCAAATTGAGGTGCTGCCTGCCAGTCCTCCAAAATAAACTGCAGGGTTTTTTGTTTGTTTGTTTTTTTGTTTTTTTTTTTTTTACCTTCCACGAAACAATCCGACTTTTTTGGACCATTGATTTATGGGTCCCCTGACTTTATGACCCTTGCCCCAAGTCCCCCTAAATGTAGGCCATTTTCCACGGGCCTCCCAAAATGAAATTGCCCAGATCCCGCCGAAAAAAATATCCCCGGGTCCTGGAAATCCCAGGTATTACAGGCCTGCGGCTGACACCCCTCCTTGCTACTAACCAGGTTCCCTGAAGTTTAGAGATCACTACCTAATGAACAAATCCACGGATCCCCAAAACTGGGGCCCTATCTTACTAGGGTTCCCTAAATGCAGACAGCGCCCGGGAAAATAGGGGCGTTTTTTTTCCTGTTTGCCAAAAATAAACTAATTGAAACCAATTTTTAGAATTAAAATCTAAAATGACCTTGATTTTCTGCGTTCTCCAAATGTACTTTTCACAGCCCAGGTTGCCCCCAGTTTAGACGGTGTTGCTTGAATCTCTAAAGCACCCTGAGGATTTTTCCCGAGGAAGCCACCACAACTACGGAATTTACTGTCCTTCGGGGCCACAAGCCTCCAGGCCACCAACTTGGATTTCTAAACCGTGGAAATCAGCCTCCACTTCCCTCCGCCACCCCGAGGGTCTGCTCAGACCCCCCAAACGTGCCCGCTGTTCTTCTCCCCCCAAATTTTATTTAGAGAATATGCCTCTCTCGGGTTCTGCCAAGTTTCCCGCTGAGACTTCCTCGGTCATCCCCAAATCCTCTTCCCCACAGTCCGGGAGCCCCCACAAGCTTACCGACCCACATGCTGGGGTCCCCCAACTTAAACGCGATCCCCTGTCCCCCAGATTCACCGAGTGATTTCCCTGGTCCTCAGACTGGGACTCTTTTACTGGAGTCTCGAATTTAGCCATTAATCACAGTTCTCCACTCCGACGCAGGCTCCCTTGGGTCCCCACGTCGGGGACATGGGTTCTCTTGCCTGCAAATCAGGCTGCTCTGACTTGCATTCAGGCCTTTGGGCATTGTTCCCCGCCCGC
SEQ ID NO:12
GCTCGC
SEQ ID NO:13
GAGCGGGGGTGGCCGCCGGGGGTGCTCCCGGGCCCCCGGACCGAGCCAGGGACGAGCCTGC
CCGCGGCGGCAGCCGGGCCGCGGCTTCGCCTAGGCTCGCAGCGCGGGAGCGCCGGGGC
SEQ ID NO:14
GGCAGCCGGGCCGCGGCTTCGCCTCGGC
SEQ ID NO:15
CCGCGGCTTCGCCTAG
SEQ ID NO:16
CCGCGGCTTCGCCTAGGCTCGCAGCGCGGG
序列表
<110> 中国科学院动物研究所
<120> 产生具有改善的特性的猪的方法
<130> P2019TC718
<150> 201810262863.4
<151> 2018-03-28
<160> 16
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IGF2 gRNA pair1-1
<400> 1
gcgcgggagc gcgtggggcg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IGF2 gRNA pair1-2
<400> 2
gcctaggcga agccgcggcc 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IGF2-663bp-F
<400> 3
cctctccttt cccagtcctt c 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IGF2-663bp-R
<400> 4
ggaggtccca gaaaaagtcg t 21
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IGF2 BSP 334bp F
<400> 5
ggattgttga agttttcgag ag 22
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IGF2 BSP 334bp R
<400> 6
ccactaaaaa cgccccgata 20
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IGF2 qRT F
<400> 7
gtgctgctat gctgcttacc g 21
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IGF2 qRT R
<400> 8
ccgcagacaa actggaggg 19
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IGF2-347bp-deep seq-F
<400> 9
actgttgaag tccccgagag cgc 23
<210> 10
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IGF2-347bp-deep seq-R
<400> 10
gaggcccgcg gactc 15
<210> 11
<211> 6144
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 11
gtgagtgtct ccagacccca gggcagggcc cggtgtcccc cggcacagag agctgtgctg 60
caggcccaga cctcccaggc cgttttagtt cccatctccc cttgggggag gggtggggct 120
cagaggggct ggggtgcatc cgcagagctg gggtgcaggg ctccaggtgc ctctctccca 180
ggcggctggc tcggaggggg gctgagcagg gacagtcggg gtcctcagcg gggagctcct 240
ggtggaagaa ggagggggag ggggttggtg ggggggaggc agggggtccg ggtgagggcg 300
ggaaggggag agaagagggt tccagggaca ctcctaagct ggggagactc cgggactccc 360
agggaggctg ggcccagctg aggcaggtga gacccagtcc tccctgccct gggctgctgg 420
ctgtggggcc tcacaccagt gctgtggcct ctctgtgtcc ttatctgtca aagtggccgg 480
ggtcacaagc ctggctgctg atccccgcga gcagcacgtg acaatgacaa ggcctagagg 540
ctcgggggcc ttacgagtcc ctgtgtcatg attccactgt gttgagccgg cagggcttcc 600
tgtgtgtgag tggggggcgg gggggggcga ctagagaggt ccaggggcca gatcctcctc 660
ggacacctgg tggagcaagc tctgtggtgg tggccgcccc atcccctgat aaggtattgg 720
gctgggagcg caggctgagc tgccccagag ggtcccggag agctctggag gcggaggcgt 780
gggccgtgtc cgtgcacctg ccccgcagcg acagagtccg ctcttcaggg cctgcagtga 840
ggggcccagc aggtgtcccc tcgcaggccg gtgtcgcctc cgagagagat gccaagaacg 900
ttgcttaaag gtgtcttagt ccagactcta cattagatgg tgcaatggcg acgcctgtgt 960
cctccaggag agcagggctc agcccctctt ctggggcccc caccccgccc atacatactt 1020
ccgactgact tctggtttat cgatcacatg gcgtgggtgt cttgtgccgt cggagtcccc 1080
gtgtccggcg gggggccggg gtcccttgtt tccagccagg gtgggaacag ggtcctcacc 1140
caggcagcag agccctgcag gggtgaggga gggacgatca ggggactctg agaacggagc 1200
tgggtttgtc aaatgctggg cttggtccca gggaaggggg gagcggcagc tcggagccag 1260
agccggggga ggaaaccggg gaggggagag gcaggacgag cagagaggga actggcggag 1320
caggcgcgag gcggccgcag gcctggtgca ggggccaggc tcgcggggtg agtccgaatc 1380
tggggggacg cttgtgttgt tggaataggg tttgtggatg ggggggtagt gctggagcag 1440
ggccggggtg ggggggtggg ccaggggatg gtgcttgggg ctgaggttcc tgccagccag 1500
gccgcagcgg agacccccaa ccccataaca tgcttgggtt gctggcaggt cccttcctac 1560
tgaggggctg gaagctgggg aggcccgggc cactggtcct ggctaggggt ggccagggcc 1620
ctttctgagc cccgcagtga cctggatctg cccctgacaa ccctgccctg ttagccacac 1680
tcgcgactaa taaggcgaga ggtcagcggg cagccccacg gggagaaagt gcctccgtgc 1740
cccccacccc tggctctgat ggcccagcct ggcaccccaa ggtggcctcg gccttcctac 1800
ctccaaggtc caggcgcatg tccaagcacc agcagaagct tctccagggt tggtgcctgc 1860
tcagggcaga aagcaggggt gaggctcccc aaagggccac tggcaccaat gcccccaggc 1920
agccccagcg aaggggacag cccaccccca gcccggggac gcaggcctga ggggacatgg 1980
ggaacccaga gcagggccaa ggggagcaga gcccctcctc cgggacttga aatctttccc 2040
ggggggccca gggagctggg gtctgcagag ggcactttca aaatacggcc cacccccaaa 2100
ttgccacgtg gccacagagc agggagtcgc tgcaaagtgg cctggcttca gcgcaggagg 2160
tcccctcctg ggcctccctc ctataggcac aggcctgagt gcaaggacgg ggactgtgga 2220
aggctgttgg ggagggaggg gggcggcgat gggtgggggg agacaggcca gatgtttttg 2280
gaaagggaca cgggggtgac tgatgccgac tggaatttga agggggaaca ttccccacgt 2340
gcctggggct ctgggtggaa aatggacggt ttttcatggg ggggggggtc tccctgtcct 2400
gccaagcgaa tgtgaaaggc ctgcctcatc cctgcccggt ccccacacct gtcccatggc 2460
attaaccccc gccttcccgg agagtcaggc tttaagggga ccccctgcca gcggggtccc 2520
tctgtggggt gacagtgggg acaagctgtg tccagtgtac tggccctagg gacctgccgc 2580
tctgctcccc agcagtgccc cctccctggc agcccctcaa cccacagctg cccctggggc 2640
ggctggcccc tgcccccaag gctgcccagt gccgaggggc tggccagttc ctggcagcag 2700
tgccttgggg ctggggaggg ttcagcagtt gcctttaagg aaccaggttt tcgcagccgg 2760
gagagggagg cttttcgaga aaattccctt ggagaaaacg aaaggagacg cttgaccccc 2820
cggccaaggg ccggtcctgc ccccatctcc ccccccccat tttctcctct cctttcccag 2880
tccttccact ctctcaattc cccaagcaaa actggtttcg ccctcctccg gggactgttg 2940
aagtccccga gagcgcccgc ggagcgccgg ggcgagcggg ggtggccgcc gggggtgctc 3000
ccgggccccc ggaccgagcc agggacgagc ctgcccgcgg cggcagccgg gccgcggctt 3060
cgcctaggct cgcagcgcgg gagcgcgtgg ggcgcggcgg cggcggggag tccgcgggcc 3120
tcctcggagg cggccgaccg gggagcctgg ggaccccgga gcgcccgggg agcagcgccc 3180
cgacgcgccc cgggccgctc tcggcttcct cccttccagc cggcgcccgc gcggccgggc 3240
ttcggcaccg gggcgctctc agtggcagga gaagcgtgcg ccccgcgggg tgggggaccc 3300
gcagaagccc cgcaccgcct ggagccgccg ccgcgcggcc agcgctcgcg tcccccgggg 3360
agggcgccac tgctccgcgc gcgcgtcccc cgacgccccg cgcgcttccc cggccggccc 3420
gggatcctaa cctctctctc ggtcgcagcc ccgcatcccc agggctccag gcccccggcg 3480
acttgcccgc tcctcccaat tgcagacacg actttttctg ggacctccca aaggacagcc 3540
tggctccagg gtcccccaga tacattcacc atttctccag atcacaagtg ggtttttcgg 3600
gcactaactt ccagagacct caaagcacat gagcccctac tggctttccc aggtttccac 3660
tagtggcctc ggtccccacc tcactgggga ttgtctccca ggctcttcgc ggtgtgatcc 3720
cacccattcg cgcccaggtc ccgcagtgcc aatccctcct ctagaaaact taaacactga 3780
ctcctggtct cggggtgagg ctgcccaatg tgcctgactc cccagaaggt ataccagtgt 3840
ttttctggca tttgggcacc gttcccccaa aacacgtgaa gctcttttcc cgcgtcccca 3900
taattttgga cgccaggggc acccaagctt agcgcccctg tttggctccc ccacaccgcg 3960
aagccctgct ccctggggtt cacgacagtt tgggacttta tctgccaagt tccacaaact 4020
gattggcccc aagctggggt ccctaaattg tacacaaaga accccagccc ccccccccaa 4080
ctccagtaca ggaagcgatg gccccaggac cctcggagtt ggaacgtggc ttcctaagcc 4140
tccaccaaaa ttgaggcttt ccgcgcaggg cgcgctgatg cccttgctga atcagaagca 4200
ctctgccctc tgattcctgc tttccacaac cctgagagca tgatttctgg tcccccaaac 4260
tcactgagca aaaatctttt tgtgggggct gcaaagatag gaggcatttc tctccggagc 4320
tctccaaact cccttgccta taatcaagtt ccctaaaact tagacagagc ttcccaggcc 4380
ccagaggcac acagagccat tattggagct gcgtttaatg atgacaggga ccatgggtca 4440
tgcagctccc ccaagtcaca aatgccccag gtatccttgg ctccagccaa gcccaaagca 4500
aactcttgca cagatcccat atcttgttat gtcaagcgct ttgcgtgtcc cagtaaacaa 4560
atagtctgag tgttttctcc acctcataac attcggaata ttaaaaaatt ccctgggccc 4620
ccggagctga cagacaagaa tccgggcttc ctaaaattca gaactgattc ccaaatccca 4680
ggccaacgcc agaccctctc ccaatctgga gcccctccga ctggacacac tggactccta 4740
agtattacgc gctgtcctcc aggcacccca aatgcattca aagtgacgct ttggtcacag 4800
aaaggcactg atttcttggg ctccaaagca gcccatgcac ccccgagtca ccccaaactt 4860
agtcagcatt tcccgggtct ccctccgcac tgcaaactcc caactgcgga caccggttct 4920
tcaggaccca ccgcctagac ggtcttaatc ccttttcccc cagacctaga ttcggatcct 4980
cagttctccc gaggactctc aagaacgtct ttggaccccc agattcaaaa actatttttc 5040
tggggcctcc aaattgaggt gctgcctgcc agtcctccaa aataaactgc agggtttttt 5100
gtttgtttgt ttttttgttt tttttttttt taccttccac gaaacaatcc gacttttttg 5160
gaccattgat ttatgggtcc cctgacttta tgacccttgc cccaagtccc cctaaatgta 5220
ggccattttc cacgggcctc ccaaaatgaa attgcccaga tcccgccgaa aaaaatatcc 5280
ccgggtcctg gaaatcccag gtattacagg cctgcggctg acacccctcc ttgctactaa 5340
ccaggttccc tgaagtttag agatcactac ctaatgaaca aatccacgga tccccaaaac 5400
tggggcccta tcttactagg gttccctaaa tgcagacagc gcccgggaaa ataggggcgt 5460
tttttttcct gtttgccaaa aataaactaa ttgaaaccaa tttttagaat taaaatctaa 5520
aatgaccttg attttctgcg ttctccaaat gtacttttca cagcccaggt tgcccccagt 5580
ttagacggtg ttgcttgaat ctctaaagca ccctgaggat ttttcccgag gaagccacca 5640
caactacgga atttactgtc cttcggggcc acaagcctcc aggccaccaa cttggatttc 5700
taaaccgtgg aaatcagcct ccacttccct ccgccacccc gagggtctgc tcagaccccc 5760
caaacgtgcc cgctgttctt ctccccccaa attttattta gagaatatgc ctctctcggg 5820
ttctgccaag tttcccgctg agacttcctc ggtcatcccc aaatcctctt ccccacagtc 5880
cgggagcccc cacaagctta ccgacccaca tgctggggtc ccccaactta aacgcgatcc 5940
cctgtccccc agattcaccg agtgatttcc ctggtcctca gactgggact cttttactgg 6000
agtctcgaat ttagccatta atcacagttc tccactccga cgcaggctcc cttgggtccc 6060
cacgtcgggg acatgggttc tcttgcctgc aaatcaggct gctctgactt gcattcaggc 6120
ctttgggcat tgttccccgc ccgc 6144
<210> 12
<211> 6
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 12
gctcgc 6
<210> 13
<211> 119
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 13
gagcgggggt ggccgccggg ggtgctcccg ggcccccgga ccgagccagg gacgagcctg 60
cccgcggcgg cagccgggcc gcggcttcgc ctaggctcgc agcgcgggag cgccggggc 119
<210> 14
<211> 28
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 14
ggcagccggg ccgcggcttc gcctcggc 28
<210> 15
<211> 16
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 15
ccgcggcttc gcctag 16
<210> 16
<211> 30
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 16
ccgcggcttc gcctaggctc gcagcgcggg 30
Claims (7)
1.一种产生具有改善的特性的猪的方法，包括通过基因编辑修饰猪IGF2基因内含子3中的序列的步骤，
所述方法包括将靶向猪IGF2基因内含子3中的序列的基因编辑系统导入猪中，其中所述基因编辑系统包含CRISPR核酸酶或编码所述CRISPR核酸酶的表达构建体，和向导RNA或编码所述向导RNA的表达构建体，
其中所述基因编辑系统包含两种向导RNA，或编码所述两种向导RNA的表达构建体，所述两种向导RNA分别靶向猪IGF2基因内含子3中位于不同DNA链上的序列SEQ ID NO:1和SEQID NO:2。
2.权利要求1的方法，其中所述CRISPR核酸酶是CRISPR切口酶。
3.权利要求1的方法，其中所述CRISPR核酸酶是Cas9切口酶。
4.权利要求1的方法，所述方法包括将所述靶向猪IGF2基因内含子3中的序列的基因编辑系统导入猪的受精卵或胚胎中，然后将所述受精卵或胚胎转移至受体代孕猪以产生其中IGF2基因内含子3中的序列被修饰的猪。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中待修饰的猪在IGF2基因内含子3中第3072位核苷酸为G。
6.权利要求1-4中任一项的方法，其中待修饰的猪选自巴马猪、民猪、梅山猪、五指山猪。
7.用于通过权利要求1-6中任一项的方法产生具有改善的特性的猪的试剂盒，其包括靶向猪IGF2基因内含子3中的序列的基因编辑系统，
其中所述基因编辑系统包含CRISPR核酸酶或编码所述CRISPR核酸酶的表达构建体，和向导RNA或编码所述向导RNA的表达构建体，
其中所述基因编辑系统包含两种向导RNA，或编码所述两种向导RNA的表达构建体，所述两种向导RNA分别靶向猪IGF2基因内含子3中位于不同DNA链上的序列SEQ ID NO:1和SEQID NO:2。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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