CN112041261A - 制造用于对生化材料进行测序的测序单元的方法以及测序单元 - Google Patents

Abstract

本发明涉及制造用于对生化材料进行测序的测序单元（100）的方法。在此，在热光刻法中在前体层中产生至少一个用于对生化材料进行测序的测序孔（104、114），以产生预结构化的层。随后通过加热到转化温度而将预结构化的层转化为石墨烯层（102），以制造所述测序单元（100）。在此，取决于转化温度而将测序孔（104、114）减小到对于测序而言合适的尺寸。

Description

制造用于对生化材料进行测序的测序单元的方法以及测序 单元

现有技术

本发明基于根据独立权利要求的种类的方法或装置。

在由前体分子制成的所谓的自组装单层（也称为自组装单层膜或简称SAM）的情况下，前体例如在硅或玻璃表面的结合位点处对接，其中取决于前体，也可发生前体分子的彼此交联。这些过程通常是自限性的，即在一个单层沉积并占据表面上所有可用的结合位置之后，就不再使用相同前体进行沉积。这种行为通常是通过将前体分子选择性且仅仅在亲水表面上对接而实现的，在此本身生成疏水表面并因此使进一步的沉积自动停止，因为其它前体分子不再能够在疏水和因此无水的表面上对接。

自组装单层也可以借助合适的溶剂，例如己烷或庚烷或碳氟化合物如FC40从液相中沉积。然而，由于前体化学的较高纯度以及沉积层的更好品质和可再现性，气相沉积已获得承认。在这种情况下，以液体形式存储的前体分子例如通过加热前体液体而被转移到气相中。在反应室中调节到所需的前体分压并与晶片接触。具有或没有载气（惰性气体或稀有气体，例如N ₂或Ar）的方法也是可行的。

某些SAM涂层可以在晶片上转化为高品质的石墨烯层。为此，将SAM涂层在沉积在衬底表面上之后例如通过蒸镀用300 nm厚的金属层（例如由镍或铜制成）涂覆，并然后在800至1000℃的高温下转化为石墨烯。

发明内容

在此背景下，通过本文介绍的方法，提出了根据主权利要求的制造用于对生化材料进行测序的测序单元的方法以及测序单元。通过从属权利要求中列出的措施使得独立权利要求中给出的装置的有利扩展方案和改进成为可能。

本文介绍的方法基于以下认知：可以在热光刻法中在合适的前体层，例如自组装单层中预定石墨烯层中的纳米孔，并且在将该前体层热转化为石墨烯层时根据转化温度而减小到合适的直径。可以将以此方式制成的元件例如集成到芯片实验室环境中，其以LATEPCR（指数后线性）进行定量聚合酶链式反应（简称qPCR），并将根据桑格方法对DNA片段的测序与通过纳米孔的DNA片段长度测定进行组合。为了在石墨烯中制造纳米孔，可以有利地将借助扫描探针的热光刻法（也称为热扫描探针光刻或简称t-SPL）与自组装单层组合使用，以在其中将自组装单层转化为石墨烯之前就已借助t-SPL限定和因此产生纳米孔，该纳米孔在自组装单层热转化后在生成的石墨烯层中留下对于DNA测序或DNA片段长度测定而言合适的纳米孔。

可例如直接在石墨烯中借助AFM方法（AFM =原子力显微镜；“原子力显微镜”）使用电流脉冲来烧制此类纳米孔。然而，为此合适的设备和合适的工艺不是标准可用的或不能从商业上获得，因此需要为此目的对商业上可得的AFM工具进行调试和在使用电流脉冲在石墨烯中烧制纳米孔的方法方面进行相应复杂的工艺研发。相反，t-SPL方法和用于在聚合物中引入纳米结构的相应工艺现在在商业上和以便宜的方式可得，更确切地说既以合适工具的形式，也以用于对聚合物材料进行纳米结构化的合适工艺的形式。但是，石墨烯不是聚合物有机材料，因此上述方法不能容易地转用于石墨烯。但是，如果借助t-SPL在SAM涂层形式的石墨烯的有机前体层中生成纳米孔，则可以将热生成纳米孔的技术一对一转用于SAM涂层，即有机材料的初级结构化。然后可以将以此方式结构化的SAM涂层例如在临时施加的金属层（例如由铜或镍制成）下方热转化为石墨烯，从而根据先前的结构化在石墨烯层中生成纳米孔。t-SPL方法的分辨率极限为例如10至15 nm，这对于应用目的而言本身太大，但是在适当控制SAM涂层至石墨烯的热转化时最终会导致直径为几纳米的纳米孔，其如对于纳米孔测序或纳米孔DNA片段长度测定而言最佳。由此可将在商业上可得且便宜的技术直接用于聚合物（SAM涂层材料）的纳米结构化，以经由该起始材料的结构化而随后在石墨烯中生成特定的纳米孔。

提出了制造用于对生化材料进行测序的测序单元的方法，其中该方法包括以下步骤：

在热光刻法中在前体层中产生至少一个用于对生化材料进行测序的测序孔，以生成预结构化的层；和

通过将预结构化的层加热到转化温度而将预结构化的层转化为石墨烯层，以制造所述测序单元。

在所述转化步骤中，取决于转化温度，可将测序孔减小到适合于对生化材料进行测序的尺寸。合适的尺寸在此例如由生化材料的尺寸得出。对于不同的生化材料，可能需要测序孔的不同直径。通过适当选择转化温度，可以生成相应的直径。生化材料可以理解为例如是指核苷酸序列，诸如DNA等。测序可以理解为是指测定生化材料的结构单元的序列，例如DNA分子中的核苷酸序列。测序孔可以理解为是指生化材料可以在测序过程中穿过的开口。前体层可以理解为是指用于制造石墨烯层的由所谓的前体分子组成的层。例如，前体层可以是自组装单层。

此类前体可以是例如有机三氯硅烷、三甲氧基硅烷或三乙氧基硅烷，例如辛基三氯硅烷、癸基三氯硅烷、十八烷基三氯硅烷、苯基三氯硅烷、辛基三甲氧基硅烷、癸基三甲氧基硅烷、十八烷基三甲氧基硅烷、苯基三甲氧基硅烷、辛基三乙氧基硅烷、癸基三乙氧基硅烷、十八烷基三乙氧基硅烷或苯基三乙氧基硅烷。三氯硅烷是特别合适的，因为由于它们的高化学反应性，它们非常迅速地水解并结合到亲水表面的羟基上，并且也迅速交联。但是，也可以使用甲氧基硅烷或乙氧基硅烷。苯基硅烷，特别是三氯苯基硅烷特别适合用于生成石墨烯，因为这些前体分子已含有对应于稍后石墨烯结构的芳族碳环。在苯基三氯硅烷的情况下，起始材料在其结构方面已与目标材料相似，这促进芳族碳环至石墨烯的后续热转化。

热光刻法可以理解为是指纳米光刻的热控制方法，例如其中使用相应的扫描探针或具有高尖端温度的隧道尖端，以通过尖端的高温对测序孔进行烧制（t-SPL方法）。替代地，也可以借助隧道电流脉冲将纳米孔烧制到导电起始材料中。

在此提出的方法可以例如在用于制造具有集成在石墨烯中的纳米孔的在硅中的阵列单元的整个过程中进行。在此，测序单元可以例如在芯片中与qPCR阵列组合。

在转化步骤中，测序孔的直径可以减小到预定直径。取决于预定直径，可以调节转化温度。预定直径可以取决于特征，例如要测序的生化材料的尺寸来选择。为了实现不同的预定直径，可以使用并例如通过使用查找表而选择不同的转化温度。

根据一个实施方案，可以在产生步骤中以纳米点的形式限定测序孔。由此可以特别快速地例如借助经调温的扫描探针而产生测序孔。

在产生步骤中，可以产生直径小于20纳米，例如直径为10至20纳米的测序孔。10至20纳米的值范围在此从t-SPL方法的当前分辨率极限得出，其中根据一个实施方案，较小的纳米孔通过随后的“生长方法”实现。相应地，在转化步骤中，可以将测序孔减小到1至5纳米，特别优选1至2纳米的直径。当不可能合理地直接制造1至5纳米或甚至更好地1至2纳米的纳米孔时，这是实现小孔的可能方式。由于t-SPL和大多数其它方法无法直接做到这一点，因此使用上述孔生长作为有利的补救措施。在一定程度上，这“治愈”t-SPL方法的不足的分辨率极限。该实施方案能够以较少的生产步骤特别有效地制造具有1至5纳米或特别优选1至2纳米的所需孔径的测序单元。

另外，由此在转化步骤中石墨烯层可以至少在测序孔的边缘区域中形成为单层。当片段穿过测序孔时，由此能够尽可能精确地进行例如DNA片段的片段长度测定。

根据另一个实施方案，在产生步骤中，可以在作为前体层的自组装单层中产生测序孔。自组装单层通常可以理解为是指在存在特定反应条件时在表面活性或有机物质上自发形成且具有高内部秩序和特定厚度的层。由此可以以高重复准确度、高纯度和高品质产生测序孔。

此外，该方法可以包括将金属层施加到预结构化的层上的步骤。在此，可以在转化步骤中借助金属层来转化预结构化的层。所述金属层可以例如是由铜或镍或其它合适金属或其它合适金属合金制成的层。所述金属层尤其可以用于加热预结构化的层。特别地，所述金属层可以是临时层，其可以在转化之后再次被去除。由此能够受控地加热预结构化的层，并因此以高重复准确度精确地减小测序孔。

有利的是在产生步骤中将前体层的孔部分加热到高于前体层的分解温度的温度，以在孔部分中产生测序孔。分解温度可以理解为是指前体层在含氧气氛中分解的温度。通过该实施方案实现的是，孔部分中的前体层立即被侵蚀，并且因此极快地将测序孔似乎烧制到前体层中。

根据另一实施方案，该方法可以包括生成具有至少一个用于容纳所述生化材料的包含入口和出口的空腔的空腔元件的步骤。在此，在产生步骤之前，将前体层施加到空腔元件的包含出口的部分上，并且在产生步骤中与出口相对地产生测序孔。空腔可以理解为例如是指在空腔元件中的管道状的通道开口。空腔元件也可以通过多个空腔生成。例如，空腔元件可以作为空腔晶片生成。例如，空腔可以用作qPCR阵列单元。入口可以理解为是指可通过其用生化材料填充空腔的开口。与此类似地，出口可以理解为是指生化材料可通过其从空腔离开的开口。通过该实施方案，可以控制出口的横截面并将其准确地减小到适合于对生化材料进行测序的直径。

有利的是在生成步骤中生成具有亲水涂层的空腔内部。附加地或替代地，可以生成具有疏水涂层的空腔元件的包含入口的那部分的周围。通过空腔内部的亲水性质，可以容易地用生化材料填充空腔。另外，通过亲水的空腔内部与疏水的空腔入口周围之间的结合，可以避免生化材料从空腔的不受控泄漏，即所谓的“拖走”。

因此，每个空腔的内部可具有亲水表面性质。相反，表面上的入口周围可以被涂覆为尽可能疏水。这些亲水和疏水层可以起重要作用。根据一个实施方案，可以在空腔元件的表面上，即在晶片表面或芯片表面上，即在空腔的入口附近或入口之间实现疏水层效应。由此可以避免空腔内容经由该表面被拖走至相邻空腔或在相邻空腔之间形成电流路径。因此，可以避免所谓的“串扰”，即来自一个空腔的生物材料经由芯片表面爬到相邻空腔中，和反之亦然。这样的串扰是不希望的，并且芯片表面上相对疏水的氮化硅用于避免这一点。根据已知的现有技术，表面的疏水作用也可以通过用其它疏水层印刷（例如作为自组装单层涂层）（例如包含PFOTS =全氟辛基三氯硅烷、PFD(ecyl)TS、PFO(cta)D(ecyl)TS等）来增强。根据一个实施方案，空腔内部本身尽可能亲水，以使得容易地用水性介质填充并将液体保持在空腔内部中。

这里描述的方法还创建了用于对生化材料进行测序的测序单元。该测序单元包括在根据前述实施方案中任一项的方法中制造且具有至少一个用于对生化材料进行测序的测序孔的石墨烯层。

本发明的实施例在附图中示出并在下面的描述中更详细解释。其中：

图1示出了根据一个实施例的测序单元的示意图；

图2a-2h示出了用于制造图1的测序单元的整个过程的示意图；和

图3示出了根据一个实施例的方法的流程图。

在本发明的有利实施例的以下描述中，相同或相似的附图标记用于在各个附图中示出且具有相似作用的元件，其中省略了对这些元件的重复描述。

图1示出了根据一个实施例的测序单元100的示意图。测序单元100包括具有用于对生化材料进行测序，这里示例性地用于确定DNA片段长度的测序孔104的石墨烯层102。石墨烯102是通过在热光刻法中用测序孔104进行预结构化的自组装单层的热转化而生成的层。选择热转化过程中的转化温度，以使得测序孔104通过生长而减小到适合于对生化材料进行测序的直径。因此，可以根据测序孔104的所需直径来选择合适的转化温度。

根据该实施例，石墨烯层102形成具有用于存储生化材料的空腔108的空腔元件106的底部。空腔108例如形成为基本上以直线穿过空腔元件106并具有入口110和与入口相对的出口112的通道。测序孔104与出口112相对，以使得空腔108的出口横截面由测序孔104限定。

根据图1所示的实施例，石墨烯层102具有多个用于对所述生化材料或其它生化材料进行测序的其它测序孔114。类似于测序孔104，生成所述其它测序孔114。空腔元件106因此形成为具有多个用于容纳生化材料的其它空腔116，其中所述其它空腔116的各自出口与各一个其它测序孔114相对。

测序单元100例如可集成到芯片实验室环境中，其由虚线框表示。例如，根据图1的测序单元100作为由在底部具有纳米孔的空腔晶片和帽形对电极118制成的结合部件实现。石墨烯层102被对电极118覆盖。测序单元100通过对电极118和各自布置在空腔108、116的入口处的多个其它电极120与用于电流测量的测量单元122连接。特别地，测序单元100作为具有随后通过DNA片段长度测定的基于石墨烯的纳米孔测序仪的在硅中的LATE-qPCR-桑格测序阵列实现。

作为用于在热光刻法中，特别是通过热扫描探针光刻（简称t-SPL）产生测序孔的前体层，以完全理想方式适合的是自组装单层（以下简称为单层），因为这种结构化方法的精确度和可重复性由于非常低且极其均匀的单分子层厚度是特别好的。此外，t-SPL方法在AFM尖端温度为900至950℃的情况下在层表面上生成300至400℃的局部和瞬时温度，这明显高于含氧环境，例如空气中或富氧气氛中或纯氧中的单层的分解温度。分解温度为例如约250℃。由此，单层的腐蚀在所涉区域中立即开始，以使得纳米孔（前面也称为测序孔）可以极快地“烧制”到单层中。由于在晶片表面上仅生成相对少的纳米孔，例如每个qPCR阵列单元最多两个纳米孔，并且为此分别驶过每个qPCR阵列单元仅一个或最多两个点并作为点“烧制”，因此测序单元100的制造过程也非常经济，因为避免了在密集写入具有大量不同尺寸和延伸结构的大区域时可能出现的问题。相反，这里每个qPCR阵列单元驶过各一个或最多两个位置并在每个位置“烧制”各一个纳米点或纳米位点就足够了。因此，有利地写入了纳米和微米范围内的点而不是复杂的结构几何形状。

t-SPL方法的分辨率极限通常为10至15 nm。对于用于通过DNA片段长度测定进行DNA测序的纳米孔而言，它例如太大并会明显降低电信号或电信号冲程。单层转化为石墨烯层102的机制明显改进了这种情况，因为通常在用于形成石墨烯的单层中存在碳过量，这导致形成双层或三层石墨烯，即多个石墨烯层而不是单个石墨烯层（也称为单层）。由于碳过量，在纳米孔区域中出现从纳米孔边缘开始的“生长”，因此石墨烯中产生的纳米孔明显小于在单层中初级生成的。在热退火的最佳过程管理中，因此可以调节到1至2nm的纳米孔尺寸，其中随着石墨烯层102越来越接近纳米孔，其特性从双层或三层变为单层。

由此，对于通过在片段穿过纳米孔时使用电流调节经由尽可能精确地测度DNA片段长度而进行纳米孔测序的应用实现了理想条件：邻近孔开口处的膜厚度大致等于孔径为1至2nm的石墨烯单层。

下面例如更详细地描述了在测序qPCR阵列的制造中通过使用自组装单层和t-SPL将石墨烯制造与纳米孔生成集成的整体工艺。给出的尺寸、层厚度或工艺流程中使用的层材料仅应理解为示例性说明。

图2a至2h示意性地示出了用于制造图1的测序单元的整体工艺。在该工艺开始时，例如在硅晶片208的正面和背面的整面上生长通过热氧化的例如250nm的二氧化硅204和在其之上通过低压气相沉积的280nm的氮化硅206的层序列。这在图2a中示出。通过沉积的氮化硅的拉应力，补偿或过度补偿热二氧化硅的压应力。给出的层厚度应仅说明如何能够通过受压应力和拉应力的层的相互作用通过适当地确定层厚度的尺寸而在层结构中在整体上生成拉应力。为了避免暴露的层膜由于“凸起”而破裂并确保足够的稳定性，所得的拉应力在该工艺的进一步过程中很重要。

在进一步的工艺步骤中，如图2b所示，通过在晶片正面上具有足够厚的光刻胶掩模210的光刻法来限定qPCR阵列单元元件的几何形状。在自对准工艺中，首先通过从晶片正面进行蚀刻来打开氮化硅层206和二氧化硅层204中的掩模窗口。这如图2c所示。然后，利用相同的掩蔽并借助DRIE工艺（DRIE =深反应离子蚀刻；“反应离子深度蚀刻”），从晶片正面穿过硅晶片208蚀刻出空腔108、116，直至停在硅片背面的二氧化硅204上。结果如图2d所示。空腔108、116代表稍后的qPCR阵列单元元件。二氧化硅层204的厚度容许一定的过度蚀刻，以补偿晶片表面上的蚀刻速率一致性偏差。例如，假设在这种过度蚀刻的情况下在空腔区域中可能会损失多达100 nm的二氧化硅。因此，二氧化硅层204根据示例性选择的250nm的初始层厚度仍然具有150nm的剩余厚度。在过度蚀刻过程中，二氧化硅层204不应穿透直至氮化硅层206，因为氮化硅在DRIE工艺中不具有足够的稳定性。对于本领域技术人员而言显而易见的是，通过何种措施能够在氧化物厚度方面适应于要容许的更高或更低的过度蚀刻。在完全蚀刻硅之后，空腔底部的膜各自是自支撑的，即应如上所述是受拉应力，从而不破裂并对于后续工艺而言具有足够的稳定性。

随后，如图2e所示从晶片正面去除光刻胶掩模210，并对硅晶片208进行热氧化，其中在qPCR阵列单元元件中在空腔108、116的侧壁上生长例如2.5μm的二氧化硅。由于该热氧化工艺，氮化硅层206的一部分也被氧化，但是比在游离硅表面上的情况中慢得多。对于2.5μm的以热方式基于硅生长的二氧化硅，通常可以从30nm的氮化硅出发，其转化为约40nm厚的再氧化物212，即二氧化硅，如从图2f中可见。

再氧化物212具有亲水表面性质。如果在随后工艺中对于正面通过选择性蚀刻，例如用经缓冲的氢氟酸从晶片正面再次去除，则如图2g所示形成相对疏水的氮化硅晶片正面。在该蚀刻操作时，在空腔108、116中在侧壁和空腔底部也损失约50至100 nm的二氧化硅，因此在空腔底部留下最小50 nm的二氧化硅204，其上存在由约250 nm氮化硅和40 nm再氧化物212形成的层结构，其中不应从晶片背面去除再氧化物212。因为晶片背面由于再氧化物212而保持亲水，因此现在可以进行用前体层214（这里是自组装单层）涂覆晶片背面的涂覆工艺，以生成石墨烯层。在借助t-SPL进行沉积之后，单层214设有纳米孔。然后将金属层蒸镀到晶片背面上，例如300nm的铜或镍。位于下面的单层214被热转化为石墨烯。退火过程在此还决定了纳米孔的大小，因为在温度处理过程中碳具有一定的迁移率，并且基于单层214的t-SPL结构化从边缘缓慢生长10至15nm的大孔。

在去除金属层之后，具有生成的纳米孔的石墨烯层102暴露在空腔底部的层结构上。这在图2h中示出。现在，逐步地将空腔底部的层结构完全蚀刻直至空腔108、114，更确切地说优选借助各向同性蚀刻的选择性湿法蚀刻化学，其中石墨烯层102用作该蚀刻工艺的掩蔽。从纳米孔出发，例如借助高度稀释或缓冲的氢氟酸从晶片背面开始依次完全蚀刻二氧化硅层，而例如使用磷酸以完全蚀刻氮化硅中间层。对于借助设有纳米孔的石墨烯层102作为掩蔽进行的自对准蚀刻操作，因此在三个步骤中将稀（经缓冲）氢氟酸用于再氧化物212，将磷酸用于氮化硅206，且将稀（经缓冲）氢氟酸用于位于下面的二氧化硅204。在使用石墨烯纳米孔作为用于蚀刻位于下面的电介质的掩模层的操作中实现的特别优点是，这些电介质基本上保留在纳米孔的外部，机械地支撑石墨烯层102并因此确保额外的稳定性。

在晶片正面上生成金属化部分216和将对置晶片结合到晶片背面上的连接面218上之后，存在用于连接到测量单元的阵列单元结构，如图1示意性所示。

该工艺流程的另一个优点是，由于氮化硅层206，晶片正面相对疏水，而由于在侧壁和空腔底部的二氧化硅层204，qPCR阵列单元中的空腔壁是亲水的。由此可以以简单的方式用水性介质填充qPCR阵列单元，因为该水性介质被亲水环境完全吸入阵列单元中并保持在其中。此外，阵列单元在正面借助油，优选借助高介电强度和高绝缘氟油或碳氟化合物，例如全氟聚醚或FC40或FC77（制造商：3M）的封闭可以特别好、可靠和可再现地进行，因为疏水晶片正面排斥水膜，或水膜可以从那里很容易和完全地被接替的氟油或碳氟化合物排挤。由此有效地抑制阵列单元元件之间的电串扰和生化串扰两者，因为通过疏水表面性质有效地抑制连接阵列单元元件的水膜。如果需要，可以例如通过用全氟烷基三氯硅烷如全氟辛基三氯硅烷或全氟癸基三氯硅烷进行印刷来进一步增强表面的疏水作用。

图3示出了根据一个实施例的方法300的流程图。可以例如进行方法300，以制造以上借助图1至2h描述的测序单元。在此，在步骤310中，在热光刻法中通过在前体层，特别是自组装单层中产生至少一个测序孔来生成预结构化的层。在进一步的步骤320中，其通过加热到特定的转化温度而转化为石墨烯层。在此，取决于选择的转化温度，测序孔减小了一定尺寸。

借助这样的方法，例如可以借助商业上可得的设备和商业上可得的工艺以特别经济的方式将大于10 nm的纳米孔写入自组装单层，并在随后的热工艺中在临时施加的金属层下方转化为具有相应纳米孔的石墨烯层。由于高温下的碳迁移，石墨烯中的纳米孔可以减小到明显低于热光刻法的10至15 nm的分辨率极限。另外，有利地邻近纳米孔周围实现了所生成的石墨烯层的层厚度减小，通常从双层或三层结构减小到单层结构，这增加了测序准确度或DNA片段长度测定的准确度。由于在晶片上写入仅相对少的作为点的纳米孔，例如每个qPCR阵列单元最多两个纳米孔，因此借助t-SPL生成纳米孔的过程可以极其经济和快速地进行。

如果实施例在第一特征和第二特征之间包括“和/或”连词，则这应以这样的方式来解读，即该实施例根据一个实施例方案具有第一特征和第二特征两者，并且根据另一实施方案仅具有第一特征或仅具有第二特征。

Claims (12)

1.制造用于对生化材料进行测序的测序单元（100）的方法（300），其中该方法（300）包括以下步骤：

在热光刻法中在前体层（214）中产生（310）至少一个用于对生化材料进行测序的测序孔（104、114），以生成预结构化的层；和

通过将预结构化的层加热到转化温度而将预结构化的层转化（320）为石墨烯层（102），以制造所述测序单元（100）。

2.根据权利要求1所述的方法（300），其中在所述转化（320）步骤中，测序孔（104、114）的直径减小到预定直径，并且取决于该预定直径来调节所述转化温度。

3.根据前述权利要求中任一项所述的方法（300），其中在产生（310）步骤中，以纳米点的形式限定所述测序孔（104、114）。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法（300），其中在产生（310）步骤中，产生直径为10至20纳米的测序孔（104、114）。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法（300），其中在转化（320）步骤中，将所述测序孔（104、114）减小到1至5纳米的直径，特别是1至2纳米的直径。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法（300），其中在转化（320）步骤中，所述石墨烯层（102）至少在所述测序孔（104、114）的边缘区域中形成为单层。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法（300），其中在产生（310）步骤中，在作为前体层（214）的自组装单层中产生测序孔（104、114）。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法（300），其包括将金属层施加到所述预结构化的层上的步骤，其中在转化（320）步骤中，借助该金属层转化所述预结构化的层。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法（300），其中在产生（310）步骤中，将所述前体层（214）的孔部分加热到高于所述前体层（214）的分解温度的温度，以在所述孔部分中产生测序孔（104、114）。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法（300），其包括生成具有至少一个用于容纳所述生化材料的包含入口（110）和出口（112）的空腔（108）的空腔元件（106），其中在产生（310）步骤之前，将所述前体层（214）施加到空腔元件（106）的包含出口（112）的部分上，并且在产生（310）步骤中，与出口（112）相对地产生测序孔（104）。

11.根据权利要求10所述的方法（300），其中在所述生成步骤中，生成具有亲水涂层的所述空腔的内部，和/或生成具有疏水涂层的所述空腔元件（106）的包含入口（110）的部分。

12.用于对生化材料进行测序的测序单元（100），其中所述测序单元（100）具有石墨烯层（102），所述石墨烯层在根据前述权利要求中任一项所述的方法（300）中制造并包含至少一个用于对生化材料进行测序的测序孔（104、114）。

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