CN112022883B - 一种用于石膏外固定材料的益生菌粉剂、其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药材料领域，公开了一种益生菌冻干粉制备方法，包括以下步骤：活化培养益生菌，所述的益生菌是乳杆菌和/或嗜热链球菌；扩大培养菌种液，益生菌的密度不少于2*10⁹cfu/ml，将菌液混合得到复合菌液，控制干酪乳杆菌和嗜热链球菌的比例为1：0.5‑3冷冻脱水复合菌液，获得益生菌冻干粉。将本发明的益生菌粉剂用于制备骨科外固定材料的衬垫，能够促进皮肤表皮的健康，显著降低需要外固定的骨科患者发生皮肤过敏的概率，成本低廉，使用简便，大大提高了患者的舒适度和依从性。

Description

一种用于石膏外固定材料的益生菌粉剂、其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医药材料领域，尤其涉及一种益生菌石膏外固定衬垫，及其制备方法和应用。

背景技术

骨折的愈合是一个复杂、连续的过程，根据骨折愈合不同阶段的特点，《骨折治疗的AO原则》将骨折愈合过程分为四个阶段：

(1)炎性期(骨折后1-7天)：骨折发生后，可迅速引发炎性反应，并一直持续到纤维组织，软骨或骨形成的开始；

(2)软骨痂形成期(骨折后2-3周)：疼痛和肿胀消退，软骨痂形成，骨折块无法自由移动。在软骨痂形成期末，其产生的稳定性已足以对抗短缩畸形，但骨折端的成角移位仍可发生。这一时期需要严格制动。骨折端固定稳定，有利于骨折的初步连接。病人在这一时期可行功能锻炼，但程度要轻，以肌肉舒缩活动为主；

(3)硬骨痂形成期(3-4个月)：当骨折两端的软骨痂连接时，硬骨痂接管开始出现，其持续至骨折由新生骨形成的坚强愈合为止；

(4)重塑形期(持续数月或数年不等)：编织骨通过表面侵蚀和骨单位性重建逐渐由板层骨所取代。

骨折的愈合过程本质上是骨的结构和生物力学特性的恢复，针对骨折愈合的四个阶段，在前两个周期需要对骨折部位进行可靠固定，因为固定不稳定一方面会增加损伤组织的炎性反应和破坏修复组织，因而延迟和阻碍了损伤组织的修复，另一方面骨折愈合早期，愈合部位组织刚度低，承受外力能力差，须稳定固定减少受力，固定不稳定，容易发生骨块移位,严重的会导致骨不连和骨不愈合；在第三周期硬骨痂形成期需要逐步降低固定强度直至应力遮挡率为0，以便以在第四周期重塑形期骨的结构和生物力学特性的恢复。

理想的用于粉碎性骨折和非承重骨折的骨折内固定捆扎带应该能在骨折愈合的初期对骨块提供稳定的力学环境，减少该部位的应力，以保持稳定，然后逐渐而不是突然降低其应力遮挡作用，使该部承受逐步增大乃至生理水平的应力刺激，从而加速骨伤愈合与塑型，防止局部骨质疏松和再骨折的发生。有文献报道，在对粉碎性骨折碎骨块进行捆扎固定时需保持150N以上的捆扎力才能取得较好的固定效果。据此，理想的用于粉碎性骨折和非承重骨折的可吸收骨折内固定捆扎带应该有以下性能：初始抗拉强度大于150N，良好的柔性以保持骨膜血运；在植入人体4周能保持较高的强度及柔性；在植入人体8-10周时有一定的强度及柔性；在植入人体14周以后丧失其力学强度；在尽可能短的时间内降解并完全吸收。

在骨折愈合过程中，通常需要使用石膏外固定材料。传统的石膏外固定是在待固定部位外周制作石膏模型，凝固成型后帮助患者固定骨折损伤部位。由于其制备繁琐、耗时费力、与患者带固定部位吻合度差、拆解困难等缺陷，目前已经被新型高分子夹板和石膏绷带所代替。高分子夹板能够根据待固定部位的尺寸和弯曲度，辅以纱布绷带或者类似材质即可针对性的制成贴附待固定部位的固体夹板。石膏绷带浸水后在绷带表明形成糊状石膏，可以直接贴附在待固定部位外侧，干燥后就形成坚硬的石膏外固定材质，由于以绷带为基本材质可以按照待固定部位随意剪裁，进一步提高了吻合度。

目前临床使用的骨科外固定材料能够较好的贴合待固定部位，使用方便、快捷，但是由于骨折愈合期较长，皮肤无法清洁，容易细菌滋生或者发生过敏、瘙痒，令患者寝食难安。临床上通常使用纤细的物品帮助止痒，但是效果非常有限，还容易损伤待固定部位及其表面皮肤尤其是粉碎性骨折或者骨折程度较严重的患者，往往需要至少2-3个月的愈合期，期间一旦需要拆开外固定材料，不仅会延长治疗周期，而且治疗效果也会大打折扣。即便如此，部分患者仍然因为皮肤过敏不得不进行二次固定。少部分患者拆开外固定材料后，皮肤已经溃烂发黑。

皮肤是人体与外界接触最大的器官，易受环境感染，皮肤表面的菌群种类繁多，与生活环境密切相关，且以过路菌为主。常见的有：葡萄球菌、链球菌、绿脓杆菌、白色念珠菌、丙酸杆菌、类白喉杆菌、非致病分枝杆菌等等。金黄色葡萄球菌也是一种皮肤表面常见的细菌，另外在鼻腔、呼吸道也能够发现。这种细菌可以引起很多种疾病，比如它是皮肤以及软组织脓肿、疖以及蜂窝组织炎的首要原因；另外，这种细菌在体内也能够导致血液感染、肺炎、骨关节感染等一系列疾病。

在皮肤以及呼吸道还有一种细菌就是化脓性链球菌，一般情况下不会引发感染，但如果免疫功能下降的时候，也会造成不小的麻烦。这种细菌感染后会在脸部、手臂或腿部表皮形成黄色的痂，而更严重的还会导致猩红热。这种细菌又被称为“食肉菌”，因为它会侵蚀感染的组织，引起坏死性筋膜炎。在皮肤以及呼吸道还有一种细菌就是化脓性链球菌，一般情况下不会引发感染，但如果免疫功能下降的时候，也会造成不小的麻烦。这种细菌感染后会在脸部、手臂或腿部表皮形成黄色的痂，而更严重的还会导致猩红热。这种细菌又被称为“食肉菌”，因为它会侵蚀感染的组织，引起坏死性筋膜炎。

益生菌是一类摄入足够量后，能对宿主生理产生有益作用的活性微生物。作为调节肠道菌群平衡的有益食物添加剂，益生菌日益受到人们的重视。但是到目前为止，尚未有通过益生菌促进骨科外固定手术患者的皮肤健康的报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种有助于保持骨科外固定过程中皮肤表面菌群平衡的益生菌配方及其应用。

本发明要解决的另一个问题使提供上述益生菌配方的制备方法。

本发明提供了一种益生菌冻干粉制备方法，所述的益生菌冻干粉制备方法包括以下步骤：

(1)活化培养益生菌，所述的益生菌是乳杆菌和/或嗜热链球菌；

(2)扩大培养菌种液，益生菌的密度不少于2*10¹⁰cfu/ml，；

(3)将菌液混合得到复合菌液，控制干酪乳杆菌和嗜热链球菌的比例为1：0.5-3；

(4)冷冻脱水复合菌液，获得益生菌冻干粉。

所述的益生菌是嗜酸乳酸菌、L.保加利亚乳酸杆菌、拟干酪乳杆菌、发酵乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、两歧双歧杆菌、长双歧杆菌中的一种或多种。

在本发明的一个优选实施中，所述的益生菌包括干酪乳杆菌和嗜热链球菌，干酪乳杆菌(Lactobacillus casei，ATCC393)和嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus，ATCC19258)均购自上海复祥生物科技有限公司。

优选的，步骤(1)中，所述的活化培养益生菌是指，将益生菌接种到MRS培养基(索莱宝)上，37℃培养过夜。通常，培养过夜10小时以上，例如12-24小时。

MRS(液体)培养基也可以按照下列配方：牛肉蛋白粉10g，鱼肉汁10g，酵母浸出汁粉5g，葡萄糖20g，醋酸钠5g，柠檬酸二铵2g，吐温800.1g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.28g，蒸溜水1000ml。用高压锅在121℃灭菌15min，调节pH6.2～6.4。固体培养基可以在此基础上添加1.5-2.0％的琼脂。

优选的，步骤(3)中，控制培养温度37℃，pH为4.1-4.5，活菌不少于2×10¹¹cfu/mL，即可终止培养。

脱脂奶粉的作用主要是作为冷冻干燥保护剂。优选的，步骤(4)冷冻脱水前，在复合菌液中添加脱脂奶粉，加入脱脂奶粉的质量比为8-15％。

优选的，步骤(4)的冷冻脱水是在冷冻的低温条件下使发酵菌液中95％以上的水分去除，可以是先经过-80℃预冻15-30小时，然后在-80℃及0.05～0.1mBar条件下进行冻干，制得益生菌粉。

相应的，本发明提供了一种益生菌冻干粉，包含乳杆菌和嗜热链球菌；乳杆菌和嗜热链球菌的比例为1：0.5-3。

在此基础上，本发明提供了一种益生菌粉剂，所述的益生菌粉剂由上述的益生菌冻干粉与益生元和/或糖醇混合制成；

所述的益生菌冻干粉与益生元、糖醇的质量比为1：(30-90)：(2-8)。

所述的益生元为低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖和菊粉的中的一种或者几种。

所述的糖醇为乳糖醇、赤藓糖醇和木糖醇的一种或者几种。

另一方面，本发明提供了益生菌粉剂的应用，所述的益生菌粉剂用于制备石膏外固定衬垫，防止待固定部位的皮肤发生过敏、炎症、溃疡或者糜烂的情况。

例如，一种益生菌石膏外固定材料，包括护理绷带、骨科夹板或者石膏绷带、棉质套筒，棉质套筒在最内层，环周围绕需要固定的部位；最外层是骨科用护理绷带，棉质套筒与护理绷带之间安置骨科夹板或者石膏绷带，骨科夹板或者石膏绷带依照需要固定部位的形状贴附或者通过护理绷带固定于棉质套筒外侧，棉质套筒贴合有含有益生菌粉的衬垫，益生菌粉层面积小于棉质套筒，对应于需要固定部位的皮肤位置。

所述的衬垫贴合在棉质套筒的内层或者外层，其基质可以是无机物、金属片、纱网、棉布、无纺布或者纸片。

较好的，所述的衬垫还包括涂敷麦芽糊精涂层、干酪涂层或者纤维素层，有助于维持益生菌的活性和生理功能。

所述的衬垫还可以包括是氧化锌颗粒或者附有氧化锌的纺织品。

氧化锌是一种宽禁带半导体氧化物，具有和二氧化钛相近的禁带宽度，具有较强的光催化作用，无光条件下纳米氧化锌对枯草芽孢杆菌的抑菌率达98％，光照下对大肠杆菌具有很强的抑制效果，其各种晶型均具有抗菌特性。光照条件下，价带上的电子发生跃迁到导带上，产生空穴和电子，表面上的空穴可将吸附在氧化锌表面上氢氧根和水氧化成为活性氧，活性氧对于大多数有机污染物、细菌、病毒作用将其氧化分解，锌离子的溶出杀菌对破坏细菌细胞膜导致细胞内容物溶出，阻碍细菌新陈代谢酶的合成，破坏遗传。

进一步的，所述的益生菌石膏外固定衬垫中还含有涂覆益生菌粉剂的载体。该载体可以有助于保持益生菌的活性，乃至起到缓释的效果。

对于微生物粘附在材料表面而言，材料的结构和性质直接影响微生物在载体材料上的粘附效果。其中，载体材料的吸附特性与材料形貌结构、孔隙分布以及材料表面化学性质等密切相关。载体村料的实体表面为微生物的粘附提供吸附位点。材料间隙不仅为微生物提供生长空间，有利于微生物的生长和繁殖，同时也有助于营养物质、代谢产物和气体等物质的内外交换。理想的载体材料应该具有较大的比表面积和高孔隙率。

例如，所述的载体是水合铝硅酸盐或者海藻酸钙。

为了进一步促进待固定部位皮肤的健康、降低发生过敏的概率，所述的骨科夹板或者石膏绷带与棉质套筒之间固定安装有透气层、防水隔汽层、吸汗层，所述透气层的外表面设置有透气口；

所述吸汗层位于防水隔汽层的内侧，防水隔汽层位于透气层的内侧。

本发明公开了一种益生菌冻干粉制备方法，提供了所制备的益生菌冻干粉及其的应用。将本发明的益生菌用于制备骨科外固定材料的衬垫，能够促进皮肤表皮的健康，显著降低需要外固定的骨科患者发生皮肤过敏的概率，成本低廉，使用简便，大大提高了患者的舒适度和依从性。

具体实施方式

以下将更详细地描述本发明。然而，本发明可以以许多不同形式实现，并且不应解释为受在此提出之实施例的限制。相反，提出这些实施例是为了达成充分及完整公开，并且使本技术领域的技术人员完全了解本发明的范围。对于没有具体描述的步骤，可以采用本领域的常规技术手段完成，或者参照《益生菌培养与应用》(清华大学出版社，ISBN：9787302504955)。

实施例1益生菌冻干粉的制备

将保藏的干酪乳杆菌和嗜热链球菌分别取一环菌苔，接种到斜面MRS培养基，37℃培养过夜。然后取活化的一环菌苔，接种到液体培养基，置于37℃摇床培养24小时。然后，从培养基中分别取1mL菌液，接种至500ml三角瓶(100ml培养基)，37℃摇床培养2天。

将10mL的培养基倾注于每个平皿中，待冷却凝固后，选取10^-8、10^-9及10^-10三个稀释度的样品匀液，分别用微量移液器吸取100μ1接种于培养基上，用L型或者三角形玻璃棒进行涂板。37℃下恒温有氧培养24h,换算稀释倍数，计算的干酪乳杆菌和嗜热链球菌的菌种密度为3.51*10⁹cfu/ml和1.42*10⁹cfu/ml。

分别取5.0ml干酪乳杆菌和6.2ml嗜热链球菌的菌液混合，接种于盛有200ml无菌培养基的1L三角瓶中，置摇床37℃振荡培养26小时，转速为160rpm。测所制益生菌发酵液符合要求为：根据国标GB4789.35-2016检验干酪乳杆菌和嗜热链球菌均不低于1亿/ml，根据国标GB4789.2-2010检测其他细菌总数不超过100个/ml。

实施例2益生菌粉剂的制备

按照占干粉保护剂体积比为10％的比例加入灭菌的脱脂乳100ml，最后用灭菌去离子水定容至1L。将混合菌液离心，弃上清，菌体沉淀用灭菌生理盐水洗涤1-2次，离心，得菌泥。灭菌溶液和菌泥的配比为干粉保护剂∶菌泥＝5ml∶1g，其中干粉保护剂按体积计算，菌泥按质量计算。混匀后，于预冻于-70℃，3～4h。然后置于-80℃冷冻干燥至至少去除95％的水分。分装成2g/份，冷冻备用。

实施例3制备包含益生菌的骨科外固定材料

棉质套筒经过表面活化处理后，以纳米粒度的氧化锌(ZnO)作为无机填料与羟基硅油、低含氢硅油、乳化剂、增稠剂和去离子水合催化剂混合成氧化锌有机硅乳液，将氧化锌有机硅乳液涂覆在经活化的纱布料上，包含以下步骤：

(1)有机硅乳液及涂覆液的制备：组分为纳米氧化锌、羟基硅油，低含氢硅油，乳化剂I聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯80，乳化剂II失水山梨醇脂肪酸酯20，增稠剂聚甲基纤维素钠，去离子水合催化剂醋酸锌或二月桂酸二丁基锡制成，搅拌均匀后获得有机硅/氧化锌乳液产品，最后加入催化剂；

(2)纱布的表面处理：将纱布织物浸渍在30wt％的氢氧化钠水溶液中，在45℃温度下反应3小时，然后将纱布拿出，清水冲洗后，放在35℃烘箱中或自然晾干；

(3)纱布的涂覆及交联：使用机器涂覆或者浸泡的方法对纱布进行上浆，温度控制在35℃，得到目标产物。

纱布表面活化后，均匀散布益生菌粉剂。待黏附干燥后，将含有实施例2制备的益生菌粉的纱布粘贴在棉质套筒内侧。

实施例4含有益生菌的石膏外固定材料

本发明的益生菌可以用于制作石膏外固定材料。该石膏外固定材料包括护理绷带、骨科夹板或者石膏绷带、棉质套筒，棉质套筒在最内层，环周围绕需要固定的部位；最外层是骨科用护理绷带，棉质套筒与护理绷带之间安置骨科夹板或者石膏绷带，骨科夹板或者石膏绷带依照需要固定部位的形状贴附或者通过护理绷带固定于棉质套筒外侧，棉质套筒对应于待固定部位的内侧，即靠近皮肤的一侧，贴合有含有益生菌粉的衬垫。衬垫以医用消毒纱布为基础，中间包裹涂敷益生菌的海藻酸钠载体，益生菌均匀散布在海藻酸钠载体上。

使用时，将贴合益生菌层的棉质套筒从密封包装袋中取出，套到患者待固定部位外周，注意将垫片对准紧密接触的皮肤位置。然后取夹板,根据待固定部位的形状、大小拗成相符的形状。最后，使用绷带、纱布等，紧密缠绕棉质套筒和夹板，形成牢固的外固定结构。

实施例5含益生菌的石膏外固定材料有助于维持皮肤健康

本发明的含益生菌的石膏外固定材料在使用时，将衬垫和棉质套筒分别从密封包装袋中取出，棉质套筒套到患者待固定部位外周，注意将衬垫在对准紧密接触的皮肤位置固定。然后，取合适长度的石膏绷带,浸水，根据待固定部位的形状、大小拗成相符的形状，干燥。最后，使用绷带、纱布等，紧密缠绕棉质套筒和成型的石膏绷带，以进一步稳固外固定材料。

对自愿使用益生菌外固定材料的4-16岁骨折患者随访。对接受随访者要求为：

1.没有服用阿司匹林类产品、抗炎药、抗组胺药或者皮质疗法。

2.没有暴露在人造紫外线和/或太阳下。

3.不改变日常卫生习惯。

4.不频繁的做剧烈运动。例如，每周参加连续半小时跑步3次以上。

虽然参加随访，但是在情况说明中没有提及参加何种测试，让患者感到只是普通的临床随访。

愿意接受随访者共计147人，完整完成调查问卷者为116人。以以往使用常规石膏外固定材料的患者100人作为对照。接受随访的患者中有3例表示非常不适，3天内要求拆除、更换绷带。其余患者通常从第5天开始表示出现瘙痒，但是大部分患者从第10天开始皮肤瘙痒，少数三周才感到皮肤明显瘙痒，明显晚于使用普通临床石膏外固定材料的患者。拆除外固定材料，皮肤发生明显红肿过敏的患者也明显少于使用普通石膏外固定材料的患者。统计表明，增加衬垫后，患者皮肤发生瘙痒的平均时间延后9天。拆解石膏外固定材料后，皮肤发生明显红肿过敏的患者(以出现红疹子为标准)数量比未使用衬垫的降低75％。

实施例6-12不同益生菌配方的石膏外固定材料

本发明的益生菌可以根据需要调整配方。虽然干酪乳杆菌和嗜热链球菌具有改善菌群平衡、提高机体免疫力等效果，但是两者在适用场景和特点方面各有不同。本发明的研究过程中发现，这两者配合总体而言有利于改善石膏外固定患者的皮肤健康状况，并非所有比例的配方都能有效。对干酪乳杆菌和嗜热链球菌投入比例的实验组记录使用效果，以出现皮肤瘙痒的天数显著多于普通石膏外固定材料的情况作为有效的标准。

测试表明，干酪乳杆菌和嗜热链球菌的比例在1：(0.5-3)有效。

具体结果如下表：

因本技术领域的技术人员应理解，本发明可以以许多其他具体形式实现而不脱离其本身的精神或范围。尽管已描述了本发明的实施案例，应理解本发明不应限制为这些实施例，本技术领域的技术人员可如所附权利要求书界定的本发明的精神和范围之内做出变化和修改。

Claims (7)

1.一种益生菌冻干粉的应用，其特征在于，由干酪乳杆菌和嗜热链球菌组成；干酪乳杆菌(Lactobacillus case)ATCC393和嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)ATCC19258；干酪乳杆菌和嗜热链球菌的比例为1：0.5-3；所述的益生菌冻干粉用于制备石膏外固定衬垫，防止待固定部位的皮肤发生过敏、炎症、溃疡或者糜烂的情况。

2.根据权利要求1所述益生菌冻干粉的应用，其特征在于，所述的益生菌石膏外固定衬垫中还含有涂覆益生菌的载体。

3.一种石膏外固定衬垫，其特征在于，所述的石膏外固定衬垫中含有权利要求1所述的益生菌冻干粉。

4.如权利要求3所述的石膏外固定衬垫，其特征在于，所述的石膏外固定衬垫中还含有涂覆益生菌的载体。

5.根据权利要求1益生菌冻干粉的应用，其特征在于，所述的益生菌冻干粉制备方法包括以下步骤：

(1)活化培养益生菌，所述的益生菌是干酪乳杆菌和/或嗜热链球菌；

(2)扩大培养菌种液，益生菌的密度不少于2*10⁹cfu/ml，；

(3)将菌液混合得到复合菌液，控制干酪乳杆菌和嗜热链球菌的比例为1：0.5-3；

(4)冷冻脱水复合菌液，获得益生菌冻干粉；

步骤(1)中，所述的活化培养益生菌是指，将益生菌接种到MRS培养基上，37℃培养过夜；

步骤(2)中，控制培养温度37℃，12-30小时，pH为4.1-4.5，活菌不少于2×10⁹cfu/mL，即可终止培养。

6.如权利要求5所述的益生菌冻干粉的应用，其特征在于，步骤(4)冷冻脱水前，在复合菌液中添加脱脂奶粉，加入脱脂奶粉的质量比为8-15％。

7.如权利要求5所述的益生菌冻干粉的应用，其特征在于，步骤(4)的冷冻脱水是指，

先经过-80℃预冻15-30小时，然后在-80℃及0.05～0.1mBar条件下进行冻干，制得益生菌粉。