CN112007623B - 一种天麻素与pega树脂共价偶联合成亲合层析树脂的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种天麻素与PEGA树脂共价偶联合成亲合层析树脂的方法及其应用,制备步骤包括:PEGA树脂的预处理、PEGA树脂的平衡、PEGA树脂的活化、PEGA树脂与反应催化物的结合、PEGA树脂与天麻素的共价偶联得到天麻素与PEGA树脂共价偶联亲合层析树脂;本发明制备得到的天麻素与PEGA树脂共价偶联亲合层析树脂可以运用于天麻素特异性结合分子靶点的筛选和鉴定,本发明步骤较少,操作简便,同时使用了新的反应催化剂,更加安全。
Description
技术领域
本发明属于化学合成及分子药理学研究领域,涉及天麻素与PEGA树脂的共价偶联及以此为基础的亲合层析法筛选鉴定天麻素化合物特异性分子靶点的应用。
背景技术
天麻是传统中药里的常用配方,中医临床上用其治疗多种心脑血管疾病,如神经过度紧张、脑缺血及缺血性中风、帕金森氏病等。天麻的主要活性成分为:天麻素(即天麻苷)及其多聚物巴利森苷、对羟基苯甲醇、对羟基苯甲醛、香草醛和天麻多糖等。天麻具有显著的镇静安神和保护神经系统的药理作用。但由于天麻素等活性单体的直接作用分子靶点尚未明确,使得这些天然活性化合物的成药研究难以取得突破性进展。西医理论要求药物的化学结构明确、作用靶点明确、作用机制明确,而中药多以复方混合成分为主,分离鉴定主要的活性成分并找到它们对应的分子靶点借以阐明其作用机理是困扰中药国际化研究的最大难题。云南中药资源丰富,与天麻类似,三七、白芨、灵芝等功效显著的中药活性成分由于靶点不明、药物与靶蛋白结合的构效关系不明、作用的主要信号通路不明,所以在西药研究的科学范式下难以成药,更无法得到国际市场的认可。目前筛选鉴定药物作用靶点的方法有很多,但最为常用且最有效的是亲合层析法。
发明内容
本发明为了拓展云南特色药用植物研究的新领域,快速鉴定天麻中功效明确但药理机制不明的活性成分以利于其成药及推向国际化,提供一种天麻素与PEGA树脂共价偶联合成亲合层析柱的方法及应用。
本发明的技术方案如下:
一种天麻素与PEGA树脂共价偶联合成亲合层析树脂的方法,具体步骤如下:
(1)PEGA树脂的预处理:
取300-500mgPEGA树脂用pH8.0的Tris-HCL缓冲液1mL重悬,于小容量瓶中充分混合搅拌30分钟;
(2)PEGA树脂的平衡:
将预处理后的树脂用DMF重悬后转移至3mL玻璃柱料管中,静置,待树脂全部沉降后,用pH8.0的Tris-HCL缓冲液过柱平衡树脂3次,每次2mL;
(3)PEGA树脂的活化:
待平衡缓冲液流尽后,向柱料管中加入吡啶过柱冲洗柱料3次,每次2mL,然后用DMF将树脂从柱料管中重悬后移出至小型圆底反应瓶中;
(4)PEGA树脂与反应催化物的结合:
向反应瓶中加入溴代乙酸乙酯至浓度达到0.088mmol/L,并不断搅拌混合6小时后,将树脂用DMF重悬后转移至柱料管中,依次用二氯甲烷、甲醇、DMF分别过柱冲洗3次,每次3mL;
(5)PEGA树脂与天麻素的共价偶联:
将PEGA树脂从柱料管中用DMF重悬后转移至反应瓶中,加入天麻素至终浓度为0.08mmol/L,加入碳酸钾至终浓度为0.08mmol/L,并不断搅拌混合,反应3天后移至柱料管中,得到天麻素与PEGA树脂共价偶联亲合层析树脂。
本发明的另一个目的是将上述所合成天麻素与PEGA树脂共价偶联亲合层析树脂用于筛选和鉴定天麻素的直接结合靶点,从而进一步阐明其药理机制。
本发明的有益效果在于:
(1)本发明提供的天麻素与PEGA树脂共价偶联合成亲合层析树脂的方法改进了催化剂,采用符合国家最新法规的试剂溴代乙酸乙酯,同时保证了反应速率和合成产率,更加安全。
(2)本发明提供的亲合层析树脂合成方法也适用于与天麻素结构类似的富含羟基的萜类化合物,可用于制备同类药物的亲合层析柱以用于药物的靶点筛选鉴定,可用于筛选鉴定天麻素及其类似物的直接作用靶点,为阐明其药理机制提供必要且关键的证据。
附图说明
图1为天麻素-PEGA亲合层析树脂的红外光谱与单纯PEGA树脂及单纯天麻素的红外光谱对比图;
图2为天麻素-PEGA亲合层析树脂作为层析柱洗脱样品的蛋白质种类和单纯PEGA树脂作为层析柱洗脱样品的蛋白质种类的集合图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步详细说明,但本发明的保护范围不局限于所述内容,凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
实施例中方法如无特殊说明均采用常规方法,使用试剂如无特殊说明,均为常规市售试剂或采用常规方法配置的试剂;实施例中使用的原材料PEGA树脂,CAS: 372109-59-6 英文名:Amino PEGA resin,为市场购买得到;天麻素为市场购买得到。
实施例1:天麻素与PEGA树脂共价偶联亲合层析树脂的合成,具体步骤如下:
(1)PEGA树脂的预处理:
取300-500mgPEGA树脂,用pH8.0的Tris-HCL缓冲液1mL重悬,于小容量瓶中充分混合搅拌30分钟;
(2)PEGA树脂的平衡:
将预处理后的树脂用DMF重悬后转移至5mL玻璃柱料管中,静置,待树脂全部沉降后,用pH8.0的Tris-HCL缓冲液过柱平衡树脂3次,每次2mL;
(3)PEGA树脂的活化:
待平衡缓冲液流尽后,向柱料管中加入吡啶过柱冲洗柱料3次,每次2mL,然后用DMF将树脂从柱料管中重悬后移出至小型圆底反应瓶中;
(4)PEGA树脂与反应催化物的结合:
向反应瓶中加入溴代乙酸乙酯达到0.088mmol/L浓度,并不断搅拌混合6小时后,将树脂用DMF重悬后转移至柱料管中,依次用二氯甲烷、甲醇、DMF分别过柱冲洗3次,每次3mL;
(5)PEGA树脂与天麻素的共价偶联:
将PEGA树脂从柱料管中用DMF重悬后转移至反应瓶中,加入天麻素至终浓度为0.08mmol/L、碳酸钾至终浓度为0.08mmol/L,并不断搅拌混合,反应3天后移至柱料管中备用,此为天麻素-PEGA亲合层析树脂。
本实施例合成的天麻素-PEGA亲合层析树脂取样后与单纯PEGA树脂及单纯天麻素样品分别进行红外光谱检测,辨别各自特征基团的吸收峰,以检验合成是否成功,结果见图1,从图中可以,天麻素-PEGA亲合层析树脂的红外图中可辩识出明显的天麻素特征基团吸收峰(吡喃糖和苯环)以及与PEGA树脂偶联后产生的叠加峰,证明偶联成功,且此亲合柱还可用于后续靶点蛋白的富集和纯化。
实施例2:采用实施例1合成的天麻素-PEGA亲合层析树脂特异性吸附PC-12细胞裂解液中的潜在靶点蛋白后质谱鉴定,具体步骤如下:
(1)细胞裂解液的制备:
新传代2天后的PC-12细胞,生长至80%以上,收集大约2个25cm直径平培养皿中细胞,3000rpm离心5min,去上清液,用PBS缓冲液重置细胞沉淀,10000rpm离心30sec,去上清液,用RIPA裂解液重悬细胞沉淀并于冰浴中裂解1h后,10000rpm离心15min,取上清液备用;
(2)天麻素亲合层析柱的平衡:
用实施例1合成的天麻素-PEGA亲合层析树脂作为层析柱,并用pH8.0的Tris-HCL缓冲液配制20mmol/L浓度的咪唑溶液且冲洗柱料3次,3mL/次;
(3)细胞裂解液中潜在靶点蛋白的过柱富集:
将细胞裂解上清液上样,流经亲合层析柱,用浓度为50mmol/L咪唑Tris-HCL缓冲液冲洗柱料3次,3mL/次;
(4)亲合柱所吸附蛋白的洗脱与质谱鉴定:
用约2mL浓度为200mmol/L咪唑Tris-HCL缓冲液洗脱亲合柱,收集全部洗脱液。
采用未处理过的PEGA树脂代替实施例1合成的天麻素-PEGA亲合层析树脂进行实施例2,收集全部洗脱液作为对照组。
实施例2的洗脱液和对照组的洗脱液一同进行蛋白质谱鉴定,鉴定结果做初步的归类见图2,从图2可以看出,天麻素-PEGA亲合层析树脂柱洗脱样品中含301种蛋白,对照组空白柱洗脱样品中含1299种蛋白,除去两者同有的95种蛋白,天麻素可能的特异性吸附的潜在靶点蛋白有196种,该实验多次重复以排除假阳性结果,说明以此为基础成功地对天麻素在人神经细胞中的作用靶点进行了初步筛选得到约196个潜在靶点蛋白,经过多次重复缩小筛选范围,以最终确定的靶点蛋白为基础可以详细阐明天麻镇静安神作用的分子机制,为该中药成分的药物开发和国际化推广提供关键的科学依据。
Claims (2)
1.一种天麻素与PEGA树脂共价偶联合成亲合层析树脂的方法,其特征在于,具体步骤如下:
(1)取300-500mgPEGA树脂,用pH8.0的Tris-HCL缓冲液1mL重悬,于小容量瓶中充分混合搅拌30分钟;
(2)将预处理后的树脂用DMF重悬后转移至5mL玻璃柱料管中,静置待树脂全部沉降后,用pH8.0的Tris-HCL缓冲液过柱平衡树脂3次,每次2mL;
(3)待平衡缓冲液流尽后,向柱料管中加入吡啶过柱冲洗柱料3次,每次2mL,然后用DMF将树脂从柱料管中重悬后移出至小型圆底反应瓶中;
(4)向反应瓶中加入溴代乙酸乙酯至浓度达到0.088mmol/L,并不断搅拌混合6小时后,用DMF将树脂重悬后转移至柱料管中,依次用二氯甲烷、甲醇、DMF分别过柱冲洗3次,每次3mL;
(5)将PEGA树脂从柱料管中用DMF重悬后转移至反应瓶中,加入天麻素至终浓度为0.08mmol/L,加入碳酸钾至终浓度为0.08mmol/L,并不断搅拌混合,反应3天后移至柱料管中,得到天麻素与PEGA树脂共价偶联亲合层析树脂。
2.权利要求1所述方法制得的天麻素与PEGA树脂共价偶联亲合层析树脂作为筛选和鉴定天麻素直接结合靶点的应用。
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